" Procédé pour la préparation de la p-ergocriptine "
La présente invention a pour objet un procédé fermentatif pour la production de la bêta-ergocriptine. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un nouveau procédé microbiologique pour la production de la bêta-ergocriptine en utilisant la nouvelle souche Claviceps Purpurea FI 7374.
La bêta-ergocriptine est un alcaloïde de la série de ltergotocine et est constituée par l'acide lisergique, la L-proline,
la L-valine et la L-isoleucine (au lieu de L-leucine, comme
c'est le cas pour l'ergocriptine usuelle, dite également al-
pha-ergocriptine). La bêta-ergocriptine possède une activité
li pharmacologique très semblable à celle de l'alpha-ergocriptine
( Schlientz et cons.- Pharmaceutica Acta Helvetiae 43, p. 497,
1968 ;-Experientia 23, p.991, 1967 ) et est isolée à partir des indurations du seigle ergoté qui contiennent l'ergotocine ( Schlienz et cons. Experientia 23 , p.991, 1967).
Le produit d'alcaloïdes à partir de l'ergot du seigle moyennant une culture aérobie submergée de souches du genre Claviceps , est connue en soi. (Kelleher, Advances in Applied Microbiol .11, p. 211, 1968 ; Spalla et cons. in Fermentation Advances , Académie Press Inc., New York 1969, p. 611) ; toutefois , on n'a jamais obtenu la bêta-ergocriptine par cet-
te méthode.
On a découvert désormais - et ceci constitue l'objet de l'invention - qu'en cultivant dans des conditions aérobies submergées, et sur un milieu de culture approprié, le nouveau microrganisme C.purpurea FI 7374 , on peut obtenir , avec un
haut rendement, un mélange d'alcaloïdes constitué principale- ment par la bêta-ergocriptine. La nouvelle souche de C.purpu-
rea a été isolée d'une induration recueillie sur un épi de seigle infecté , trouvé à proximité de Brunico (Italie) ; il présente les caractéristiques qui seront exposées dans la suite.
Le procédé, objet de la présente invention , consiste à cultiver le nouveau microrganisme Claviceps purpurea FI 7374
dans un milieu contenant des sources de carbone , des sources d'azote et des sels minéraux , et à extraire l'alcaloïde de la manière connue. Plus particulièrement et suivant le procédé
objet de l'invention, le microrganisme est amené à se développer dans un milieu de culture liquide, dans des conditions aérobies, en culture submergée, à une température comprise entre 22[deg.] C et 28[deg.] C, de préférence de 24[deg.] C , pendant une
durée variable de 10 à 16 jours. Le pH des milieux de fermen- tation utilisés varie entre 4,5 et 6,5. A titre de sources de carbone on peut employer le glucose, le saccharose, la mannite, le sorbitol, la glycérine, l'acide citrique, l'acide succinique. La source d'azote peut être constituée par l'asparagine, les produits de l'hydrolyse de la caséine, de peptones ou de sels d'ammonium, tels que le chlorure d'ammonium.
On peut obtenir des résultats particulièrement favorables
en utilisant , à titre de source d'azote et de carbone un sel ammoniacal d'un acide organique tel que le citrate ou le succinate d'ammonium. Les sels minéraux convenant à la production
de l'alcaloïde varient suivant le terrain utilisé; ils consis- tent normalement en phosphates de sodium et de potassium ; en sulfates de magnésium , de fer , de zinc , de manganèse et en chlorure de potassium. La souche C.purpurea FI 7374 peut être conservée par lyophilisation , en utilisant comme milieu de suspension un liquide constitué par deux parties d'une solution aqueuse stérile de 60% de saccharose et une partie de lait stérile. En outre, la souche C.purpurea FI 7374 peut être conservée en maintenant à une température de 80[deg.]C sous zéro soit une culture dans un milieu- solide, soit une micelle mise en suspension dans une solution aqueuse à 15% de glycérine, ou bien au moyen de transplantations successives sur un des milieux énumérés dans le tableau 1.
La fermentation peut être effectuée dans une fiole d'Erlenmeyer et dans un vase de fermentation de laboratoire ou industriel de capacité appropriée. / <EMI ID=1.1>
Composition des milieux de culture solides.
<EMI ID=2.1>
L'alcaloïde présent dans le bouillon est révélé par chromatographie sur papier et déterminé quantitativement à l'aide d'une méthode spectrophotométrique , par comparaison avec un échantillon étalon de bêta-ergocriptine.
