BE542827A - - Google Patents
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Description
<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention se rapporte à un antibiotique nouveau et utile, dénommé Thiactine,, et à sa production. Plus particulièrement., elle est relative à un procédé pour sa troduc- tion par fermentation,à des procédés pour son extraction età sa concentration à partir de solutions brutes contenant les bouillons de fermentation, la purification et la production de sels.
L'invention couvre l'antibiotique et ses sels en solution diluée, sous forme de concentras bruts et sous des formes plus purifiées, solides et cristallisées.
Au cours des dernières annéeson a isolé un prand nombre de produits du métabolisme de la croissance de bactéries t de fongus et on a trouvé nu'ils possèdent des propriétés
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thérapeutiques de valeur. Parmi ceux-ci on peut mentionner la pénicilline, la streptomycine, la gramididine, la tyrocidine, la bacitracine, la subtiline, la streptotricine, l'Auréomycine (chlorotétracycline), la Terramycine (oxytétracycline' et d'autres.
Certains se sont avères de valeur élevée par suite de leur efficacité contre des organismes pathogènes. D'autre se sont avérés d'utilité limitée, à cause par,exemple.,de leur toxicité. un but de la présente invention est de procurer un antibiotique nouveau, non toxique, d'utilité thérapeutique, par- ticulièrement dans les infections de mycobactéries et d'organismes à Gram-positif. Un autre but de la présente invention est de procurer des procédés de préparation de la substance antibiotique précitée, appropriés à l'application industrielle.
On a découvert maintenant,suivant la présente inven- tion, l'antibiotique Thiactine et un procédé de production de la Thiactine, dans lequel on cultive une souche de Streptomyces BL-678506 dans une solution aqueuse d'hydrates de carbone contenant l'azote nutritif dans des conditions aérobies submergées jusau'à ce nue cette solution présente une activité antibactérienne im- portante et on sépare ensuite la Thiactine ainsi prod.uite du bouillon de fermentation.
On a découvert en outre suivant la présente invention, une substance efficace pour l'inhibition de la croissance de bactéries à Gram-positif, choisie dans le groupe constitué par
EMI2.1
une substance ari-nliotère susceptible de former des sels avec- des acides et des m6taux, présentant les valeurs de spectre ft récrites ci-,i,orèc.3, et les sels d'acides et de métaux de cette substance.
L'antibioticue nouveau est préparé par culture dans dt? condit.101rs rÉoi6es particulière? d'un mierooTni3!M l'on ct(,1'1t iiimflu'à nrs r nt, aor P1 P provisoirement Si:rAnt .2:Y.Çe: i3L-6 ,- aul p été 3cJ¯ d'un échantillon de sol. La rlp.cT.'1T'ti('n d cet orY i rr^ f.'f- donnée nll1 loin. f.'oT'<'f::-111f"!"e RL-678506 sp nov. qnl Prnluît 1.8 '.Irt1Ct.',..r.
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appartient au genre couramment appelé Streptomyces. La croissance de cet organisme est bonne sur un agar de Bennett à 30 C. Sur ce milieu, il se forme des hyphes aériennes d'une couleur allant du blanc à l'aluminium et un pigment brun-vert est sécrété dans l'agar. Le mycélium est composé d'hyphes ramifiées, dont les éléments les plus jeunes sont à Gram-positif. Des conidies sont produites sur les hyphes aériennes.
Des prélèvements de Streptomyces BL-678506 se dévelop- pent bien à 28-30 C sur des milieux nutritifs, asparagine-dextro- se-agar, asparagine-glycérol-extrait de viande-agar, agar d'
Emerson, agar de Bennett, dextrose de pommes de terre-agar, tomates-farine d'avoine-agar, dextrine de Czapek et sucrose- liqueur de macération de maïs-agar. Le mycélium végétatif, croissant sur des supports d'agar, est hyalin sans aucune couleur distincte et avec ramification monopode. Un mycélium aérien blanc se développe le deuxième ou le troisième jour et' donne naissance à des sporophores formant des spirales (sur certains milieux) portant des conidies ovales allant de 0,6 à 0,8 micron de largeur et 0,7 et 1,3 micron de longueur.
A mesure que la sporulation continue, les hyphes aériennes avec conidies deviennent chair à gris clair sur certains supports d'agar, Il. se forme un pigment soluble, jaune à brun clair, sur certains milieux. Si on ajoute de l'eau à une culture de l'organisme, les spirales se séparent en leurs spores composants.
Les hydrates de carbone suivants sont d'utilisation aisée quand ils sont compris dans l'agar synthétique de Pridham et Gottlieb ne contenant pas d'autre source de carbone dextrine, inuline, amidon, glycérol, arabinose, rhamnose, xylose, glucose, lévulose, saccharose, raffinose, maltose, lactose, d-mannitol, d-sorbitol, cellobiose, dl'inositol, acétate de sodium, citrate ,Le sodiun, oxalate de sodium, tartrate de sodium, succinate de sodium et malate de calcium. Le dulcitol est une source pauvre on
<Desc/Clms Page number 4>
carbone, le salicilate de sodium ne supporte pas la croissance.
Une description plus détaillée de l'organisme sur un certain nombre de milieux communément utilises dans l'étude d'éléments du genre Streptomyces est donnée dans le tableau I.
Le type de croissance, la production .de pigment et d'autres . caractéristiques ont été notés . Ona ensemencé des milieux par traînées et toutes les cultures ont été incubées à 27-29 C pendant une période de 14 jours.
Le Streptomyces BL-678506 produit une réaction acide dans du lait de tournesol incub4 à 29-30 C, sans coagulation. ou peptonisation. On a fait des essais de réduction' de nitrate avec le bouillon de Czapek en utilisant le procédé de l'acide sulfanilique-alpha-naphtylamine. Il se produit du nitrite en quatre jours en culture agitée à 27-29 C. Le StreptomycesBL-678506 n'hmolyse pas le milieu sang-agar, mais produit un pigment noir.
Le traitement des cultures d'amino-agar par une solution d'iode de Lugol indique que l'organisme possède une faible action diastatiaue, donnant une zone de 2 mm d'hydrolyse en 14 jours.
La gélatine n'est pas liquéfiée.
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TABLEAU I
EMI5.1
caractéristiaues culturelles des StrentOMrce BLrg%]59J6
EMI5.2
Milieu Quantité de Mycélium aérien Pte;mC'1'1t l1;111fit'cmes:
EMI5.3
<tb> croissance <SEP> et <SEP> coloration <SEP> soluble
<tb> des <SEP> spores
<tb>
EMI5.4
Asparagine-deytrose- bonne blanc néant fihvers brun
EMI5.5
<tb> agar
<tb>
<tb> Asparagine-glycérol- <SEP> " <SEP> blanc <SEP> néant' <SEP> envers <SEP> violet
<tb> extrait <SEP> de <SEP> viande- <SEP> On <SEP> observe
<tb> agar <SEP> les <SEP> spirales.
<tb>
EMI5.6
Agar de Bennett " blanc à gris 1')1"1:111.
Envers brun
EMI5.7
<tb> Agar <SEP> nutritif <SEP> " <SEP> blanc <SEP> brun <SEP> Envers <SEP> brun
<tb> clair
<tb>
<tb> Agar <SEP> d'Emerson <SEP> " <SEP> blanc <SEP> brun <SEP> Envers <SEP> brun
<tb> rouge
<tb> Agar <SEP> de <SEP> Czapek <SEP> " <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> néant <SEP> Envers <SEP> jaune
<tb> légèrement <SEP> blanc <SEP> pale.
<tb>
EMI5.8
Apar de Czapek modérée blanc . jaune Envers ,jrime
EMI5.9
<tb> avec <SEP> dextrine <SEP> Le <SEP> mycéium
<tb>
<tb> aérien <SEP> sedé-
<tb>
<tb> tache <SEP> révélant
<tb>
EMI5.10
une craJss:1nce
EMI5.11
<tb> , <SEP> hyaline <SEP> sur
<tb>
<tb>
<tb> support, <SEP> en
<tb>
<tb>
<tb> forme <SEP> d'an-
<tb>
EMI5.12
nenuy.0n,n'
EMI5.13
<tb> observe <SEP> pas
<tb>
<tb> . <SEP> de <SEP> spirales.
<tb>
EMI5.14
Malate de cal- pauvre Mycélium aérien nant envers inco- ci1n-agar légèrement blanc 101'0 j
EMI5.15
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> Ma- <SEP> modérée <SEP> blanc <SEP> avec <SEP> cen- <SEP> brun <SEP> Envers <SEP> brun
<tb>
EMI5.16
cération de tre plus paie clair clp1r' 1'l n', mafs-aqar observe pas
EMI5.17
<tb> . <SEP> de <SEP> spirales.
<tb>
Tomates- <SEP> bonne <SEP> blanc <SEP> à <SEP> brun <SEP> envers <SEP> brun
<tb>
EMI5.18
farine d'avoi- chair rourrE' ,1 Un'è tre.0n nc-aear pale observe des 3r).trales.
Tampon de pom- bonne zris Coinnips mas de terre hT'\'T1 roupa deV'rnant slav
EMI5.19
<tb> tand <SEP> brun
<tb>
EMI5.20
1"'j s ave; 'Y'V Ál i U'1. n'"t"1'en.
---<----------,-- ,
EMI5.21
Les descriptions des couleurs ci-dessiis provirner¯t ri "D1ct1onary of Color", de Maerz & Paul, première nrlition.
<Desc/Clms Page number 6>
Il est clair que pour la production de Thiactine on ne désire pas se limiter à ces organismes particuliers ou à des organismes narticuliers répondant pleinement à la description donnée ci-dessus, faite uniquement aux fins d'illustration. On
EMI6.1
désire u2..rticulièrement inclure l'utilisation d'organisées oui sont susceptibles d'être produits par mutation à nartir de l'organisme décrit par des agents de mutation tels aue les rayons X, les rayons ultra-viol et, les gaz azotés, etc..
L'antibiotique Thiactine s'est avéré être actif in vitro contre un grand nombre de mycob actéries et de bactéries à Gram- positif.-Le tableau suivant indique l'activité antibiotique de la Thiactine (lot 3-7) quand elle est placée dans une tranchée découpée dans une plaque d'agar-infusion de coeur (pH 7,0) :
SPECTRE DE PLAQUE DE LA THIACTINE (5 mg/cm3)
EMI6.2
Organisme Zone d'inhibition en mm
EMI6.3
<tb> Thiactine
<tb> (5mg/cm3
<tb>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> 11
<tb>
EMI6.4
E. ty-ohosa Ni
EMI6.5
<tb> E. <SEP> coli <SEP> N1
<tb>
EMI6.6
S p ar atvphi B Ni K. pneumoniae N1 Ps. aeru7inosa Ni" S.
Fallinarun N1
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<tb> B. <SEP> anthracis <SEP> 13
<tb> S. <SEP> schottmulleri <SEP> N1
<tb>
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> 9 <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb> B. <SEP> vycoides <SEP> 0 <SEP> 9
<tb>
NL signifie "pas d'inhibition".
L'essai de suectre est réalise cornue suit : On place dans un vase
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de Ptrj stérile d'un diamètre de 3I pouces (88,9 mom) apnroxima- tivPPient 30 c3 d'un bouillon d'infusion de coeur (Difco a avec 2. d7pe,-r comme aent de solidification et on laisse durcir.On creuse ensuite une tranchée de 8 mm 7- 40 nu- dans 1-Iqeypr avec une snatule stérile. Le fond de la tranchée est scella nar une goutte ou deux Pa1'ar t'M,du. On fait une trarnée avec un bouillon de culture 111tri t i. f de 4 heures de chaque bactérie d'essai, prpalahl pment
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3'.rc??t;e ' 37 C, à l'aide d'une petite si-se, du t r 9 de la tranchez jusqu'à la paroi du vase dePtri. La tranchée est ens',iit<a r610 par une solution de 5 rnr:/cm.3 de l'antibiotioue. On 18jsp 8nsuii:A le vpse ?t 37 C ndnt 18 24. heures.
