La présente invention a pour objet un procédé de préparation de nouveaux composés de la série des tétra cyclines.
Ces composés sont les 5a(lla)-déhydrotétracy- clines, répondant à la formule :
EMI2.1
dans laquelle Z est un atome d'hydrogène, de brome ou de chlore,
<Desc/Clms Page number 3>
Suivant la nomenclature internationale, le
EMI3.1
nom chimique approprié du nouvel analogue de chlorotétrocy- cline de l'invention(rentrant dans la formule (I) ci-dessus lorsque Z représente le chlore), est 7-chloro-4-diméthylamino- 1,4,.a,5?6,11,12,12G-octahyd.ro-3 6,10,12a-tétrahydroxy-.6- méthyl-ljll,l2-trioxo-naphtacène-2-carboxa:ide. Le nom courant approprié de l'anclogue de chlorotétrrcycline serait '-chloro--5a(11a)-déhydrotétracycline.
De même, l'analogue de tétracycline (lorsque Z représente Ihydrogène dans la formule (1), s'appellera 5a(llû)-dé.,,drotétracycline et l'analogue de bromotétracycline (lorsque Z représente le
EMI3.2
brome dans la formule 1))sfappellera 7-bromo-5a(lla)- déhydrotétrr cycline.
Les nouveaux composés de la série des tétra- cyclines sont produits par certaines souches mutantes de
EMI3.3
S. aureol'aqiens. Les nouvelles souches mutantes sont des espèces des S. ciureofaciens> car elles descendent toutes directement de l'espèce des S. rureofaciens productrice de chlorotétracycline appelée A377 et décrite dans le brevet américain Duggar n 2.1-2,055 du 13 3cpl;ciii>i e 1949, et déposée au Northern Régional Research Laboratory, à Peoria, Illinois sous la référence 1RRL 2209. Pour obtenir les nouvelles souches de S. aureofaciens à partir de la souche primitive A377 isolée à partir du sol, on a traité la souche A3 77 par des agents mutagènes, notamment par irradia- tion ultra-violette et par la nicotine et l'ypérite azotée.
EMI3.4
La mutation spontanée des souches de S. auruofaciens produc- trices de chlorotétracycline aboutit à des souches qui
EMI3.5
produisent aussi les inti'oiotiques nouveaux.
<Desc/Clms Page number 4>
Le procédé suivant l'invention, pour préparer les 5a(11a)-déhydrotétracyclines répondant à la formule I, consiste à faire fermenter dans des conditions aérobies un milieu nutritif aqueux ordinaire contenant des ions chlorue, à l'aide d'une .souche de S. aureofaciens propre à produire le composé I dans lequel Z représente le-.chlore, ou bien à faire fermenter un milieu similaire déficient en - ions chlorure pour obtenir le composé I dans lequel Z repré- sente l'hydrogène, ou bien un milieu similaire contenant des quantités notables dtions bromure de manière à obtenir le composé I dans lequel Z représente le brome,
La souche primitive de S. aureofaciens que l'on a appelée S1308 et qui donne les nouveaux antibiotiques, est quelque peu instable.
Quand on en fait des sous-cultures elle dégénère rapidement en une culture mixte dans laquelle on peut isoler plusieurs variantes plus stables d'aspect différent. En général, toutes ces souches sont caractéristi- ques de l'espèce S. aureofaciens, mais diffèrent quelque peu les unes des autres et des souches de S. aureofaciens antérieurement décrites, principalement quant à la pigmen- tation. La quasi-totalité de ces souches présente- une fluorescence ultra-violette caractéristique à 3600 lorsqu'on les cultive sur des milieux d'agar-agar et de liqueur de macération de mais.
Bien que les nouvelles souches'de S. aureofaciens et leurs variantes diffèrent principalement des souches de S. aureofaciens antérieurment décrites par la nature des antibiotiques produits, les souches étudiées jusqutici diffèrent quelque péu par leur pigmentation sur divers milieux de culture, comme il est indiqué ci-dessous.
<Desc/Clms Page number 5>
Comparaison des pigments fluorescents diffusibles en
EMI5.1
milieu d' .gar-agar
EMI5.2
Souche Agar-cg r Q4 Agar-agar APIS A3 77 néant néant s1308 vert-jc.une vif vert-jaune vif
EMI5.3
Formule de l'agar-Qgfr Q4 :
EMI5.4
<tb> saccharose <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
EMI5.5
HgSO 4' 7H20 0, 5 g 2ro4 4 g ( NH 4.) 3 PO 4 2 g
EMI5.6
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 7,5 <SEP> cm3
<tb>
<tb> agar-agar <SEP> brut <SEP> 30 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> H2O, <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> ajusté <SEP> à <SEP> 6,5
<tb>
EMI5.7
Formule de 1 f a,ar-agar AP4 :
EMI5.8
<tb> saccharose <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
EMI5.9
ITgS04,7H20 0,25 g
EMI5.10
<tb> KH2PO4 <SEP> 2 <SEP> g
<tb>
EMI5.11
(I\TH4)3 PO 4 2 g
EMI5.12
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 4 <SEP> g
<tb>
<tb> agar-agar <SEP> raffiné <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb> H2O, <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
EMI5.13
Formule de lraar-ar AP6 I: Comme l'agar-cgar AP4, sauf que la proportion de liqueur de macération de mais est de 6 g par litre.
Le. souche S1308 croît vigoureusement sur agar-agar Q4, en donnant des spores abondants gris foncé.
Sur agar-agar AP4 et AP6, la colonie typique est fortement
<Desc/Clms Page number 6>
pigmentée en jaune-brun foncé, et prend une couleur brune ou rouge-brun à la. lumière d'une lampe à incandescence ; elle est cohérente mais avec une marge diffuse, convexe et lisse, et devient papillée au centre en vieillissant.
La croissance et la culture de la souçhe primitive S1308 ont permis d'observer et? d'isoler plusieurs types aberrants d'aspect différent, dont la couleur va du blanc au jaune pâle, à l'orangé foncé, au brun clair, et eux nuances typiques jaune-brun et rouge-brun. Tous présen- tent la fluorescence ultra-violette caractéristique à 3600 , sauf-les types aberrants blancs.
