Procédé de préparation d'un composé de la série des tétracyclines La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un nouveau composé de la série des tétracyclines, à savoir la 5a(lla)-déhydrotétra- cycline, répondant à la formule
EMI0001.0004
Le nouveau composé de la série des tétracyclines est produit par certaines souches mutantes de<I>S.</I> au- reofaciens. Les nouvelles souches mutantes sont des espèces des S.
aureofaciens, car elles descendent tou tes directement de l'espèce des<I>S.</I> aureofaciens pro ductrice de chlorotétracycline appelée A377 et décrite dans le brevet américain Duggar N, 2482055, et dé posée au Northern Regional Research Laboratory, à Peoria, Illinois, sous la référence NRRL 2209.
Pour obtenir les nouvelles souches de<I>S.</I> aureofaciens à par tir de la souche primitive A377 isolée à partir du sol, on a traité la souche A377 par des agents mutagènes, notamment par irradiation ultraviolette et par la nico tine et l'ypérite azotée. La mutation spontanée des souches de<I>S.</I> aureofaciens productrices de chloro- tétracycline aboutit à des souches qui produisent aussi les antibiotiques nouveaux.
Le procédé suivant l'invention pour préparer la 5a(lla)-déhydrotétracycline consiste à faire fermen ter dans des conditions aérobies un milieu nutritif aqueux ordinaire déficient en ions chlorure à l'aide d'une souche de<I>Streptomyces</I> aureofaciens suscepti ble de produire le composé de formule I.
La souche primitive de<I>S.</I> aureofaciens que l'on a appelée S1308 et qui donne les nouveaux antibioti ques est quelque peu instable. Quand on en fait des sous-cultures elle dégénère rapidement en une culture mixte dans laquelle on peut isoler plusieurs variantes plus stables d'aspect différent. En général, toutes ces souches sont caractéristiques de l'espèce<I>S.</I> aureofa- ciens mais diffèrent quelque peu les unes des autres et des souches de<I>S.</I> aureofaciens antérieurement dé crites, principalement quant à la pigmentation.
La quasi-totalité de ces souches présente une fluorescence ultraviolette caractéristique à 3600 A lorsqu'on les cultive sur des milieux d'agar-agar et de liqueur de macération de mais.
Bien que les nouvelles souches de S. aureofaciens et leurs variantes diffèrent principalement des sou ches de<I>S.</I> aureofaciens antérieurement décrites par la nature des antibiotiques produits, les souches étu diées jusqu'ici diffèrent quelque peu par leur pig mentation sur divers milieux de culture, comme il est indiqué ci-dessous.
EMI0001.0036
<I>Comparaison <SEP> des <SEP> pigments <SEP> fluorescents <SEP> diffusibles</I>
<tb> <I>en <SEP> milieu <SEP> d'agar-agar</I>
<tb> Souche <SEP> Agar-agar <SEP> Q4 <SEP> Agar-agar <SEP> AP4
<tb> A377 <SEP> néant <SEP> néant
<tb> S1308 <SEP> vert-jaune <SEP> vif <SEP> vert-jaune <SEP> vif
EMI0002.0001
<I>Formule <SEP> de <SEP> l'agar-agar <SEP> Q4:
</I>
<tb> saccharose <SEP> <B>....</B> <SEP> __.._-....--.-...-<B>----</B> <SEP> .<B>------</B> <SEP> -<B>----</B> <SEP> ..._ <SEP> 10 <SEP> g
<tb> MgS04, <SEP> 7H20 <SEP> ..<B>------</B> <SEP> .<B>---------- <SEP> --------- <SEP> -- <SEP> --------</B> <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb> KH2P04---<B>-----------</B> <SEP> .<B>----------------------</B> <SEP> -.-..<B>-------</B> <SEP> 4 <SEP> g