Des mesures li1 6:;d r(" de la zo-7e d'ir:hibit1on sont faites 'n bord de la t?wncrc .i'Jsnl1'al; point 0'''. la croissance <1 'orP'8'11i 1)'Ie dressais s annarii t. Le lot r 8
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inhibe la croissance des .tuberculosis H37Rv dans le milieu
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Dubos, a 0 , 0± -0,014 1!]rT / cm3.
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Le tableau ci-dessous résume les essais d'activité
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ant1bact.fr1enne in vitro effectuas avec la 'l'hiactine cristallisée.
L'essai utlli14 s'effectue par le procédé de dilution en tubes et on è!4t8?'!r!.ne les concentrations minima d'antibiotique inhibant C0'1]TJ1:tJ11ent la croissance des bactéries en 24 heures. On utilise un bouillon d'infusion de coeur comme milieu nour tous les OT.'17P- nismep soumis à l'essai, sauf si on le précise expressément.
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Organisme Concentration minimum d'inhihitim ----- ¯.' ¯ .¯ rn c. Il7.l ....,......¯.....
Micrococcus nyogenes var. aureus jt025 M"1 erococcus aureus var. Dyopenes 52-79 (rEsi stant à la pénicilline) ,0,25 Mipropoccnp AUre')", var. nyomenes 72.-75 (r±sl =tant 1 la ppnicilline) 0,25 ::ntoroCOC('l1S McDonol1r.th 0,125 l'tel"000CCU MrDonouh (i,/r± stant à la n4niiilline) 0,?5 Ca'"7iyia tetrapena 0,025 trFtocrvs pyorPnAR C203" 0, 5 Sfr<.antnrt-i r-iis nVOrrf'lT1E?S C203' (aes.st.an;
à la ma;nimvcine et l "r;rthroTnvci.11 A 0,008 t r'(n h:>0('(''1 p",,!.'> 1 p cti a e 7077 0,003 Strentococcus drsealactiae 9926 0,002 011uior-IP<;ii? nne7mto11 e= 0,002 Ll-1doh.?eil1u ac-tdophilup f.f.4356 0,003 rH:tohfleil1uR cas 1. =fiJ+6/6':Ji,* 0,025 L?dohaci11us lejch:!!1annii..'3;' 0,006 Bnr111us nfihrrcis 0,05 rc'ïl7.t ('::'1"Ç>"q var. 1T:,r('o-ïèAS y D,l llaeil111s !:"11htiljs 0,01 t'à'r1""r,.,.n1rviT':i,i=n i,prn <3 0,003 CJ.()strftll!'1 welc11i.i 60l:r:v 0,02 Cl n t ri d'f 1111'1 P::> 1 l,'q 9- 0,06 CIO1tl'i.iu!l1 sp1rommnPn 81,Y#* 0,03 Cl(')tT'i(Jf'1rr, <:,nn,..r'''''(.1'l 4() 0,007 fin l1"'rm 1,:,11;"\ t-vnhnpp *>10 1,v,n'$h;a 01j 10 'a istl1 ,"<l'lt1 1 '>10 r'> la<=>1 d<rre1-.tprine f'lpjt yrt'.p'r >10 Klt>h""1"'ll" rr!I1fJ"Jf',jqe >10 Pl"')1f!p!" ifl"((1"a-r, >10 Pqf1)rt""'I(WJ" ruf*iro33 ':;..10 tjmit<;r>pia r. 10 f"l,rnry.r.>'11 r> 1- > + , r 1= h 1 ;
....10 GJ1r,,!l(lr :>H'1'H'1"" 6/"")
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n Essai dans un bouillon de sérum a 1 y? Essai dans un bouillon de jus de tomate 3HB! Essai dans un bouillon de thioslycollate.
Ce qui suit est le procédé dressai sur plaaue de diffu- sion pour la détermination de l'activité. de la Thiactine.
Milieu de Culture:
L'agar d'essai pour Streptomycine (avec extrait de levure) est fourni par les Baltimore Biological Laboratories, Baltimore, Maryland, et utilisé comme indiqué sur l'étiquette.
Une préparation appropriée peut être obtenue en mettant en
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suspension dans un litre d'eau distill'e à un pH final de 6,2, un mélange de 15 g: d'extrait de boeuf, 3 g d'extrait de levure, 6,0 g de peptone (par exemple Gelysate) et 15 g d'agar. On laisse reposer la suspension pendant 5 minutes, on la mélange jusqu'à ce qu'on obtienne une suspension uniforme et on chauffe modéré- ment en agitant. On fait bouillir la suspension pendant une ou deux minutes ou jusqu'à ce qu'elle se dissolve. Le milieu de cul- ture est alors introduit et stérilisé à 121 C. (15 livres/pouce
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carré (1 kg/cm2) environ de pression de vapeur, manomètre, pen- dant 15 minutes).
Inoculum:
L'organisme d'essai est le Bacillus subtilis A.T.C.C.
6633.On ajoute une suspension de spores contenant 50.000.000
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spores viables par cm3à"L'agard'essaifondn(refroidi à 53CJ.C) pour obtenir un inoculum final de 2%.
Préparation des plaques:
On place 21 cm3 d'agar stérile pour essais dans des vases de Pétri stériles remnlis à ras et on laisse se solidifier.
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On répartit alors régulièrement 4 cm3 d'ap-ar inoculé sur la sur- face de la couche de base. On place des nlaaues d'acier i.no9vdahlP percées d'une série de trous sur le milieu a-orès que celui-ci sa soit refroidl à la tet1Jnprature ordinaire et on '!)lace les pc11'm- ti7los dQl1F 1 trous.
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Tampon:
On utilise un tampon au citrate au pH 6,2 pour pré- oarer les dilutions. On le prépare en mélangeant 192,12 g d'acide citrique anhydre avec 106,3 g d'hydroxyde de sodium dans un litre d'eau distillée et on dilue le mélange à'- la concentration
1/10 nar de l'eau distillée. Le pH du tampon doit être vérifié potentiométriquement et si nécessaire, ramené au pH 6,2 par addition d'acide citrique ou d'hydroxyde de sodium. Les variations du pH ou de la concentration du tampon affectant fortement les grandeurs des zones d'inhibition. On n'a pas trouve nécessaire de stériliser' le 'tampon. La solution mère est conservée par du chloroforme ou du toluène et des nouvelles solutions de travail sont préparées journellement.
Essai:
Les échantillons inconnus sont dilués en cas de besoin dans le tampon a.u citrate au pH 6,2. On utilise 3 trous de chaaue plaque pour recevoir une même dilution de l'échantillon. Après incubation à 32 C, on mesure les diamètres des zones et on fait la moyenne entre ces diamètres.
La. présente invention comprend un procède de culture d'une espèce de microorganismes nouveaux, inconnus jusqu'ici,
Streptomyces BI,-678506 à 24-30 C environ dans des conditions submergées d'agitation et d'aération et sur de'3 milieux contenant Lme source de carbone, une source d'azote, une source de suhstan- ces de développement, des sels minéraux comme le chlorure de sodium, le nhosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le nitrate de sodium et, si on le désire, un agent tampon comme le carbonate de calcium.
Comme source de carbone dans le milieu nutritif, on peut utiliser un des composés suivants :
Amidon ordinaire Xvlose
Amidon soluble Arabinose
Saccharose Rha@nose
Glucose Fructose
Maltose Lactose
Dextrose Inuline Glycrol Dextrines
Galactose
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C'h '.,u;rces de carbone sont introduites dans le milieu à l'état sur ou'sous la forme de nroduits concentrés. La quantité de ces
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sources de carbone pour une préparation antibiotique opti ti.1l, , â.H considérablement avec le milieu, de à 5e en poids du poids total du milieu de fermentation.
Des sources d'azote appropriées, comprenant certaine
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source: de substances de développement Dour le procédé de l= eroeien- tation sont très nombreuses et on -oeut citer entre autres : les amino-acides la caséine, hydrolysée ou non hydrolysée la farine de poisson la farine de soya les extraits de viande le tourteau de foie l'urée les nitrates lescomposes d'ammonium les bouillies de grains pour la distillation la liqueur de macération du mais la ]Joueur de macération du froment le netit lait ou les concentrés de petit lait le gluten de mais hydrolyse à'l'acide le gluten de froment hydrolyse à l'acide la peptone les abats la levure de brasserie la farine de graines de coton la lactalbumine la tryptone.
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-'.es tngrê4ients prot4iaues ne doivent pas être appliqués à un haut. de 1-4, le pureté; les matières moins pures qui contiennent des reeeo-s do racleurs de développement et des 'quantités considérables d'agents nutritifs Dêùvent convenir. Il n'est évidemment pas nos- sinle à cause de la nature brute de la plupart de ces substances
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-Me't:ée5 dia. spécifier des proportions définies de la matière à sajou- ter. Un? <iiaGtit d'environ 031! 5,0?f en noids sur base Rolid"3 crrr :i la utile de substances azot1es n. ajolité-r au ni :.t d;iY' 1:1 la sl!xart 3es cas.
Le -ni-1 de fermentation doit être environ de 6,0 6,2 pu début de 1.a 'ernnt:ziiczn. La température 'r'1'-<f'.r'!; DOUX' Ir f'r.rrr(I(:rn- ta ri <2t'\ <si> '!r1 \r1 t":m "16 q 2"C. Le re:11,"Vlo.rt .. Ayj::!1:1; .-')11 I1T'O,lU i t: (qt 1C :'';r'Lt; <,?=,t,j3J.;ii .3n ?-5 jours suivant 1. ""rl)C'.!\1' '1"! ^j7' l i7T' nu "E-' liC 5.
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La Thiactine est active in vcvo aussi bleu aiie 1-l yit.!:: et exerce une activité chiilliothérapeutique naraUt<8 sur le* infections expérimentales chez les souris. Les rsultts d'3 cet essai et les déterminations de toxicité sont d()tl'l'S dans 1\:
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tableau suivant.
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DC50 pour 11 de la Thiactine donnée à des souris car les vies
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suivantes
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0 ra, ani sn e I. P. ,1'' Orale D. pneumoniae 0,0004 mg/kg. 5 mg kg 6 J'l; Strip. hemolyticus 0,13 11 30
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<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 1000 <SEP> "
<tb>
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L'antibiotique présente la marne D050 intramusculaire quand il est administré 18 heures avant ou 6 heures après une infection par
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D.pneumoniae.
On n'observe pas de tdxicité lorsau'on'administre l'antibiotique à des souris à une dose de 1000 mf/kg par voie intrcuausculaire et 2000 mg/.kf? par voie intrôp8ritonéale. La DC50 (dose curative 50) est la dQ,se minimum de Thiactine qui xuôrira 50 d'un groupe de souris qui ont reçu nar voie intrapt±ri,toa4ale de 100 à 1.000 doses flL50 d'un organisme,, par exemple le DiP1-ococcu8 pneumoniae chaque dose DL 50 étant suffisante lorsau' elle est administrée seule, pour tuer 50f d'un groupe de souris.
:' Ln'ection est créée.. en une fois au moment de leinjection du médicament d'essai en suspension aqueuse (0,40/'. de carhoymt'h,yl- cellulose) (CMC). On observe les animaux pondant 4 jours et les dpcÀs de chaque groupe sont exPrQ1s en .' de la totalité des ani- maux nar srouae. La proportion de.rortalité est transformée en valeurs de nrobit et celles-ci sont Dort6es sur un l!t'ap11ioue et COrllD8 r eg pu lopprithme de la dose en ne nar k de poids de ol1ri s.
Le nojnt d'interpection de la ligne de rrobit 5 et de la meilleure liErne construite 'n 1-1,qide des points eynlri.:ne{lt8u;r cnrresnonc la concentrtInn u médicament nui -orot' je le moitié dep an'ïfnai')- dans les conditin11S de l'expprience. L'?nt.nOP'Rrithr1A do ce t='r.n est ;mnl J a. VF-!l"!!l1" DC50.
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Pour d4tern'iner la toxicité chroniaue de la Th3actine chez les souris., deuy frounes de souris ;mâles ont 't4 pess j our!1ell'!1'=!lt et ont reçu des injections intran6ri ton:Ües d'une suspension à 2 de cette mptiere (lot 4-) dans 0, 5 de 1 Cpc à des doses de 50 et -75 mg/kg. Un "troisième groupe a reçu un volume de 0,5fi de !?'el C.N. C.' égal à celui de la dose plus 'leve, agissant ainsi comme témoin.