Pour illustrer les variations de couleur des nouvelles souches de S. aureofaciens qui produisent les nouveaux cntibiotiques dont il s'agita on a cultivé six souches sélectionnées sur liqueur de macération de mais et agar-agar, et on a fait les .observations suivantes.
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
Obsçrvations sur la coulcur (1) : S. aureofF.cjeus cgar-::'gar AP4 avec liqueur cGO nm.cération de mais; six joursdlincuction â 0,5 C.
EMI7.2
<tb>
Souche <SEP> Colonies <SEP> séparées <SEP> Croissance <SEP> en <SEP> masse
<tb>
<tb> S1308 <SEP> brun <SEP> cuivré <SEP> brun <SEP> foncé
<tb>
EMI7.3
S130É-V146 càdrc acajou foncé S1308-V237 tan fondé (Ildark ambre luggage tan") S13-29 i-ouillc-or,,nge rouille-orange
EMI7.4
(1) Les couleurs sont conformes au ''Color Ikrmony I.knualil, 3ème édition, Contciner Corporction of America..
9bsorvtions sur les couleurs 1 1: S. aureofacîens ±gpr-c&'r AP6 Lvec ligueur d.0 mac6r,-it de mais ; six jours d'incub:,tion â ? ,5 C.
EMI7.5
<tb>
Souche <SEP> Colonies <SEP> séparées <SEP> Croissance <SEP> en <SEP> masse
<tb>
<tb> S1308 <SEP> henné <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> brun <SEP> foncé
<tb>
EMI7.6
S130-Vll6 santal brun châtaigne S1308-V237 tan foncé d.rk tan foncé (?id.<;rk luggc.gc tan'') luggage tan") 51.30$-.29 rouille-orenge rouille-orange (1) Morne remarque que ci-dessus.
Les souches mutantes qui produisent les nouveaux antibiotiques possèdent les mêmes caractéristiques générales que les souches qui produisent les tétracyclines, et elles différent entre elles de la même façon générale que celle suivant laquelle les souches productrices de té- trcycline et les souches productrices de chlorotétracycline diffèrent les unes des autres, canne on l'a indiqué dans plusieurs articles scientifiques qui ont été publiés. Les données ci-dcssous serviront à illustrer les différences entre les nouvelles souches et la souche primitive A377 que l'on trouve sous la référence IIRRL 2209.
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
On c. établi les différences entre le S. aureofaciens souche S1308 et le S. c-ureofacicns souche A377 (NRRL 2209) en observant les cc-ractéristiques de croissance sur divers milieux, .fvcc incubation, à 26,5 C.
1. AKar-. p:ar avec zlvcérol, QSDaragine et extrrit de boeuf
EMI8.2
<tb> glycérol <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> L-asparcgine <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb>
EMI8.3
1m2 PO 4 0,05 ,e agar-agar raffine ¯ ' 1,5
EMI8.4
<tb> eau <SEP> distillée, <SEP> q.s <SEP> pour <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> %
<tb>
EMI8.5
ajustement du pH avec l10x à 50 :
pH 7ex
EMI8.6
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,2
<tb>
EMI8.7
StreT)tomyces ureo¯ciens
EMI8.8
<tb> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb>
<tb>
<tb> croissance <SEP> bonne, <SEP> couleur <SEP> bonne
<tb> "chameau" <SEP> (1)
<tb> hyphes <SEP> aériens <SEP> légers <SEP> à <SEP> modérés <SEP> légers <SEP> à <SEP> assez
<tb> importants
<tb> blancs <SEP> à <SEP> gris
<tb> Blancs <SEP> à <SEP> gris <SEP> clair
<tb>
EMI8.9
sporulation éssez importante aux "pris clair
EMI8.10
<tb> foyers <SEP> gris
<tb>
<tb> pigment <SEP> diffusible <SEP> vcrt-jaune <SEP> clair <SEP> jaune <SEP> alair <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb> envers <SEP> chameau <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair <SEP> jaune <SEP> à <SEP> jaune-
<tb>
<tb> orange <SEP> clair
<tb>
(1) Couleurs :même remarque que ci-dessus
EMI8.11
2.
Agr.r-c.c'.r Czapek-Dpx a la dextrine
EMI8.12
<tb> dextrine <SEP> 1. <SEP> 0%
<tb>
<tb> NaNO3 <SEP> 0,2%
<tb>
EMI8.13
K2H4 0;1 .igS04,7H20 Q )05 KCl 0 10'5 FOSQ4p7H20 0 ,001 c.gar-a.gar rc-ffiné 1,5 Í -1 eau distillée, q.s. pour 100)0 %
EMI8.14
<tb> pH <SEP> ,,près <SEP> stérilisation <SEP> 7,2
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
StreptomYces ¯:
urcpf ' lli-2.
EMI9.2
Souche S130 Souche A3 77
EMI9.3
<tb> croissance <SEP> médiocre, <SEP> hyaline <SEP> bonne
<tb>
EMI9.4
hyphes aériens néant cbondants, gris
EMI9.5
<tb> souris <SEP> (Il <SEP> à <SEP> gris <SEP>
<tb>
<tb> plomb, <SEP> globules <SEP> su-
<tb>
EMI9.6
Dorficie13 inco-
EMI9.7
<tb> lores
<tb>
EMI9.8
sporulation n6cnt profus'e pigment diffusible nec-nt, trace jaune pale
EMI9.9
<tb> envers <SEP> trace <SEP> de <SEP> pigment <SEP> non <SEP> pigmentée <SEP> trace
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> rouge-orangé <SEP> de <SEP> rose
<tb>
EMI9.10
(1) m8m: remarque qu: ci-dessus.