<tb> ## <SEP> PO <SEP> g
<tb> #l\L1 <SEP> 4)3 <SEP> 4 <SEP> ..<B>-----------------</B> <SEP> ._....<B>----------</B> <SEP> ._..... <SEP> 2
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> ... <SEP> 7,5 <SEP> cm3
<tb> agar-agar <SEP> brut <SEP> <B>----- <SEP> ----</B> <SEP> ..... <SEP> ............-... <SEP> . <SEP> 30 <SEP> g
<tb> H20 <SEP> <B>---------------</B> <SEP> ....<B>-------</B> <SEP> . <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> pour <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb> pH <SEP> ajusté <SEP> à <SEP> 6,5
EMI0002.0002
<I>Formule <SEP> de <SEP> l'agar-agar <SEP> AN:</I>
<tb> saccharose <SEP> <B>-------</B> <SEP> . <SEP> .. <SEP> 10 <SEP> g
<tb> MgS04, <SEP> 7H20 <SEP> .. <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb> KH.P04 <SEP> <B>---- <SEP> -</B> <SEP> ..... <SEP> ... <SEP> 2 <SEP> g
<tb> (NHIP04 <SEP> __.--.... <SEP> ... <SEP> -- <SEP> ..- <SEP> . <SEP> <B>-----</B> <SEP> -<B>-----</B> <SEP> --<B>......</B> <SEP> ... <SEP> 2 <SEP> g
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 4 <SEP> g
<tb> agar-agar <SEP> raffiné <SEP> Bacto <SEP> _. <SEP> 20 <SEP> g
<tb> H20 <SEP> . <SEP> ......... <SEP> . <SEP> .. <SEP> . <SEP> - <SEP> q. <SEP> s. <SEP> pour <SEP> 1000 <SEP> cm'
<tb> <I>Formule <SEP> de <SEP> l'agar-agar <SEP> AP6:
</I> Comme l'agar-agar AP4, sauf que la proportion de liqueur de macération de maïs est de 6 g par litre.
La souche S1308 .croît vigoureusement sur agar- agar Q4, en donnant des spores abondants gris foncé. Sur agar-agar AP4 et AP6, la colonie typique est fortement pigmentée en jaune-brun foncé et prend une couleur brune ou rouge-brun à la lumière d'une lampe à incandescence; elle est cohérente mais avec une marge diffuse, convexe et lisse, et devient pa- pillée au centre en vieillissant.
La .croissance et la culture de la souche primitive S1308 ont permis d'observer et d'isoler plusieurs types aberrants d'aspect différent, dont la couleur va du blanc au jaune pâle, à l'orangé foncé, au brun clair, et aux nuances typiques jaune-brun et rouge- brun. Tous présentent la fluorescence ultraviolette caractéristique à 3600 A, sauf les types aberrants blancs.
Pour illustrer les variations de couleur des nou velles souches de S. aureofaciens qui produisent le nouvel antibiotique dont il s'agit, on a cultivé six souches sélectionnées sur liqueur de macération de maïs et agar-agar, et on a fait les observations sui vantes
EMI0002.0018
<I>Observations <SEP> sur <SEP> la <SEP> couleur <SEP> (1) <SEP> :</I> <SEP> S. <SEP> aureofaciens
<tb> <I>agar-agar <SEP> AP4 <SEP> avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs;
</I>
<tb> <I>six <SEP> jours <SEP> d'incubation <SEP> à <SEP> 26,5o <SEP> C</I>
<tb> Colonies <SEP> Croissance
<tb> Souche <SEP> séparées <SEP> en <SEP> masse
<tb> S1308 <SEP> brun <SEP> cuivré <SEP> brun <SEP> foncé
<tb> S1308-V146 <SEP> cèdre <SEP> acajou <SEP> foncé
<tb> S1308-V237 <SEP> tan <SEP> foncé <SEP> ( <SEP> dark <SEP> ambre
<tb> luggage <SEP> tan <SEP> )
<tb> S1308-29 <SEP> rouille-orange <SEP> rouille-orange
<tb> (1) <SEP> Les <SEP> couleurs <SEP> sont <SEP> conformes <SEP> au <SEP> <SEP> Color <SEP> Har mony <SEP> Manual <SEP> , <SEP> 3e <SEP> édition, <SEP> Container <SEP> Corpora tion <SEP> of <SEP> America.
