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La présente invention a pour objet des substances thérapeutiques nouvelles que l'on a identifiées comme étant des antibiotiques du groupe déméthyltétracycline (comprenant la déméthyltétracycline, la chlorodéméthyltétracycline et la. bromodéméthyltétracycline) et leurs épimères .
Les nouveaux antibiotiques suivant la présente invention se forment dans un processus de fermentation dans lequel on utilise des souches mutantes de Streptomyces aureofaciens. Les nouveaux antibiotiques semblent étroitement apparentés aux membres de la famille tétracycline décrits antérieurement, mais ils en sont nettement différents..Ils sont caractérisés par une stabilité marquée aussibien en milieu alcalin qu'en milieu acide, et sont supérieurs aux tétracyclines à cet égard. Ils ont une activité antibioti- que similaire et peuvent servir aux mêmes usages, et de la même façon'générale, que les tétracyclines actuellement con- nues .
Suivant l'invention, on fournit un procédé pour la préparation des antibiotiques du groupe déméthyltétracycline (comprenant la déméthyltétracycline, la chlorodéméthyltétra- cycline et la bromodéméthyltétracycline) et de leurs épimères, procédé qui consiste à faire fermenter dans des conditions aérobies un milieu nutritif aqueux d'une teneur réglée en ions'chlorure et/ou bromure, avec une souche de S. aureofa- ciens productrice de déméthyltétracycline, à récupérer si on le désire les antibiotiques déméthyltétracycline obtenus, à partir du milieu de fermentation, et, si on le désire, à ajuster le pH d'une solution concentrée de cet antibiotique pour en obtenir les épimères .
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Chacun des antibiotiques tétracyclines antérieure- ment connus qui sont produits par fermentation avec le S. aureofaciens dans des conditions particulières, à savoir, la tétracycline, la chlorotétracycline et la bromotétracycli- ne possède sa contre-partie dans la nouvelle série d'anti- biotiques. Autrement dit, suivant le procédé de la présente invention, en utilisant certaines souches mutatntes de S. aureofaciens qui seront plus particulièrement décrites ci- après, on obtient une substance antibiotique similaire à la tétracycline, une autre similaire à la chlorotétracycline et une autre analogue à la bromotétracycline. Le nouvel anti- biotique particulier qui se forme à la suite du processus de fermentation dépend de la nature du milieu nutritif et des autres conditions du processus.
Dans un milieu exempt de chlorures, l'antibiotique qui prédomine est l'analogue non chloruré de la tétracycline. Dans un milieu riche en brome, il se forme l'antibiotique bromé; et dans un milieu riche en chlore, l'antibiotique prédominant sera un antibiotique chlo- ré analogue à la chlorotétracycline. Ordinairement, il se forme aussi de la tétracycline, de la chlorotétracycline et/ou de la bromotétracycline pendant le processus de fermen- tation, et leurs proportions relatives dépendent de la teneur du milieu en ions chlorures et/ou bromure, et de la souche de microorganisme utilisée- En sélectionnant soigneuesment la souche de S. aurecfaciens, il est possible d'éliminer presque complètement la formation de ces antibiotiques connus du groupe tétracycline.
Les nouveaux antibiotiques suivant la présente invention peuvent être convertis en épimères comme décrits ci-après, de façon similaire à la conversion des tétracycli- nes en quatrimycines .
Les déméthyltétracyclines chlorées et bromées, suivant la présente invention peuvent être déshalogénées par
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hydrogénation, avec un catalyseur palladium sur charbon de bois, de même que l'on convertit la chloroté-gracycline ou la bromotétracycline en tétracycline pure et simple .
Des analyses chimiques, et l'examen des propriétés chimiques et physiques des nouveaux composés, indiquent qu'ils diffèrent essentiellement des tétracyclines correspondantes par le fait qu'ils contiennent un groupe méthyle en moins. Le groupe méthyle en question est très vraisemblablement celui qui occupe la position 6 sur le noyau naphtacène des tétra- cyclines . En conséquence, l'analogue de la tétracycline s'appellera 4-diméthylamino-l,4, 4a,5,5a,6,11.,12a-octahydro- 3,6,10,12,12a-pentahydroxy-1,11-dioxo-2-naphtacène-carboxa.- mide. Dans le cas des analogues chlorés et bromes, le sub- stituant halogène doit être en position 7, et on les dénomme- ra en conséquence.
Les noms courants appropriés de ces nou- veaux antibiotiques seraient déméthyltétracycline, chlorodémé- thyltétracycline et bromodéméthyltétracycline, et on utilise- ra ici cette nomenclature. Mais il est entendu que la struc- ture postulée n'a pas été prouvée par une synthèse non équi- voque, et pourrait"être trouvée erronée par la suite. La pré- sente invention concerne de nouveaux composés qui possèdent des propriétés déterminées, et n'est pas limitée par un sys- tème particulier de nomenclature ni par une structure proba- ble.
Les nouveaux antibiotiques suivant l'invention sont produits par certaines souches mutantes de S. aureofaciens.
Ces souches sont sans aucun doute de l'espèce Streptomyces aureofaciens, puisqu'elles dérivent de la souche primitive- A-377 isolée par le Dr B.M. Duggar, et déposée aux Northern Regional Research Laborabories à Peoria (Illinois, Etats-Unis), et indexées en ce Laboratoire sous le n NRRL 2209. Les mutations comportant un traitement de la souche
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A-377 par des agents mutagènes, comprenant successivement l'irradiation ultra-violette, la nicotine et le chlorhydrate de 2,2-dichloro-N-méthyldiéthylamine, ont été utilisées pour créer l'une des souches. Diverses' autres souches ont été ob- tenues par mutation' spontanée et par traitement à l'aide d'agents mutagènes .
Ces diverses souches qui produisent les nouveaux antibiotiques en différentes proportions et avec des rendements divers, présentent les caractéristiques générales de l'espèce .aureofaciens. Elles diffèrent un peu entre elles et aussi des souches de S. aureofaciens antérieurement décri- tes, principalement par leur pigmentation et leur propriété de produire les nouveaux antibiotiques. Bans la plupart des - cas, on note un pigment brun-rougeâtre lorsque les microorga- nismes sont cultivés sur des milieux de culture ordinaires.
Les nuances du pigment varient de la nuance pêche ou du brun cuivré jusqu'à un acajou foncé, suivant la souche particulière et le milieu nutritif utilisé. Bien que la propriété de pro- duire les nouveaux antibiotiques de la présente invention 'soit généralement associée à des souches qui présentent ce type de pigmentation, cette formation de pigment et la produi - tion des nouveaux antibiotiques ne sont pas nécessairement des propriétés solidaires. Toutes les souches étudiées pro- duisent de la chlorotétracycline , et généralement de la té- ' tracycline, bien que les Reportions relatives de ces anti- biotiques varient considérablement suivant la nature du mi- lieu de fermentation, les conditions de fermentation et la souche particulière choisie.
Dans certains cas, la production de chlorotétracycline et de tétracycline est très faible, de l'ordre de quelques % sur le total de l'antibiotique produit par la fermentation.
Les souches mutantes qui produisent les nouveaux antibiotiques de la présente invention possèdent les mêmes caractéristiques générales que les souches qui produisent
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les tétracyclines, et elles diffèrent entre elles de la même façon générale que les souches productrices de tétracyline diffèrent l'une de l'autre, ainsi qu'on l'a expliqué dans plusieurs articles scientifiques qui ont été publiés. Bien- que de nombreuses souches de S, aureofaciens soient à la dis- position du public dans les collections de cultures et aient été décrites dans la littérature scientifique, les données suivantes serviront à illustrer le type de va.riation des nou- velles souches, par rapport à la souche primitive A-377 qui se trouve sous la désignation NRL 2209.
Comparsison des souches de S. aureofaciens
S-604 et A-377 sur divers milieux.-
Le Streptomyces aureofaciens souche S-604 qui produit la chlorodéméthyltétracycline et la déméthyltétracy- cline a été comparé au Streptomyces aureffqciens souche A-377 (NRRL 2209) par observation des caractéristiques de croissance sur divers milieux incubés à 26-27 C.
