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Publication number: BE522647A
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Description


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   RECHERCHE ET INDUSTRIE THERAPEUTIQUES, en abrégé "R.I.T.", résidant à GENVAL, 
PREPARATION DE SUBSTANCES ANTIBIOTIQUES. 



   La présente invention, due à Messieurs Pierre De Somer, docteur en médecine et Paul Van Dijck, ingénieur des industries agricoles, est rela- tive à un procédé de préparation d'une substance antibiotique dénommée gri- séomycine. 



   La résistance des souches bactériennes aux antibiotiques connus va en croissant. C'est ainsi qu'on isole fréquemment dans les laboratoires de bactériologie des staphylocoques résistant à tous les antibiotiques em- ployés, comme l'auréomycine, la   terramycine,  la pénicilline et la streptomy- cine 
On a découvert récemment deux nouveaux antibiotiques   l'érythro-   mycine et la magnamycine, qui inhibent principalement les microbes Gram-posi- tifs et les rickettsies, Leur spectre antibiotique est comparable à celui de la pénicilline. Ces deux antibiotiques présentent comme principal intérêt leur activité dans le cas de microbes devenus résistant aux autres antibio- tiques, surtout à la pénicilline. 



   Dans un vaste programme de sélection de streptomyces du sol, la demanderesse a pu isoler une substance appartenant au même groupe que l'éry- thromycine et le magnamycine, aussi bien par ses propriétés chimiques que par ses propriétés biologiques. Cette substance a été dénommée griséomycine, parce qu'elle provient d'un microorganisme de l'espèce des streptomyces du type Streptomyces Griseolus. La souche productrice est déposée à L'Université de Louvain, Département de Bactériologie, sous la référence Streptomyces 151. 



   Le mycélium de la souche submergé a une coloration neutre,sur la plupart des milieux de culture à base d'agar; après une incubation de quatre à cinq jours, la masse se couvre d'un mycélium aérien blanc et l'agar se co- lore de brun par la diffusion d'un pigment soluble. Après sporulation, la sur- face prend un aspect poudreux et une couleur légèrement blanchâtre, On trouve, à l'examen microscopique, un mycélium se divisant en conidies rondes ou ova- les ;il n'y a pas   d'anthrospores.   

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   La souche se développe encore très bien à une température dépas- sant 30 Co   @   ces conditions,on trouve seulement des formes bacillaires qui ne collent pas à la surface du milieu de culture et qui se désagrègent facilement. Le streptomyces en cause liquéfie la gélatine. En bouillon glu- cosé, le développement est maigre et le milieu s'acidifie légèrement. Comme source d'hydrates de carbone, la demanderesse a constaté que seuls.,   l'amidon   et le glucose donnent de bons résultatso Le saccharose, le maltose et le lac- tose ne sont pas fermentes. Les nitrates sont transformés en nitrites. Le lait n'est pas caillé, mais légèrement peptonisé. 



   Les données qui précèdent n'ont pas permis à la demanderesse d'i- dentifier le streptomyces d'après Bergey's   Manual.   Les différences entre ce streptomyces et les streptomyces Erythreus et Halstedii, respectivement pro- ducteurs de   l'érythromycine   et de la magnamycine, sont nettes. 



   D'après le docteur De Vries du   "Centraalbureau   voor schimmelcul- tures te Baarn", le streptomyces en cause appartient au type Streptomyces Griseolus Waksman, malgré les différences suivantes : 
1 / l'inversion de sucre est positive, 
2 / le mycélium aérien n'est pas grisâtre, mais blanc, après cul- ture pendant dix jours sur un milieu agar-glucose et agar-amidon, 
3 / Inaction'des diastases est bonne et non "fair", d'après la terminologie de Waksman, 
4 / le tallus a une coloration moins prononcée sur   agar-amidon,   
5 / le tallus ne devient pas noir, mais   brun-olive   sur le milieu pomme de tare-glycérine, 
6 / il ne se forme pas de mycélium aérien sur gélatine et "glucose   broth".   