<EMI ID=3.1>
Sur les milieux de culture agarisés, les colonies sont formées par des individus plus ou moins sinueux et emmêlés d'environ 3-4 microns de diamètre. Les germes sont peu ramifiés et présentent intérieurement des granulations. On observe parfois des grossissements sphériques, tant latéraux qu'apicaux, qui ont l'aspect d'arthrospores. La souche comprend normalement des conidies qui se forment au sommet des germes et présentent une forme ovale et des dimensions de 6-8 microns pour la longueur et de 3-5 microns pour l'épaisseur.
<EMI ID=4.1>
Les caractéristiques culturales ont été relevées en culture incubée à 28[deg.] C, pendant 5, 10, 20 et 30 jours, en éprouvette inclinée, dans les milieux indiqués dans le tableau.
Milieu patate douce.
Bonne croissance sous la forme d'une pellicule plate de couleur blanc sale à la périphérie et à gros plissement ondulé de couleur violet sombre au centre. L'envers de la colonie est violacé . Absence de pigments solubles. Présence de conidiés.
Milieu TS.
Croissance très abondante sous la forme d'une multitude de gros plis blancs à crème et, finalement, violets sur toute la superficie après le 30ème jour.
L'envers de la colonie est rosé ou blanc . Absence de
J
pigments solubles. Absence de conidies.
<EMI ID=5.1>
Croissance abondante, sous la forme de multiples plis extrêmement petits, de couleur crème à beige , sur toute la superficie. L'envers de la colonie est jaune marron. Absence de pigments solubles. Présence de conidies .
Milieu Malt
Croissance peu abondante, à colonies isolées, lisses, de couleur blanc sale, d'un aspect pulvérulent.
L'envers de la colonie est marron clair. Absence de pigments solubles. Présence de conidies après le 20ème jour.
Les exemples ci-après servent à mettre l'invention en évidence , sans toutefois la limiter.
Exemple 1.
La totalité du contenu d'une fiole stérilisée en chaleur humide est mise en suspension dans 0,2 ml d'eau distillée stérile et est répartie sur la superficie d'une éprouvette inclinée de milieu TS (voir Tableau 1). On effectue l'incubation à
28[deg.] C pendant 12 jours. La culture ainsi obtenue peut être conservée au frigorifique à 4[deg.] C environ pendant un mois et être utilisée à n'importe quel moment pour ensemencer d'autres cultures en éprouvette inclinée, de même milieu. Ces cultures sont à leur tour incubées à 28[deg.] C pendant 12 jours, et les cultures ainsi obtenues sont utilisées pour ensemencer une fiole de 300 ml contenant 50 ml de milieu ayant la composition suivante :
<EMI ID=6.1>
<EMI ID=7.1>
Eau distillée a 1000 ml
pH ajusté à 5,2 à l'aide de l'hydrate d'ammonium.
L'ensemencement des organismes végétatifs est effectué au moyen d'un fragment d'une culture en tube d'essai incliné, fragment homogénéisé par sa mise en suspension dans une petite quantité du milieu qui vient d'être décrit , et agité à l'aide de billes de verre, dans des conditions de stérilité. Une éprouvette inclinée sert à ensemencer 3-4 fioles. On met les
<EMI ID=8.1>
de 220 tours à la minute, avec une excentricité de 3 cm. Au bout de 4 jours on utilise la culture pour l'ensemencement de milieux productifs. La culture est de couleur blanchâtre, de bonne croissance et possède un pH 4 environ. Le milieu productif a la composition suivante :
<EMI ID=9.1>
pH ajusté à 5,2 à l'aide d'hydrate d'ammonium.
Ce milieu est réparti dans des fioles de 300 ml , à raison de 50 ml par fiole. Chaque fiole est ensemencée avec 5 ml de culture végétative et incubée dans les conditions décrites à propos des formes végétatives . Au bout de 16 jours d'incu-
<EMI ID=10.1>
entre 1050 et 1240 mcg/ml. Les alcaloïdes produits sont constitués par 70% de bêta-ergocriptine, 20% d'ergosine, les 10% restants étant de l'ergocornine et de l'ergocriptine (alphaergocriptine).
A partir de 10 litres de culture sur bouillon (210 fioles) on sépare par filtration le bouillon et la micelle. Le bouillon est ajusté à un pH 9 à l'aide de carbonate de soude et extrait deux fois avec la moitié de son volume de chloroforme. La micelle est extraite, avec agitation, au moyen d'un mélange d'acétone aqueux à 50% contenant 4% d'acide tartrique, et filtrée, le filtrat étant ajusté à un pH 9 et extrait avec un volume égal de chloroforme.