Les observations faites sont les suivantes :
1.- Glycérol, asparagine, extrait de boeuf, agar-agar:
EMI5.1
<tb> Glycérol <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Asparagine-L <SEP> 0,05%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 0,2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,05%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> 1,5%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillé <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> ajustement <SEP> du <SEP> pH <SEP> 100%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> par <SEP> KOH <SEP> à <SEP> 50%:
<SEP> 7,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,1
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
Streptomyces aureofaciens
EMI6.1
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Croissance <SEP> Abondante, <SEP> couleur <SEP> Assez <SEP> abondante
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "Venetian <SEP> Red;
<SEP> ( )
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Abondants, <SEP> blanc <SEP> à <SEP> Blancs, <SEP> unifor-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "Rose <SEP> grey" <SEP> ( ) <SEP> mes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporulation <SEP> Légère, <SEP> devenant <SEP> Aucune
<tb>
<tb>
<tb> abondante
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusi- <SEP> Brun-rougeâtre <SEP> Jaune
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ble
<tb>
EMI6.2
Envers ItBro\"1l1 Mahogany"( ) Jaune à jaune
EMI6.3
<tb> orange <SEP> clair
<tb>
( ) Désignation des nuances d'après le "Color
Harmony Manual" 3ème édition, édité par
Container Corporation of America 2.-'Dextrine, Czapek-Dox, agar-agar .-
EMI6.4
<tb> Dextrine <SEP> 1%
<tb>
<tb> NaN03 <SEP> 0,2%
<tb>
<tb> K2HP04 <SEP> 0,1%
<tb>
EMI6.5
²S04.7H20 0,
05%
EMI6.6
<tb> KC1 <SEP> 0,05%
<tb>
EMI6.7
. FeSO.?H0 0,001%
EMI6.8
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> 1,5%
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée, <SEP> q, <SEP> s. <SEP> pour <SEP> 100,0%
<tb>
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,0
<tb>
EMI6.9
Streptomyces aureofaciens -
EMI6.10
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Croissance <SEP> Rare, <SEP> hyaline <SEP> Profuse
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Absents <SEP> Abondants, <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lead <SEP> grey" <SEP> ( )
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Globules <SEP> superficiels
<tb>
<tb>
<tb> incolores
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporulation <SEP> Aucune <SEP> Abondante
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Aucun <SEP> Léger:
<SEP> jaune <SEP> pâle
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Envers <SEP> non <SEP> pigmenté <SEP> Non <SEP> pigmenté
<tb>
( ) voir note précédente.
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
3. -Liqueur de macération de mais, èJ.1ar-agar:
EMI7.2
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,4%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 1,0%
<tb>
EMI7.3
jgSO,.7H 0 0,025% 1\H2P04 0,2% (NH4)zHP04 0,2% Agar-agar Bacto 2,0
EMI7.4
<tb> Eau <SEP> du <SEP> robinet, <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> pour <SEP> 100,0%
<tb>
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 63,
<tb>
EMI7.5
Streptomyces aurenfaciens
EMI7.6
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> 'Souche <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb> Croissance <SEP> Profuse <SEP> Profuse
<tb>
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Abondants <SEP> "rose <SEP> Abondants,
<tb> taupe" <SEP> (')foncé <SEP> "Beaver"
<tb>
EMI7.7
Sporulation Très abondante, LÎr.èfu¯ab.ondteJ,
EMI7.8
<tb> uniforme <SEP> uniforme
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Très <SEP> concentré, <SEP> Jaune <SEP> verdâtre
<tb> "deep <SEP> brown" <SEP> à <SEP> clair
<tb> "deep <SEP> brown <SEP> Mahogany"
<tb>
EMI7.9
Envers "Brown 3Mariogany" "Covert Brown"
EMI7.10
<tb> foncé <SEP> ( ) <SEP> ( <SEP> ) <SEP>
<tb>
( ) voir notes précédentes.
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
4.- Autres milieu-x Streptomyces aureofaciens
EMI8.2
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> nutri- <SEP> Croissance <SEP> médiocre, <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> a-
<tb>
<tb> tif <SEP> "Tauppe <SEP> brown" <SEP> à <SEP> bondante. <SEP> Pas <SEP> d'hy-
<tb>
<tb> "dark <SEP> brown"( ).Pas <SEP> phes <SEP> aériens. <SEP> Envers
<tb>
<tb>
<tb> d'hyphes <SEP> aériens. <SEP> :
jaune <SEP> pâle.Pigment
<tb>
EMI8.3
Envers "Taupe brown" soluble jaune à jaune
EMI8.4
<tb> ( ).Pigment <SEP> soluble <SEP> ne <SEP> brunâtre <SEP> clair.
<tb>
<tb> brun <SEP> rougeâtre
<tb>
<tb> Glucose,aspara- <SEP> Croissance <SEP> abondante. <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> a-
<tb>
<tb> gine, <SEP> extrait <SEP> de <SEP> Gros <SEP> hyphes <SEP> aériens <SEP> bondante.Hyphes <SEP> aé-
<tb>
<tb> viande, <SEP> agar-agar <SEP> bigarrés:"rose <SEP> taupe" <SEP> riens <SEP> blancs <SEP> deve-
<tb>
EMI8.5
ou "fawn" ou IIcamelll(O)nant de plus en plus.
EMI8.6
<tb>
-Sporulation:abondante.- <SEP> gris <SEP> quand <SEP> la <SEP> forma-'Envers:"Taupe <SEP> brown" <SEP> tion <SEP> de <SEP> spores <SEP> aug-
<tb> ( ).Pigment <SEP> soluble <SEP> mente.Envers:jaune
<tb> brun <SEP> rougeâtre. <SEP> clair.Pigment <SEP> soluble <SEP> jaune <SEP> clair.
<tb>
<tb>
Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Croissance <SEP> profuse <SEP> hu- <SEP> Croissance <SEP> profuse
<tb> mide,lisse,nodulée: <SEP> lisse,humide,nodu-
<tb>
EMI8.7
"Dark broim j-iahogaily" lée:"Light Nie llon ( ) avec trace de yellow"( ) à "asti- "peàch tan"( ).Hyphes que rose"( ).Hyphes
EMI8.8
<tb> aériens <SEP> :absents <SEP> à <SEP> abon- <SEP> aériens:trace.Pas
<tb>
<tb> dants,devenant <SEP> blancs <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble.
<tb>
EMI8.9
à 11 C ame lÉ! ( ) . Sporula-
EMI8.10
<tb> tion <SEP> abondante <SEP> dans
<tb>
<tb> les <SEP> zones <SEP> de <SEP> forte <SEP> for-
<tb>
<tb> mation <SEP> d'hyphes <SEP> aériens.
<tb>
<tb>
Pigment <SEP> soluble <SEP> "choco-
<tb>
EMI8.11
late" ( ) "chocolate
EMI8.12
<tb> broi,ni" <SEP> ( <SEP> <SEP> ) <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Lait <SEP> pourpre <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> crois- <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sance <SEP> "Deep <SEP> red <SEP> Maho- <SEP> croissance <SEP> blanc <SEP> à
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> gany"( ). <SEP> Peu <SEP> de <SEP> varia- <SEP> jaune <SEP> pâle.
<SEP> Pe <SEP> u <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> tion <SEP> notable <SEP> du <SEP> pH,peu <SEP> variation <SEP> notalde
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> peptonisation <SEP> appa- <SEP> du <SEP> pH, <SEP> peu <SEP> de <SEP> pept
<tb>
<tb>
<tb> rente.Légère <SEP> réaction <SEP> nisation <SEP> apparente
<tb>
<tb>
<tb> colorée <SEP> faussement <SEP> alca- <SEP> en <SEP> 15 <SEP> jours
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> line <SEP> due <SEP> à <SEP> la <SEP> diffusion
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> du <SEP> pigment <SEP> soluble.
<tb>
( ) voir notes précédentes.
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
Sur tous les agar-agars, 'excepté dextrine ' Czapek-Doc,, mais y compris la c'u1.t\\1.r'e inclinée sur pomme de terre, le .aurèofacien9 souche 'S-.604 ,produit une pigmen- tation fo'Hcee caractéristrque, apparaissant généralement ave la croissance. De même, il est facile d'observer le pigment caractéristique soluble 'brun rougeâtre.
EMI9.2
5.- Observatin'mJ.croscopiques.
EMI9.3
' Stre tom ces aureofacièzis
EMI9.4
<tb> Milieu <SEP> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377 <SEP> . <SEP>
<tb>
<tb>
Mycélium <SEP> Spores <SEP> Mycélium <SEP> Spores
<tb>
<tb> Glycérol, <SEP> Sinueux, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> Sinueux, <SEP> Sphéroïdaux
<tb>
EMI9.5
asparagine, continu , à ovoïdaux. sontinu, -à ovolàaux. extrait de ramifié. Diamètre ramifié. a ovo aux. boeuf, Diamètre 1,5 - 2,0 Diamètre diamètre agar-agar o8 à microns 0,7 à 1,3 - 270 ,l,a micron 1,0 micron microns Liqueur de Sinueux, Sphérodidaux Sinueux, Sphéroidaux maaération continu, à ovoïdaux. continu, à ovoïdaux.
