Procédé de préparation d'un composé de la série des tétracyclines La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un nouveau composé de la série des tétracyclines, à savoir la 5a(lla)-déhydrotétra- cycline, répondant à la formule
EMI0001.0004
Le nouveau composé de la série des tétracyclines est produit par certaines souches mutantes de<I>S.</I> au- reofaciens. Les nouvelles souches mutantes sont des espèces des S.
aureofaciens, car elles descendent tou tes directement de l'espèce des<I>S.</I> aureofaciens pro ductrice de chlorotétracycline appelée A377 et décrite dans le brevet américain Duggar N, 2482055, et dé posée au Northern Regional Research Laboratory, à Peoria, Illinois, sous la référence NRRL 2209.
Pour obtenir les nouvelles souches de<I>S.</I> aureofaciens à par tir de la souche primitive A377 isolée à partir du sol, on a traité la souche A377 par des agents mutagènes, notamment par irradiation ultraviolette et par la nico tine et l'ypérite azotée. La mutation spontanée des souches de<I>S.</I> aureofaciens productrices de chloro- tétracycline aboutit à des souches qui produisent aussi les antibiotiques nouveaux.
Le procédé suivant l'invention pour préparer la 5a(lla)-déhydrotétracycline consiste à faire fermen ter dans des conditions aérobies un milieu nutritif aqueux ordinaire déficient en ions chlorure à l'aide d'une souche de<I>Streptomyces</I> aureofaciens suscepti ble de produire le composé de formule I.
La souche primitive de<I>S.</I> aureofaciens que l'on a appelée S1308 et qui donne les nouveaux antibioti ques est quelque peu instable. Quand on en fait des sous-cultures elle dégénère rapidement en une culture mixte dans laquelle on peut isoler plusieurs variantes plus stables d'aspect différent. En général, toutes ces souches sont caractéristiques de l'espèce<I>S.</I> aureofa- ciens mais diffèrent quelque peu les unes des autres et des souches de<I>S.</I> aureofaciens antérieurement dé crites, principalement quant à la pigmentation.
La quasi-totalité de ces souches présente une fluorescence ultraviolette caractéristique à 3600 A lorsqu'on les cultive sur des milieux d'agar-agar et de liqueur de macération de mais.
Bien que les nouvelles souches de S. aureofaciens et leurs variantes diffèrent principalement des sou ches de<I>S.</I> aureofaciens antérieurement décrites par la nature des antibiotiques produits, les souches étu diées jusqu'ici diffèrent quelque peu par leur pig mentation sur divers milieux de culture, comme il est indiqué ci-dessous.
EMI0001.0036
<I>Comparaison <SEP> des <SEP> pigments <SEP> fluorescents <SEP> diffusibles</I>
<tb> <I>en <SEP> milieu <SEP> d'agar-agar</I>
<tb> Souche <SEP> Agar-agar <SEP> Q4 <SEP> Agar-agar <SEP> AP4
<tb> A377 <SEP> néant <SEP> néant
<tb> S1308 <SEP> vert-jaune <SEP> vif <SEP> vert-jaune <SEP> vif
EMI0002.0001
<I>Formule <SEP> de <SEP> l'agar-agar <SEP> Q4:
</I>
<tb> saccharose <SEP> <B>....</B> <SEP> __.._-....--.-...-<B>----</B> <SEP> .<B>------</B> <SEP> -<B>----</B> <SEP> ..._ <SEP> 10 <SEP> g
<tb> MgS04, <SEP> 7H20 <SEP> ..<B>------</B> <SEP> .<B>---------- <SEP> --------- <SEP> -- <SEP> --------</B> <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb> KH2P04---<B>-----------</B> <SEP> .<B>----------------------</B> <SEP> -.-..<B>-------</B> <SEP> 4 <SEP> g