3. Ar-gr AP avec liqueur de riacérntion de maïs
EMI9.11
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> nais <SEP> 0,4 <SEP> %
<tb>
<tb> saccharose <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>
EMI9.12
ïsïgSO, 7HZ0 1) ,025 :,; KH2P04 ' 0,2 I (HI4)2HP04± 0,2 :
EMI9.13
<tb> agar-agar <SEP> raffine <SEP> 2,0 <SEP> %
<tb>
EMI9.14
eau du robinet, 'los. pour 100;0 iJ ÎÎa#èkiiÉ2hiilÉïoi 6,5
EMI9.15
Strcatomycs ¯ureof<<c ciâ
EMI9.16
Souche S130u Souche kJ5? i' croissance bonne ï;c rz3c hyphes aériens modérés à cbondantp cbordants. f!:'JJ.iT6 z î-1uv e (1) sporulation abondr.nte, uniforme ' ,J;'0i\lS'::; uniforme pigment soluble brun-orr.ngc .Í ()l)(' l'me r. L=ù,1-r à c. v ec/c o uc 1 < #b vert,-- zorn jaune envers brun chocolat .:;<...ü r.:'- '1.:.' (1) même remarque que ci-dessus
<Desc/Clms Page number 10>
4.
Autres milieux d'agar-agar
Streptomyces sureofaciens
EMI10.1
<tb> Milieu <SEP> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> assez <SEP> bonne <SEP> croissan- <SEP> bonne <SEP> croissance, <SEP> pas
<tb>
<tb>
<tb> nutritif <SEP> ce <SEP> : <SEP> -hyphes <SEP> aériens <SEP> d'hyphes <SEP> aériens.
<tb>
<tb>
<tb> mastie <SEP> (1) <SEP> à <SEP> brun <SEP> mou- <SEP> 'Envers <SEP> : <SEP> jaune <SEP> pâle.
<tb>
<tb>
<tb> tarde. <SEP> Envers <SEP> : <SEP> mastic <SEP> Pigment <SEP> soluble
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> devenant <SEP> brun-moutcr- <SEP> 'jaune <SEP> pâle.
<tb>
<tb>
<tb> do. <SEP> P@s <SEP> de <SEP> pigment
<tb>
<tb>
<tb> soluble.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Glucose,aspara- <SEP> Croissrnce <SEP> abondante: <SEP> Bonne <SEP> croissance.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> gine <SEP> extrait <SEP> cannelle <SEP> à <SEP> tan <SEP> foncé <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> blancs
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> viande <SEP> ("dark <SEP> luggage <SEP> tan"). <SEP> devenant <SEP> de <SEP> plus <SEP> en
<tb>
<tb>
<tb> Hyphes <SEP> a <SEP> ériens <SEP> - <SEP> abon- <SEP> plus <SEP> gris <SEP> quand <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb> dents: <SEP> blancs <SEP> à <SEP> fau- <SEP> formation <SEP> des <SEP> 'spores
<tb>
<tb>
<tb> ve. <SEP> Sporulation <SEP> abon- <SEP> croit. <SEP> Envers <SEP> : <SEP> jaune
<tb>
<tb>
<tb> dante. <SEP> Envers <SEP> :
<SEP> tan <SEP> clair <SEP> à <SEP> orange <SEP> rosé.
<tb>
<tb>
<tb> foncé <SEP> ("dark <SEP> luggage <SEP> Trrce <SEP> de <SEP> pigment <SEP> solu-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> trn"). <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> ble <SEP> jaune <SEP> orangé.
<tb>
<tb>
<tb> brun-orange.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Agar-agar <SEP> AP4 <SEP> Bonne <SEP> croissance, <SEP> Excellente <SEP> croissance.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> chameau <SEP> à <SEP> brun <SEP> chêne. <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> profus
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> macération <SEP> de <SEP> Hyphes <SEP> @ériens <SEP> bons <SEP> Sporulation <SEP> profuse <SEP> : <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> mais <SEP> à <SEP> abondants,- <SEP> fauves, <SEP> .fauve. <SEP> Envers <SEP> : <SEP> tan.
<tb>
<tb>
<tb>
Sporulation <SEP> : <SEP> bonne, <SEP> clair. <SEP> Pigment <SEP> solu-
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> abondante. <SEP> Envers <SEP> : <SEP> ble <SEP> jaune <SEP> clair <SEP> à
<tb>
<tb>
<tb> brun <SEP> chocolat. <SEP> Pigment <SEP> ambre.
<tb>
<tb>
<tb> soluble <SEP> brun-orange
<tb>
<tb>
<tb> foncé <SEP> avec <SEP> couches
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> vert-jaune.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Agar-agar <SEP> AP6 <SEP> Croissance <SEP> abon- <SEP> Excellente <SEP> croissan-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> denté <SEP> : <SEP> rouge <SEP> bri- <SEP> c <SEP> e. <SEP> Mycélium <SEP> aérien
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> macération <SEP> de <SEP> quo <SEP> à <SEP> brun <SEP> cuivré. <SEP> profus. <SEP> Sporulation
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mais <SEP> Hyphes. <SEP> aériens <SEP> abon- <SEP> profuse, <SEP> fauve.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dants <SEP> à <SEP> profus, <SEP> bei- <SEP> Envers <SEP> : <SEP> tan. <SEP> Pigment
<tb>
<tb>
<tb> ges. <SEP> Sporulation <SEP> abon- <SEP> soluble <SEP> ambre <SEP> clair.
<tb>
<tb>
<tb> dante.Envers <SEP> :
<SEP> brun
<tb>
<tb>
<tb> chocolat. <SEP> Pigment
<tb>
<tb>
<tb> soluble <SEP> brun-rouge
<tb>
<tb>
<tb> . <SEP> foncé <SEP> avec <SEP> couches
<tb>
<tb>
<tb> vert-jaune.
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
Milieu <SEP> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> Q4 <SEP> Excellente <SEP> croissance: <SEP> Excellente <SEP> croissan-
<tb>
<tb> brun <SEP> cuivré <SEP> à <SEP> brun-cho- <SEP> ce <SEP> : <SEP> jaune <SEP> pâle. <SEP> Mycé-
<tb>
EMI11.2
col,-tt.ï,iycA.li= aérien lium aérien profus :
EMI11.3
<tb> profus, <SEP> beige. <SEP> Spnru- <SEP> ' <SEP> brun <SEP> foncé. <SEP> Sporula--
<tb>
<tb>
<tb> lation <SEP> profuse. <SEP> Envers <SEP> :
<SEP> tion <SEP> profuse. <SEP> Envers;
<tb>
<tb>
<tb> brun-chocolat. <SEP> Pigment <SEP> orangé <SEP> à <SEP> jaune-orangé.