EMI9.6
<tb> de <SEP> mais <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> ramifié!.
<SEP> Diamètre
<tb>
EMI9.7
agar-agar Diamètre l5 - 2O a Diamètre 1,5 - 2,0
EMI9.8
<tb> 0,8 <SEP> à <SEP> microns <SEP> 0,8 <SEP> à <SEP> microns
<tb>
EMI9.9
].,0 micron ]1,0 micron
La morphologie du mycélium et des spores pour la souche S-604 est apparemment similaire à celle observée pour la souche A-377. Les deux souches montrent un mycélium continu, sinueux, ramifié, avec tendance occasionnelle des
EMI9.10
hyphes aériens à la spiralisatioii. Les spores caractéristi- ques sont ovoïdaux à sphéroidaux.
<Desc/Clms Page number 10>
Pour illustrer les variations de couleur parmi les différentes souches de s.aureofacieus qui produisent les déméthyltétracyclines, on a cultivé quatre souches sélection- nées sur de l'agar-agar avec liqueur de macération de mais, et on a fait les observations suivantes :
Observations de couleur( ); Streptomyces aureofa- ciens :
Agar-Agar avec liqueur de macération de mais (AP): :Incubation 4 ,jours à 27 C.
EMI10.1
<tb>
Souche <SEP> Colonies <SEP> isolées <SEP> Croissance <SEP> en <SEP> masse
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S-604M1 <SEP> "Deep <SEP> red <SEP> mahogany" <SEP> "Deep <SEP> red <SEP> mahogany"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S1071 <SEP> "Copper <SEP> brown" <SEP> "Deep <SEP> brown <SEP> mahogany"
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> "Red <SEP> mahogany"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> V-62 <SEP> Large <SEP> zone <SEP> marginale <SEP> "Light <SEP> copper <SEP> brown"
<tb>
<tb>
<tb> "peach <SEP> tan" <SEP> devenant
<tb>
<tb>
<tb> "light <SEP> copper <SEP> brown"
<tb>
<tb>
<tb> au <SEP> centre <SEP> de <SEP> la <SEP> colo-
<tb>
<tb>
<tb> nie.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
B-740 <SEP> "Dark <SEP> Wine" <SEP> "Burgundy"
<tb>
( ) couleurs suivant l'ouvrage déjà cité/
Une méthode relativement simple pour sélectionner une souche de S.aureofaciens capable de produire les nou- veaux antibiotiques, consiste à choisir une souche de S.au- reofaciens qui présente des colonies marron foncé quand on la cultive sur un milieu d'agar-agar et de liqueur de macération de mais. On prépare des inocula avec ces colonies et on con- duit une fermentation comme expliqué dans les exemples 1 et
2 ci-après. A la fin de la période de fermentation, on acidi- fie une certaine quantité de la liqueur de fiermentation à un pH voisin de 1,5 pour solubiliser l'antibiotique et on filtre pour obtenir une solution aqueuse limpide.
On place une ou deux gouttes du filtrat sur une bande de papier et on les chromatographie, par des méthodes ordinaires de dévelop-
<Desc/Clms Page number 11>
pement chromatographique. On utilise comme solvant du buta- nol équilibré avec un tampon phosphate aqueux 0,3 M au pH 3.
On développe les bandes de papier par chromatographie des- cendants avec la phase solvant du mélange équilibré. L'empla- cement des taches correspondant aux déméthyltétracyclines est facile à déterminer par inspection aux rayons ultra-vio- lets. Une autre autre méthode, plus sensible, consiste à pla- cer la bande sur un plateau d'agar-agar ensemencé avec des mi- croorganismes sensibles aux antibiotiques tels que le Bacillus cereus ou le Bacillus subtilis,- et à faire incuber les pla- teaux. Des zones d'inhibition apparaissent dans les régions correspondant aux taches d'antibiotique.
La comparaison des taches avec des échantillons témoins d'antibiotique pur et les indices "Rf" donnés ci-après, fournissent une base pour détecter la présence des nouveaux antibiotiques dans la li- que.ur fermentée, et une base semi-quantitative pour détermi- ner la quantité présente.
On peut donner une illustration de cette technique à l'aide de la figure 1 du dessin qui montre comment la chro- matographie sur bande de papier peut séparer et détecter les diverses tétracyclines et les produits de la présente inven- tion. Le dessin représente une bande de papier, 1, sur la- quelle on a placé, au point 2, une petite quantité d'une solu tion d'antibiotique contenant de la tétracycline, de la chlorodéméthyltétracycline, de la déméthyltétracycline et de la chlorodéméthyltétracycline. L'activité antibiotique totale de la solution placée au point 2 est de 30 microgrammes, expri mée en tétracycline. On développe alors les bandes de pa- pier comme décrit plus haut.
Au bout d'un certain temps, on examine les bandes aux rayons ultra-violets, avec les résul- tats indiqués sur le dessin. Le front du solvant s'est avan- cé jusqu'au point indiqué par le trait plein, 3. Le constitu- ant tétracycline de la solution mixte d'antibiotique s'est
<Desc/Clms Page number 12>
avancé jusqutau point 5 et la chlorotétracycline s'est avau- cée jusqu'au point 7. Le nouvel antibiotique, déméthyltétra- cycline, s'est avancé jusqu'au point 4, et l'antibiotique chlorodéméthyltétracycline te trouve au point 6. Les indices Rf de ces antibiotiques sont aussi indiqués sur le dessin.
L'indice Rf est par définition la distance entre la tache et le point d'origine, 2, divisée par la distance entre le front de solvant, 3, et l'origine, 2, et bien entendu il est tou- jours inférieur à 1. On peut utiliser divers système sol- vants pour obtenir une série d'indices Rf pour tel ou tel an- tibiotique particulier, et ces indices sont considérés comme très précieux pour identifier les antibiotiques et les.dis- tinguer d'autres.
Les indices Rf de quelques tétracyclines, quatri- mycines et déméthyltétracyclines dans deux systèmes solvants précis indiqués dans le tableau suivant.
EMI12.1
<tb>
Antibiotique <SEP> Acétate <SEP> d'éthyle/ <SEP> 90/10 <SEP> chloroforme/
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> 4,7, <SEP> tampon <SEP> butanol,
<tb>
<tb>
<tb> citrate-phosphate <SEP> H3PO4 <SEP> aqueux <SEP> 0,3M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (Mac <SEP> Elvain)' <SEP> 0,1% <SEP> acide <SEP> tri-
<tb>
<tb>
<tb> chloracétique,
<tb>
<tb> pH <SEP> 1,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorotétracycline <SEP> 0,76 <SEP> - <SEP> 0,80 <SEP> 0,61
<tb>
EMI12.2
Bromotétracyclitite 0,76 - 0,80 0,61 Tétracycline 0 .6 - 0 .7 0 z0 Quatrimycine 0,14 - 0,16 0$12 Chloroquatrimycine OY27 - O28 ,33 Bromoquatrimycine ,27 - 0)28 o33 Oxyquatrimycine OYOO - 0,06 0,11
EMI12.3
<tb> Chlorodéméthyltétracycline <SEP> 0,68 <SEP> - <SEP> 0,72 <SEP> 0,39
<tb>
<tb> Déméthyltétracyclitle <SEP> 0,27 <SEP> 0,2q
<tb>
<tb> Epichlorodméthyltétra-
<tb>
EMI12.4
cycline ,25 - 0,27 0,
20
EMI12.5
<tb> Epidéméthyltétracycline <SEP> 0,09 <SEP> 0,10
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
Plusieurs souches de S.aureofaciens qui produisent les nouveaux antibiotiques ont été déposées à l'American Type Culture Collection, à Washington; et sont cataloguées sous les n ATCC 12551, 12552, 12553 et 12554. Il est entendu que des mutantes produisant aussi les nouveaux antibiotiques peuvent être tirées de ces souches par des méthodes courantes, et en fait, il faut s'attendre à ce que certaines d'entre elles possèdent la propriété de produire des rendements plus élevés d'un ou plusieurs des nouveaux antibiotiques, dans des conditions favorables.