<tb> ## <SEP> PO <SEP> g
<tb> #l\L1 <SEP> 4)3 <SEP> 4 <SEP> ..<B>-----------------</B> <SEP> ._....<B>----------</B> <SEP> ._..... <SEP> 2
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> ... <SEP> 7,5 <SEP> cm3
<tb> agar-agar <SEP> brut <SEP> <B>----- <SEP> ----</B> <SEP> ..... <SEP> ............-... <SEP> . <SEP> 30 <SEP> g
<tb> H20 <SEP> <B>---------------</B> <SEP> ....<B>-------</B> <SEP> . <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> pour <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb> pH <SEP> ajusté <SEP> à <SEP> 6,5
EMI0002.0002
<I>Formule <SEP> de <SEP> l'agar-agar <SEP> AN:</I>
<tb> saccharose <SEP> <B>-------</B> <SEP> . <SEP> .. <SEP> 10 <SEP> g
<tb> MgS04, <SEP> 7H20 <SEP> .. <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb> KH.P04 <SEP> <B>---- <SEP> -</B> <SEP> ..... <SEP> ... <SEP> 2 <SEP> g
<tb> (NHIP04 <SEP> __.--.... <SEP> ... <SEP> -- <SEP> ..- <SEP> . <SEP> <B>-----</B> <SEP> -<B>-----</B> <SEP> --<B>......</B> <SEP> ... <SEP> 2 <SEP> g
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 4 <SEP> g
<tb> agar-agar <SEP> raffiné <SEP> Bacto <SEP> _. <SEP> 20 <SEP> g
<tb> H20 <SEP> . <SEP> ......... <SEP> . <SEP> .. <SEP> . <SEP> - <SEP> q. <SEP> s. <SEP> pour <SEP> 1000 <SEP> cm'
<tb> <I>Formule <SEP> de <SEP> l'agar-agar <SEP> AP6:
</I> Comme l'agar-agar AP4, sauf que la proportion de liqueur de macération de maïs est de 6 g par litre.
La souche S1308 .croît vigoureusement sur agar- agar Q4, en donnant des spores abondants gris foncé. Sur agar-agar AP4 et AP6, la colonie typique est fortement pigmentée en jaune-brun foncé et prend une couleur brune ou rouge-brun à la lumière d'une lampe à incandescence; elle est cohérente mais avec une marge diffuse, convexe et lisse, et devient pa- pillée au centre en vieillissant.
La .croissance et la culture de la souche primitive S1308 ont permis d'observer et d'isoler plusieurs types aberrants d'aspect différent, dont la couleur va du blanc au jaune pâle, à l'orangé foncé, au brun clair, et aux nuances typiques jaune-brun et rouge- brun. Tous présentent la fluorescence ultraviolette caractéristique à 3600 A, sauf les types aberrants blancs.
Pour illustrer les variations de couleur des nou velles souches de S. aureofaciens qui produisent le nouvel antibiotique dont il s'agit, on a cultivé six souches sélectionnées sur liqueur de macération de maïs et agar-agar, et on a fait les observations sui vantes
EMI0002.0018
<I>Observations <SEP> sur <SEP> la <SEP> couleur <SEP> (1) <SEP> :</I> <SEP> S. <SEP> aureofaciens
<tb> <I>agar-agar <SEP> AP4 <SEP> avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs;
</I>
<tb> <I>six <SEP> jours <SEP> d'incubation <SEP> à <SEP> 26,5o <SEP> C</I>
<tb> Colonies <SEP> Croissance
<tb> Souche <SEP> séparées <SEP> en <SEP> masse
<tb> S1308 <SEP> brun <SEP> cuivré <SEP> brun <SEP> foncé
<tb> S1308-V146 <SEP> cèdre <SEP> acajou <SEP> foncé
<tb> S1308-V237 <SEP> tan <SEP> foncé <SEP> ( <SEP> dark <SEP> ambre
<tb> luggage <SEP> tan <SEP> )
<tb> S1308-29 <SEP> rouille-orange <SEP> rouille-orange
<tb> (1) <SEP> Les <SEP> couleurs <SEP> sont <SEP> conformes <SEP> au <SEP> <SEP> Color <SEP> Har mony <SEP> Manual <SEP> , <SEP> 3e <SEP> édition, <SEP> Container <SEP> Corpora tion <SEP> of <SEP> America.