L'étude est terminée au bout de 4 semaines. Au cours de cette période, on n'observe pas de mortalité dans les groupes témoins ou les groupes à 50 mg/kg. Celles du groune à 75 mg/kg commencent à mourir après sept injections, et toutes, sauf 2
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meurent après la toeizième'injection. Oh $EXEMPLE I
Dans la préparation de la Thiactine à l'échelle de labo- ratoire,la fermentation est menée dans des bouteilles agitées, ouvertes à l'air, ma.is protégées de la contamination par des
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couvercles d'ouate ou de gaze.
Le St-re-ptoinycps BL-,678506 est cultiva dans un milieu nutritif aplroptié, par le procédé de culture submergée, une agitation et une aération de la. culture étant effectuées en plaçant les bouteilles dans un agitateur du type à va-et-vient qui assure la pulvérisation, la projection ou l'agitation de la bouillie, dans une atmosphère contenant de l'oxygène. Dans un cas typique, 500 cm3 d'un ¯milieu de culture composé de
1% maltose
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1, 5 KH2POi 0,5f Ü#J 2HPOl.
0,5fi Nscî Hpo, 0,0000033%' ôfnc12 . . H20 0,0000033 Caso4 5 H20 O.,0050,r zr,90 7 H20 o,5fl TI'3'1t-6ne z extrait de boeuf sont introduits (1:1115 des flacons de 4 litres et stérilisas.
Anrbs nassafe en autoclave', on inocule Pli milieu environ 1' Pr.
'ml 'P1 C'UTt'..SLtt7a:'!ion aaueuse troubla t1 spores dm i1'T'?p'i0'iVCaç
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provenant d'une souche d'aar. Le pH est de 6,0-6,2 au début de la fermentation. Le contenu du flacon est incubé ensuite à
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26-2sac pendant l,.S heures, avec une agitation comportant 130 Mouvements par ninute d'une ampleur de 1 1/4 pouce (29 mm). A la fin de la période d'incubation, la liqueur de fermentation, à l'essai par le procédé indique ci-dessus, donne des zones d'inhibition d'environ 17,7 mm lorsque le bouillon est dilué 3 fois. Ce bouillon contient'de la Thiactine, qu'on peut isoler comme décrit ci-dessous.
EXEMPLE II.
Pour une production de Thiactine à échelle plus grande, on prépare un inoculum dans un milieu de fermentation contenant, en poids,
1% maltose
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1 5%7 KH2PO± 0,5% peptone 0,5% extrait de boeuf
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Q,55t (NH HP04 0,% . NaCI q,ooopo33% MnC12 . 5 H20 0,0000033% CUSOI.- 5 H20 a, 00 5 Znso, . 7 H20 on l'étend à un volume de 2500 cm3 et on l'introduit dans un flacon de 2 1/2 gallons (101). Le milieu'est stérilise par de la
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vapeur.à l18-1?0 C pendant une heure. Lorsqu'il est froid, on inocule au milieu environ 0,5% en volume, d'une suspension aqueuse trouble de spores du Streptomyces provenant d'une souche d'aar.
Le contenu du flacon est ensuite incubé à 26-28 C pendant 72 heures dans un agitateur du type à va-et-vient et on souffle de l'air st4rile à la surface du liquide. Du flacon d'inooulum, on déverse
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le bouillon contenant le Streptomvces SPI dans la cuve de fermen- tation dans des conditions d'asepsie parfaite. Si on.le désire, on peut traiter le liquide comme décrit ci-dessus, et on peut isoler la Thlactine.
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Effl4PLE I I I . L'antibiotique produit par le CtrpntomycPJl BrJ-67506, la Thiactine peut être prépara sur une grande échelle, par
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culture submergée ou profonde. Des cuves de fermentation rires pourvues d'agitation et d'aération appropriées se sont avérées utiles à cet effet. Un milieu nutritif constitue de
1% maltose
0,5% netone
0,5% extrait de boeuf 1,5% KH2PO4 0,5% (NH4)2HPO4
0,5% NaCl 0,0000033 MnCl2 . 4 H20 0,0000033% CuSO4. 5 H20 0,005% ZnSO4 7 H20 Eau q.s. (5600 1.) est convenable.
Ce milieu peut être préparé dans un récipient de fermentation doublé de verre de 2000 gallons (7560 1.) équipé d'une chemise à circulation d'eau pour le réglage de la tempéra- ture, d'un agitateur en acier inoxydable approprié et d'un dispo- sitif arroseur approprié pour l'aération. Le milieu est stérilisé par chauffage à la vapeur sous pression et puis refroidi. Apres la stérilisation, la concentration en ions hydrogène du milieu doit correspondre approximativement au pH 6,2. On inocule au milieu nutritif 15% en volume d'une culture végétative cultivée soit dans un appareil de fermentation semblable, auquel on a préalablement inoculé soit un inoculum. décrit plus haut, soit un inoculum préparé au laboratoire.
La culture dans le récipient de fermentation de 2000 gallons est incubée à une température de 83 F (28 C) pendant trois ou quatre jours. Durant l'incubation, l'agitateur tourne à une vitesse de 90 tours/minute, et on intro- duit dans le milieu de l'air stérile par l'arroseur à raison de 100 nieds cubes/minutes (2,8 m3). A la fin de la période d'incu- bation, le liouide de culture contient normalement suffisamment d'activité antibiotique pour donner dans l'essai contre les or- garismes une zone d'inhibition d'environ 17 mm de diamètre, avec un bouillon dilué 4 fois par le urocessus d'essai décrit ci- dessus. La Thactine est isolée comme décrit plus loin.
EXEMPLE I V.
Un liouide de fermentation contprpnt la Thiactine est prépara suivant le procédé de l'evemple I, en utilisant
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le milieu de culture suivant : le(. de gluten de froment
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1 da 7.vcérol 0,5% de NaC1 0,05% de matières solubles de distillation 0,1% de CaC03
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EX'-'IFL E V.
Un liouide de fermentation contenant 1a 'l'ri;:ct5ne ept 1rEvaré suivant le nrocédé de l'exemple 1, en utilisant 1.P miï.i7: de culture suivant :
1% de farine de graines de coton
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1q" de clucose o,05if dp matières solubles de distillation O,5o.S de NeCl 0 , lqt d e CaC03 û'Xil1P.L LJ VJ.
Un liquide de fermentation contenant la Thiactine est
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préparé suivant le nroc±d6 de l'exemple I. en utilisant le milieu de culture suivant :
1% de liqueur de macération du maïs
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1 de dérëlose 0,5% d e NaCl
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0, lf' de Cacha 3
EXEMPLE VII.
Un liquide de fermentation contenant la Thiactine est
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prtparé suivant le proc4clé de 1-lexemnle I. en uti11sélTlt le milieu de culture suivant :
1% de farine de sova
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1"' de aré7.nre 0, de N?Cl OY05" d'evtrajt de levure 0,1% de CaCO
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EXIPLE VIII.
Un liquide de fermentation contenant la Thiactine est Pl'l"f!1" suivant le- mroc4dô de lit en utilisant le milieu de culture suivant :
3% de farine de soya
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05 1'?idon de aT'p! 0,.' N.S--a-ine¯3 (nt'oèht.i.t de la digestion 8nzYP1:=!t:i n'"'! ch f -le Nain03 la a ca s ,<;,mel fi>, 5' "\ C?C03 EXEMPLE IX.
L 1.i"i',im de 'fermentation rontn^# ni- 1s Thipftire o- "r" PP' nttjz,j- le proc6d6 de l'eyeYrlple I, an llt.ï1 ff',\')t
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1 =iilieu de culture suivant : 1 de H-Z-amine B
1% de cérélose
0,5% d'extrait de levure 0, 5 de NaCl
0,1% de CaC03
EXEMPLE IX-A.
Le liquide de fermentation contenant la Thiactine est préparé suivant le procédé de l'exemple I, en utilisant le milieu de culture suivant :
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EXEMPLES DE MILIEUX DE FERMENTATION liN FLACONS AGITES POUR STREPTOMYCES BL-6t506.
Hydrates de carbone 1%
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Liaueur de macération du mal's 1'' -NaCl 0, 5 (NH1J 2HPO 4 b, 5tf.
KH 0 1,5 Ku 12. 4ho 0,0000033t Ci.iSO4: 5H20 OYOOOO033ce ZnSO. pH 7HZ0 initi al 6 , 0-6 2 0.,005cf Après 96 heures d'agitation et d'aération dans des conditions
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aseptiaues, on obtient ce qui suit :
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<tb> Hydrates <SEP> de <SEP> carbone <SEP> Puissance <SEP> pH <SEP> final
<tb>
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¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯" mcs/CM3¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
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<tb> maltose <SEP> 83 <SEP> 5,6
<tb> saccharose <SEP> 48 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP>
<tb> dextrose <SEP> 32 <SEP> 5,5
<tb> lycérol <SEP> 18 <SEP> 5,2
<tb> lactose <SEP> 37 <SEP> 5,6
<tb>
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O-p.a1a8tose 55 5, 5 Argo-pol v,.qaccharide 144 5, 9 dextri-maltose. 73 5,8 EXEMPLE IX-B
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Argo-Dolvsaccl1aride 3 Liaueur de macération dumars 3% Levure de brasserie 1%
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K2HP04 0.7 X S 4 .
7H2 0.?.< NaCl 0,5% pH initial 6,0 - 6,2
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Puissance anr%s 96 heures - 253 mcy/cm3 pH fin>1 7,6 SXfI4PLE IX-C Ai'f1-ii7¯T;'aCiz'!'1c'.r3de z r.i!1Ul1r dm ,r acôrat3 0n du mais 3<1 1,m :,i p (! brasserie 0²75r.tt: F04.7H20 0,7 ;irt, 7z3 0,7 Ti n S''L 0,5'l CrC03 ,6??" Puissance au bout de 120 hur3 - '1/+1 '1lcr/rma nsl 9inal 7,5
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±]4 ¯PL 1 I D.
v3 ¯-- : ;' '1." c-ron 3jl, Lî;<i>,>ii 'HF'ris-i''"! ü ''si? 3" -le brassene oe 75 "1 ,ip3, 0 , 7<' '.>'r:0! . 7LCi 0 nef iI <; 1 1 0 -H initial 7 0-'? 2
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ii iv ,i r ? (- <i <1 e carbone P u 1 s s a P r e (mc' / ("' 3 1,r{ fins aré 96 "1 ?ure s ---. .¯¯.--..¯..... -.-. '..--.. à r .i <> -1., ol pr .; a c cJi arî <] e 340 72 ,le "'aIs" soluhie bzz bzz
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XEJ:!P1E IX-E.
Ar<?o-nolysacchaTide 3 Source d'azote le K2HP047H os Hf'S04.7H20 0 y 20f NaCI 0' 5, % pH iritinl 60 - 6,2
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nn-uroe d'azote Puissance (mc/crT3' pH fh' '11 ---'----"'-"'--------'---------' 2Drès 96 heures¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯ Proto-nentone de Wilson n 366 76 5,7 St8.-mino type A 22 5,9 Farine dp sang 17 6,0 l'ro.t,4in<* de Drackett n 220.. 56 6,2
EMI17.5
Après fermentation complète, on sépare la 'l'hiactine du bouillon, par exemple en filtrant pour éliminer le n'Yclil1J11, 19n nritant le bouillon avec du butanol, du chloroforme ou de la ln '::t'MY1-l so'hutYl-etone, en séparant la couche de solvant contenant la 'l'hJactàne, en-la .concentrant en un volume f'ail"1le par (Hr,tllll3- tion, et puis n la 1r'langeant à un hydrocarbure inférieurs nar 8.n't'1D1e le Skel1ypolvp. C ou en la lyophilisant pour rc:i:.er 1,i 'l'1i,1ctine oljd.. sous forme .de la hase.