Ces mutantes peuvent varier quelque peu quant à leurs caractéristiques morphologiques générales, de même que les diverses souches de l'espèce S.aureofaciens.
On s'attend aussi à ce que d'autres souches de S.aureofaciens productrices de déméthyltétracycline puissent être trouvées dans la nature et puissent être créées à partir des souches. actuellement isolées de S.aureofaciens qui ne produisent pas ces nouveaux antibiotiques.
L'un des avantages les plus importants de la démé- thyltétracycline sur les tétracyclines décrites antérieure- ment, est sa stabilité accrue en milieu acide et alcalin.
L'instabilité de la tétracycline en milieu acide et l'insta- bilité de la chlorotétracycline en milieu alcalin sont bien connus. La chlorotétracycline en solution aqueuse avec un tampon carbonate de sodium au pH 9,85 a une demi-vie de 29,2 minutes à 23 C. Par contre, la chlorodéméthyltétracycline ne perd pas plus de 6% de son activité en 24 heures dans les mêmes conditions. La tétracycline est complètement détruite en meins de 5 minutes dans l'acide sulfurique 1N à 100 C.
Par contre, la chlorodéméthyltétracyline perd seulement 2% environ de son activité dans l'acide sulfurique 1N à 100 C au bout de 15 minutes. De même,le nouvel antibiotique déméthyl-
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tétracycline ne perd qu'environ 33% de son activité dans l'a- cide chlorhydrique 1N à 100 C, en 6 minutes. Dans la soude 0,1N à 50 C, la déméthyltétracycline a une demi-vie d'environ
20 heures, contre 3,3 heures pour la tétracycline. Ces proprié -tés inattendues sont très précieuses, étant donné que l'in- stabilité de la tétracycline en milieu acide et l'instabili- té de la chlorotétracycline en milieu alcalin limitent ou empêchent complètement l'emploi de ces substances précieuses dans de nombreuses applications.
Grâce à la stabilité beaucoup meilleure des nouveaux antibiotiques, il est cessible de pré- parer de nombreux produits pharmaceutiques qui ne/pouvaient pas être préparés de façon satisfaisante avec les tétracycli= nes. La stabilité accrue permet aussi d'améliorer les procé- dés de récupération et de raffinage, car on peut avoir re- cours à ces conditions plus rigoureuses de pH et de tempéra- tured, et on peut donc améliorer l'efficacité de diverses éta- pes du procédé .
Les analyses chimiques d'échantillons très puri- fiés de chlorodéméthyltétracycline concordent avec la formule empirique calculée C21H21C108' l'erreur se situant dans la marge expérimentale. La méthode Kuhn-Roth pour la détermina- tion des groupes méthyle donne une valeur extrêmement faible, indiquant qu'il n'y a pas de groupe méthyle en position 6 du noyau naphtocène. En conséquence, le nom de chlorodéméthyl- tétracycline apparait approprié. Cela est encore confirmé par la comparaison des spectres d'absorption d'ultra-violet et d'infra-rouge des produits, avec deux des différentes té= tracylclines.
Le point de fusion de la chlorodéméthyltétracycli- ne sous sorme de base libre, mesuré sur une plate-forme chau- de, est de 170-175 C avec décomposition. Le point de fusion de la chloro tétracylline est de 168-169 C. La démé- thyltétracycline base libre fond à 170-177 C, avec décomposa
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tion, tandis que la tétracycline fond sur la plate-forme chau- de à 160-168 C.
Voici d'autres comparaisons entre la chlorotétra- cycline et la chlorodéméthyltétracycline. La chlorodéméthyl- tétracycline présente un indice pHa de 4,45 dans un mélange de diméthylformamids et d'eau à 50/50. La rotation optique de la chlorodéméthyltétracycline dans l'acide chlorhydrique
0,03N à une concentration de 0,5% est de [o(725D= 261 ; pour la chlorotétracycline, ' on trouve -243 Les déméthyltétracy- clines .semblent être plus solubles dans l'eau que les tétra- cyclines correspondantes. Par exemple, le chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline est soluble dans l'eau à raison d'environ 45 mg/cm , contre environ 14 mg/cm pour la chlorotétracycline.
L'activité antibactérienne des tétracyclines et des' déméthyltétracycline est généralement similaire, mais avec des différentes nettes comme on le verra par le tableau suivant.
Ce tableau compara les concentrations de chloroté- tracycline et de chlorodémétyyltétracycline qui sont néces- saires pour réaliser une inhibition demiàmaximum de la crois- 'sance, exprimées en microgrammes d'antibiotique par cm3 de solution, en des laps de temps variant de 4 à 48 heures avec divers microorganismes. Les chiffres faibles indiquent une inhibition plus efficace de la croissance .
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TABLEAU I. -
Antibiotique
EMI16.1
Microorganisme chlorotétracycline ch10rodéTIéthyltêtracyclinE Teups en heures Temps en heures ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯4 8 4 1$ - 8 24 48
EMI16.2
<tb> Staphylococcus
<tb> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538 <SEP> P <SEP> 0,041 <SEP> 0,072 <SEP> 0,57 <SEP> 4,1 <SEP> 0,065 <SEP> 0,094 <SEP> 0,41 <SEP> 0,68
<tb>
<tb> Staphylococcus
<tb> albus <SEP> 7,5 <SEP> 20,5 <SEP> >50,0 <SEP> >50,0 <SEP> 16,5 <SEP> 50,0 <SEP> >50,0 <SEP> > <SEP> 50,0
<tb>
EMI16.3
Escherichia coli 0,12 0,27 1,5 10,2 0,16 0,3 0,66 ±. 1,56 O,8 Salmonella galli- 0 0,74 4 65 37, 0 0, l 0, 56 1, 06 1,1 narum Bacillus cereus (0,02;
5 0,035 0,15 1,1 0,015 0,039 0,077 0,19 Pseudomouas
EMI16.4
<tb> aeruginosa <SEP> 0,31 <SEP> 0,56 <SEP> 6,3 <SEP> 35,0 <SEP> 0,94 <SEP> 1,3 <SEP> 4,3 <SEP> 6,7
<tb> Streptococcus
<tb>
EMI16.5
pyrogenes bêta 11,5 1r3,0 >50,0 >50,0 14,A 41,0 >50,0 50,0
EMI16.6
<tb> hémolytique
<tb>
EMI16.7
Proteus vulgsris 0>28 0,56 9,2 50,0 0,62 1,12 JY38 4,4
EMI16.8
<tb> Escherichia <SEP> coli
<tb>
<tb> ATCC <SEP> 9637 <SEP> 0,54 <SEP> 1,18 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 34,0 <SEP> 0,43 <SEP> 0,67 <SEP> 0,97 <SEP> 1,8
<tb>
Comme on le verra en examinant les chiffres du
EMI16.9
tableau ci-dessus, la chlorotétr:cyclizze, de façon générale; est légèrement plus active en un laps de temps de 4 heures.
Cependant, on notera qu'après un certain temps de repos des solutions, la croissance bactérienne reprend dans le cas de la chlorotétracycline, mais qu'elle est encore généralement inhibée dans les solutions qui contiennent de la chlorodémé thyltétracycline. C'est en effet de la stabilité meilleure de ce dernier antibiotique. On observe des résultats similai- res quand on compare la tétracyline à la déméthyltétracycli- ne et la bromotétracycline à la bromodéméthyltétracycline.
On a trouvé aussi que les d'éméthyltétracyclines sont considé-
EMI16.10
rablement supérieures à ltoxytétracycline dans le même type
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On a aussi¯comparé les déméthyltétracyclines avec les tétracyclines dans des tests in vivo, et on a trouvé qu'il n'y a pas de différence appréciable dans l'activité antibac- térienne des déméthyltétracyclines en comparaison de leurs, analogues tétracyline. On en conclut donc que cesnouveaux antibiotiques meuvent servir au traitement des mêmes maladies de la même façon générale que les tétracyclines actuellement employées .
Les spectres d'absorption d'ultra-violet des tétra- cyclines et des déméthyltétracyclines sont très similaires.
La figure 2 des dessins montre la comparaison entre lé spec- tre d'absorption d'ultra-violet de la chlortétracycline et de la chlorodéméthyltétracycline à la même concentration.
Comme on le notera, la forme des courbes est essentiellement la même, mais il y a toutefois un léger flottement du spec- tre d'absorption de la chlorodéméthyltétracycline au voisina- ge de 260 millimicrons .