EMI0002.0019
<I>Observations <SEP> sur <SEP> les <SEP> couleurs <SEP> (1) <SEP> :</I> <SEP> S. <SEP> aureofaciens
<tb> <I>agar-agar <SEP> AP6 <SEP> avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs</I>
<tb> <I>six <SEP> jours <SEP> d'incubation <SEP> à <SEP> 26,50 <SEP> C</I>
<tb> Colonies <SEP> Croissance
<tb> Souche <SEP> <U>s</U>éparées <SEP> en <SEP> masse
<tb> S1308 <SEP> henné <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> brun <SEP> foncé
<tb> S1308-V146 <SEP> santal <SEP> brun <SEP> châtaigne
<tb> S1308-V237 <SEP> tan <SEP> foncé <SEP> ( <SEP> dark <SEP> tan <SEP> foncé <SEP> ( <SEP> dark
<tb> luggage <SEP> tan <SEP> ) <SEP> luggage <SEP> tan <SEP> )
<tb> <U>S1308-29 <SEP> ro</U>uille-<U>or</U>ange <SEP> rouille-orange
<tb> (1) <SEP> Même <SEP> remarque <SEP> que <SEP> ci-dessus.
Les souches mutantes qui produisent les nouveaux antibiotiques possèdent les mêmes caractéristiques générales que les souches qui produisent les tétra cyclines, et elles diffèrent entre elles de la même façon générale que celle suivant laquelle les souches produc trices de tétracycline et les souches productrices de chlorotétracyclinediffèrent les unes des autres, comme on l'a indiqué dans plusieurs articles scientifiques qui ont été publiés. Les données ci-dessous serviront à il lustrer les différences entre les nouvelles souches et la souche primitive A377 que l'on trouve sous la réfé rence NRRL 2209.
On a établi les différences entre le S. aureofaciens souche S1308 et le<I>S.</I> aureofaciens souche A377 (NRRL 2209) en observant les caractéristiques de croissance sur divers milieux, avec incubation à 26,5o C.
EMI0002.0027
<I>1. <SEP> Agar-agar <SEP> avec <SEP> glycérol, <SEP> asparagine</I>
<tb> <I>et <SEP> extrait <SEP> de <SEP> b#uf</I>
<tb> glycérol <SEP> . <SEP> 1,0 <SEP> o/0
<tb> L-asparagine <SEP> ... <SEP> 0,05%
<tb> extrait <SEP> de <SEP> b#uf <SEP> ... <SEP> 0,2 <SEP> 0/0
<tb> KH.,P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> <B><I>0,0501o</I></B>
<tb> agar-agar <SEP> raffiné <SEP> Bacto <SEP> 1,5 <SEP> %
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> pour <SEP> 100,0 <SEP> 0/0
<tb> ajustement <SEP> du <SEP> pH <SEP> avec <SEP> KOH <SEP> à <SEP> 50 <SEP> 0l0
<tb> pH <SEP> _ <SEP> 7,0
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,2
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> <U>Souche <SEP> S</U>1<U>308 <SEP> Souche <SEP> A</U>377
<tb> croissance <SEP> bonne, <SEP> couleur <SEP> bonne
<tb> chameau <SEP> (1)
<tb> hyphes <SEP> aériens <SEP> légers <SEP> légers <SEP> à <SEP> assez
<tb> à <SEP> modérés <SEP> importants
<tb> blancs <SEP> à <SEP> gris <SEP> blancs
<tb> à <SEP> gris <SEP> clair
<tb> sporulation <SEP> assez <SEP> importante <SEP> gris <SEP> clair
<tb> aux <SEP> foyers <SEP> gris
<tb> pigment <SEP> vert-jaune <SEP> clair <SEP> jaune <SEP> clair
<tb> diffusible <SEP> chameau <SEP> jaune <SEP> à <SEP> jaune <U>envers</U> <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair <SEP> orange <SEP> clair
<tb> (1) <SEP> Couleurs: <SEP> même <SEP> remarque <SEP> que <SEP> ci-dessus.