On réunit les extraits au chloroforme du filtrat et de la micelle , on les concentre, et on les extrait avec une solution aqueuse d'acide tartrique à 4%. On alcalinise la solution tartrique à un pH 9 et l'on extrait au chloroforme.L'extrait au chloroforme, concentré à un petit volume, est chargé sur une colonne de 250 g de gel de silice dans le chloroforme et élué avec une quantité croissante de méthanol de 1 à 4%. Il se produit d'abord la descente des "pics" contenant les isomères dextrogyres des groupes de l'ergotocine (alpha et bêta-ergocriptinine et ergocorninine ) et d'ergotocine (ergosinine).
Ce "pic", soumis à une dessication, donne une masse brute de 8,5 g , constituée, suivant l'analyse chromatographique des
d des acides aminés hydrolysés , par 85% de bêta-ergocriptine
(isoleucine), 10% d'ergocornine( valine) et 5% d'ergocriptine
(leucine). En continuant l'élution de la colonne avec le chloroforme contenant 8% de méthanol, on obtient une masse brute de
2,5 g , constituée par la seule ergosine.
On dissout les 8,5 g de masse brute dans 100 ml de méthanol et les additionne de 7 g d'acide di-(p.toluyl)-tartrique.
En ajoutant 10 ml de H20 , avec agitation , on obtient la cristallisation de 2,1 g d'un mélange constitué principalement par le bêta-ergocriptine, mais contenant aussi l'ergocornine et toute l'ergocriptine présente dans la masse brute.
Les eaux-mères sont concentrées à un petit volume et alcalinisées, et les bases sont extraites au chloroforme. L'extrait chloroformique est concentré et chargé sur une colonne de 1,0 kg d'alumine dans le chloroforme et élue avec des quantités croissantes de méthanol de 0,1 à 0,2%. Il se produit d'abord une élution de petites quantités de bêta-ergocriptinine et d'ergocorninine, puis d'un "pic" de bêta-ergocriptinine, suivi d'une petite quantité dlergocornine, mélangée à de la bêta-ergocriptine.
Le "pic" de la bêta-ergocriptine concentré et déssèché donne 4,3 g de bêta-ergocriptine pure, laquelle donne, après hydrolyse acide, uniquement les acides aminés isoleucine et proline
en quantités équimoléculaires et, par hydrolyse alcaline, l'acide lisergique et diméthyl-pyruvique. Cristallisation dans le benzène en prismes rectangulaires à un point de fusion à 172[deg.]
c , avec décomposition.
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
<EMI ID=13.1>
<EMI ID=14.1>
Exemple 2.
On opère comme dans l'exemple 1, sauf qu'au lieu d'utiliser le milieu productif décrit dans l'exemple 1; on emploie le milieu ayant la composition suivante :
<EMI ID=15.1>
Eau distillée a 1000 ml
pH ajusté à 5,2 avec le NaOH.
Au bout de 14 jours de fermentation on obtient la production
de 900 mcg/ml d'alcaloïdes entiers consistant pour 70% en bêtaergocriptine.
Exemple 3.
Une micelle de la souche C.purpurea FI 7374 sur un milieu TS solide est mise en suspension dans 60 ml d'eau stérile, est homogénéisée à l'aide d'un mélangeur et est utilisée pour ense- mencer 6 1 de milieu productif décrit dans l'Exemple 1, contenu
<EMI ID=16.1>
<EMI ID=17.1>
jours à 24[deg.] C, avec un degré d'aération correspondant à un flux d'air de 4 1/min , avec une agitation correspondant à 300 tours par minute d'un agitateur muni de 6 pales.
Les cultures ainsi obtenues servent à ensemencer , dans une proportionne 10%, 6 1 de milieu nutritif ( comme celui décrit dans l'Exemple 2) préparé et stérilisé dans un autre vase de fermentation de 10 1. On procède à l'incubation à 24[deg.]C avec une aération correspondant à un flux d'air de 6 1/min avec une agitation de 380 tours/min par un agitateur à 6 pales.
Au bout de 12 jours d'incubation , la culture contient 950 mcg/- i ml d'un mélange d'alcaloïdes constitué pour 70% par de la bêtaergocriptine.. '