<tb>
<tb>
<tb> soluble <SEP> brun-rouge <SEP> très <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> brun-
<tb>
<tb>
<tb> foncé <SEP> avec <SEP> couches <SEP> orangé.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> vert-jaune.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Croissance <SEP> profuse, <SEP> Croissance <SEP> profuse,
<tb>
<tb>
<tb> lisse, <SEP> nodulée <SEP> : <SEP> humide, <SEP> lisse, <SEP> nodu-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> rouille <SEP> orangé <SEP> à <SEP> brun <SEP> lée <SEP> : <SEP> jaune-brun
<tb>
<tb>
<tb> foncé <SEP> ou <SEP> brun <SEP> clair. <SEP> clair <SEP> à <SEP> beige <SEP> ou
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> solu- <SEP> cèdre. <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pig-
<tb>
<tb>
<tb> ble. <SEP> ment <SEP> soluble.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Lait <SEP> pourpre <SEP> Collier <SEP> de <SEP> croissan- <SEP> ' <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> ce, <SEP> léger <SEP> nais <SEP> défini, <SEP> croissance <SEP> blanc <SEP> à
<tb>
EMI11.4
jaune-chartreuse vif. jaune pâle. Peu de
EMI11.5
<tb> Peptonisation <SEP> partiel- <SEP> variation <SEP> significati-
<tb>
<tb> le <SEP> apparente <SEP> nais <SEP> peu <SEP> ve <SEP> du <SEP> pH, <SEP> et <SEP> peu <SEP> de
<tb>
<tb> de <SEP> variation <SEP> signifi- <SEP> pcptonisation <SEP> appa-
<tb>
<tb> cative <SEP> du <SEP> pH. <SEP> rente <SEP> en <SEP> 14 <SEP> jours.
<tb>
(1) Couleurs :voir remarque plus haut.
EMI11.6
5. ObscrvQtions microscopiques 3trcntomyces c,ureof;.ci<3ns
EMI11.7
<tb> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb>
EMI11.8
Milieu Mycélium Spores Ifiyc%<lium Spores Agcr-agar Flexueux, -)phénol- Flexueux, Sphéroidaux avec glycé- continu, daux à ovo- continu, à ovoïdaux. rol,¯spar^gi- rrmifié. idaux.Dia- ranifie. Diamètre ne,extrait de Diamètre mètre 1,2- Dicmètre 1,2-1,5}1 viande l, 2-2,0)1 1,5/pf 1,0-1,2
EMI11.9
<tb> Agar-agar <SEP> Flexuoux, <SEP> Sphéroï- <SEP> Flexueux, <SEP> Sphéroldaux
<tb>
<tb> AP4 <SEP> avec <SEP> li- <SEP> continu, <SEP> deux <SEP> à <SEP> ovo- <SEP> continu, <SEP> à <SEP> ovoïdaux.
<tb>
EMI11.10
queur de M'P-cé-rà-.iifi6. idux. ramifié.
Diamètre ration de Diamètre Dic.i=1étre Diamètre 1;2-le5 mais 0,il-1,)/ 1,2-1,Vr 0,..10 V
<Desc/Clms Page number 12>
La morphologie du mycélium et des spores, pour
EMI12.1
la souche S130 est appc.rcr.Gnt similaire à celle observée pour la souche A3 77' Les deux couches présentent un mycélium continu,flexueux ramifie, avec tendance occasionnelle des
EMI12.2
hyphes aériens à Îa. forme spirale. Les spores caractéristi- ques sont ovoïdaux à sph6roidauX.
Des cultures viables de 3. ureofaciens souche S1308 et plusieurs de ses variantes qui produisent les
EMI12.3
nouveaux antibiotiques ont été déposées à l'American Type Culture Collection, à Washington, et le nuncro d'inscription ATCC 12746 a été attribué à la souche S1306, le n ATCC 12749 à la souche S1308-29, le n ATCC 12750 à la souche S1308-Vl46 et le n ATCC 12751 à la souche S1308-V237.
EMI12.4
Le spectre antibactérien de la 7-chloro-5a(lla)- déhydrôtétrccycline est étroitement parallèle à celui de la tétrt=cyclinq4et"à celui de la chlorotétracycline, si ce n'est que le niveau d'activité du nouvel antibiotique est très inférieur vis-à-vis de divers cgents pathogènes tels que les stc.phylocoques et les streptocoques par exemple. La principale
EMI12.5
utilité de la 7-chloro-5c(Ila)-déhydrotétr-cycline est que ltori peut la convertir, par un procédé de déchloruration réductive, en tétracycline qui est un antibiotique bien connu à spectre large.
Un procédé de déchloruration réductive catalytique qui convient pour effectuer cette conve ion est décrit plus en
EMI12.6
détail dans la. demande die brevet L de la demanderesse détail d 1 t4 u des compo- déposée ce\B{e jgroûrv: tPxocédé de préparation des compo- sés de la série des tétracyclines, notanment de l'épimère 5a de la tétrccycline".
Il est possible aussi d'effectuer une conversion
EMI12.7
biologique de la 7-chloro-5a(lla -déhydrotétracyeline en chlorotétracycline à largespectre. On peut effectuer cette conversion en ajoutant des cristaux du nouvel antibiotique dans une fermentation utilisant des souches ordinaires de
<Desc/Clms Page number 13>
S. aureofaciens productrices de chlorotétr. cycline. Un procédé biologique approprié pour réaliser cette conversion fait l'ob-
EMI13.1
.ej et de le. demande de brevet trt.'Q!7.g de la demanderesse \4a.NiJ.1qrg a-?'Y.!!f.,e.v1>.. -" # déposée -ce)Be j9Wr fõùr : "Procédé de préparation des tétera- cyclines".