La Th3arvtine soljd8 a5f,,r,i nroeziite Deut ê'tre encore ourifi'e nar absorption s narti.r c'l'1.",)o 01 ntion sur -un éldsor'h(1nt r:'I1r0'118toPT'anhiIJUA (nar er('1'r1ple ") '-l"1"'1i;>", une :-'1'ice comme le 4'101" sil) fuivi de lavage (par ':>;-''';''D1';, aç,-,1 11'Rct0:1P ou su î'''7r0'Or",n ""(}111' en'!<v?r len t'"n11r't/;''' et d'n1.11ti0n (par eve'rr'l'? 0r::r 1," 'r"'...t ,-'"?'(7Z dn'". e r:1-lnT'()- f'UÎ "'1 Tir; '.'1,ipct'!"" '"'1P''lf'i;':e dan3 l'lpf "'st ,"/-r1:rIA Tl;1I' '-'r1'"i . ¯ 1:-t.ï¯orl, "",i'éCipfta.tj'Î'1, IvoDhilifé1tio'"!, ou +r<>,<.;4/ i'JIi"1 8ve.
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On peut préparer divers sels de la Thiactine, très simplement, en ajoutart l'acide désiré, minéral ou oraniaue, à l'antibiotique dans l'eau jusau'à ce qu'il se forme une solution claire. Les sels solides peuvent être préparés en réglant le pH d'une telle solution d'un sel de Thiactine à une valeur juste au-dessous de la valeur à laauelle l'antibiotiaue commencerait à se séparer. La solution peut être alors séchée, par exemple en soumettant la solution congelée au vide. Les sels d'acides de la Thiactine sont obtenus par évaporation d'une solution du sel dans l'eau à un pH peu élevé. Les acides minéraux au'on peut utiliser sont les acides chlorhydrique, phosphorique et sulfurique.
Les acides organiques qu'on peut utiliser sont les acides citrique, tartrique, gluconique, etc... Puisque la Thiactine est amphotère, on peut préparer. avec l'antibiotique, des. sels de divers éléments métalliques, en particulier, les sels des métaux alcalins de la.
Thiactine sont préparés en traitant une suspension aqueuse de l'antibiotique par un hydroxyde alcàlin. Les sels métalliques so- lides de la Thiactine sont obtenus par évaporation sous vide d'une solution aqueuse de l'antibiotique au pH approprié.
EXEMPLE X.
Le bouillon de fermentation contenant la Thiactine est préparé suivant le procédé décrit plus haut. Le bouillon (110 gallons ou 415 1.) est récolté au pH 5,8, filtré et extrait par 26 gallons (96 1.) de méthyl-isobutyl-cétone, qui est séparée et concentrée par distillation sous vide au-dessous de 95 F (35 C) à un volume de 200 cm3. On introduit en agitant du Skellysolve B (21) dans le concentré. Après un séjour ,jusqu'.au lendemain dans le froid, la Thiactine solide (3,02 g) précipite et est séparée par filtration; un échantillon à 1 mg/cm3 a une activité de 18,2 mm à 4X et de 16,2 à 16X surB. subtilis au pH 6,2 et reçoit l'étiquette, lot 3-4.
On dissout cette Thiactine solide (1 g) dans du chloro- forme, on filtre et la solution (40 cm30 est adsorbée sur une
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c"lo!1'j.] ('l1rù)'1toCTraphinue d'alumine (150 F.1). Anrs avoir Gc.;ï¯ li 310 e",' v' lnat, la colonne est dévelonp4e nar du cbl r sr râe c<1 1-'n;"J1t ?,5r de m4thanol. Deux bandes sparces sont cé,r?.ano"F:: dans C3 ''1lanp'e solvant. La première bande est l'PIlwil1it" ,1.si-s l'1'1rt-: suivant de 190 cm:3 (A). L'éluat suivant de 70 em3 est rejets et on reClell-':,I la seconde bande dans l'éluat suivant (;Je 50 cm3
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(B).
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L'éluat A est déplace n?r 3 cm3 d'alcool "1-tylir'v9 tertiaire (distilla sous vide avec addition d'alcool t-butylique JUSQu'à ce ou-il ne reste d'autre solvant que l'alcool f.-l.,ut,vliauei, le concentra est lyophilisé et on obtiert la Tblectirie solide (20 mg), donnant à l'essai 14,1 mm â l6Xâ 4 de IDP./CTy3 sar R. suhtili
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au pH 6,2 (lot 3-5).
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L'éluat B est déplace par 6 cm3 d'alcool t-butyli0ue
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et, par l'addition de 60 cm3 de Skellysolve B, la Thiactine
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solide (110 mag) précinite et est recueillie par filtration et donne â, l'essai 15,1 mm à 16 X à 1 mg/cTfi3 sur B. subtiles à un nH 6?
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(lot 3-6).
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On agite de la Thiactine solide (1,3 g, lot i-4} dans du chloroforme (50 cm3', on enlève un résidu insoluble de 210 mer
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par filtration et on fait passer le filtrat par une colonne de
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120 ? d'alumine. On d8veloppe la colonne ppr du chlorofoim<1z (3?0 cm et puis par du méthanol à 1,5C1! dans le chloroforme (300 rm3l et puis par du mpthémo1 'P. 2,5 dans le chloroforme (100 cm3)'. Fi¯nr' rent la colonne est plu$.e nar du z4thanol à 5 dans le chlorc.facn:; une bande rougeâtre est développée et on recueille 200 cm3 1'1,A; jaune jUSI1U'l?U moment 0", cette bande commence à quitter la gJ1.>'>Tin>;.
On combine l'lut su3vant de 85 cm3 avec 155 cm3 d'rflat n11i:(Jt11!1 par dwe3arnAnant par r1n m6th:=>nol à 25 dans le chloroforme;- ter 1.1 ut!' combinas sont é4nlac's nar de l'alcool t-'hut.yl1 ('1ue. I:: ^1 0-. t1(lr de l'alcoel t-nuty11cue est alors lyonhilisfp et donne (1,<:> 1v Tr'ict1np' f'nl ir1, 230 nr;, recevant 1'ticu:fii f, lot 3-7 pt ;'<,,iri>'= "'0,? 111111 '7 l,"' riir 1J.r,l;}tilis au pH 6,2 à 1 7rg/c". Ce- dpT!&T#5 <tdSfJI'nf,1 or t é,llli:1on enlèvent la matière 1naeti Vf: ('(11ol"ée..
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La Thiactine produite suivant les proc0dés ci-dessus est identifiée avec certitude, même lorsap'elle est contaminée par des produits chimiaues organiques semblables, par son "spectre" d'activité (c'est-à-dire le dgré de migration ou les valeurs Rf) en utilisant une série de solvants dans le brocédé connu sous le non de chromatographie sur bande de papier. Cette technique est un procédé relativement nouveàu, mais déjà bien connu., pour l'identification de composés organiques; cornue les maxima dans l'infra-rouge, les valeurs Rf dans une série de systèmes solvants sont une caractéristique unique et reproductible d'un produit chimique donné et constituent en quelque sorte ses "empreintes digitales".
Le procédé utilisé est le suivant. Des bandes de papier filtre exempt de cendres, dense et à grande capacité'de rétention, (par exemple le 589 Blue Ribbon Special de Carl Schliecher & Schuell CO.Keene N.H.)' de 2 pouce (13 mm) de largeur et 58 cm de longueur, sont suspendues à la température ambiante constante dans une région protégée (par exemple dans un grand bocal) au bord d'une cuvette.
La partie supérieure de la bande est en contact avec une certaine quantité d'un système solvant particulier (égale- ment anpelé phase de développement) dans la cuvette ; chacune des bandeÇ est suspendue à une cuvette différente contenant un @@lvant différent d'une série de solvants utilisés pour l'essai;- @@ partie inférieure de chaque bande pend librement et n'atteint @@@ la quantité de système solvant (ou ses ingrédients volatils) placésen dessous de la bande suspendue pour faciliter la satura- tion de l'air par le solvant choisi.
Le produit examina (dans un bouillon de fermentation ou comme solide isolé) est nlacf. à an endroit maroué à la -partie supérieure de la -partie de bande qui pend librement dans l'air.
Pans le cas d'une matière solide on la dissout dans un solvant utile quelconque. Les quantités utilisées sont celles qui donnent une none de dimensions appropriées'lors de l'essai final et ces quantités neuvent être déterminées par un essai simple. Par
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Txeznle, une quantité utile est de 5 mljsrolitres (0,Q0b cro3) d'une solution contenant 1-.0 mucm. de Thiactine dans un s01v pour l'essai si19 B"Jt!1)ltil:1J;-!.. La bande est s4chPE'" puis ni >,'<* avec son extr4mit6 SlM1'18p¯1..e en position dans 1:0. cuvette '.'ut contient le système acÜ 'l:r.1, choisi. On laisse migrer le solvant vers le bas, c'est-à-dire développer la bande, jusqu'à ce que le front du solvant atteigne la partie inférieure de la bande.
Il faut pour cela environ 15 heures; l'atmosphère environnante est maintenue à une température constante, elle est exempte de courants
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d'air et saturpe de vapeur de solvant provenant d'une t1-?re <11' fond du bocal.
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Chaque bande est alors retirée, séch6e à l'air et nlnc6n sur un plateau d'agar à un pH déterminé (dans ce cas 6,2) inoculé
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avec un organisme d'essaie dans ce cas B.subtlis. Apres séjour eu réfrigérateur jusqu'au lendemain, les bandes développées dans les différents systèmes sont retirées et les plateaux sont marques pour les identifier, incubées jusqu'au lendemain et relevées directement ou photographiées pour obtenir un document permanent.
Le contour de l'ensemble de la bande est visible.
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L'emplacement de chaque aa'ent antibioticue sur la bande est indi- au4 par une r6glon claire qu3 contraste avec la région trouble ou 1'orp'anisme d'essai s'est développe. La band.e représentée sur la photographie est divine en zones renrpsentant ,, 10, 10 10, 10, 10, 1C, 10, 10 et 15< de la distance depuis le point d'application de l'échantfllon jusqu'à la D'ortie inférieure respectivement et ces zones sont décrites comme ayant des velours
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Rf de 1 à 10 inclus. Une petite tache au centre ey-act aurait donc une valeur de R6, t:r>rc1i S ou'nre arande tache qui s'°;anr7ra-It dans les zones adjacentes aurait une valeur Rrj,6,7 pu'!snu'on compte la ?onP toute entière.
Fuivpnt ce procc3P, on a 4tabi,a 1e s1-ert1 e H f fie 1.:'1 Thiact.irp (lot 3-7) avec 5 microlit1"p; d'7nP :-Ol11ti.on 3. l')fT/rrp3 comme r<('hr'ntHlo'1 pt en utilisant In B, siahtj]1 sur un
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ap-ar au pH 6,2, dans les douze systèmes solvants ci-dessous :
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-97btàne solmnt à B C D E F G H I J K L . Valeur Rf 112 1 1 8>9510 - 1=4 décom- l,.- 10 8,910 10 10 Tl , 9-
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<tb> position
<tb>
La composition de ces systèmes solvants est la sui- vante : A- Eau B- Citrate de sodium en solution aqueuse à 10% C- Citrate de sodium en solution aqueuse à 40% D- Butanol saturé d'eau E- Méthyl-isobutyl-cétone.anhydre F- Mélange de 100 parties de méthanol à 80% et 10,5 parties de pipéridine réglé au pH 9,5 par de l'acide acétique.
G- Mélange, en volumes, de80 parties de méthanol, 5 parties d'acide acétique glacial et 15 parties d'eau.
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H- Butanol saturé d'eau et contenant 2 d'acide ptolubne-sulfa- niaue U- Mélange de 100 cm3 de butanol saturé d'eau et de 5 cm3 d'acide acétique glacial.
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J- Butanol saturé d'eau et contenant 2 d'acide p-tolup..ne-sulfoni- que et 2% de pipéridine.
K- 100 parties de butanol saturé d'eau et 2 g d'acide p-toluène- sulfonioue plus 2 cm3 de pipéridine plus 2 g d'acide laurique.
L- Mélange de 2 parties d'alcool isoamylique et, de 1 partie de chloroforme saturé de 10 d'eau. Dans ce cas, avant l'appli-
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cation de 114'%chantillon., les bandes sont saturées d'une so- lution aaueuse de citrate de sodium à 10% réglée au pH 5,4 'par de l'acide citrique, et séchées.
La Thiactine veut se décomposer dans les systèmes F, H, J et K.