EMI0002.0019
<I>Observations <SEP> sur <SEP> les <SEP> couleurs <SEP> (1) <SEP> :</I> <SEP> S. <SEP> aureofaciens
<tb> <I>agar-agar <SEP> AP6 <SEP> avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs</I>
<tb> <I>six <SEP> jours <SEP> d'incubation <SEP> à <SEP> 26,50 <SEP> C</I>
<tb> Colonies <SEP> Croissance
<tb> Souche <SEP> <U>s</U>éparées <SEP> en <SEP> masse
<tb> S1308 <SEP> henné <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> brun <SEP> foncé
<tb> S1308-V146 <SEP> santal <SEP> brun <SEP> châtaigne
<tb> S1308-V237 <SEP> tan <SEP> foncé <SEP> ( <SEP> dark <SEP> tan <SEP> foncé <SEP> ( <SEP> dark
<tb> luggage <SEP> tan <SEP> ) <SEP> luggage <SEP> tan <SEP> )
<tb> <U>S1308-29 <SEP> ro</U>uille-<U>or</U>ange <SEP> rouille-orange
<tb> (1) <SEP> Même <SEP> remarque <SEP> que <SEP> ci-dessus.
Les souches mutantes qui produisent les nouveaux antibiotiques possèdent les mêmes caractéristiques générales que les souches qui produisent les tétra cyclines, et elles diffèrent entre elles de la même façon générale que celle suivant laquelle les souches produc trices de tétracycline et les souches productrices de chlorotétracyclinediffèrent les unes des autres, comme on l'a indiqué dans plusieurs articles scientifiques qui ont été publiés. Les données ci-dessous serviront à il lustrer les différences entre les nouvelles souches et la souche primitive A377 que l'on trouve sous la réfé rence NRRL 2209.
On a établi les différences entre le S. aureofaciens souche S1308 et le<I>S.</I> aureofaciens souche A377 (NRRL 2209) en observant les caractéristiques de croissance sur divers milieux, avec incubation à 26,5o C.
EMI0002.0027
<I>1. <SEP> Agar-agar <SEP> avec <SEP> glycérol, <SEP> asparagine</I>
<tb> <I>et <SEP> extrait <SEP> de <SEP> b#uf</I>
<tb> glycérol <SEP> . <SEP> 1,0 <SEP> o/0
<tb> L-asparagine <SEP> ... <SEP> 0,05%
<tb> extrait <SEP> de <SEP> b#uf <SEP> ... <SEP> 0,2 <SEP> 0/0
<tb> KH.,P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> <B><I>0,0501o</I></B>
<tb> agar-agar <SEP> raffiné <SEP> Bacto <SEP> 1,5 <SEP> %
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> pour <SEP> 100,0 <SEP> 0/0
<tb> ajustement <SEP> du <SEP> pH <SEP> avec <SEP> KOH <SEP> à <SEP> 50 <SEP> 0l0
<tb> pH <SEP> _ <SEP> 7,0
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,2
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> <U>Souche <SEP> S</U>1<U>308 <SEP> Souche <SEP> A</U>377
<tb> croissance <SEP> bonne, <SEP> couleur <SEP> bonne
<tb> chameau <SEP> (1)
<tb> hyphes <SEP> aériens <SEP> légers <SEP> légers <SEP> à <SEP> assez
<tb> à <SEP> modérés <SEP> importants
<tb> blancs <SEP> à <SEP> gris <SEP> blancs
<tb> à <SEP> gris <SEP> clair
<tb> sporulation <SEP> assez <SEP> importante <SEP> gris <SEP> clair
<tb> aux <SEP> foyers <SEP> gris
<tb> pigment <SEP> vert-jaune <SEP> clair <SEP> jaune <SEP> clair
<tb> diffusible <SEP> chameau <SEP> jaune <SEP> à <SEP> jaune <U>envers</U> <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair <SEP> orange <SEP> clair
<tb> (1) <SEP> Couleurs: <SEP> même <SEP> remarque <SEP> que <SEP> ci-dessus.