Les conditions de fomentation, avec les nou- velles souches mutantes de S. aureofaciens de la présente invention en vue de préparer la 7-chloro-5a(lla)-déhydro- tétrccycline sont généralement les mêmes que dons les méthodes actuellement connues de préparation de la chlorotétracycline par fermentation, autrement dit, le milieu de fermentation contient les substances nutritives et minérales usuelles.
Des substances nutritives appropriées qui peuvent fournir les corps nécessaires sont notamment l'amidon, le dextrose, le sucre de canne, le glucose, la mélasse, la,farine de soja, la farine d'arachide, la levure, les extrcits de vicnde, la peptone, le sulfate dlcmmonium, l'urée, la liqueur de macéra- tion de mais, les produits solubles de distillerie, la farine de poisson et d'autres substances courantes. Les sels inorga- niques comprennent notamment le carbonate de calcium, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, et les divers oligo-éléments tels que le manganèse, le coblt, le zinc, le cuivre, le fer etc...
Les autres conditions générales de la fermenta- tion telles que le pH, la température, .le temps, le taux d'aération, la préparation de l'inoculum, la stérilisation, l'inoculation etc..., sort usuelles et peuvent âtre similaires à celles de la production de la chlorotétracycline qui sont décrites dans le brevet américain n 2.482.055 de Duggar déjà cité.
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Mois il existe un point qui s'écarte des condi- tions de fermentation de la chlorotétrccycline et qui a une signification considérable. Les nouvelles souches Mutantes de ±. cureofa.ciens apparaissent comme des organismes déficients en riboflavine, et par suite les rendements en antibiotiques nouveaux sont faibles lorsqu'on conduit :des fermentations avec des milieux qui ont une teneur faible ou nulle en ribo- flavine, Par exemple, lorsqu'on conduit la fermentation avec un milieu ordinaire de liqueur de macération de mais, sans y ajouter de riboflavine, on obtient 2500 à 4000 gammas par cm3 d'antibiotiques nouveaux. L'addition de traces de ribo- flavine à ces milieux donne une augmentation de puissance.
C'est pourquoi il est préférable d'utiliser un milieu de liqueur de macération de mais riche en riboflavine' et à ce point de vue on a trouvé que lorsque le milieu contient de 0,1 à 2,0 parties par million environ de riboflavine ajoutée, la puissance de la liqueur de formentation va jusqu'à 6000 à 10 000 gammas par cm3, ce qui démontre que les nouvelles mutantes sont des souches productrices d'antibiotique. à grand rendement.
Pendant la fermentation, il se forme aussi de petites quantités de chlorotétr@cycline et de tétracycline.
Habituellement, les quantités ne sont pas assez grandes pour gêner le produit principal de la fermentation ni pour valoir la peine dtune opération séparée de récupération, car elles ne dépassent généralement pas 200-400 gammas par cm3 environ dans le milieu de fomentation, bien que la proportion relative de ces trois antibiotiques puisse varier considérablement suivant la.souche mutante particulière, le milieu et les conditions de fermentation utilisés.
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si
On a observé aussi que/les milieux de fomenta- tion sont pauvres en ion chlorure disponible (voir Minieri, brevet américain n 2.734.018 du 7 Février 1956 ), les
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nouvelles souches mutantes de S. urc-ofaciens donnent liane.= logue non chloré de tétrc:
cycline qui est la 5(lla)-déhydro-. tétraçyclino ; il est évident que celle-ci est identique à l'antibiotique chloré dont la formule structurale est indi- quée plus haut, si ce n'est qu'elle est dépourvue d'atone de
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chlore en position 7 du :noy.u naphtacènc. L'analogue non chloré peut 1ve- réduit cat.lyt2qucment on tétracycline ainsi qu'os lrtz expliqué plus haut à propos du composé chloré. De même, l'analogue non chloré peut être converti biologi- quement en tétracycline par des procédés de fermentation simples.
Afin d'obtenir cc nouvel antibiotique non chloré, il suffit de modifier la milieu de fermentation qui contient la riboflavine, de la façon indiquée dans le brevet susdit de
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1-linieri de fcçon que le milieu obtenu soit ptlu'lÎ1!'e,,'en chlorure disponible, c'est-à-dire qu'il contienne moins de 5'0'p,,,,-rties par million environ d'ion chlorure. En conduisant la fermen- tation dans ce milieu pauvre en chlorures, avec les nouvelles souches mutantes, on peut obtenir des quantités satisfaisantes
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de 51;(lla)-déhydrotétr<.cycline.
On a observé aussi que si les milieux de frmcn.-
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. tction contiennent des quantités notables d'ions brOl1Ure" les nouvelles souches mutantes de S. ùreofaciens produisent l'analogue de bromotétr&cycline, qui est la 7-bromo-5a(11a}- déhydrotétracycline ; il est évident qu'elle est identique à l'ant'ibiotiquc chloré dont la formule structurale est indi- quée plus haut, sauf qu'elle porte un atome de brome en positioi 7 du noyau naphtncène au lieu d'un atome de chlore. Ce nouvel
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antibiotique peut aussi être réduit catalytiquement on tétra- cycline comme on l'a expliqué plus haut à propos des composés chlorés et non chlore.
De même, on peut le convertir biolo- iquement en bromotétracycline par des procédés de fermenta- tion appropriés.
Afin de préparer ce nouvel analogue, il suffit de-modifier le milieu de fermentation de façon que le milieu obtenu contienne au moins 50 parties par million et de préfé- rence 100-1500 parties par nillion d'ions bromure, et au maximum 50 parties pcr nillion d'ions chlorure. En conduisant la fermentation drns ce milieu qui contient des ions bro- mure, avec les nouvelles souches mutantes de S. aureofaciens, on peut obtenir des quantités-satisfaisantes de 7-bromo-5a(11a) déhydrotétrcycline.
On peut isoler les déhydrotétracyclines de la liqueur de fermentation par tous moyens appropriés. Une méthode préférentielle comporte une séparation chromatogra- phique, drns l@quelle on acidifie la liqueur de fermentation en ajustant le pH à 1-2, avec un acide approprié tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, etc... On filtre alors la liqueur et on met le filtrat aqueux acidifié qui contient l'activité en contact avec un alcool, par exemple le butrnol-n, pour former un extrait alcoolique de l'acti- vité. On concentre l'extrait puis on le chromatographie sur une colonne de terre d'infusoires, de la façon usuelle, et' on développe la colonne avec un mélange à 80% de butanol-n et 20% de chloroforme.