   La présente invention a pour but l'obtention, dans de bonnes con- ditions de rendement et de pureté, de la nouvelle substance antibiotique. A cet effet, dans le procédé selon l'invention, on cultive artificiellement des microorganismes de l'espèce des streptomyces capables de produire la griséo- mycine, notamment des streptomyces du type Streptomyces Griseolus, on sépare la griséomycine du bouillon de culture, de préférence par extraction dans un solvant organique non miscible à l'eau à un pH alcalin, suivie d'une réextrac- tion en milieu aqueux à un pH acide. 



   Dans une forme de réalisation avantageuse, pour l'extraction de la griséomycine, on ajoute au milieu de culture filtré, environ 1/10 de son volume d'un solvant organique non miscible à l'eau, tel que le chloroforme, l'éther,   etc.009,   le pH du mélange étant ensuite amené entre 8 à   10.   



   Dans une forme de réalisation particulière, le solvant organique contenant la griséomycine est additionné d'eaû acidulée jusqu'à un pH compris entre 1; 5 et 2,de préférence avec agitation, puis alcalinisé à un pH de 7,5 environ, le cycle des opérations étant éventuellement répété plusieurs fois, pour arriver au degré de pureté désiré. 



   La présente invention a encore pour objet la nouvelle substance dénommée griséomycine et qui peut être obtenue par le procédé mentionné ci- avant. 



   D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description, donnée ci-après à titre d'exemples non limitatifs, de   di-   vers modes de réalisation du procédé selon l'invention. 



   On produit la nouvelle substance antibiotique, dénommée griséomy- cine, par culture dans des conditions très artificielles, des microorganismes qui la produisent en inoculant un milieu convenable avec des spores de l'or- ganisme ou par culture submergée. 



   Des variations considérables sont possibles dans la composition du milieu de culture, surtout en ce qui concerne la présence des constituants 

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 organiques et minéraux. 



   On peut utiliser comme   sourc.e   d'azote l'une des nombreuses sour- ces déjà employées dans les laboratoires de microbiologie pour la culture de   microorganismes;,   par exemple les peptones, les extraits de viandes, les ex- traits de levures, des farines de maïs, de soya, d'arachide, de poisson, etc.... Certaines de ces sources s'avèrent particulièrement avantageuses; ce sont le lait battu, le mais germé, la farine de palme et les hydrolysats de levure,, 
Comme hydrates de carbone, le glucose et l'amidon donnent seuls de sons résultats, dans la proportion de 10 à 50 grammes par litre du milieu de culture. La présence de ces hydrates de carbone n'est pas absolument né- cessaire pour arriver à une production, mais ils contribuent à l'augmentation du rendement. 



   Le microorganisme 151 ne semble pas avoir   d'exigences   spéciales en éléments minéraux pour la production de son antibiotique. Les sources d'hy- drates de carbone et de protéines,énumérées ci-dessus, contiennent   suffisam-   ment de ces éléments pour permettre une production optima de l'antibiotique. 



  Une teneur trop grande en métaux lourds (fer, cuivre, cobalt) nuit à la pro-   duction.   



   Il est avantageux, mais pas absolument nécessaire d'ajouter une proportion de carbonate de calcium variant entre 2 et 10 grs par litre, afin de neutraliser les acides qui sont formés pendant la culture par la fermenta- tion des sucres. 



   Les milieux de culture suivants conviennent bien pour la produc- tion de la griséomycine. a) Farine de poisson 20 grs 
Hydrolysat de levure 3 grs 
Sulfate ammonique 2 grs 
Chlorure de sodium 5 grs 
Fécule de pommes de terre-20 grs 
Huile de maïs 1cc 
Phosphate acide de potassium 0,2 gr 
Eau de la ville   1000cc.   



   Après 48 heures d'incubation à 26 C dans des flacons posés sur une table agitante, on obtient environ 220 microgrammes de griséomycine par ce. b) Hydrolysat de levure 3 grs 
Chlorure de sodium 5 grs 
Fécule de pomme de terre 15 grs 
Farine   d'arachides   10 grs 
Extrait de viande vendu sous le nom   "Liebig"   n  2003 5 grs 
Huile de maïs 1cc. 



   Eau de la ville   lOOOcc.   



   Le pH est réglé à 6,8 avec de la soude à   30%.   