EMI0003.0001
<I>2. <SEP> Agar-agar <SEP> Czapek-Dox <SEP> à <SEP> la <SEP> dextrine</I>
<tb> dextrine <SEP> =.. <SEP> _...... <SEP> .. <SEP> 1,0 <SEP> 0/0
<tb> NaNO.; <SEP> ..........<B>......</B> <SEP> .<B>....</B> <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb> K.HP04 <SEP> .. <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .... <SEP> .. <SEP> . <SEP> ... <SEP> .. <SEP> .. <SEP> 0,1 <SEP> 0/0
<tb> MgS04, <SEP> 7H.0 <SEP> ... <SEP> .. <SEP> ........ <SEP> .. <SEP> .. <SEP> 0,05 <SEP> 0/0
<tb> KCl <SEP> . <SEP> . <SEP> ... <SEP> .. <SEP> .. <SEP> . <SEP> ... <SEP> . <SEP> 0;
05 <SEP> %
<tb> FeS04, <SEP> 7H0 <SEP> ........ <SEP> .. <SEP> . <SEP> .. <SEP> ... <SEP> . <SEP> <B>0,001%</B>
<tb> agar-agar <SEP> raffiné <SEP> Bacto <SEP> ..1,5 <SEP> 0/0
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> . <SEP> . <SEP> q. <SEP> s. <SEP> pour <SEP> 100,0 <SEP> %
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,2
<tb> <I>Streptofnyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb> croissance <SEP> médiocre, <SEP> bonne
<tb> hyaline
<tb> hyphes <SEP> aériens <SEP> néant <SEP> abondants, <SEP> gris
<tb> souris <SEP> (1) <SEP> à
<tb> gris <SEP> plomb
<tb> (1), <SEP> globules
<tb> superficiels
<tb> incolores
<tb> sporulation <SEP> néant <SEP> profuse
<tb> pigment <SEP> diffusible <SEP> néant <SEP> trace
<tb> jaune <SEP> pâle
<tb> envers <SEP> trace <SEP> de <SEP> pigment <SEP> non <SEP> pigmenté,
<tb> rouge-orangé <SEP> trace <SEP> de <SEP> rose
<tb> (1) <SEP> même <SEP> remarque <SEP> que <SEP> ci-dessus.
EMI0003.0002
<I>3. <SEP> Agar-agar <SEP> AN</I>
<tb> <I>avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs</I>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> . <SEP> ... <SEP> 0,4 <SEP> 0/0
<tb> saccharose <SEP> .. <SEP> .... <SEP> . <SEP> ... <SEP> .1,0 <SEP> %
<tb> MgS04, <SEP> 7H.0 <SEP> . <SEP> 0,025%
<tb> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> .......... <SEP> ...... <SEP> 0,2 <SEP> 0/0
<tb> (NH4)2HP04 <SEP> ... <SEP> . <SEP> _ <SEP> ............ <SEP> .. <SEP> . <SEP> ..... <SEP> 0,2 <SEP> 0/0
<tb> agar-agar <SEP> raffiné <SEP> Bacto <SEP> . <SEP> _ <SEP> .. <SEP> 2,0 <SEP> %
<tb> eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> <B>-----</B> <SEP> ... <SEP> .. <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> pour <SEP> 100,0 <SEP> %
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 6,5
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb> croissance <SEP> bonne <SEP> excellente
<tb> hyphes <SEP> aériens <SEP> modérés <SEP> abondants,
<tb> à <SEP> abondants <SEP> fauves <SEP> (1)
<tb> fauves <SEP> (1)
<tb> sporulation <SEP> abondante, <SEP> profuse,
<tb> uniforme <SEP> uniforme
<tb> pigment <SEP> soluble <SEP> brun-orange <SEP> jaune <SEP> clair
<tb> foncé <SEP> à <SEP> ambre
<tb> avec <SEP> couches
<tb> vert-jaune
<tb> envers <SEP> brun <SEP> chocolat <SEP> tan <SEP> clair <SEP> (1)
<tb> (1)
<tb> (1) <SEP> même <SEP> remarque <SEP> que <SEP> ci-dessus.
EMI0003.0003
<I>-1. <SEP> Autres <SEP> milieux <SEP> d'agar-agar</I>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aicreofaciens</I>
<tb> Milieu <SEP> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb> Agar-agar <SEP> nutritif <SEP> Assez <SEP> bonne <SEP> croissance: <SEP> hyphes <SEP> aériens <SEP> Bonne <SEP> croissance, <SEP> pas <SEP> d'hyphes <SEP> aériens.