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Les dessins (figures 1 et 2)o les lettres dôsinnnnt les pvptpnes solvants et les chiffres les valeurs Rf} jndiouent les tracés eyacts réduits à 50 environ da chaque diner-nion, des nhotorrnrhtes des nlaoues d'asar utilisées nouer obtenir le spectre Rf dA la Thiictine (lot 3-7) décrit ci-dessus. Les dessinr 1nri-trucont la sit11::+:jon des bandes et le roint de situatjon de la fiihiactinm (pY"'('r0it d'activité antihactârienna.
La "'m,de tel-le ct'11p "'!+ suspendue initialement est représentée dns lp
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dessin telle au'elle résulte d'une lecture depuis le sommet
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supérieur droit vers le bas et ensuite du sommet aanche voir< 1= has; les bandes sont couvées en deux avant d'être repues sur les plateaux d'agar étant donné qu'elles sont presoue deuv fois
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ulmus longues nue les nlateauv. Lp valeur Rf obtenue et la lettre, définies ci-dessus, identifiant le système solvant utilisé, figurent dans les dessins en dessous de chaaue bande.
EXEMPLE XI.
Le bouillon de fermentation contenant la Thiactine est préparé suivant le procédé décrit ci-dessus. Donc, le Streptomyces
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BL-67g506 est fermenté à 790F (26aC), pendant '70 heures, en utili- sant un volume d'air par volume de bouillon et 0,45% d'anti- mousse dans un milieu contenant :
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1,0 ! Maltose 0,005( ZnSO 0, 5 f NaCl 1,0%' neptonê 0!2% MgSO 05% extrait de boeuf l, 5% KH2P04 0,5% (NH4'z Ho Le pH est de 6,0 aprs 25 heures et de 6,1 après 50 heures.
Le bouillon final (100 gallons, pH 6,3) donne à l'essai (comme
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ci-dessus) 1J,0 mm à lux, il est filtré après lui avoir ajouté 45 livres (20 kg) de Dicalite et le filtrat est extrait par 20 wallons de mthyl-isobutyl-eFtone' La méthyl-isobutyl-cétone est séparée et concentrée nar distillation sous vide a 200 cm3 qu'on introduit avec agita- tion dans 2,5 1. de Skellysolve B. Par séjour dans le froid jusqu'au lendemain, il se produit un précipité solide de Thiactine,
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couleur tan, non-hyro..scapinue, qu'on recueille par filtration, pesant 1,72 et donnant à l'essai 23,0 mm â 16X sur B.!=!l1 til1 a,t rH 6,2 Pn échantillon à 1 mg/ cm3 dans une solution a.aueuse d'alcool t-bnt"lr1iC!u Q 50%. Cet chprtillon reçoit l'ptiouette lot 4-8.
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EX LBLB XII.
Le bouillon de .fermentatior 'on'f' nt 1- Thiactine est produit comme ci-dessus et extrait n'='r de li mAthvl-5 ob1Jtyl- cé,tol''I:' nu'n !-,'r),3re et concentre à 1 litre. On ajoute encore de
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la nip'thyl-4-!:-obi-itvl-c(ltone et la solution est séchée aanotrarsinue- ment, concentrée à 200 cm3 et introduite en pétant dans 1,5 litre de S'rellvsolve B.Il se uroduit un prcinité de Thiactine solide, couleur tan, ou'on recueille nar filtration (3,9 -) et out donne à l'essai 20,. mm à 167 sur :D. subtilis à un pH 6s2 en échantillon à 1 mg/c3. Ce produit reçoit l'.t3auAtte lot -9.
EXENPLE XIII.
On convertit la Thi-actine' de pureté cil-itzleon(ilie en r,'hlorhvdrate,,,e-Q traitant la matière dans de l'eau par l'acide . chlorhydrique jusqu'à ce cu'on obtienne une solution claire dont le pH dst inférieur à 3-4. La solution est congelée, séchée sous vide et donne une poudre facilement soluble.
EXEMPLE XIV.
On transforme la Thiactine de pureté quelconque en un sel de sodium en traitant la matière dans l'eau par de l'hydroxyde de sodiuun jusqu'à ce que le.pH soit sunérieur à 9,5.
La solution est ensuite congelée et séchée sous vide et donne le sel de sodium anhydre sous forme d'une poudre stable, solide dans l'eau.
EXEMPLE XV.
Le bouillon de fermentation contenant la. Thiactine
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(4100 ctrt3 (donnant à l'essai 14,5 mm à 64X? est produit comme ci-dessus, extrait par un volume égal de m4thyl-isobutyl-c4ton= et filtré sur de la terre d'infusoires (Dicalite). La mpthyl- isobutyl-cétone est séparée et concentrée nar distillation sous vido- !..5 (' en vi ron. Par refroidissement, la Thiactine cristallisée (200 rifr) se sépare et on la recueille nar filtration elle donne lly,7 mmo 16X sur R, suhtil s dans l1P e solution aaueuse (1.e mrthAno1 50^', â 0,25 mq/cn3. lgirg,<pL-q YVI.
Fun bouillon de fer;J"lE''1.t?tion c0T1t"r.ênt la Thi<ctjne (41.) Aet Y1roÓlli+: comme ci-dPs:z:, ;+rait npr un volninq 1 fi" "'éthvl-ifohiatT"1-c'tonfl et fil trI> sur de 1 terre c1' -f.r. f'11r,; rr.>
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(Di (':.l ï te). La m'thvl-isobutvl-cr';tone est séparée et concentrée nar distillation sous vide à environ 20 cm3. Pa1";refroidj ssen\Ji;, la Thiactine cristallisée (198 mp) se s°nare et on la recueille
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bar filtration, on la lave à l'éther, on la sèche à l'air et elle
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accuse à l'essai 1280-1350 me/cm3 en solution aaueuse de form:'1nd de à 50 à 0,5 mg/ cm3 sur un échantillon témoin (lot 5-9) auouel on as-iryne arbitrairement une puissance de 1000 mce/m! et donne F=0,.! mm à 1.6X sur B.subtilis à un pH 6,2 en pchantillon de 1 mg/cm3.
EXEFIPLE 7 VIT.
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On dissout de la Thiactine cristallisée (262 mg, obtenus
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comme ci-dessus) dans 10 CM3 de chloroforme et on la filtre D011T'
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Eliminer environ 18 mg de matière insoluble dans le chloroforme.
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A cette solution, on ajoute un volume gal de m8thYl-isobutyl- c8tone. On réduit le volume do. moitié opr nvaporation dans un courant d'air; la Thia.ctine qui commence 5 précipiter est transfor- me en cristaux en chauffant à environ' 11-0-4, pendant environ 4 minutes. Après une nouvelle. réduction en volume â, environ 8 cm3, la Thiactine cristallisée (156 mag) est séparée par filtration, lave à l'éther, spchée à l'air et recristal13,sôe encore de la J11P1'118 façon pour donner 114 mg de Th3actine ctistallisée, devenant foncée à environ 220 c .et fondant à environ 223-231oC et l:1CCUS8nt amiriron 2800 T'rJC/1'TJP" sur un échantillon témoin (lot 5-9) auauel on a;s3ne ,rbitrnir4m,-nt une puissance de 1000 mcg/mq et donnant 20 4 mm à 16Y sur B.suht;i,'Iis s au DH 6, 2 en 0chantil10n de 1 m:r/cm3.
La solubilité de la Thi a ctine est supérieure à 2-5 mi,/c,n3 dans le fornamide, chloroforme, mpthyl-ce1los01 ve, butanol nt dioxane 'iod4r<'-i:%1-t chauds et dans l'alcool à=1iylique chaud, et infériel1!'p à 2-5 1TC"/c"13 dons .2Câ1'OYl ben7bne, acétate n.'Ftrrrvl'1, é'lCltAtE' d'thyle, di.!'1 tho:rytr:.Ane, dim4thoyydi''thvlëne plvcol. c3nd3, -3anr 1'rthanol et l'acide chlorhydrique O,1P.
L c- points ae fusion sont dÀer-jn6s sur des 6ch-1-- t111n r/ (deux heures a 60 C sous vide sur P0) sur des (,},;rt:ï11rms non r'c'a<fls et des Echantillons Sr'C'1^r dans lu1 t.n11'; :'rjl: '"11"0 vide d'air renu6 hermtinuAment les rfsn.lt;:>ts
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SÙ1,t 1'2 SUiVél1.tS :
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ECltntillo"1. Asso!!lbrisset:1ent F'us1.or s'ché 205 C 223 - 235 c Nor séché 205 C 220 - 2J5 C
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<tb> (,tanche, <SEP> vide <SEP> d'air <SEP> 224 C <SEP> ?26 <SEP> - <SEP> 235 C.
<tb>
Les analyses chimiques donnent les résultats suivants;
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pour comparaison, on a indiqué les valeurs pour la Sidfàctine et la Phalamycine :
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Thiactine SuI'a.ctir¯e Phal!vcire C, 51,8;52,2;51,7 50,3 53,5
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<tb> H, <SEP> % <SEP> 5,56;5,66;5,57 <SEP> 6,0 <SEP> 5,45
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N, <SEP> % <SEP> 18,1;15,3;16,4 <SEP> 17,2 <SEP> 13,65
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S, <SEP> % <SEP> 10,1 <SEP> ; <SEP> 9,2;9,3 <SEP> 14,1 <SEP> 5,11
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Halogène <SEP> néant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Phosphore <SEP> néant
<tb>
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R±s18u, fF 0, 57; néant; 0,1
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<tb> Matières <SEP> volatiles <SEP> %'6,65;8,56;4,42 <SEP>
<tb>
La préparation de la Sulfactine est décrite dans le Il.Journal Biol.
Chem. " 168 (21 (Mai 1947) et la préparation de la
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PhalamYcine est décrite dans "p.ntibiotics and Chemotherapy, 3(8), 818 (Août 1953.).
Le pouvoir rotatoire de la Thiactine après séchage 27 sous vide à 60 C pendant deux heures est de [a]D27 - 68,5 à 69,5 ' (c =/dans le chloroforme).
Une suspension obtenue en broyant'la. Thiactine cristallisée dans des grains de bromure de potassium présente de nombreuses bandes d'absorption caractéristiques 'dans l'infra- rouge. Parrrii celles-ci on relève les longueurs d'onde suivantes
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(envierons) : 2e98x 3e37; !r,?0 - 428 (bande, large) ; 6,05; 6,50 - 6,70 (bande large); 7,00 - 7,10 (palier) 7,25 ; 7,70 - 7,95 (bande large); 8,28 ; 8,85-8,98 (bande large); 9,17 ; 9,25 - 9,50 (palier); 9,65 - 9,85 (nalier); 10,15 - 10,35 (bande large); 10,75; 11,23; et 12,40 - 12,60 (palier).
Le spectre d'absorption
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dans l'infra-rouge de la ihiactine entre les longueurs d'onde r:aT'wCriSf T1 S de 5 3 13 :'? C:'0:15 est 11'ilC. 3 la flEure des Q':,..11':' p.'lD.e78, dans lal'18l1e les ;1?scisqes .T3i'S i1:11t f""-sf.e4tlveI1t le5 l10::bre3 d'ondes en C!'1-1 et les longueurs j9)ntl",, nierons et "'->n {)""'.0rm!e f'iRï.lre le ''le iT':is:7i1S1;T:.
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Le spectre de l'absorption dans l'ultra-violeb d< la Tiliactine de 200 mu à 400 mu en concentration de 50 !:f1/ ('13 4aiis de l'acide chlorhydrioue 2N et d I.ns de l'hydroyyde rt( ,;).4 iUltl 4.11 ne orésente pas de 2na.xi1Illll!1; il semble y avoir un tsible opl ter
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dans la région de 300 iny.
Un échantillon de Thiactine est ¯ni:, en suspenpior) dans l'eau et le mélange est port et maintenu à .1.1lJ ",111 tl on rendant 1 minute environ; un essai bioloqiuue sur de la 1'?ii.;cti!.ie solide récup6rÓe montre qu'il n'y a pas de perte de nvj <sa,nce.