   Après 48 heures d'incubation à 26 C dans des flacons posés sur une table agitante, on obtient environ 280 microgrammes de griséomycine par ce. c) Hydrolysat de levure 3 grs 
Sérum de lait 20 grs 

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 EMI4.1 
 
<tb> Farine <SEP> de <SEP> poisson <SEP> 3 <SEP> grs
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 30 <SEP> grs
<tb> 
<tb> 
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb> 
<tb> 
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> gr <SEP> s <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Huile <SEP> de <SEP> mais <SEP> 1cc.
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  Eau. <SEP> de <SEP> la <SEP> ville <SEP> 1000cc
<tb> 
 
Après la même incubation que celle indiquée précédemment,la pro- duction de mycélium est abondante et après 72 heures, la teneur en griséomy- sine s'élève à environ 450 microgrammes par ce. 



   Dans les exemples cités, l'eau de la ville peut être remplacée par de l'eau distillée 
En utilisant les   milieux-décrits   ou d'un type équivalent, on peut produire la griséomycine en culture, soit immobile, soit immergée.On obtient les meilleurs résultats à une température comprise entre 24 et 28 C et en maintenant le pH de la culture entre 6 et 7. Cette dernière condition est réalisée ou bien en ajoutant du carbonate de calcium, comme il a été dit pré-   cédemment,   ou bien en neutralisant le milieu toutes les 24 heures au moyen de soude, de potasse, de carbonate de sodium ou d'une autre substance alca- line, qui ne nuit pas au développement du   microorganisme.   



   Pour séparer la substance antibiotique du bouillon de culture et pour la purifier ultérieurement,on peut adopter le procédé selon la présente invention, dans lequel on procède à l'extraction par un solvant organique à un pH alcalin et à une réextraction dans l'eau à un pH acide. L'extraction se fait sur le filtrat du milieu de culture préalablement acidifié à un pH de 2 environ et éventuellement additionné d'un agent filtrant. On peut en principe se servir pour l'extraction de tous les solvants organiques non mis- cibles à l'eau, par exemple l'éther, le chloroforme,le benzène d'éthyle, le méthyl isobutylcétone,   etc....   



   L'alcanisation du milieu se fait à un pH de 8 à 10 de préférence au moyen d'une solution alcaline à une concentration variant de 0,1 à 10 N. 



  On opère en présence d'un solvant organique pour éviter la destruction de la substance   active.   En effet, la griséomycine base est stable quand elle est dissoute dans un solvant organique, mais se détériore rapidement en mi- lieu aqueux. Il n'est pas nécessaire de dépasser un volume de solvant orga- nique égal à 1/10 du volume du milieu de culture à traiter.On décante le solvant riche en antibiotique et on procède à la réextraction en agitant le solvant décanté en présence d'un acide dilué.La   griséomycine   se concentre dans la phase aqueuse. 



   Après deux ou trois opérations similaires, on peut séparer un sol- vant riche en griséomycine et suffisamment pur pour donner soit, sous un pH alcalin, un précipité que l'on fait sécher,soit, sous un pH acide, du chlor- hydrate de griséomycine que   l'on   recueille en cristaux, après évaporation du solvant. 



   Les détails des différentes phases du procédé sont donnés dans les exemples suivants : 
 EMI4.2 
 EXEHPIE .1- On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante 
 EMI4.3 
 
<tb> Bacto-peptone <SEP> 5 <SEP> grs
<tb> 
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> n  <SEP> 1011 <SEP> vendu
<tb> par <SEP> la <SEP> Compagnie <SEP> Liebig <SEP> 5 <SEP> grs
<tb> 
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5 <SEP> grs
<tb> 
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb> 
 

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 EMI5.1 
 
<tb> Fécule <SEP> de <SEP> pommes <SEP> de <SEP> terre <SEP> 15 <SEP> grs
<tb> 
<tb> Huile <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 1cc.
<tb> 
<tb> Eau <SEP> de <SEP> la <SEP> ville <SEP> 1000cc.
<tb> 
 



   On introduit   80cco   de ce milieu dans des flacons de 300oc. et on stérilise 25 minutes à 120 C Après refroidissement, on inocule les flacons, soit avec une suspension de spores, obtenue dans un tube d'agar, soit avec un inoculum végétatif âgé de 24 heures et de même composition que le milieu de production,, 
Les flacons sont alors secoués sur des tables   agitantes,   ayant un déplacement d'environ 25 mm. et tournant à 200 tours par minute, pendant une période de 48 heures à 26 C Après ce temps, on constate que le bouillon de fermentation présente une 'activité biologique de 240 microgrammes par   ce.   en- vers le bacillus subtilis, suivant la méthode de diffusion en gélose à partir de petits cylindres ("Cylinder-plate ASSAY   method").   