<tb> mastic <SEP> (1) <SEP> à <SEP> brun <SEP> moutarde <SEP> (1). <SEP> En- <SEP> Envers <SEP> : <SEP> jaune <SEP> pâle. <SEP> Pigment <SEP> soluble
<tb> vers <SEP> : <SEP> mastic <SEP> devenant <SEP> brun-moutarde. <SEP> jaune <SEP> pâle.
<tb> Pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble.
<tb> Glucose, <SEP> Croissance <SEP> abondante <SEP> :
<SEP> cannelle <SEP> (1) <SEP> à <SEP> tan <SEP> Bonne <SEP> croissance. <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> blancs
<tb> asparagine, <SEP> foncé <SEP> (1) <SEP> ( <SEP> dark <SEP> luggage <SEP> tan ). <SEP> Hyphes <SEP> devenant <SEP> de <SEP> plus <SEP> en <SEP> plus <SEP> gris <SEP> quand <SEP> la
<tb> extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> aériens <SEP> abondants<B>:</B> <SEP> blancs <SEP> à <SEP> fauve. <SEP> Spo- <SEP> formation <SEP> des <SEP> spores <SEP> croît. <SEP> Envers <SEP> : <SEP> jaune
<tb> rulation <SEP> abondante. <SEP> Envers <SEP> :
<SEP> tan <SEP> foncé <SEP> clair <SEP> à <SEP> orange <SEP> rosé. <SEP> Trace <SEP> de <SEP> pigment
<tb> ( <SEP> dark <SEP> luggage <SEP> tan<B> ).</B> <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> soluble <SEP> jaune <SEP> orangé.
<tb> brun-orange.
<tb> Agar-agar <SEP> AP4 <SEP> Bonne <SEP> croissance <SEP> chameau <SEP> (1) <SEP> à <SEP> brun <SEP> Excellente <SEP> croissance. <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> pro avec <SEP> liqueur <SEP> chêne <SEP> (1). <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> bons <SEP> à <SEP> abon- <SEP> fus. <SEP> Sporulation <SEP> profuse <SEP> : <SEP> fauve <SEP> (1). <SEP> En de <SEP> macération <SEP> dants, <SEP> fauves <SEP> (1). <SEP> Sporulation: <SEP> bonne <SEP> à <SEP> vers <SEP> : <SEP> tan <SEP> clair <SEP> (1). <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> jaune
<tb> de <SEP> maïs <SEP> abondante. <SEP> Envers:
<SEP> brun <SEP> chocolat <SEP> (1). <SEP> clair <SEP> à <SEP> ambre.
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> brun-orange <SEP> foncé <SEP> avec
<tb> couches <SEP> vert-jaune.
<tb> Agar-agar <SEP> AP6 <SEP> Croissance <SEP> abondante: <SEP> rouge <SEP> brique <SEP> (1) <SEP> Excellente <SEP> croissance. <SEP> Mycélium <SEP> aérien
<tb> avec <SEP> liqueur <SEP> à <SEP> brun <SEP> cuivré <SEP> (1). <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> abon- <SEP> profus. <SEP> Sporulation <SEP> profuse, <SEP> fauve <SEP> (1).
<tb> de <SEP> macération <SEP> dants <SEP> à <SEP> profus, <SEP> beiges <SEP> (1). <SEP> Sporulation <SEP> Envers: <SEP> tan <SEP> (1). <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> ambre
<tb> de <SEP> maïs <SEP> abondante. <SEP> Envers <SEP> :
<SEP> brun <SEP> chocolat <SEP> (1). <SEP> clair.
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> brun-rouge <SEP> foncé <SEP> avec
<tb> couches <SEP> vert-jaune.