On concentre les fractions éluées et on les sèche par congélation. On dissout dans le méthanol la matière brute séchée par congélation, et la cristallisation de l'antibiotique sous forme neutre se fait rapidement. On
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filtre les cristaux, on les lave et on les sèche sous vide de la façon usuelle.
Toute la chlorot tracycline et la tétra- cycline résiduelle qui peut être présente peut 8tre enlevée par un procédé de recristallisation qui consiste- à dissoudre l'antibiotique dans du méthanol acidifié, à filtrer, à neutraliser par un alcali frible at à cristalliser la 7-chloro-5a(11a)-déhydrotétracycline purifiée, par exemple. tes nouveaux antibiotiques ont une forme épimère sur l'atome de carbone en position 4, ainsi qu'on l'a décrit à propos d'autres composés du type tétracycline.
On peut forme e nouvel isomère en ajustrnt simplement entre 3,0 et 5,0 le pH d'une solution concentrée de l'antibiotique, et en laissant reposer la solution jusqu'à ce que l'isomé- risc tion soit parvenue à l'équilibre.
Le plus commode est de conduire l'isomérisation à la température ambiante, bien que l'on obtienne un taux de conversion supérieur aux températures plus élevées. Le pH doit être compris entre 3,0 et 5,0 environ, de préférence entre 3,5 et 4,5. Il se produit une certaine épimérisation aux pH qui sortent de ces intervalles, et même dans l'eau distillée, mais la vitesse est très faible.
La concentra- tion de l'antibiotique dans la solution aqueuse doit être ussi élevée que possible afin de donner de plus grandes vitesses d'épimérisation. L'équilibrage complet peut nécessi- ter une durée d'environ 24 huures à 25 C, mais un équili- brage satisfaisant peut être obtenu en un temps considéra- blement plus court dans des conditions précises. Habituelle- ment toutefois, on obtient les meilleurs résultats en laissant reposer les solutions pendant une semaine ou davan- tage.- Il semble que l'équilibre doit atteint dans la plupart des cas aux environs de 50%; autrement dit, la moitié
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environ de l'antibiotique se convertit en épimère à l'équilibre.
Etant donné que la concentration est un facteur importent pour obtenir clos rendements élevés en de courts laps de. temps, il faut choisir un système suivant qui donne la concentration la plus élevée d'antibiotique. Ces sys mes solvants doivent être tamponnes pour donner un pH compris dans l'intervalle préférentiel. Parmi les solvants, on citera le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétone, le
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2-éthoxyéthanol, le 2méthoxypropnol, le tétrnhydrofurane, la dinéthylformamide et les mélanges de' ces corps. On peut encore utiliser d'autres solvants.
Le tampon préférentiel
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est le phosphc.te monosodiquo, mais on peut utiliser d'autres tampons et couples de tampons susceptibles de maintenir le pH dans la gamme désirée.
Les nouveaux rntibiotiques' fornent des sels du même type général et de la même manière 'générale que les tétracyclines connues, c'est-à-dire que l'on peut fccile- ment préparer les sels d'acides minéraux, les sels alcalins
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et les sels alcalino-ter:.eux des nouvelles tétracyclines.
Ainsi, on peut préparer les sels décides minéraux en traitant par des acides tels que l'acide chlorhydrique à un pH infé- rieur à 4 environ. On peut obtenir la base libre à un pH compris entrer 4. et 7 environ. On peut former simplement les
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5±]S ac#lins, et. alcalino-terreux en traitant le composé amph'atèBe pan* un équivalent environ de la base choisie, #'està-dire I!a soude, la potasse, la chaux toi#e, etc... un pH d erwüon 7 ou <:.u-dessus . De on .deux des sels du composé.épimère.
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On décrire.. l'invention plus en détail à propos ,3 des exemples précis qui suivent, dans lesquels les rendements
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sont exprimés en grn8cs pcr centinètre cube ( /cm3 ) EXEMPLE 1
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Sur une culture sur .r- ôo,r on prélève drs spores d'une souche de S. ---ur,3o±- ciens cr-pable de produire de la 7-chloro-5a(llc.)-dhydroté'cr.cycline, prr exemple la souche S130, en les lavant à lieu distil16e stérile pour former un(éuspension contenant environ 60-ÜO millions de spores par cm3.
On utilise une portion de 0,33 cm3 de la suspension pour inoculer un tube de Brewer contenant 8cm3 d'un milieu prépare suivant la formule ci-dess'ous:
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saccharose 30 g sulfate d ' c#.:;.io n:ium 2 g carbonate de calcium 7'g liqueur de nacération de raa31s 16,5 cm3 caudu robinet, q. s . pour 1000 cm3
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Avant 1'inocu.lc.tion, on stérilise le milieu pondant 2o minutes sous une pression do 1,05 kg/cm2, et pendant ce temps le pH passe de 6,3 à 6,9. On faitlors incuber le
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tube inoculé sur une sccoucuse -lternativo à 2lot pendant 24 heures .
EXEMPLE 2
On prépare un milicu qui c- la composition sui- vente :
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<tb> Ingrédients <SEP> Quantités
<tb>
<tb> suif <SEP> et <SEP> e <SEP> d'ammonium <SEP> 5' <SEP> g
<tb> chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> amidon <SEP> 55' <SEP> g
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 1,28 <SEP> g
<tb>
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Lt.,c;J.ç!e rph98Pf19.,rifill.e . 0 :1,. g c:p.p\1at.e de oa :lcxitün 90 g . soalln , ,d'ol;igo-"cilÓr!1cnts s 10 cm3 '1é ;rte !3aindoux 20 cm3 er.u, ,q!3.. pour 1000 cm3
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Après stérilisation du milieu nutritif, on met
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2µ cn3 de ce milieu dans un flacon Erlen;ieyer de 250 cm3 , et on inocule avec 1 cm3 d'inoculum préparé COt::n:1C à 1 r exenple 1.