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Des échantillons de Thiactine sont chauffes dans de
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l'acide chlorhydrique 6N toute la nuit 1 100 C et dans des tubes ébauches à 150 C. Les solutions résultantes hydrolyspes'donnent une réaction positive à la ninhydr1ne. A l'aide d'analyses par papier chromatoraphiaue de ces hyd:rol.,ysst:s,, on a .,trouve de la cystine ou de la cystéine,' de la thrponine, de l'a-1:L1.Hnine, de la glycine et une 'des leucines, les leucines n-'apparaissent pas dans la Phalamycine; d'autres amino-acides peuvent sur
EMI27.6
trouver-
EMI27.7
Les nrocds suivants sont utiles pour séparation e la Thiactine à oartir de solutions, comprenant les bouillons;;
1) Sxtriiction par la :nPth.-Yl-isobutyl-ctone de la solution à la température de chambre froide, suivie d'un traite-
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ment très rapide de l'entrait- par déplacement car l'eau (distilla-
EMI27.9
tion nous vida avq r3^;i.tion d'eau ,jvsau'3 linintion cuhiplete '11 s,)lv!jnt ïn3tia1 et en le hropYïJ¯i sanv.
2) Aorohion sur du 'charbon de bois activa (!7arcoi', suivie a' lutio=. DE (' :le faibles volurnes a la température de ' 1fcb l' t3 ^ ro i c? -3 ?) ''a:.,am <='ur ''rT5 =olonne -:?'nl1l':";ne d'un bouillon "u ''q...r. :nlvrfol1 eytrs,3ts par de 1é- n:)'trwl-isohlltvl-cr:tm10, sui.vj 'i'é1'1.i(1" ''::ir unn solution al1ueus d'alcoT. lizty15:7of- trt f a5 ,..
<Desc/Clms Page number 28>
4) Extraction d'une solution ou d'un bouillon par
EMI28.1
de la méthyl-isobutyl-cétone, suivie de à.1JlaCer1.ent de l'extrait par de l'alcool butylique tertiaire et de lyophilisation.
5) Extraction d'un bouillon ou .3'une solution par de
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la n'thyl-îsobutyl-cétone, suivie d'une concentration à un volume très faible et par une précipitation par addition d'alkanes inférieurs (Skellysolve), et
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6) Adsorption complète de la Thi8c'ine dans une solu- tion de chloroforme sur une colonne ou une (:h1' T'?;e d'alumine, suivie par une 8lution par des mélanges méthafi,)I1o,.chloroforme ! (par exemple 5 de méthanol, 95% de chlorofo1
Des échantillons cristallisés de Thiactine, obtenus comme décrit ci-dessus, sont recristallisés de la manière
EMI28.4
eut vante : 1) par solution dans du chloroforme à environ 25'mg/om3 suivie d'une concentration à environ un cinquième .du volume; le concentré est déplacé par la méthyl-isobutyl-cétone.
2) Par solution dans du méthyl-cellosolve à environ 20 mg/cm3, en chauffant pendant quelques minutes environ à 50- 55 C, suivie d'addition à cette solution après refroidissement de 10 à 50%'environ en volume d'eau.
3) Par solution- dans du dioxane à environ 20 mg/cm3
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n chauffant pendant quelques minutes à environ 50-55 'C, suivie d'addition à cette solution d'environ 7 volumes d'eau, et
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4? nar solution dans du dioxane à environ 20 mg/cm3 : en eliruffant pendant Quelques minutes à environ 50-55 C, en ,concentrant à un cinquième du volume, en refroidissant et en adulant de l'acétone* Lorsoue tout le bouillon est filtré, il se produit
EMI28.7
une roartïtion appréciable de l'activité entre le filtrat et 1.2 m:cllu11 (masse) et la Thiactine est recueillie de chacun d'eux. Ainsi, l'extraction de tout le bouillon est un procédé très approprié.
Claims (1)
- EMI29.1REVENDICATIONS, ---------------------------- EMI29.2 1.- Substance ainsi oue ses sels d'acides et de f#taux, e"icace D0111' inhiber la croissance de bactéries ? ?I C;rll- nositif, choisie dans le g1'ouve constitue d'une substance !f'111)J:.:>tè1'e susceptible de former des sels avec des acides et des .J'<:t. xx, et ayant les valeurs R de spectre suivantes : EMI29.3 tcxé c so7râr A B C D F G H alPu Rf 7.,2 D Y4' d^com- 8 10 $,910 10 10 '97l0 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯position¯¯¯¯ ¯¯ ¯ EMI29.4 o" la composition des systèmes solvants est la suivante : EMI29.5 A- Eau EMI29.6 B- Solution aqueuse de citrate de sodium à 10I.C- Solution anueuse de citrate de sodium à 405Te 0-butanol saturé d'eau.,- Mfthyl-J sobutyl-ctone anhydre.!1'- Mélange de 100 parties de mthanol à 80% et de 10,5 part;Les de nip0r1.dine, r0p10 au pH 9,5 par de l'acide Rctif1n8.11- Mlaxze en volU11es, de 80 parties de <x4thanol, b partie d'acide acétique glacial et 15 parties d'eau.Il- Rutanol sature d'eau et contenant 26C d'acide p-tolueno su-lfoniaue.'I- M-laape de 100 cm3 de butanol sature d'eau et de b cm3 diacide 1=\(' t.tque glacial.J- 'Rutélnol sature d'eau et contenant 2% d'acide p-tolun'3 ulfon(U# et 2 de niperidine' K- 100 rirties de butanol satura d'eau et 2 grammes d' IW1. dr.- p- fio7.ttFne f-:111 f'onirme nlus 2 cm3 de pipr;ridine plus ? rrznrnms d'n.àide lauriflae, et L- \rLH1'-' d 2 1l!'Jrt1p d'alcool Isoxrl171iqua et d'una pPl.t.j de crll1!'O f0T'111 e, saturé d'eau, ces bandes tant saturées ciliuie :a.tafii.tn n'1Uf;!U8 de citrate de sodium à 10trf" l'?/'!,lpp.'3ftn pH ',4 n-,r e4. l'acîd1> 0.;¯triaue, et sôc'a6es avant l'annlicatloq Je EMI29.7 l'échantillon. EMI29.8P.- -,il de ca]"\'f.'1"1 de la S11bstRrH'8 étf!lphot8T"? a,i ,=znt In xEU''c7 1'( t"t: h i r': 1.3.- 5-'81 de sodium de lp 11'h,qt::r] "l1fphcdr' f':a...t'\P 'lt 1:1 ""'crrtai":Wfcn 1..1.- Ph0Sp11c:!tA tie la substance amnfiol.4r<* Sllf\Ji"P la rflllml.5J.<'tit.li>"i 1. <Desc/Clms Page number 30>5. - Sulfate de la' substance amphotère suivant la revendication 1. EMI30.16.- Chlorhvdrate de la substance anmßo,èrk: su-ivnt 1 ' revendication 1. EMI30.27.- Substance efficace pour inhiber la cr.o1 Ç,n.ce d.-:' bactéries à Gram-positif et ayant les v>1 ?ur= F f de spectre suivantes : EMI30.3 Svst9!B sciant c D E F G H " J K"L""" SVst.ÈI# solvant ABC D E 1 f' EI H l I--. - ., Valeur Rf l, 1 1 8,9,10 1-4j <-1;ccm- fi-<A 10 ;-,9, le) 1J To )y0 ¯¯¯¯¯¯¯¯ , 2 ^ ¯ : siiort ¯¯ ......¯ ¯.¯ ..w ¯ où la composition des systèmes de solvants est comme suit : A- Eau.B- Solution aqueuse de citrate de sodium à 10.C- Solution aoueuse de citrate de sodium à 40%.D- Butanol saturé d'eau. EMI30.4E- l4éÉhyl-îsobutyl-cétone anhydre' F- Mélange de 100 parties de m'thanol à 80% et de'10,5 parties de pipéridine, règle au pH 9,5 par de l'acide acétiaue.G- Mélange, en volumes, de 80 parties de m4thanol, 5 narties diacide acétique et 15 parties d'eau.H- Butanol saturé d'eau'et contenant 2 d'acide p-toluène sulfo.. ' nique. EMI30.5I- 1-l'lanp,,e de 100 cm3 de butanol saturé d'eau et 5 cm3 d'acide acétionÉ,,. flacial.J- Butanol saturé d'eau et contenant 2% d'acide p-toluène sulfo- EMI30.6 nique et 2 de pipér3dine K- 100 parties de butanol satura d'eau et 2 grammes d'acide ptoluène sulfoniaue plus 2 cm3 de pipéridine plus 2 grammes d'acide laurique, et EMI30.7 L- Mélange de 2 parties d'alcool isoamvliaue et d'une-partie de chloroforme, saturé d'eau, ces bandes étant saturées d'une solution aaueuse de citrate de sodium à 10<, rp14es au ni 5,h par de l'acide citrique et séchées avant application de l' échan- tillon. EMI30.88.- Procédé de production de la Thia.ctine, carctrisp en ce qu'on cultive une souche de Str ep tomy c es BL-678506 dan 3 une solution aaueuse d'hydrates de carbone contenart àmg acnts nutritifs azotés dans des conditions aérobies sùbnerg4es urau'. ce aune la solution nrésente une activité 1=Jnti'l-)f!ctrj p.rme sl1bst:m- <Desc/Clms Page number 31> tielle et on recueille ensuite la Thiactine ainsi produite du bouillon de fermentation.9. - Procédé de production de la Thipctine caractérisa en ce qu'on cultive une souche de Streptomyces BL-678506 dans une solution aqueuse d'hydrates de carbone contenant des agents nutritifs azotés dans des conditions aérobies submergées à une température d'environ 24 C à environ 30 C perdant environ 3-5 jours, jusau'à ce que la solution présente une activité antibactérienne substantielle et on sépare ensuite la Thiactine ainsi produite du bouillon de fermentation.10.- -Procédé de production d'un bouillon de fermenta- tion de la Thiactine, caractérisé en ce ou'on cultive une souche EMI31.1 de StrPptoyces )3L-678506 dans une solution aqueuse d'hydrates de carbone contenant des agents nutritifs azotés 'dans des conditions aérobies jusqu'à ce que la solution présente une activité anti- bactérienne substantielle.11.- Procède suivant la revendication 8, caractérise en que la séparation de la Thiactine comprend l'extraction de EMI31.2 la 'lhi actine d'une solution aaueuse 'car un solvant organique immiscible à l'eau.12.- Procédé suivant la revendication 8, caractérise en ce que la séparation de la Thiactine comprend l'extraction de la l'hiactine d'une solution aqueuse par le butanol.13. - Procède suivant la revendication 8, caractérisa EMI31.3 en cp nue la 0N:q.tion de la Thiactine comprend l'extraction de la Thiactine d'une solution aqueuse Dar la mthyl-isobuty1- r4tJne.14. - P1'()(''';dp suivant 7¯a tevmn4icaion 8, cara ctri SP en ce que la séparation de la Thiactine comprend 1'etr>ctlon de la 'l'hi f4('tir,A d'une solution anupiise nar un solvant ornnniaue im<fiiscihle à l'eau, la séparation de cette solution de la 1'} 1 Act1 nI} nt, la nréciritation de la Thiacttnp par addition d'un alrrane 1*.nf n 'ri eut. <Desc/Clms Page number 32> EMI32.115.- Procédé suivant la -revendication 8, carrct±tis4 en ce que la séparation d.e la Th-1;3ct-Llie comprend l'e:f:tion. de la Thiactine d'une solution aqueuse nar 1'3 butanol, la spu/:!:!'a;" tion de cette solution de la Thiactine et la '>1'('i.}!it.&timi de là Thiectine par addition d'un alka#inférieur.16. - Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que la séparation de la Thiactine comporte l'extraction EMI32.2 de la Thiactine d'une solution aqueuse par la m0thyl":':isobu,tyl- cétone, la séparation de cette solution de la Thiactine et la précipitation de cette Thiactine par addition d'un alkane in- ferieur.' 