EMI0004.0001
Milieu <SEP> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb> Agar-agar <SEP> Q4 <SEP> Excellente <SEP> croissance: <SEP> brun <SEP> cuivré <SEP> (1) <SEP> à <SEP> Excellente <SEP> croissance: <SEP> jaune <SEP> pâle. <SEP> Mycé brun-chocolat <SEP> (1). <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> pro- <SEP> lium <SEP> aérien <SEP> profus <SEP> : <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> (1). <SEP> Spo fus, <SEP> beige <SEP> (1). <SEP> Sporulation <SEP> profuse. <SEP> En- <SEP> rulation <SEP> profuse. <SEP> Envers<B>:</B> <SEP> orangé <SEP> à <SEP> jaune vers:
<SEP> brun-chocolat <SEP> (1). <SEP> Pigment <SEP> solu- <SEP> orange. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> brun-orangé.
<tb> ble <SEP> brun-rouge <SEP> très <SEP> foncé <SEP> .avec <SEP> couches
<tb> vert-jaune.
<tb> Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Croissance <SEP> profuse, <SEP> lisse, <SEP> nodulée <SEP> :
<SEP> rouille <SEP> Croissance <SEP> profuse, <SEP> humide, <SEP> lisse, <SEP> nodulée
<tb> orangé <SEP> (1) <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> (1) <SEP> ou <SEP> brun <SEP> jaune-brun <SEP> (1) <SEP> clair <SEP> à <SEP> beige <SEP> (1) <SEP> ou <SEP> cèdre
<tb> clair <SEP> (1). <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble. <SEP> (1). <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble.
<tb> Lait <SEP> pourpre <SEP> Collier <SEP> de <SEP> croissance, <SEP> léger <SEP> mais <SEP> défini, <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> croissance <SEP> blanc <SEP> à <SEP> jaune
<tb> jaune-chartreuse <SEP> vif <SEP> (1). <SEP> Peptonisation <SEP> pâle.
<SEP> Peu <SEP> de <SEP> variation <SEP> significative <SEP> du
<tb> partielle <SEP> apparente <SEP> mais <SEP> peu <SEP> de <SEP> varia- <SEP> pH, <SEP> et <SEP> peu <SEP> de <SEP> peptonisation <SEP> apparente <SEP> en
<tb> tion <SEP> significative <SEP> du <SEP> pH. <SEP> 14 <SEP> jours.
<tb> (1) <SEP> Couleurs: <SEP> voir <SEP> remarque <SEP> plus <SEP> haut.
EMI0004.0002
<I>5. <SEP> Observations <SEP> microscopiques</I>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureo <SEP> f <SEP> aciens</I>
<tb> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb> Milieu <SEP> Mycélium <SEP> Spores <SEP> Mycélium <SEP> Spores
<tb> Agar-agar <SEP> avec <SEP> gly- <SEP> Flexueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdales <SEP> à <SEP> ovoï- <SEP> Flexueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdales <SEP> à <SEP> ovoï cérol, <SEP> asparagine, <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> dates. <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> dates.
<tb> extrait <SEP> de <SEP> viande. <SEP> 1,2-2,0 <SEP> u. <SEP> Diamètre <SEP> 1,2-1,5 <SEP> #t. <SEP> 1,0-1,2'u.
<SEP> Diamètre <SEP> 1,2-1,5
<tb> Agar-agar <SEP> AP4 <SEP> avec <SEP> Flexueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroidaies <SEP> à <SEP> ovoï- <SEP> Flexueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdales <SEP> à <SEP> ovoï liqueur <SEP> de <SEP> macéra- <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> Jales. <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> dates.
<tb> tion <SEP> de <SEP> maïs. <SEP> 0,8-1,0 <SEP> I,. <SEP> Diamètre <SEP> 1,2-1,5 <SEP> tt. <SEP> 0,8-1,0 <SEP> ;ti. <SEP> Diamètre <SEP> 1,2-1,5 La morphologie du mycélium et des spores, pour la souche S1308, est apparemment similaire à celle observée pour la souche A377. Les deux souches présentent un mycélium continu, flexueux, ramifié, avec tendance occasionnelle des hyphes aériens à la forme spirale. Les spores caractéristiques sont ovoïdales à sphéroïdales.