   Le pH du bouillon est d'environ 6,8 à la fin de la fermentation. 



  Pour faciliter la filtration et pour bien dissoudre la substance active, on ajoute de l'acide chlorhydrique 1/2 N. pour régler'le pH à 2, on agite dans le liquide une petite quantité d'un agent filtrant, par exemple la matière vendue sous le nom de   "clarcel     DIC"   et on filtre le mélange sur des filtres du type   Buchner.   Le pH du filtrat est ensuite amené à 8 et on ajoute 10cc. de chloroforme pour chaque   100cc.   de filtrat. 



   On agite pendant 15 minutes à la température ambiante; après ce temps, on laisse reposer le mélange pour que les liquides se séparent. Le bouillon, qui est épuisé par le chloroforme, est jeté et on récupère la cou- che de chloroforme. 



   Par l'extraction,88% de la substance active sont passés dans le solvant organique. Ce dernier est évaporé sous vide jusqu'à siccité et on obtient une'substance brunâtre, résineuse. On ajoute alors trois fois, suc- cessivement, 1,5cc. d'eau distillée au résidu d'évaporation et on règle cha- que fois le pH à 2 avec de l'acide chlorhydrique dilué 1/2 N. Les fractions ainsi obtenues sont réunies, ce qui donne un liquide brunâtré contenant à peu près   60%   de l'activité initiale.A ce liquide, on ajoute, goutte à gout- te,de la soude à   30%   pour arriver à un pH de 7,5. 



   Par le changement de pH, il se forme un précipité abondant qui contient la substance active. Ce précipité est recueilli et séché sous vide; on obtient ainsi une poudre jaunâtre qui, à l'essai biologique indiqué ci- avant, donne une activité de 800 microgrammes par   milligramme.   La substance obtenue de cette façon présente une toxicité faible pour les souris.    



  EXEMPLE On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante s   
 EMI5.2 
 
<tb> Farine <SEP> de <SEP> poisson <SEP> 20 <SEP> grs
<tb> 
<tb> Levure <SEP> séchée <SEP> de <SEP> brasserie <SEP> 3 <SEP> grs
<tb> 
<tb> 
<tb> Sulfate <SEP> ammonique <SEP> 2 <SEP> grs
<tb> 
<tb> 
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb> 
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 30 <SEP> grs
<tb> 
<tb> 
<tb> Huile <SEP> de <SEP> mais <SEP> lcco
<tb> 
<tb> 
<tb> Eau <SEP> de <SEP> la <SEP> ville <SEP> 1000cc.
<tb> 
 



   On règle le pH à 6,8 avec de la soude à 30% et on ajoute 4 grs de carbonate de calcium . 



   Dans des flacons de 300cco,on introduit 80 cc. du milieu préparé et on stérilise 25 minutes à   120 C.   Après refroidissement, les flacons sont 

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 ensemencés avec   3%   d'ion inoculum végétatif,, provenant   d'une   culture agitée pendant 24   retires   à   26 C.   



   Le milieu que   1 *on   utilise pour obtenir la culture de départ con-   tient :    
 EMI6.1 
 
<tb> Peptone <SEP> blanche <SEP> 5 <SEP> grs
<tb> 
<tb> Hydrolysat <SEP> de <SEP> levure <SEP> 3 <SEP> grs
<tb> 
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb> 
<tb> Fécule <SEP> de <SEP> pommes <SEP> de <SEP> terre <SEP> 15 <SEP> grs
<tb> 
<tb> Eau <SEP> de <SEP> la <SEP> ville <SEP> 1000cc.
<tb> 
 



   On introduit 80cc. de ce dernier milieu dans des flacons de 380cc. et on stérilise comme indiqué pour le milieu de production. 