17.- Procédé suivant la revendication 8, caractérisé EMI32.3 en ce que la séparation de la Thiactine comprend l'aqsorpt10n sur un adsorbant chromatographique et l'élution subséquente de celui-ci. EMI32.418.- Procédé suivant la revendication 8, caraett:'riscol en ce que la séparation de.la Thiactine comprend l'adsorption sur de l'alumine chromatographique d'une solution dans le chloro- EMI32.5 forme et par après, une élution par du chloroforme m4tbanolJaiie.19.- Aent thérapeutique constitué par une composition , sous forme de dosage unitaire caractérisé en ce qu'il comprend une substance suivant la revendication 1, en une quantité non toxique, efficace contre les infections bactériennes. ; 20.- Procédé suivant la revendication 8, caractérisé EMI32.6 en ce que la snaration de la Thiactine comprend l'extracbjon de la Thiactine d'une solution aoueuse par la méthyl-isobutyl- cétone et la nrécipitation subsecuente de la Thiactine cr't6t?l- lisée de la m4thvl-isobutyi-c6tone s'nprée, par concentrat16n.21.- Procédé suivant la revendication 8, caraot4ï*jsé en ce aue la séparation de la Thiactine comnrend l'extraction 1P 1.--i Thiactine d'une solution aqueuse par la rr.th:.rl-isonutYl-cptcq'1l et la. r!:cinitation subséquente de la Thiactine cristllip. de la 1"étl-rfl-is()r1Jbrl-ctonp. séparée par di ati llation sous vide. <Desc/Clms Page number 33> EMI33.122.- Sl1btneW! efficace pour inhiber la croissance de bactéries à Gram-positif, choisie dans le groupe constitua d'une substance amphotère susceptible de former des sels avec d.es acides et des métauv présentant des bandes d'absorption des caractéristiaues dans la région de l'infra-rouge du spectre EMI33.2 lorsau'elle est granulée, dans du bromure de ootassium, nour les longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns .2,98 , 3,37 ; 4,20 - 4,28 (bande large); 6,05 ; 6,50 - 6,70 (bande large); 7,00 - 7,10 (palier) 7,25 ; 7,70 - 7,95 (bande large) '1,28 ; 8,85 - 8,98 (bande large); 9,17, 9,25 - 9,50 (nalier); 9,65 - 9,85 (palier); .10,15 - 10,35 (bandé large); 10,75 ; 11,23;et 12,40 - 12,60 (palier), et caractérisée par un pouvoir rotatoire dans le chloroforme d'environ a 27 69 , par un point de fusion dans un tube capillaire, vide d'air et étanch< d'environ 226 -235 C, par la formation par hydrolyse acide d'un mélange d'amino-acides comprenant l'a-alanine, la thréonine, la glycine, une leucine et un, élément choisi du groupe constitué par la cystine et de la cystéine et par une solubilité supérieure à 2 mg/cm3 dans la formamide, le chloroforme, le méthyl-cellosolve, le butanol modérément chaud, le dioxane modérément chaud et l'alcool amylique chaud et inférieure à 2 mg/cm3 dans l'acétone, le benzène, l'acétate d'amvle,l'acétate d'éthyle et le diméthoxy- éthane chauds et de l'éthanol et contenant uniquement les Eléments carbone, hydrogène oxygène, azote et soufre et présentant une EMI33.3 analyse élémentaire typique de N 15,3 - 18,1%', Co ,51;7 - 52,?.; H 5,56 -5,66<1. etS:-;,2 - 10,if; et les sels des acides et des métaux de cette substance.23.- Comnopé suivantla r-vendicption ?.2,' sous forme crl st!ll 11 se, 5zhstantiellempnt pure.24.- Substance, efficace cour 1'in'hihition de la r)j SS::1nce de b:::ct--<ri es à Gr;;nl-positif, 5ii-,cepti'nle de former des A1s Aver des acides et des in6tau%/, et nrsntar.t des bandes 40' ;;, <"'JT'n Ur>n r.;rrtristiques dans la r4gion 1'1 l'Infra- <Desc/Clms Page number 34> rouge du spectre lorsqu'elle est granulée, dans du bromure de botassium, pour les longueurs d'onde suivantes, exprimées en nierons : 2,98, 3,37; 4,20 - 4,28 (bande large) 6,05;6,50 - 6,70 (bande large); 7,00 - 7,10 (palier); 7,25 ; 7,70 - 7,95 (bande large); 8,28 ; 8,85 - 8,98 (bande large); 9,17 ; 9,25 - 9,50 (palier); 9,65 - 9,85 (palier); 10,15 - 10,35 (bande large); 10,75; 11,23 ;et 12,40 - 12,60 (palier) et caractérisée nar 27 un pouvoir rotatoire dans le chloroforme d'environ [a]27 D 69 , bar un point de fusion dans un tube capillaire, sous vide, étanche, d'environ 226 -235 C, par la formation par hydrolyse acide d'un mélange d'amino-acides comprenant l'a-alanine, la thréonine, la glycine, une leucine et un élément choisi dans le groupe constitué par la cystine et la cystéine., par une solubilité dans l'eau supérieure à 2 mg/cm3 dans la formamide, le chloroforme,'le méthyl-cellosolve, le butanol modérément chaud, le dioxane modé- rément chaud et dans l'alcool amylique chaud et inférieure 2 mg/cm3 dans l'acétone, le benzène, l'acétate d'amyle, l'acé- tate d'éthyle et le diméthoxyéthane chauds,et dans l'éthanol, contenant uniquement les éléments carbone, hydrogène, oxygène, azote et soufre et présentant une analyse élémentaire typique de NI 15,3 - 18,1% CI 51,7 - 52,2%; H- 5,56 - 5,66% et SI 9,2 - 10,1''.25. - Sel de calcium de la substance amphotère suivant la revendication 24.26.- Sel de sodium de la substance amphotère suivant; la revendication 24.27.- Sulfate de la substance amphotère suivant la revendication 24.28.- Chlorhydrate de la substance amphotère suivant la revendication 24.29. - Substance, ainsi que ses sels d'acides et de métaux, efficace pour l'inhibition de la croissance de bactéries à Gram-positif, choisie dans le roune composé d'une substance <Desc/Clms Page number 35> EMI35.1 a::photère susceptible ie former des sels avec des acides et des ',!;tA Il'X et présentant des bardes d'absorption caract0r.i sti rp1es dans la. région de l'infra-rouge du spectre, 10rscu'811e est ra.n.ul:'e, dans du bromure de potassium, pour les longueurs d'onde suivantes exprimées en microns: 2,98; 3,37; 4,20 - $,28 (bande EMI35.2 large) 6,05 ; 6,50 - 6,70 (bande large); 7,00 - 7,10 (palier); EMI35.3 7,25; 7,70 - 7,95 (bande large); 8,28; bzz35 - z (bande large); EMI35.4 9,17 ; 9,25 - 9,50 (palier) ; 9,65 - 9,85 (palier); 10,15 - 10,35 EMI35.5 (bande large); 10,75 ; 11,23;et 12,40-12,60 (pa1ifr1et caractérisée ¯ ?7 envi L-" 7270 nar un pouvoir rotatoire dans le chloroforme d'environ r<i2 D 69 EMI35.6 par un point de fusion dans un tube capillaire, vide d'air et EMI35.7 ; ?'tanche d'environ 2?6 -?35 C, par la formation par hydrolyse acide d'un m41ange d'arnino-acides comprenant l'a-alanine, la EMI35.8 thréonine, la glycine, une leucine et un élément choisi dans le groupe constitué par la cystine et la cystine,par une solubilité EMI35.9 sl1DÁrleure à 2 mg/cm3 dans la formamide, le chloroforme, le m4thyl- cellosolve, le butanol modérément chaud, le dioxane modêrénent EMI35.10 chaud et l'alcool amylique chaud et inférieure à 2 mg/em3 dans EMI35.11 l'ac0tone, le benzène, l'acétate d'amyle, l'acétate d'éthyle et le dim .1 th y -oxyéthane chauds et dans l'éthanol,et.contenant EMI35.12 uniquement les éléments carbone, hydrogène, oxygène, azote et EMI35.13 soufre et présentant une analyse 414Tnentaire typioue de Ni 15,3 - 7.* .i','; Cl 51,7 - 52,2%; H- 5,56 - 5,66% et S- 9,2 - 10,1% et avant EMI35.14 les valeurs Rf de spectre suivantes : EMI35.15 , , i=,c r al,rr A B Bzz D E F G H I J Lez 1$5@rt à 1 1 ,9,1D -f--4 d?com- l,.-¯ 14 8y9 10 l0 .Q 97ÏO posîblon 9,10 EMI35.16 o la connopition de ces systèmes solvants est la suivante : A -Eau.- Solution aoueuse de citrate de sodium 3 10< C - F'olutior poueupp de citrate de sodium Ç01'.¯ 2.fiGnal. saturé d'eau* - Hrtryl-1 sobutyl-cptone Anlwrrn. <Desc/Clms Page number 36> EMI36.1F - 1.-41ange de 100 parties de ;J.th8nol à 80'( et de 10,5 parties de nipf-ridine, 'régln' au pH 9,5 Dar de l'acide acétique.G - Yélange, en volumes, de 80 parties de méthpnol, 5 parties diacide acstiaue glacial et 15 parties d'eau.H - Butenol saturé d'eau et contenant 2' d'acide p- toluène-sulfonicue- I - Mélange de 100 cm3 de butanol saturé d'eau et de 5 cm3 d'acide acétique glacial.J - Butanol saturé d'eau et contenant 2% d'acide p- EMI36.2 toluène-sulfonique et 2 de -pipéridine- K - 100 parties de butanol saturé d'eau et 2 grammes d'acide p-toluène-sulfonique plus 2 cnt3 de pipéridine plus 2 grammes d'acide lauricue., et L - Mélange de 2 parties d'alcool isoamylique et de 1 partie de chloroforme, saturé d'eau, ces bandes étant saturées d'une solution aqueuse de citrate de sodium à 10% réglées au pH 5,4 par de l'acide citricue, et séchées avant d'appliauer l'échantillon.30. - Procédé de préparation d'une substance (et de ses sels d'acides et de métaux) efficace pour inhiber la croissance de bactéries à Gram-positif, choisie dans le groupe constitué d'une substance amphotère susceptible de former des sels avec des acides et des métaux, et ayant les valeurs Rf de snectre suivantes, EMI36.3 Q,nxt=Pesdlv?nt A 3 C D E F G H I J K L Valeur Rf 1,2 l l Q,9,lO 1-4 decom- .-f IO 8, 9 ,10 10 10 9 ,10 EMI36.4 <tb> position <tb> où la composition de ces systèmes solvants est la suivante : A - Eau. EMI36.5B - Solution aaueuse d3 citrpte de sodium a 10fifl C - Solution anuAmse de citrate de sodilr à 4-0tf..D - Butanol satura d'eau.' , - Vthyl-isobutvi-crbone anhydre. <Desc/Clms Page number 37> EMI37.1'<' - 1:lêY!f1e de 100 parties de m6tiianoi à 8019 et de 1.c'.t5 ppth'2 de nlpfridine, r4g14 au pH 9,5 par dz l'acide EMI37.2 acétique. EMI37.3G - 1'Lar¯e en volumes, de 80 parties de m7tharLol., 5 parties d'scide aetir'ue glacial et 15 parties d'eau.H - Butanol saturé d'eau et contenant 2 d'acide p- to1l1,Ène-sul fonicue.I - Mlane de 100 cm3 de butanol saturé d'eau et 5 c<3 d'acide Pcticue F-lacial.J - Butanol saturé d'eau et contenant 2% d'acide p- t,01uÈ'ne-sul fonicue et 2" de pipéridine. EMI37.4K - 100 parties'de butanol saturé d'eau et 2 grammes EMI37.5 d'acide p-toluene-sulfoniaue plus 2 cm3 de pipéridine plus 2 grammes d'acide laurique, et L - Mélange de 2 parties d'alcool isoamylique et de 1 EMI37.6 nartie de chloroforme, saturé d'éau, ces bandes étant saturées EMI37.7 oer une solution aqueuse de citrate de sodium à 10%' r0glpesau pH 5,+ par de l'acide citrique, et séchées avant d'appliquer EMI37.8 l'échantillon. 