Des cultures viables de S. aureofaciens souche S1308 et plusieurs de ses variantes qui produisent les nouveaux antibiotiques ont été déposées à l'American Type Culture Collection, à Washington, et le numéro d'inscription ATCC 12748 a été attribué à la souche S1308, le No ATCC 12749 à la souche S1308-29, le No ATCC 12750 à la souche S1308-V146, et le No ATCC <B>12751</B> à la souche S1308-V237.
Les conditions de fermentation avec les nouvelles souches mutantes de<I>S.</I> aureofaciens de la présente in vention, en vue de préparer la 5a(lla)-déhydrotétra- cycline, sont généralement les mêmes que dans les méthodes actuellement connues de préparation de la chlorotétracycline par fermentation, excepté que le milieu de fermentation doit être pauvre en ions chlo rure. Autrement dit, le milieu de fermentation con tient les substances nutritives et minérales usuelles.
Des substances nutritives appropriées qui peuvent fournir les corps nécessaires sont notamment l'ami don, le dextrose, le sucre de canne, le glucose, la mé- lasse, la farine de soja, la farine d'arachide, la levure, les extraits de viande, la peptone, le sulfate d'ammo nium, l'urée, la liqueur de macération de maïs, les produits solubles de distillerie, la farine de poisson et d'autres substances courantes. Les sels inorganiques comprennent notamment le carbonate de calcium, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, et les divers oligo-éléments tels que le manganèse, le co balt, le zinc, le cuivre, le fer, etc.
Les autres conditions générales de la fermentation telles que le pH, la température, le temps, le taux d'aération, la préparation de l'inoculum, la stérilisa tion, l'inoculation, etc., sont usuelles et peuvent être similaires à celles de la production de la chlorotétra- cycline qui sont décrites dans le brevet américain No 2482055 de Duggar déjà cité.
Mais il existe un point qui s'écarte des conditions de fermentation de la chlorotétracycline et qui a une signification considérable. Les nouvelles souches mu tantes de S. aureofaciens apparaissent comme des or- ganismes déficients en riboflavine, et par suite les rendements en antibiotiques nouveaux sont faibles lorsqu'on conduit des fermentations avec des milieux qui ont une teneur faible ou nulle en riboflavine. Par exemple, lorsqu'on conduit la fermentation avec un milieu ordinaire de liqueur de macération de maïs, sans y ajouter de riboflavine, on obtient 2500 à 4000,! par cm- d'antibiotiques nouveaux.
L'addition de tra ces de riboflavine à ces milieux donne une augmen tation de puissance. C'est pourquoi il est préférable d'utiliser un milieu de liqueur de macération de maïs riche en riboflavine et à ce point de vue on a trouvé que lorsque le milieu contient de 0,1 à 2,0 parties par million environ de riboflavine ajoutée, la puissance de la liqueur de fermentation va jusqu'à 8000 à 10 000 ,, par cm @, ce qui démontre que les nouvelles mutantes sont des souches productrices d'antibiotique à grand rendement.
Pendant la fermentation, il se forme aussi de peti tes quantités de chlorotétracycline et de tétracycline. Habituellement, les quantités ne sont pas assez gran des pour gêner le produit principal de la fermentation ni pour valoir la peine d'une opération séparée de récupération, car elles ne dépassent généralement pas 200-400 y par cm' environ dans le milieu de fermen tation, bien due la proportion relative de ces trois ;antibiotiques puisse varier considérablement suivant la souche mutante particulière, le milieu et les condi tions de fermentation utilisés.
Le composé non chloré peut être réduit catalyti- quement en tétracycline ou il peu!. être converti bio- logiquement en tétracycline par des procédés de fer mentation appropriés.
Afin d'obtenir ce nouvel antibiotique: non chloré, il suffit de modifier le milieu de fermentation qui contient la riboflavine, de la façon indiquée dans le brevet américain N 2734018 de Minieri de façon que le milieu obtenu soit pauvre en chlorure disponible, c'est-à-dire qu'il contienne moins de 50 parties par million environ d'ion chlorure. En conduisant la fer mentation dans ce milieu pauvre en chlorures, avec les nouvelles souches mutantes, on peut obtenir des quantités satisfaisantes de 5a(llcr)-déhydrotétracy- cline.