On conduit la firnenti'tion pendant 120 heures à 25 C sur une secoueuse rotative fonctionnant à 100 t/inn. 0ntLtre,la liqueur pcr voie fluoromêtrique et spectr aphotornêtrique, et on trouve qu'elle contient 6 gamr.s s/cm3 de chlorotétracycline et 100 g4:r.imas/cz:i3 de '7-chloro-5r.(llaj-dhydï^ottr cyclinc.
EXEMPLE 3
On répète l'exemple 2 en utilisant le même milieu
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contenant 0,32 go.l,lrilo.!cm3 de riboflavine. On trouve que la liqueur obtenue contient 71 gamiinas/cm3 de chlorotetrrcycline et 1450 gani3as/cm3 de 7-chloro- a ( lla j -dchydrotétracycline.
,LUilL ll L j
On prépare un Milieu qui a. la composition suivante :
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Ingr.',dients : u,,n4uit à s
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<tb> sulfcte <SEP> d'ammonium <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb> carbonre <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 9' <SEP> g
<tb>
<tb> chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb>
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chlorure de t,lagiié s iunay 6H0 g
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<tb> sulfate <SEP> ferreux,7H20' <SEP> " <SEP> 0,04 <SEP> g
<tb>
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sulfate de mangnnèse,4H20 z05 g
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<tb> chlorure <SEP> de <SEP> cobalt, <SEP> 6H2O <SEP> 0,001 <SEP> g
<tb>
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sulfate de zinç 7H0 0 1 . g
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<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 25-30 <SEP> g
<tb>
<tb> amidon <SEP> 55 <SEP> g
<tb>
<tb> huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> 2 <SEP> cm3
<tb>
<tb> eau, <SEP> q.s.
<SEP> pour <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Après stérilisation du milieu à l'autoclave, on inocule 25 cm3 du milieu, dans un flacon Erlenmeyer de 250 cm3, avec 1 cm3 d'inoculum préparé comme dans l'exemple 1.
On conduit la fermentation pendant 120 heures à ?5 C sur une secoueuse rotative fonctionnant à 180 t/mn. On titre la
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liqueur obtenue par voie fluorontiltrique et spectrophotométrique
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et on trouve qu'elle contient G4 ganmas/cm3 de chlorotétra- cycline et 2 30 gamr.,/cn3 de 7-chloro-5 a ( lla )-déhydrotctra- cyc line.
EXEMPLE 5
On répète l'exemple 4 en utilisant le même milieu contenant 2 gammas/cm3 de riboflavine. On trouve que la li-
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queur contient 760 cmmc.s/cm3 de chlorotétracycline et 9200 gammas/cm3 de 7.-chloro-5a(lla)-déhydrotétr^.cycline.
EXEMPLE 6
On prend une portion de 200 cm3 de liqueur de S1308 titrant 3940 gammas/cm3 de 7-chloro-5a(lla)-déhydro- tétracycline, préparée comme à l'exemple 4 ; on ajuste le pH à 1,5 avec de l'ccide chlorhydrique concentré ct on filtre.
On délàie le gâteau-filtre dans 200 cn3 d'eau à 40 C, on ,juste le pH à 1,5 et on filtre. Aux filtrats réunis, on ajoute 54 g de chlorure de sodium et on extrait 'la solution obtenue avec trois portions de 60 cm3 de butrnol-n. On réunit les extraits et on les concentre à environ/17 cm3, on sature d'eau et on filtre. On verse cc filtrat sur une colonne de terre, d'infusoires de 5x30cm qui contient 0,5 cm3 d'eau à pH 2 (HCl) par gremme de terre d'infusoires. On développe alors la colonne avec un mélange à 80% de butanol-n
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et 201,0 de chloroforme, saturé de HC1 0,01 N. On recueille au total 34 fractions de 10 cm3.
Sur la base des titrages spectrophotométriques, 'on réunit les fractions 12 à 23, riches en antibiotique , on les concentre en présence d'eau pour donner une solution aqueuse et on sèche par congélation.
.On cristallise le produit brut rinsi obtenu dans 1 cm3 de méthanol. On filtre les cristaux, on les lave avec un mélange de méthanol et d'éther à 50/50, puis à l'éther. On sèche le
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produit sous vide à 40 C pour obtenir 16 mg de 7-chloro-5a(lle; déhydrotétracycline titrant 927 8GmQs/mg, soit un rondement de 16% en poids sur la liqueur.
Les analyses ires correspondent de très
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près à une formule empirique C22H2l-23K2ClOg qui correspond à la 7-.chloro-5a( llr. )-,d:hydroté tr cycline neutre. On détermine le pKa-, qui est de 6,05 drns la ii11éthylfornc.mide. L'équiva- lent de neutralisation est de 175,5. La rotation spécifique, f.-V5 , déterminée sur une solution à 0,502 dans HCl 0,1 N, est de -55,8 .
On détermine le spectre d'absorption d'ultra- violet d'après un échantillon du composé neutre dans la
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soude 0,1 1 à une concentration ' 3300 ' gamrn^s/cm3. On
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obtient de façon usuelle le spectre c!'''absrpt"ioML d tinfra-
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rouge du produit neutre, avec ltatib,ot3qze en phase solide comprimé en un disque avec KBr.
EXEMPLE 7
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On délaie dans 3 cui3 de i::,thanol lg de la base libre obtcnue à l'exemple 6, et on ajoute de l'acide chlorhy- drique concentré pour obtenir la dissolution.'Après filtration on ajuste le pH de la solution à 4,0 avec du carbonate deodium saturé ; des cristaux seforment rapidement. On filtre les cristaux de chlorhydrate, on les lave avec un mélange d'éther et de méthanol et finalement avec de l'éther pur. Le produit séché sous vide pèse 500 mg.
EXEMPLE 8
On prépare un mélange contenant 75% 'de -chloro-
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5:'(11D.)-d6hydrotétcycline et 25 de chlorot6tri--cycline et on le recristallise par le procédé ci-dessus pour obtenir un produit qui contient moins de 2 de chlorotétr[1cyclinc ainsi
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qu'on le détermine par titrage fluorométrique.