   Après 48 heures d'inoculation dans le milieu de production,à 26 C et en agitant comme dans l'exemple I, on trouve, au dosage biologique, une activité de 220 microgrammes par ce. 



   Le bouillon de fermentation est séparé des substances solides en suspension dans le milieu, par filtration après acidification préalable à l'a- cide sulfurique à 10%, pour amener le pH à 2. La filtration peut être faci- litée par l'addition d'un agent filtrant. 



   Le pH du bouillon clair est ensuite réglé à 8 environ et on   ajou-   te 10% en volume de benzol. Le bouillon et le solvant organique sont   intime-   ment mélangés par une agitation violente pendant 15 minutes environ. On peut répéter l'extraction décrite pour en augmenter l'efficacité. 



   Par la double extraction, il passe 80% de la substance active dans le benzol. Après séparation par centrifugation du solvant organique,on a- joute un volume d'eau distillée égal à 5% du volume du benzol et on acidifie avec de   l'acide   chlorhydrique 1/2 N jusqu'à un pH de 1,5. Après une violente agitation pendant 15 minutes, comme pour la première extraction, on récupère la phase aqueuse par centrifugation. On refait de la même façon une deuxième réextraction dans l'eau. 



   La griséomycine a passé alors dans la phase aqueuse à raison de 60% environ de la quantité initiale.On ajoute ensuite un volume de chloro- forme égal à 10% du volume d'eau, on ajuste le pH à 8 avec de la soude à 30%, on mélange intimement et on sépare le chloroforme par centrifugation. La gri- séomycine passe pour ainsi dire complètement dans le solvant organique; la perte due au dernier traitement est donc   minime.   



   Ensuite, pour chaque 10cc. de chloroforme, on ajoute 1cc. d'eau distillée et on agite fortement,au moyen d'un agitateur mécanique, en acidi- fiant le mélange avec de l'acide chlorhydrique 12 N, jusqu'au moment où l'on arrive à un pH stable de   2.   



   On centrifuge le mélange pour séparer les deux phases. L'eau, qui contient beaucoup d'impuretés et peu de substance active,est jetée.On ré- pète encore deux fois le traitement, qui a pour but une purification et la transformation de la substance basique en chlorhydrate de griséomycine. 



   Le chloroforme contient à peu près 55% de l'activité initiale. 



  Il est évaporé sous vide jusqu'à complète siccité. On obtient de cette façon, un sel cristallin de griséomycine titrant 1000 microgrammes de griséomycine par milligramme de produit. 



   La griséomycine est une substance alcaline peu soluble dans l'eau (¯2 mg par ce.),mais très soluble dans beaucoup de solvants organiques, tels que le chloroforme,   l'éthanol,   le butanol, le benzol, l'acétone, l'acétate d'éthyle. La substance pure est blanche et a un goût amer. Elle cristallise en lames et fond, probablement avec décomposition, entre 76 et 80 C. 

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    En solution de 1% dans le chloroforme, elle a un pouvoir rotatoire o( 25 = + 52 . Son spectre infra-rouge dans le chloroforme présente une série de maxima à 3471, 2932, 2800,1748, 1700, 1649, 1641, 1461, 1384, 1363,     1276,   1167, 1113, 1097,   1077   982, 956, 944, 883, 835 cm-1. 



   Le chlorhydrate de griséomycine est très soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol et le chloroforme, peu soluble dans beaucoup d'autres solvants organiques. Ce sel fond à   120 Co   Il est précipité de la solution aqueuse par l'acide picrique,les sels de Reinecke et les autres précipitants des alcaloïdes. 



   La stabilité de la griséomycine, contrairement à celle de l'éry- thromycine, est très bonne pour un pH de 2. Le produit est rapidement détruit en milieu alcalin et après chauffage à   100 C.   



   Le poids moléculaire de la griséomycine serait d'environ 530 et la formule brute du chlorhydrate serait de C25 H46 N1 O8 C11. 



   Il résulte de ce qui précède que la   griséomycine   a beaucoup de caractéristiques communes avec la magnamycine et   l'érythromycine,   notamment en ce qui concerne la solubilité dans l'eau et'les solvants organiques, le spectre infra-rouge, les activités biologiques, etc..., mais que les diffé- rences entre ces substances sont cependant nettes. C'est ainsi notamment que le point de fusion de la griséomycine est particulièrement bas et que son pouvoir rotatoire a une valeur très différente de celui des deux autres substances. 