On peut isoler la déhydrotétracycline de la liqueur de fermentation par tous moyens appropriés. Une mé thode préférentielle comporte une séparation chroma- tographique, dans laquelle on acidifie la liqueur de fermentation en ajustant le pH à 1-2, avec un acide approprié tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfu rique, etc. On filtre alors la liqueur et on met le filtrat aqueux acidifié qui contient l'activité en contact avec un alcool, par exemple le butanol-n, pour former un extrait alcoolique de l'activité.
On concentre l'extrait puis on le chromatographie sur une colonne de terre d'infusoires, de la façon usuelle, et on développe la colonne avec un mélange à 80% de butanol-n et 200/(> de chloroforme. On concentre les fractions éluées et on les sèche par congélation. On dissout dans le méthanol la matière brute séchée par congélation, et la cristallisation de l'antibiotique sous forme neutre se fait rapidement. On filtre les cristaux, on les lave et on les sèche sous vide de la façon usuelle.
Toute la chlorotétracycline et la tétracycline résiduelle qui peut être présente peut être enlevée par un procédé de re- cristallisation qui consiste à dissoudre l'antibiotique dans du méthanol acidifié, à filtrer, à neutraliser par un alcali faible et à cristalliser la 5a(lla)-déhydro- tétracycline purifiée.
Le nouvel antibiotique a une forme épinière sur l'atome de carbone en position 4, ainsi qu'on l'a dé crit à propos d'autres composés du type tétracycline. On peut former ce nouvel isomère en ajustant simple ment entre 3,0 et 5,0 le pH d'une solution concentrée de l'antibiotique, et en laissant reposer la solution jusqu'à ce que l'isomérisation soit parvenue à l'équi libre.
Le plus commode est de conduire l'isomérisation à la température ambiante, bien que l'on obtienne un taux de conversion supérieur aux températures plus élevées. Le pH doit être compris entre 3,0 et 5,0 envi ron, de préférence entre 3,5 et 4,5. Il se produit une certaine épimérisation aux pH qui sortent de ces intervalles, et même dans l'eau distillée, mais la vi tesse est très faible.
La concentration de l'antibiotique dans la solution aqueuse doit être aussi élevée que possible afin de .donner de plus grandes vitesses d'épimérisation. L'équilibrage complet peut nécessiter une durée d'environ 24 heures à 25() C, mais un équi librage satisfaisant peut être obtenu en un temps con sidérablement plus court dans des conditions précises. Habituellement toutefois, on obtient les meilleurs ré sultats en laissant reposer les solutions pendant une semaine ou davantage.
Il semble que l'équilibre soit atteint dans la plupart des cas aux environs de 50 % ; autrement dit, la moitié environ de l'antibiotique se convertit en épinière à l'équilibre.
Etant donné que la concentration est un facteur important pour obtenir des rendements élevés en de courts laps de temps, il faut choisir un système sol vant qui donne la concentration la plus élevée d'anti biotique. Ces systèmes solvants doivent être tampon nés pour donner un pH compris dans l'intervalle pré férentiel. Parmi les solvants, on citera le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétone, le 2-éthoxyéthanol, le 2-méthoxypropanol, le tétrahydrofurane, la .diméthyl- formamide et les mélanges de ces corps. On peut en core utiliser d'autres solvants.
Le tampon préférentiel est le phosphate monosodique, mais on peut utiliser d'autres tampons et couples de tampons susceptibles de maintenir le pH dans la gamme désirée.
Le nouvel antibiotique forme des sels du même type général et de la même manière générale que les tétracyclines connues, c'est-à-dire que l'on peut faci lement préparer les sels d'acides minéraux, les sels alcalins et les sels alcalino-terreux des nouvelles tétra cyclines. Ainsi, on peut préparer les sels d'acides minéraux en traitant par des acides tels que l'acide chlorhydrique à un pH inférieur à 4 environ. On petit obtenir la base libre à un pH compris entre 4 et 7 environ. On peut former simplement les sels alcalins et alcalino-terreux en traitant le composé amphotère par un équivalent environ de la base choisie, c'est- à-dire la soude, la potasse, la chaux éteinte, etc., à un pH d'environ 7 -ou au-dessus.
De même, on peut pré parer des sels du composé épinière.