On voit une autre comparaison des spectres d'absrop- tion d'ultra-violet des tétracyclines dans le tableau II, qui indique les/coefficients d'extinction E 1cm (absorption spectrophotométrique d'une solution à 1% mesurée dans une cellule de 1 cm) mesurée au maxima et aux minima des minima des différents antibiotiques. On a calculé les valeurs d'a- près les courbes d'absorption d'ultra-violet, en corrigeant à 1% les concentrations auxquelles on a fait les essais.
Tous les échantillons ont été mesurés dans une solution de H2SO4 0,1N.
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TABLEAU II
EMI18.1
<tb> Max. <SEP> Mih. <SEP> Max. <SEP> Min. <SEP> Max.
<tb>
Antibiotique <SEP> e <SEP> 1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milliE1cm <SEP> micron <SEP> E1cm <SEP> micron <SEP> E1cm <SEP> micron <SEP> E1cm <SEP> micron <SEP> e1cm <SEP> micron
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorotétracycline <SEP> 209 <SEP> 368 <SEP> 135 <SEP> 302 <SEP> 356 <SEP> 265 <SEP> 288 <SEP> 242 <SEP> 343 <SEP> 228
<tb> Epichlorotétracycline <SEP> -NH4 <SEP> 170 <SEP> 368 <SEP> 100 <SEP> 302 <SEP> 332 <SEP> 254 <SEP> 290 <SEP> 242 <SEP> 342 <SEP> 228
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> tétracycline <SEP> 305 <SEP> 355 <SEP> 182 <SEP> 299 <SEP> 393 <SEP> 268 <SEP> 191 <SEP> 232 <SEP> 289 <SEP> 217
<tb> Epitétracycline-NH4 <SEP> 290 <SEP> 355 <SEP> 140 <SEP> 299 <SEP> 326 <SEP> 254 <SEP> 200 <SEP> 232 <SEP> 275 <SEP> 216
<tb> Déméthyltétracyline <SEP> neutre <SEP> 292 <SEP> 353 <SEP> 169 <SEP> 298
<SEP> 395 <SEP> 268 <SEP> 202 <SEP> 232 <SEP> 299 <SEP> 217
<tb> Chlorhydrate <SEP> d'épidéméthyltétracycline <SEP> 310 <SEP> 355 <SEP> 162 <SEP> 299 <SEP> 367 <SEP> 255 <SEP> 228 <SEP> 232 <SEP> 306 <SEP> , <SEP> 217
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorodéméthyltétracycline <SEP> 249 <SEP> 368 <SEP> 160 <SEP> 299 <SEP> 362 <SEP> 268 <SEP> 270 <SEP> 238 <SEP> 357 <SEP> 227
<tb> Chlorhydrate <SEP> d'épichlorodéméthyltétracycline <SEP> 242 <SEP> 368 <SEP> 130 <SEP> 300 <SEP> 348 <SEP> 254 <SEP> 289 <SEP> 238 <SEP> 346 <SEP> 227
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
Les spectres d'absorption d'infra-rouge de plusieurs des produits nouveaux sont représentés sur les autres figures du dessin.
La figure 3 est une représentation du spectre d'ab- sorption d'infra-rouge du chlorhydrate de chlorodéméthylté- tracycline. La figure 4 représente la comparaison des spectres d'absorption d'infra-rouge de la tétracycline base libre et de la déméthyltétracycline base libre. Comme on le voit, il y a plusieurs différences nettes, et aussi des similitudes.
La figure 5 montre le spectre d'absorption d'infra-rouge du chlorhydrate d'épichlorodéméthyltétracycline, et la figure 6 est le spectre d'absorption du chlorhydrate d'épidéméthyl- tétracycline. Ces courbes ont été obtenues sur un spectropho- tomètre automatique enregistreur à infra-rouge Perkin- Elmer modèle 21, avec les antibiotiques en phase solide, comprimés en un disque avec KBr. Voici d'autres données : prisme - NaC1; résolution - 2; réponse - 1 - 1; gain - 5; , vitesse 1/2 mn/micron; suppression - 2; et échelle : 50,8 mn pour un micron.
Diverses méthodes ont été mises au point pour ti- trer les tétracyclines, et certaines d'entre elles peuvent servir à titrer lesdéméthyltétracyclines, avec, bien entendu des modifications appropriées. Le titrage fluorométrique de la. chlorotétracycline est basé sur un accroissement de fluores -cence par suite de la formation d'une isochlorotétracycli- ne en milieu alcalin. On dissout l'échantillon à titrer dans un tampon phosphate alcalin, et on détermine la fluorescence de la solution dans un fluorophotomètre au temps zéro (immé- diatement après la préparation de la solution), et à nouveau après repos pour permettre à l'isomérisation de se produire.
L'augmentation de fluorescence correspond à la quantité de chlorotétracycline présente. riais la présence de chlorodémé- thyltétracycline dans la solution peut interférer avec la réaction de la chlorotétracycline, tendant à donner l'illusion
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d'une teneur moindre en chlorotérracycline. Une méthode plus digne de confiance pour déterminer la chlorotétracycline dans des mélanges avec la chlorodéméthyltétracycline est basée sur le fait' que le produit de dégradation alcaline de la chlorotétracycline n'absorbe pas à 380 m millimicron. On pré- pare l'échantillon au pH 10 au moyen d'un tampon carbonate, et on mesure la vàriation d'absorption à 380 m millimicron après 30 minutes de repos (environ trois demi-vies de chloro- tétracycline).
La chlorotétracycline et la chlorodéméthylté- tracycline absorbent toutes deux avant la dégradation alcali.. ne, mais seule la chlorodéméthyltétracycline absorbe après le traitement de dégradation; et la diminition d'absorption est la mesure de la chlorotétracycline primitivement présente dans l'échantillon.
Un titrage spécifique de la chlorodéméthyltétracy- cline en présence d'autres antibiotiques du groupe tétra- cycline est basé sur la méthode Hiscox. Un traitement acide modéré, de 15 minutes à 100 C par HC1 1N détruit toutes les tétracyclines excepté la chlorodéméthyltétracycline. Puis on soumet une portion de l'échantillon ainsi traité à un traitement acide énergique de 15 minutes à 100 C par HC1 6N, pour détruire la chlorodéméthyltétracycline. On calcule la teneur en chlorodéméthyltétracycline en mesurant la perte d'absorption spectrophotométrique à 369 m millimicron eu l'augmentation à 430 m millimicron, qui est réalisée par le traitement acide énergique, et en comparant avec un témoin.
Un mélange contenant seulement deux constituants, par exemple un mélange contenant les deux membres d'un couple épimérique,:peut être titré par spectrophotométrie. On dé- termine les absorptions spectrophotoinétriques pour deux lon- gueurs d'onde, et on interpose linéairement le rapport de ces deux absorptions entre les valeurs connues nour les consti-
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tuants purs. On peut ainsi déterminer- la composition centé- simale du mélange..
La façon la plus simple de titrer la bromodéméthyl- tétracycline consiste à analyser la. teneur en brome par des méthodes courantes de microanalyse.
Comme on l'indique plus haut,, on peut obtenir la bromodéméthyltétracycline comme antibiotique principal de la fermentation, en réglant la teneur en halogène du milieu de fermentation. Généralement, le milieu nutritif aqueux doit contenir au moins 50 parties par million d'ions bromure et la teneur en ions chlorure doit être maintenue aussi basse que possible, moins de 50 parties par million environ d'ions chlorure. L'ion bromure peut être fourni par n'importe quel bromure soluble dans l'eau, par exemple le bromure de potas- sium, qui libère des ions bromure pour servir à la synthèse biologique de l'antibiotique.
A part le réglage de la teneur en ions halogènes de la fermentation, le procédé de préparation de la bromodé- méthyltétracycline est similaire à celui de préparation de la déméthyltétracycline et de la chlorodéméthyltétracycline, décrit plus haut. Les souches de S.aureofaciens qui produi- sent la déméthyltétracycline peuvent aussi servir à produirè l'analogue bromé.
La bromodéméthyltétracycline a à peu près la même activité antibactérienne que la chlorodéméthyltétracycline, et elle peut servir aux mêmes usages et de la même façon.