   La comparaison des spectres antibiotiques résulte du tableau   ci-   après dans lequel la concentration minium inhibant complètement le développe- ment des microbes examinés est donnée pour la griséomycine,   l'érythromycine   et la magnamycine. 
 EMI7.1 
 
<tb> 



  Organismes <SEP> :Concentration <SEP> bactériostatique
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<tb> 
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<tb> Organismes <SEP> minimum
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<tb> : <SEP> Erythro- <SEP> Magna- <SEP> : <SEP> Griséo-
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<tb> : <SEP> mycine <SEP> : <SEP> mycine <SEP> : <SEP> mycine
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<tb> Pseudomonas <SEP> aeroginosa <SEP> :> <SEP> 1000 <SEP> :> <SEP> 1000 <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> 
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<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> (var.aureus) <SEP> 0.75 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> :

   <SEP> 0.5
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<tb> 
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> (var.aureus)
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<tb> 
<tb> (résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> pénicilline) <SEP> - <SEP> - <SEP> 0.5
<tb> 
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<tb> Neisseria <SEP> (isolé <SEP> d'un <SEP> cas <SEP> clinique) <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 5
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<tb> 
<tb> 
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<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 0.2 <SEP> 0.2 <SEP> s <SEP> 0.2
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<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus- <SEP> -. <SEP> 0. <SEP> 3
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<tb> Corynebacterium <SEP> pseudodiphteriae <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 2
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<tb> Corynebacterium <SEP> diphteriae <SEP> 0.2 <SEP> 0.2 <SEP> 0.2
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<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> :> <SEP> 1000 <SEP> :

  > <SEP> 1000 <SEP> >1000
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<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> :> <SEP> 1000 <SEP> > <SEP> 1000
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<tb> Bacillus <SEP> typhosus <SEP> 400 <SEP> >1000 <SEP> : <SEP> > <SEP> 1000
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<tb> Shigella <SEP> Flexner <SEP> 400 <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> : <SEP> > <SEP> 1000
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<tb> Shigella <SEP> dysenteriae <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> >1000
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<tb> Brucella <SEP> abortus <SEP> 1000 <SEP> 200 <SEP> :>1000
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<tb> Bacillus <SEP> mesentericus <SEP> 1.4 <SEP> 0.2 <SEP> : <SEP> 1.3
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<tb> Bacillus <SEP> mycoides <SEP> : <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 0.2
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<tb> 
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> s <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0.2 <SEP> :

   <SEP> 0.2
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<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 1.2 <SEP> : <SEP> 0.5 <SEP> : <SEP> 0.5
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<tb> Pseudo <SEP> anthrax <SEP> (isolé <SEP> d'un <SEP> cas <SEP> clinique) <SEP> 7- <SEP> 0. <SEP> 7 <SEP> 0. <SEP> 7
<tb> 
 

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 EMI8.1 
 
<tb> organismes <SEP> Concentration <SEP> bactériostatique
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 EMI8.2 
 rgansme 1IlJJlJ.mum .. :Erythro- : Magna- Griséo- ; mycine : mycine : mycine l-fycobacteri-#'l tuberculosis (HRV37) - - 187 le02acterium lacticola 0 e.2 0.2 0.2 Hyccbacterium smegma 15 0.2 15 Candida albicans )1000 > 1000 ]I0p0 
On peut en déduire que la griséomycine est active pour les mi- crobes Gram-positifs et pour les Neisseria. Les   Gram-négatifs   sont seule- ment inhibés par les très fortes doses. Les trois spectres montrent beaucoup de ressemblance.

   L'érythromycine serait un peu plus active pour certains   Gram-négatifs;   elle exerce moins d'activité pour le bacille   anthracoïde   précité que la griséomycine. 



   Il existe, d'autre part, une résistance croisée entre l'érythro- mycine, la magnamycine et la griséomycine, en ce sens que des microbes deve- nus résistant à un de ces antibiotiques, sont également résistant aux deux autres. Ce phénomène dénote une action similaire dans le métabolisme micro- bien. 