EXEMPLE 9.
On dissout une portion de 102 mg de la base
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neutre dans 0,17 cm3 de dinéthylfornamide ct on joute 0,3t cm3 d'eau. On filtre les cristaux qui se {:'ornent rapidement, on les lave à deux reprises à l'eau et on les sèche sous vide à 40 pour obtenir un rendement de 78 mg de 7-chloro-
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5a (llc--déhydrotétracycline.
EXEMPLE 10
On dissout lg de la base neutre dns une quan- tité de butanol suffisamment petite pour former une solution presque saturée. On filtre alors la solution, on ajuste le pH à 1,5 avec de l'acide chlorhydrique concentré, et on ajoute de l'éther jusqu'à ce qutil se forme un léger trouble permanent On ensemence le mélange, on le lcisse reposer pendant 24 heures à le température ambiante, =prés quoi on filtre le produit cristallin, on le l@ve au but:nol-n puis à l'éther et on sèche sous vide. On obtient un rendenent de 0,78 g en chlor-
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hydrate de 7-chloro-5c(lla)-dChydrot6trpcycline.
Le produit est soluble dcns l'eau et donne un précipite de chlorure d'argent quand on le tr@itepar le nitrate d'argent.
EXEMPLE 11
On suit le procéda, de l'exemple 4, sauf que le milieu utilisé contient.moins de 50 parties par million
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environ d'ions chlorure. On obtient la 5 a ( lla ) -déhydrot,tre.- cycline.
EXEMPLE 12
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A 5mg de 7-chloro-5 <<( lla ) -d.'hydrotcar cycline, on ajoute 1 cm3 d'acide acétique glacial. On agite le mélange et
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on le laisse s'équilibrer à la température ambiante pendant 18 houris, puis on filtre. La¯¯ chromatographie du filtrat
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sur brnde de papier indique la présence do 7-chloro-5a(lla)- déhydro-4-épi-t8trcyclino.
EXEMPLE 13
On suit le procédé de l'exemple 4, sauf que l'on modifie le milieu de façon qu'il contienne plus de 50 parties par million d'ions bromure et moins de 50 parties par million
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d'ions chlorure. On obtient la '.-brof:io-.5c ( .la ) -.déhydrotétra.- cycline.
EXEMPLE 14
On répète le procédé-de l'exemple 12, sauf que
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leon utilise la a(1.14.}.-d:;hydrotcaxc;cycline. La chrovictogra- phie du filtrat sur bande de papier indique 10. présence de 5 d( 11a ) -d.hydro-.l-épi-tétxt.cycline.
EXEMPLE 15
On répète le procède de l'exemple 12, sauf que
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l'on utilise la 7-brouo-.5a(11a)-c.éhydrotéta.^ cycline. La chromatogrrphie du filtrc.t sur b nde de papier indique la présence de 7-bromo-5 (21.)-d2hydr0-...épi-,tétr4.CyCl..ile.
REVENDICATIONS 1) - Nouveaux composes de la surie des tétra-
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cyclines; comprenant les 5.(11^)-dényc;rotcarcyclines ot répondant à le formule :
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Z Hou OH H 1%1( c Ili 3)2
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"%fl' ...,¯ ¯ . ,-" ly/y1-co IH2
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<tb> OH
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> OH <SEP> 0
<tb>
dans laquelle Z est un ;tome d'hydrogéne, de brome ou de chlore, ainsi que les épimères 4a dcsdits composés, notamment
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la 7-chloro-5a(lla)-déhydrotétrccycline et son épimère 4) la 7-browo-5a(lla)-déhycirotétr;cycline et son épianère 4a.
2) - Sels acides et basiques des composes suivant revendication 1.
3) - Complexes des composes suivant revendica- tion 1-..
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4) - Procédé de préparation des 5a(lla)-d.éhyeiro- tétracyclines, caractérisé par le fait que l'on fait formenter dans des conditions aérobies un milieu nutritif aqueux ordi- naire contenant des ions chlorure à l'aide d'une souche de
S. aureofaciens susceptible de produire le composé dans lequel Z=Cl, ou bien que l'on fait fermenter un milieu -mini-- lafre déficient en ions chlorure de manière à obtenir le composé dans lequel Z=H , ou bien que l'on fait fermenter un milieu contenant des quantités notables d'ions bromure de manière à obtenir le composé dans lequel Z=Br.
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5) - Procédé suivant revendication 4, caractérisé par le fait que l'on ajoute de la riboflavine au milieu.
6) - Procède suivant les revendications 4 ou 5, caractérisé par le fait que l'on utilise un nilieu contenant moins de 50 parties par million d'ions chlorure ct d'ions bromure, pour obtenir le composé drns lequel Z=H.
7) - Procédé suivant les revendications 4 ou 5, caractérisé par le fcit que l'on utilise un milieu contenant moins de 50 parties prr million d'ions chlorure et au moins 50 parties par million d'ions bromure pour obtenir le composé dans lequel Z=Br.
8)- Procède de préparation des épimères 4a des 5a(11a)-déhydrotétracyclines. caractérisé par le fait que l'on ajuste à 3,0-5,0 le pH d'une solution concentrée du composé 5a(11a)-déhydrotétracycline initial, et qu'on laisse reposer la solution jusqu'à ce que l'isomérisation ait atteint l'équilibre.
9) - Procédé suivant revendication 8, carrcté- risé par le fait que l'on travaille à pH 3,5-4,5 dans un système solvant tamponné.
10) - Procédé de préparrtion des sels acides et basiques des composas suivant revendication l,caractérisé par le frit que l'on fait réagir une solution du composé 5a(11a)-déhydrotétr cycline ou de son épimère 4c. ir. @l sur un acide ou une base.
11) - Procédé de préparation de complexes des composés suivant revendication 1,caractérisé par le fait que l'on fait réagir une solution du composé 5a(11a)-déhydro- tétracycline ou de son épimère 4a initial sur un composé formateur de complexes.