Il n'est pas nécessaire de séparer la broinodénié- thyltétracycline des autres antibiotiques qui peuvent se former concurremment durant la fermentation, car un mélange. des diverses déméthyltértracyclines est utile à de nombreux usages; par exemple, on peut concentrer le milieu nutritif fermenté et l'utiliser directement pour sa teneur en antibio-
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tiques. Une autre façon de l'utiliser est d'acidifier la li- queur fermentée, de filtrer pour éliminer le mycélium et les matières insolubles; de neutraliser et de concentrer pour obtenir une poudre sèche que l'on peut mélanger à des aliments pour animaux. Les antibiotiques mélangés sont utiles pour stimuler la croissance de nombreux animaux.
Une forme brute de bromodéméthyltétracycline, et des mélanges de celle-ci avec d'autres antibiotiques, peuvent servir à préserver les viandes, volailles et poissons de la même façon que l'on emploie actuellement les tétracyclines.
Dans ces compositions, il n'est guère nécessaire de faire at- tention aux proportions des diverses tétracyclines qu'elles peuvent contenir.
Au cas où l'on désire séparer la bromodéméthylté- tracycline des autres antibiotiques contenus dans la liqueur fermentée, on peut le faire par plusieurs moyens qui apparaî- tront à l'homme de l'art. Par exemple, le traitement par un acide détruit la tétracycline, et le traitement par un alcali détruit la chlorotétracycline et la chlorotétracycline dans la liqueur fermentée. On peut récupérer la bromodéméthyltétra- cycline à partir des solutions résultantes; grâce à une chro- matographie fractionnée en utilisant de la terre d'infusoi- res dans la colonne. Un mélange de chloroforme et de butanol au pH 2,0 environ élue les antibiotiques de la terre d'infu- soires.
La bromodéméthyltétracycline sort de la colonne en avant de la déméthyltétracycline et on peut la récupérer à partir de ltéluant. On peut aussi séparer la bromodéméthylté- tracycline pour obtenir un seul constituant antibiotique, grâ- ce à la technique de distribution à contre-courant de Craig.
Les épidéméthyltétracyclines de la présente inven- tion sont considérées comme des isomères des déméthyltétracy-
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clines. La différence structurale semble être basée sur un réarrangement du groupe diméthylamine sur l'atome de carbone en position 4. Apparemment, dans certaines conditions qui se- ront décrites plus en détail ci-après, l'inversion se produit et on obtient un mélange à l'équilibre de déinéthyltétracycli- ne et de son épimère. On peut séparer les deux pour obtenir des produits pratiquement purs.
Pour chacun des corps, démé- thyltétracycline, chlorodéméthyltétracycline et bromodéméthylJ tétracycline, il existe un isomère correspondant que l'on ap' pellera épidéméthyltétracycline, épichlorodéméthyltétracycli- ne, et épibromodéméthyltétracycline. On peut convertir les déméthyltétracyclines en leurs formes isomères en ajustant simplement le pH d'une solution concentrée de l'antibiotique entre 3,0 et 5,0 et en laissant reposer la solution jusqutà ce que l'isomérisation soit parvenue à un équilibre. Les con- ditions les plus importantes qu'il est nécessaire de régler pour convertir les déméthyltétracyclines en leurs isomères sont la concentration, le pH, le temps et la température.
Le plus commode est de réaliser l'isomérisation à la température ambiante, mais à des températures plus élevées, on obtient un taux de conversion plus élevé. Le pH doit être compris entre 3,0 et 5,0 environ, de préférence entre 3,5 et 4,5. Il se produit une certaine épimérisation à des pH sor- tant de cet intervalle, et même dans l'eau distillée ; mais la vitesse est très faible. La concentration de l'antibioti- que dans la solution aqueuse doit être aussi élevée que pos- sible si lton veut obtenir des vitesses d'épimérisation plus grandes. L'équilibrage complet peut nécessiter une durée d'en- viron 24 heures à 25 C, mais on peut obtenir une équilibrage satisfaisant en un temps beaucoup plus court dans des condi- tions déterminées.
Ordinairement toutefois, on obtient les meilleurs résultats en laissant reposer la solution pendant
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des durées d'une semaine ou davantage. Il semble que l'équi- libre soit atteint, dans la plupart des cas, à 50% environ ; autrement dit, à l'équilibre la moitié environ de la déméthyl- tétracycline est convertie en épimère.
Etant donné que la concentration est un facteur im- portant pour obtenir des rendements élevés en de courts laps de temps, il faut choisir un système solvant qui donne la plus forte concentration de déméthyltétracycline. Il faut tamponner ces systèmes solvants pour obtenir un pH compris dawi (eutre l'intervalle préférentiel. Les divers solvants compren- nent le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétone, le 2- éthoxyéthanol, le 2-méthoxypropanol, le tétrahydrofurane, la- diméthylformamide et les mélanges de ces solvants. On peut utiliser d'autres solvants encore. Un tampci préférentiel est le phosphate monosodique, mais on peut utiliser d'autres tampons et couples de tampons qui maintiennent le pH dans l'intervalle désiré.
On peut récupérer les épimères des déméthyltétra- cyclines à partir des solutions aqueuses, de la même façon générale que l'on récupère les tétracyclines. Bien qu'ils aient une activité antibactérienne, in vitro et in vivo, lé- gèrentent inférieure à celle des déméthyltétracyclines, ils sont encore très utiles dans le traitement des maladies cau- sées par les bactéries, grâce à leur activité antibactérien- ne appréciable.
Comme on pourrait s'y attendre, les déméthyltétra- cyclines forment des sels et des complexes du même type, et de la même façon générale, que les tétracyclines. Le traite- ment par les acides à un pH inférieur à 4 environ aboutit à la formation de sels d'acides. On peut obtenir la base libre à un pH de 4 à 6 environ ; et aux pH supérieurs à 8, on ob-
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tient des sels avec dès bases, par exemple le sel de calcium.
De môme,on forme dès sels des ép'imères.
Gomme on l'a indiqué précédemment, le procédé de préparation des nouveaux antibiotiques suivant la présente invention sera général-ement le même' que les procédés de produ< -ion de chlorotétracycline, de tétracycline et de bromotétre cycline, les principales différences résidant dans le fait .
EMI25.1
que l'on choisit une souche mutante due S. aureofaciens qui produit la déméthyltétracycline désirée au lieu de l'une des tétracyclines.
La composition' du milieu de fermentation, le degré d'aération, le temps, la température', le contrôle des ions hydrogène, le mode d'inoculation et analogues, appli- qués lors de la production de chlorotétracycline, de bromo- tétracycline et de tétracycline conviennent peur la productio des nouvelles déméthyltétracyclines.
Afin que le processus de fermentation suivant l'in- vention' puisse être plus complètement compris on le décrira maintenant en se référant aux exemples précis qui suivent.
EXEMPLE 1. -
On peut préparer Lui milieu approprié pour la pré- paration d'inocula destinés à des fermentations, avec les substances suivantes :
EMI25.2
<tb> Sucrose <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb>
EMI25.3
(NH)50, -S'J 2 g/1
EMI25.4
<tb> CaC03 <SEP> 7 <SEP> g/1
<tb>
Liqueur de macération de mais 16,5 cm3/1
Le pH du milieu ainsi obtenu est d'environ 6,8.
On mesure une portion de 8 cm3 que l'on introduit dans un tube Brewer de 20 cm, et on stérilise à 120 C pendant 20 minutes. On inocule alors le milieu stérilisé avec 0,5 cm3 d'une suspension aqueuse de spores d'une souche de S.aureofa
EMI25.5
ciens capable de produire de la chiarodéméthyltétracycline,
<Desc/Clms Page number 26>
par exemple la souche S-604 , la suspension contenant environ 40-60 millions de spores par cm3. On fait incuber le milieu inoculé pendant 24 heures à 28 C, sur une secoueuse alterna- tive fonctionnant à 110 cycles par minute.
Un milieu de fermentation approprié contient de l'eau et un milieu typique qui convient pour produire, de la chlorodéméthyltétracycline est le suivant :
EMI26.1
<tb> amidon <SEP> de <SEP> mais <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 57 <SEP> g/1
<tb>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 2g/1
<tb>
EMI26.2
FeS04-7H20 l0 z:ng/1 MnS04-4H20 50 rr/1
EMI26.3
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 100 <SEP> mg/1
<tb>
EMI26.4
CoCl 2 ¯6H 2 0 5 mg/1
EMI26.5
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> 2,0% <SEP> en <SEP> volume
<tb>
Quand on restreint la teneur de ce milieu en ions chlorure cela tend à augmenter la quantité de déméthyltétracycline aux dépens de la production de chlorodéméthyltétracycline.