   La griséomycine appartient donc au même groupe que l'érythromycine et la magnamycine, mais elle se distingue cependant nettement de ces deux antibiotiques. 



   Il doit être entendu-que l'invention nest nullement limitée aux modes de réalisation décrits et que bien des modifications peuvent être ap- portées à ceux-ci sans sortir du cadre du présent brevet. 11 n'est pas exclu, notamment qu'il existe d'autres souches de départ que celle décrite ci-a- vant. 



   REVENDICATIONS. le Procédé de préparation d'une substance antibiotique dénommée griséomycine, caractérisé en ce qu'on cultive artificiellement des microor-   ganismes   de l'espèce des streptomyces capables de produire la griséomycine, notamment des streptomyces du type Streptomyces Griseolus, on sépare la gri- séomycine du bouillon de culture, de préférence par extraction dans un sol- vant organique non miscible   à   l'eau à un pH alcalin, suivie d'une réextrac- tion en milieu aqueux   à   un pH acide.

Claims

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fer- mentation s'effectue en maintenant dans la culture un pH compris entre 6 et 8.

3. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, ca- ractérisé en ce que la fermentation s'effectue à une température comprise entre 24 et 28 C pendant un temps compris entre deux et quatre jours.

4. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fermentation s'effectue dans un milieu de culture contenant une source d'azote assimilable, un hydrate de carbone, de préfé- rence du glucose ou de l'amidon dans la proportion de 10 à 50 grammes par litre du milieu de culture, et de l'eau.

5. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications précédentes, caractérisé en ce que, pour l'extraction de la griséomycine,on ajoute au milieu de culture filtré, environ 1/10 de son volume d'un solvant organique <Desc/Clms Page number 9> non miscible à leau, tel que le chloroforme, l'éther, etc...,, le pH du mé- lange étant ensuite amené entre 8 à 10.

60 Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le solvant organique contenant la griséomycine est additionné d'eau aci- dulée jusque un pH compris entre 1, 5 et 2, de préférence avec agitation, puis alcalinisé à un pH de 7,5 environ, le cycle des opérations étant éven- tuellement répété plusieurs fois, pour arriver au degré de pureté désiré.

7. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le liquide riche en substance active, obtenu après le cycle d'opérations précité, est amené à un pH compris entre 7 et 8, le précipité obtenu étant séché,de préférence sous vide.

80 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le li- quide riche en substance active, obtenu après le cycle d'opérations précité, est amené à un pH de 2 environ, le solvant précité, qui contient alors du' chlorhydrate de griséomycine étant séparé, par exemple par centrifugation, puis évaporé, de préférence sous vide, ce qui permet de recueillir le chlorhy- drate sous forme cristalline.

9. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 5 à 8, carac- térisé en ce que, avant l'extraction, on filtre le milieu de culture conte- nant la griséomycine, après acidification à un pH égal à 2 environ, avec addition éventuelle d'un agent filtrant..

10.Substance antibiotique dénommée griséomycine, alcaline, peu soluble dans l'eau mais très soluble dans les solvants organiques tels que le chloroforme, l'éthanol, le butanol, le benzol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, qui cristallise en lames, qui fond, probablement avec décomposi- tion, entre 76 et 80 C et qui, lorsqu'elle est pure, est blanche et a un goût'amer 11. Substance selon la revendication 10,caractérisée en ce que, en solution de 1% dans le chloroforme, elle a un pouvoir rotatoire Ó D25= + 32 et en ce que son spectre infra-rouge dans le chloroforme présenteune série de maxima à 3471, 2932, 2800, 1748, 1700, 1649, 1641, 1461, 1384, 1363, 1276, 1167, 1113, 1097, 1077, 982, 956, 944, 883, 835 cm-1.

12. Substance selon l'une ou l'autre des revendications 10 et 11, caractérisée en ce que son poids moléculaire est d'environ 530 et en ce que la formule brute du chlorhydrate est C25 H46 N1 Og C11.

13. Substance antibiotique dénommée griséomycine et son procédé de préparation, tels que décrits ci-avant.

N.R. datée du 2-10-1953.

Page 4 aligne 29, il faut lire "alcalinisation" et non "alcanisa- tion".

Page 7, ligne 24,il fait lire s "minimum" et non "minium"