31.- Procédé de préparation d'un sel de calcium de EMI37.9 la substance emdhotère suivant la revendication 30. EMI37.10 32.- Procède de préparation d'un sel de sodium de la EMI37.11 :7thstatce anhotpre suivant la revendication 30.33.- Procédé de prnparatjon d'un phosphate de la l1hr't','îrt'> rfi>photère suivant la reverdication 30.?4.- Procédé de préparation d'un sulfate de la substance :':"î1\C1tt're suivant la revendication 30.35.- Procdp de vr/varation d'un chlorhydrate de la <'1;;,,,V,r,('p E"'n11otnre suivant If revend Talion 30.6.- Proc/d6 de nrnr.ara.tion d'une substance efficace r "1'11" fi<1;ih<.r la croissance de bactErieq 3 GrH'n-'Dor'Jtir r pr:"E'ntf1nt.'Les va.1.euT's Hf ;e <.;1')0trA suivantes : <Desc/Clms Page number 38> EMI38.1 e solvant if;-:-i:ur hf 1,21 1 8eg5lo 1-±. co-' 4' ]Q 'Î,9,10 10 10 " 9,10 EMI38.2 <tb> position <tb> EMI38.3 0 la . composition de ces systèmes solvants est If suivante : EMI38.4 A - Eau. EMI38.5B - Solution noueuse de citrate de ?odiuni a 10. C - Solution aaueuse de citrate de sodium à ;.0. EMI38.6 D - Butanol satur' d' eau. EMI38.7E - 24pthyl-isobvtTl-ctone anbvdrc.F - Mélange de 100 parties de mpth 8Tlol â S0%' et de la,5 tarties de pipéridine réglé au pH 9, 5 par'de 1' 3 de acJtioue.G - Mélange, pn volumes, de 80 parti p3 de m4tb,anol, 5 3rt3 es d'acide acétique alecial et 15 parties d'eau..H - Butanol satura d'eau et contenant 2f d'acide pu- oluène- sul foniC1ue. EMI38.81 - Mélange de 100 cm3 de butanol satura d'eau et EMI38.9 or3 d'acide acétique placie.1.J.- Butvnol saturé d'eau et contenant 2 d'acide p- ;;01uène-sll1 foni aue et 2d ,de piperidire. EMI38.10K - 100 parties de butanol saturé d'eau et 2 grammes EMI38.11 1:- H':ide -o-tolune-111 forliaue plus 2 c?t de 11tl!ridille plus 2 d'acide laurioue, et L - Ml2ne de 2 parties d'alcool isoamylique et de 1 i,,rt-fe de chloroforme, SRtur d'eau, ces bandes 4tant saturées ,PUri'" o11J.t,ion aaueuse de citrate de SOtU DM 8 la± ri au pH 5,1."}'!' de 7¯'cide citrique, et pobes avant d'appliquer 1'±cbrntil- EMI38.12 Ion. EMI38.1337.- Proc'C,' de nr.'=7'?'tion d'un figent thÁra'O11ti que onsti. t11 fi'll'1" ^rlTry70çit0?lSrl7S forme de ',OS2ag unitaire omn1'e- EMI38.14 EMI38.15 ont une 'I7h'-^''rE? ë7litrcnt la revndination 30, en 7U2nt7'tr non to,"J4ue ""r&>ic::I"e contre les inactions bactériennes.38. - P1"t>C"rdh de T)1"'1)ar::ti(11'1 d'une .::11'1- ':+rHe 9t: ro rms <"C!ls :i'p,.tà.""'" 0+ rlc .....6t811Y efficace pour inhiber la crn? -?'r.? n "'::'!ctrl('1> z! C:t"'A'...nyritif, choisie dans le ?rouT!e constitué'" <Desc/Clms Page number 39> EMI39.1 nar une substance ariphotère susceptible de former des sml-s pyec des acides et des taux, et présentant des bandes d'absorntion caractéristiques dans la TPf!ion de l'infrB-roul7e du spectre, lorsqu'elle est granulée, dans du bromure de Dotassium, pour les longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns : 2,98; 3,37; EMI39.2 4,20 - 4,28 (bande large) 6,05; 6,50 - 6,70 (bande large); 7,00 - 7,10 (palier) 7,25; 7,70 - 7,95 (bande large) ,2g; 8,85 - 8,98 (bande lardez 9,17; 9,25 - 9,50 (ualier); 9,65 - z5 (pilier) 10,15-10,35 (bande large);10,75; 11,23; et 12,40 - 12, 60 (palier}, et caractérisée par un pouvoir rotatoire dans le chloroforme EMI39.3 d'environ La D - 69 et par un point de fusion dans un tube capillaire vide d'air et étanche, d'environ 226 -235 C et.par la formation par hydrolyse acide d'un mélange d'amino-acides,compor- EMI39.4 tant 1' a -alanine, la thrponine, la glycine, une leucine et un élément choisi dans le groupe constitue de la cystine et de la cystéine et par une solubilité supérieure à 2 mg/cm3 dans;le EMI39.5 formamide, le chloroforme, le methyl-cellosolve, le butanol modérte,ent chaud, le dioxane modérément chaud, et dans l'alcool a1J\rlioue chaud et inf4rieure à 2 m/cr3 dans l'acétone, le benzène, 1-'ac$"*t.-rite d'amyle, l'acétate d'éthyle et le diméfiwoxyéthane chauds et dans l'éthanol et contenant seulement les éléments carhone, pvdoèna, 07P-na, azote et soufre et présentant une analyse é1mntR1re typique de N- 15,3 - 18,1, CI 51,7 - 52,2<; HI 5,56 - 5,66 et S79,2 - 10,1.39.- Procède de préparation d'un composa suivant la EMI39.6 ren1t1o 38, sous une forme cristallisée, substantiellement pure.40.- Procédé de préparation d'une substance efficace EMI39.7 pour inhiber lp croissance de bactéries à Gr?m1-nositif, suscepttb1 de fn1-er der çAls avec des métaux et des acides et Dr6sentant des bardes; fi' n fOT''1t.i 011 caractristicmps dans la rÂp'ion de l'infra- rovge Ili 3n,-trn,lorsou-1 elle est yranulôe, dans du bT'(')TrJ:l1r de <Desc/Clms Page number 40> EMI40.1 potassium, pour des longueurs d'ondes suivantes, p:r.rées 9+1 microns : 2,98, 3,37; 4,20 - 4,28 (bande lrge 6,05: 6,50 - 6,70 (bande large); 7,00-7,la (palier); 7,?5 ; 7,70 - 7,95 (hl;rve large); 8,28 ; 8,85 - 8,98 (bande laree); 9,17 ; 9,25 - 9.,50 (palier); 9,65 - 9,85 (palier?; 10,15 - 10,35 (bande large); EMI40.2 1 ,75 ; 11,23 ;et 12,40 - 12,60 (palier), et c?ract4Tispe n:)1' -27 ' un pouvoir rotatoire dans le chloroforme d' enviran .,¯/ 0 -6 ", par un point de fusion dans un tube 'capillaire, vide d'air et Ptanche, d'environ 226a-235aC, nar la formation D&1" hydrolyse acide d'un mélange d'amino-acides comportant l'a-alanine, la thréonine, la glycine, une leucine et un élément choisi dans le groupe constitue de la cystine et de la cystéine et par un- solubi- EMI40.3 lit4 sudrieu-re à 2 mg/cm3 dans la. foamide, le chloroforme, le méthyl-celiosolve, le butanol modérément chaud,, le d3oyane modrment chaud et dans l'alcool amylique chaud et inférieure à 2 mg/cm3 dans l'acétone, le benzène, l'acétate d'amyle, l'acétate EMI40.4 d'éthyle, et le d:i1D.éthvoxyéthane chauds et dans l'éthanol et contenant uniquement les éléments carbone, hydrogène, oxygène, azote et soufre et présentant une analvse éléentaire typique de EMI40.5 N 15,3 - lE,1 ; cl 51,7 - 52, 2,'; H 5,56 - 5,66'?t et Si 9,2 - 10ylcèf; 41.- Procédé de préparation d'un sel de calcium de la substance amphotère suivent la revendication 40.42.- Procédé de préparation d'un sel de sodium de la EMI40.6 substance aniphotère suivant la revendication li.0.43.- Procédé de préparation d'un sulfate de la substance amphotère suivant la revendication 40.44.- Procédé de préparation d'un chlorhydrate de la substance amphotère suivant la revendication 40.45.- Procd de préparation d'une substance efficace EMI40.7 pour inhiber la croissance de bactéries ": Gram-noaitir, choisie d-inf le croupe constitua par une substance amphotère t'uscB1)tjhle de fçrfrer des sels avec des acides et des Y.,i't811,r, et nr6se-trnt les bpn4e< d'absorption caractéristiques dans la r4frfon de lu <Desc/Clms Page number 41> EMI41.1 infra-rouge du spectre, lorsau' ell e est prantzl é e, dans du bromure de potassium, pour les longueurs d'onde suivantes, exprimées en microns : 2,98 ; 3,37 ; 4,20 - 4,28 (bande large); 6,05 ; 6,50 - 6,70 (bande large); 7,00 - 7,10 (Daller); 7,25 ; 7,70 - 7,95 (bande large); 8,28 ; 8,85- 8,98 (bande large); 9,17 ; 9,?5 - 9,50 (palier); 9,65 - 9,85 (palier);10,16 - 10,35 (bande larve); 10,75 ; 11,23 ; et 12,40 - 12,60 (palier), et caractérisée par un 27 pouvoir rotatoire dans le chloroforme d'environ [a]27 D 69 , par un point de fusion dans un tube capilliare, vide d'air et EMI41.2 C"Itanche., d'environ 226a-235 C, par la formation par hydrolyse acide d'un mélange d'amino-acides comprenant l'a-alanine, la thréonine, la glycine, une leucine et un plument choisi dans le groupe constitué par la cystine et la cystéine et par une solu- EMI41.3 bilité supérieure à 2 mg/cm3 dans la formamide, le chloroforme, le io6thyl-cellosolve, le butanol 1"n;odrment chaud, le dioxarïe modprment chaud et dans l'alcool amylique chaud, et inférieure à 2 mg/cm3 dans l'acétone, le benzène, l'acétate d'amyle, l'acétate EMI41.4 d'éthyle et le dim4thyioxyôthane chauds et dans l'éthanal et contenant uniquement les pigments carbone,, hydrogène, oxygène, azote et soufre et présentant une analyse élémentaire typique de EMI41.5 N- 15,3 - 18,1<;0151,7-52,2%} Fi'S,56 - 5,66% et 5.9,2 O,IPh avant les valeurs Rf de spectre suivantes : EMI41.6 <tb> Svstème <SEP> solvant, <SEP> -- <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> G <SEP> H <SEP> @@ <SEP> J, <SEP> K <SEP> L <SEP> <tb> EMI41.7 Valeur Rf 1;2 7 1 ,9,la d'p7com- l-R 10 8,9,10 10 10 9,JO EMI41.8 <tb> position <tb> où la composition de ces systèmes solvants est la suivante : A - Eau.B - Solution eaueuse de citrate de sodium à 10%. EMI41.9C - Solution a(1l1eus de nitrate de sodium à lr0 ', D - -qut::1pol satur d'eau.S - Mthyl-ipobutvi-ctone zn:Trdre.- .' lane de 100 parties 4e -'"th?'nol S 30 et 10, <Desc/Clms Page number 42> EMI42.1 parties piyéiiàine, l' 1 au TT 9,5 pr cw1'acT.d.e actcte 0 - /Eél rnge, en volumes de 80 parties de rztb.arr.ol , 5 parties d'scide Gc^tiase glacial et 15 rarties d'eAu.3 - ' utanol satura d'eau et eont:zta 2 daci6? ''?- toluene-sul foniaue.I - fl±11?nge de 100 em3 de hutH.11.o1 saturé :1'eau et ? cm3 d'acide acétique glacial.J - But&nol satura d'eau et contenant 2% diacide p- EMI42.2 toluëne-sulfoniaue et 2 f de ui?'4ridine.K - 100 parties de butanol saturé d'eau et 2 p.rBes d'acide 'P-tolu.'P-ne-sulfonique -olus 2 czn3 de pinrid3,xe plus 2 grammes d'acide lauriaue, et .L - Mélange de 2 -parties d'alcool isoamylique et. 1 nar- tie de chloroforme, sa.turf d'eau, ces bandes ôtant saturées d'une EMI42.3 solution aaueuse de citrate de sodium à 10%, relesau phi bzz. par de l'acide citrique et séchées avant d'appliquer l'échan- ti.llon, et les sels des acides et des métaux de cette substance. EMI42.4 46. - La présente invention avec toutes ses ca.ract/;1h- tiaues nouvelles et utiles.
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