EEMPLE 2. -
On conduit une fermentation en flacons de secoueus? qui aboutit à former une certaine quantité de déméthyltétra- cycline et de chlorodéméthyltétracycline , avec un milieu préparé comme suit :
EMI26.6
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb>
<tb> huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> 2% <SEP> en <SEP> volume
<tb>
<tb> amidon <SEP> de <SEP> mais <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb>
<tb> CaC03 <SEP> 7 <SEP> g/1
<tb>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 5 <SEP> g/1
<tb>
<Desc/Clms Page number 27>
EMI27.1
<tb> NH4C1 <SEP> 1,5g/1
<tb>
EMI27.2
ZnS04..7H20 100 n/1 MhSO,.4HO 50 m/.
EMI27.3
<tb> CoC12.6H2O <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb>
On mesure une portion de 25 cm3 que l'on introduit
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dans un flacon d'Erleiimeyer de 250 con3, on stérilise pendant. 20 minutes à 120 C et on inocule avec 1 cm3 de culture mycé- lionne préparée comme dans l'exemple 1. Après incubation de 120 heures à 26 C sur une secoueuse ratative à 186 t/mm, on titre la liqueur et on trouve qu'elle ne contient pas plus de 70 microgrammes environ de chlorotétracycline par cm3,
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environ 450 mfucrogrammes de déméthyltétracycl ine par cm3, et environ 900 microgrammes de chlorodéméthyltêtracycline par cm3.
EXEMPLE 3. -
Fermentation en' cuve.-
On conduit une fermentation de 40 litres dans . une cuve pilote, essentiellement suivant la méthode décrite à l'exemple 2. Après avoir préparé le milieu, on le stérili- se pendant 25 minutes à 125 C et on l'inocule avec un inocu- lum de souche S-604 préparé comme indiqué par Duggar, brevet des Etats-Unis d'Amérique n 2.482.055 du 13 septembre 1949.
On conduit la fermentation avec agitation continue à une temp -rature de 28 C pendant les 24 premières heures et 25 C, jusqu'à achèvement, en 135 heures. On introduit de l'air stérile à raison de 0,3 1/1/mm pendant les seize premières heures, puis à raison de 0,5 1/1/mm jusqu'à la. récolte.
Les exemples suivants illustrent la récupération, le raffinage et la séparation des antibiotiques.
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EXEMPLE A. - Raffinage de la chlorodéméthyltétracycline et de la déméthyl tétracycline.-
On prépare 25,8 litres de liqueur comme dans l'exem- ple 3, on les traites par 200 cm3 d'acide chlorhydrique concer -tré pour ajuster le pH à 1,5. On filtre la liqueur traitée, après l'avoir mélangée à 2,8 Kg d'un adjuvant de filtration, pour obtenir 16,3 litres de filtrat. On reprend le tourteau de filtration par 25 litres d'eau à une température d'environ 50 C et in ajuste au pH 1,5. Après avoir agité pendant 30 minutes, on filtre le tourteau délayé et on réunit le filtrat au filtrat précédent, pour former une masse de 42,3 litres.
On traite le filtrat réuni avec 6,76 kg de chlorure de so- dium et on extrait à quatre reprises par le butanol à raison de 15% du volume du filtrat. On réunit les extraits, on les clarifie par filtration et on les concentre sous vide à 25- 30 C jusqu'à un volume final de o litres.
EXEMPLE B. -
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Séparation chromatograDhique de la chlorodéméthyltétracycli- ne et de la déméthyltétracycline.-
On divise le concentré au butanol de l'exemple A -,en deux portions égales, on concentre l'une à 900 cm3 et on concentre l'autre à 610 cm3 sous vide. On filtre les concen- trés et on les ajuste au pH 2 avec de la soude à 50%.
Pour préparer le système solvant utilisé pour la séparation chromatographique, on équilibre un mélange à 80% de butanol et 20% de chloroforme avec de l'eau ajustée au pH 2 au moyen d'acide chlorhydrique. Les colonnes sont des colonnes de verre de 15 cm de diamètre garnies de 2,8 kg de terre d'infusoires lavée à 1'acide. On équilibre les colonnes avec la phase aqueuse du système solvant avant l'usage.
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On traiteles deux concentrés au butanol, sur des. colonnes séparées. On verse doucement les concentrés dans le haut des colonnes. Puis on élue les colonnes avec la phase solvant que l'on fait passer au travers à raison d'environ 10 litres par heure. Dans chaque cas, on prend 40 tranches de 500 cm3 et on détermine la teneur en antibiotique de chacune par chromatographie sur bande de papier. Dans la portion de 900 cm3, les tranches 6 à 17 contiennent la chlorodéméthyl- tétracycline et la chlorotétracycline, et les/tranches 24 à 40 contiennent la déméthyltétracycline et la tétracycline.
Dans la pottion de 610 cm3, les tranches 7 à 18 contiennent la chlorodéméthyltétracycline et la chlorotétracycline,et les tranches 19 à 31 contiennent la déméthyltétracycline et la. tétracycline.
EXEMPLE G. - Récupération de la chlorodéméthyltértrcycline à partir de fractions de colonne.-
On réunit les fractions contenant de la chlorodémé-- thyltétracycline et provenant de l'exemple B, pour obtenir un volume d'environ 12 litres. On ajoute une égale quantité d'eau, et on concentre le mélange sous vide jusqu'à 1810 cm3 de solution aqueuse. On ajuste le pH du concentré à 2,3-1,9 par addition d'acide chlorhydrique. On lave à deux reprises le concentré acidifié avec 180 cm3 de chloroforme, on filtre et on concentre sous vide jusqu'à un volume de 360 cm3. On ajuste le pH du concentré entre 1,2 et 2,8, avec de la soude à 50%.
On sèche la solution par congélation pour donner 18,56 g de chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline amorphe titrant 550 microgrammes par mg.
EXEMPLE D. - Récupération de la déméthyltétracycline à partir de fractions de colonne.-
On réunit les tranches de l'exemple B qui contien-
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tient la déméthyltétracycline pour obtenir un volume de 14 li- tres. On ajoute un égal volume d'eau et on concentre le mé- lange sous vide à 24 C jusqu'à un volume de 565 cm3 de solu- tion aqueuse. On ajuste le pH du concentré à 1,65 en ajoutant de l'acide chlorhydrique concentré, et on lave la solution à deux reprises avec 55 cm3 de chloroforme. On filtre la solu- tion lavée et on l'ajuste au pH 5,8 avec de la soude à 505.
Après vieillissement de 3 heures à la température ambiante, et 15 heures à 4 C, on filtre la bouillie cristalline obtenue et on lave le produit à l'eau et on sèche sous vide à 40 C.
On obtient un rendement de 4,7 g de déméthyltétracycline neu- tre brute titrant 880 microgrammes par mg exprimés en chlorhy. drate de tétracycline, ce qui représente un rendement d'en- semble de 73% à partir du concentré âqueux.
EXEMPLE E.- Cristallisation du chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycli- ne par le mélange acétone-éther.-
Un prend le,56 g de chlorodéméthyltétracycline séchée par congélation comme dans l'exemple C, on agite dans un mélange de 55 cn3 d'acétone, 7,4 cm3 d'eau et 3,7 cm3 d'acide chlorhydrique concentré. On filtre la solution et on rince les solides à deux reprises avec un total de 55 cm3 d'acétone contenait 1,85 cm3 d'eau. On réunit les filtrats, le pH étant de 0,8, et on traite par 55 cm3 d'éther. On ensemence le mélange, on laisse vieillir 18 heures à la tempé- rature ambiante avec agitation constante, et on enlève par filtration les cristaux qui se forment.
On lave le pràduit avec un mélange d'acétone, d'eau et d'éther, puis avec de l'a- cétone et finalement avec de l'éther, et on sèche sous vide à 40 C. On obtient un rendement de 4,74 g de chlorhydrate de
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chlorodémétl1ylt±tracycli:le cristallin titrant 1090 uticrogram- nies par mag, ce qui -représente LUI lende;uelU' d! op(:ratloll de 50,0;,;. Le produit contient 11 dé chlor8t'3tracrcliile.
(..." 1C'..J. .-J J F, ¯ ¯ L,ristallisatii; du clil,riiv -dr de c]ilorodéinéthjrl.t4tracyclî,ie , ' à partir d'un talazye butatzol-eel7¯orolve.- On prend une portion de 50,4 g de chlorodéméthyl- tétracycline séchée par congélation, préparée comme dans
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l'exemple G, et titrant 7fla3 microgrammes par tztJ, oz1 la délaie dans 22,5 cm3 de cellosolve, et à la solution résultante on ajoute, au total, 205 cm3 de butanol. On ajuste le pH à 0,8 par addition de 11 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et on laisse vieillir le mélange 51 heures avec agitation. On enlè- ve les cristaux obtenus par filtration, on lave avec un mé- lange à 90/10 de butanol et de cellosolve, puis avec du chloroforme et on sèche sous vide.
On obtient un rendement de
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3036 g de chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline, titrant 1053. microgrammes par soit un rendement de 4;j*.
EXTMPLE G. - 4ecristallisatioii de la cI1l0r¯od6méthyltétracyclil!.e de manière à détruire la chloro6étracirclin;. -
On prend lg de la chlorodéméthyltétracycline pré- parée dans lexemple E, pn la délaie dans 3 cm3 de mélange à 90% de butanol et 10% de cellosolve, et on y ajoute 3 cm3 de triéthylamine pour ajuster le pH à 10,4. On laisse reposer la solution incomplète à la température ambiante pendant 24 heures pour détruire la chlorotétracycline qui peut être présente, et au bout de ce temps, on aïeule de l'acide chlor- hydrique concentré pour abaisser la pH à 0,5, et on laisse
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vieillir le m'lau;e nendant 4 heures avec agitation.
Ou fil- tre le produit cristallin, ou la lave avec un mélange d 90% de butanol et 10% de cellosolve puis au chloroforme et on
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che sous vide à 40 C. On obtient un rendement de 0,36 g de .
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c".pri.iydrate de chlorodémêthyltétracycline, titrant 1228 microgrammes par mg et contenant environ 2,5% de chlorotétra- cycline, ce qui représente un rendement de 40%
Les exemples suivants illustrent la conversion des antibiotiques en diverses formes :
EXEMPLE H. - Broitihydrate de chlorodéméthyltétracycline.-
On dissout 1,0 g de chlorodéméthyltétracycline- ammonium dans 20 cm3 d'eau et on traite la solution par 0,6 cm3 d'acide bromhydrique à 48% pour ajuster le pH à 1,6.
On laisse vieillir le mélange pendant 18 heures en agitant, à là température ambiante, et au bout de ce temps on trouve des cristaux en aiguilles allongées de bromhydrate de chlorodémé- thyltétracycline. On filtre le produit, on le lave aven 6 cm3 d'eau ajustée au pH 2,2 avec de l'acide bromhydrique, et on sèche sous vide pendant 5 heures à 44 C. On obtient un rende- ment de 750 mg de bromhydrate de chlorodéméthyltétracycline.
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Analyse calculée pour ClIi2ZNC1Br0$ : 0=46,2; H=1,,1; N=5,1; Ci=6,5; Br=l4,6; 0=23,4.
Analyse effective : 0=45,94; H=4,44; N=4,71; C1= 6,78, 6,47; Br=13,74; 0(différence : 24,39; 24,70).
EXEMPLE I. - Préparation du sel d'ammonium de chlorodéméthyltétracycline.'
On prend une portion de 100 mg de la chlorodémé- thyltétracycline préparée dans l'exemple E, on la dissout dans 0,5 cm3 de mélange à 90;3 de butanol et 10% de cellosolve et on fait barboter du gaz ammoniac dans la solution jusqu'à ce qu'il apparaisse un solide épais. On dilue la bouillie a- vec une petite quantité d'ammoniaque aqueuse concentrée, on
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laisse; re'fiY0\-ge#!' à la température ambiante pendant 5 heures et on filtre. On lave le produit avec un mélange à 90% de
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butanol et 10% de cellosolve, puis à l'acétone, et on sèche sous vide.
On obtient un rendement de 41;4mg de sel d'ammo- nium de chlorodéméthyltétracycline, titrant 1148 microgram- mes p'ar mg en chlorhydrate de chlorotétracycline (rendement 44%).
EXEMPLE J. -
Préparation de la chlorodéméthyltétracycline neutre.':::
On prend une portion de 50 mgr de la chlorodémé- thy1tétracyc1ine obtenue dans l'exemple E, titrant 1090 micro" grammes par mg, on la dissout dans 1,3 cm3 dieàù et on traite la solution par le carbonate de sodium sec jusqu'à un'pH de 7-8. On élimine par centrifugation le précipité amorphe ob- tenu, et on ajuste au pH 5,4, le liquide limpide de décanta- tion et on le laisse vieillir 16 heures à la température am- binate.
On filtre le produit, on le lave à l'eau et on le sè- che sous vide à 35 C pour obtenir 21,9 mgr de chlorodéméthl. tétracycline neutre cristalline titrant 1250 microgrammes par mg (rendement 50%)
EXEMPLE K.- Réduction de la chlorodéméthyltétracycline en déméthyltétra- cycline. -
On dissout dans de l'eau un échantillon de 12,5 mg: de chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline cristallin et on y ajoute une goutte de triéthylamine.
On mélange la solu-' tion avec 10 mg de palladium à 10% sur charbon, et on agite sous atmosphère d'hydrogène pendant 20 minutes. On filtre la solution obtenue pour éliminer le catalyseur.Les spectres ultra-violets aussi bien que la chromatographie sur papier indiquent que la déchloration se produit et donne la démé- thyltétracycline.
Comme indiqué plus haut, les sels de déméthylté- tracyclines peuvent se former par un traitement avec des
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acides et des bases. L'acide chlorhydrique est un acide préférentiel parce que les sels de cet acide et des déméthyl- tétracyclines sont des produits très utiles. On peut communi- quer des propriétés spéciales en utilisant d'autres acides, tels que l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide acétique, l'acide borique, et les autres acides organiques et inorganiques. On peut préparer des sels avec des bases, en utilisant les hydroxydes alcalins tels que la soude et les hydroxydes alcalino-terreux, comme indiqué plus haut.
Le sel de calcium est particulièrement utile, et on peut le préparer en ajustant simplement au pH 6-10 une solution a- queuse de l'une des déméthyltétracyclines, avec au moins un équivalent molaire de calcium dans la solution. On peut pré- parer les sels de baryum, de magnésium, de strontium[, etc... de façon similaire. Il se forme aussi des complexes des dé- méthyltétracyclines avec le bore, le zirconium et d'autres ions métalliques polyvalents, comme dans le cas des tétracy- clines.
Evidemment, si le milieu de fermentation ne contient pas de chlore ni de brome, on ne peut pas former de chloro- déméthyltétracycline ni de bromodéméthyltétracycline. En pareil cas, l'antibiotique principal sera la déméthyltétra- cycline. Quand on élève la teneur en ions chlorure, particu- lièrement au-dessus de 50 parties par million, il se forme des quantités notables de chlorodéinéthyltétracycline, car 1 partie d'ion chlorure peut amener la formation d'environ 14 parties de chlorodéméthyltétracycline. On.peut régler la quantité de ce dernier antibiotique.
Lorsqu'on prépare cet antibiotique, il est préférable que le milieu de fermenta- . tion contienne plus de 50 parties par million d'ion chlorure, et on peut porter cette ouantité jusqu'à 1000 parties par million ou même davantage pour avoir une production maximum
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de chlorodéméthyltétracycline.
Une petite concentration d'ion bromure dans le milieu de fermentation,' d'environ' 10 parties par million à plusieurs %, tend à diminuer la formation de chlorodéméthyl- tétracycline, et la formation de déméthyltétracycline est généralement accrue. Quand le milieu de fermentation, contient moins de 50 parties par million environ d'ions chlorure, et plus de 50 parties par million environ d'ions bromure, la
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formation de la bromodéraéthy1tétracycline est favorisée; et avec des souches de S.aureofaciens qui sont bonnes prôductri- ces d'antibiotique, la liqueur fermentée obtenue peut conte- nir la bromotétracycline en tant qu'antibiotique prédominant.
REVENDICATIONS.-
1.- Procédé pour la préparation des antibiotiques du groupe déméthyltétracycline (comprenant la déméthyltétra-
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cycline, la chlorodéméthy1tétra'èyèline et" la Éfôhiodéméthylté- tracycline), et de leurs épimères, dans lequel on fait fer- menter, dans des conditions aérobies, un milieu nutritif a- queux d'une teneur contrôlée en ions chlorure et/ou bromure, avec une souche de s.aureofaciens productrice de déméthylté- tracycline, on récupère si on le désire les antibiotiques du milieu de fermentation et, si on le désire, on ajuste le pH d'une solution concentrée pour obtenir les épimères.