EMI0003.0001
<I>2. <SEP> Agar-agar <SEP> Czapek-Dox <SEP> à <SEP> la <SEP> dextrine</I>
<tb> dextrine <SEP> =.. <SEP> _...... <SEP> .. <SEP> 1,0 <SEP> 0/0
<tb> NaNO.; <SEP> ..........<B>......</B> <SEP> .<B>....</B> <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb> K.HP04 <SEP> .. <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .... <SEP> .. <SEP> . <SEP> ... <SEP> .. <SEP> .. <SEP> 0,1 <SEP> 0/0
<tb> MgS04, <SEP> 7H.0 <SEP> ... <SEP> .. <SEP> ........ <SEP> .. <SEP> .. <SEP> 0,05 <SEP> 0/0
<tb> KCl <SEP> . <SEP> . <SEP> ... <SEP> .. <SEP> .. <SEP> . <SEP> ... <SEP> . <SEP> 0;
05 <SEP> %
<tb> FeS04, <SEP> 7H0 <SEP> ........ <SEP> .. <SEP> . <SEP> .. <SEP> ... <SEP> . <SEP> <B>0,001%</B>
<tb> agar-agar <SEP> raffiné <SEP> Bacto <SEP> ..1,5 <SEP> 0/0
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> . <SEP> . <SEP> q. <SEP> s. <SEP> pour <SEP> 100,0 <SEP> %
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,2
<tb> <I>Streptofnyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb> croissance <SEP> médiocre, <SEP> bonne
<tb> hyaline
<tb> hyphes <SEP> aériens <SEP> néant <SEP> abondants, <SEP> gris
<tb> souris <SEP> (1) <SEP> à
<tb> gris <SEP> plomb
<tb> (1), <SEP> globules
<tb> superficiels
<tb> incolores
<tb> sporulation <SEP> néant <SEP> profuse
<tb> pigment <SEP> diffusible <SEP> néant <SEP> trace
<tb> jaune <SEP> pâle
<tb> envers <SEP> trace <SEP> de <SEP> pigment <SEP> non <SEP> pigmenté,
<tb> rouge-orangé <SEP> trace <SEP> de <SEP> rose
<tb> (1) <SEP> même <SEP> remarque <SEP> que <SEP> ci-dessus.
EMI0003.0002
<I>3. <SEP> Agar-agar <SEP> AN</I>
<tb> <I>avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs</I>
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> . <SEP> ... <SEP> 0,4 <SEP> 0/0
<tb> saccharose <SEP> .. <SEP> .... <SEP> . <SEP> ... <SEP> .1,0 <SEP> %
<tb> MgS04, <SEP> 7H.0 <SEP> . <SEP> 0,025%
<tb> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> .......... <SEP> ...... <SEP> 0,2 <SEP> 0/0
<tb> (NH4)2HP04 <SEP> ... <SEP> . <SEP> _ <SEP> ............ <SEP> .. <SEP> . <SEP> ..... <SEP> 0,2 <SEP> 0/0
<tb> agar-agar <SEP> raffiné <SEP> Bacto <SEP> . <SEP> _ <SEP> .. <SEP> 2,0 <SEP> %
<tb> eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> <B>-----</B> <SEP> ... <SEP> .. <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> pour <SEP> 100,0 <SEP> %
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 6,5
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb> croissance <SEP> bonne <SEP> excellente
<tb> hyphes <SEP> aériens <SEP> modérés <SEP> abondants,
<tb> à <SEP> abondants <SEP> fauves <SEP> (1)
<tb> fauves <SEP> (1)
<tb> sporulation <SEP> abondante, <SEP> profuse,
<tb> uniforme <SEP> uniforme
<tb> pigment <SEP> soluble <SEP> brun-orange <SEP> jaune <SEP> clair
<tb> foncé <SEP> à <SEP> ambre
<tb> avec <SEP> couches
<tb> vert-jaune
<tb> envers <SEP> brun <SEP> chocolat <SEP> tan <SEP> clair <SEP> (1)
<tb> (1)
<tb> (1) <SEP> même <SEP> remarque <SEP> que <SEP> ci-dessus.
EMI0003.0003
<I>-1. <SEP> Autres <SEP> milieux <SEP> d'agar-agar</I>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aicreofaciens</I>
<tb> Milieu <SEP> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb> Agar-agar <SEP> nutritif <SEP> Assez <SEP> bonne <SEP> croissance: <SEP> hyphes <SEP> aériens <SEP> Bonne <SEP> croissance, <SEP> pas <SEP> d'hyphes <SEP> aériens.
<tb> mastic <SEP> (1) <SEP> à <SEP> brun <SEP> moutarde <SEP> (1). <SEP> En- <SEP> Envers <SEP> : <SEP> jaune <SEP> pâle. <SEP> Pigment <SEP> soluble
<tb> vers <SEP> : <SEP> mastic <SEP> devenant <SEP> brun-moutarde. <SEP> jaune <SEP> pâle.
<tb> Pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble.
<tb> Glucose, <SEP> Croissance <SEP> abondante <SEP> :
<SEP> cannelle <SEP> (1) <SEP> à <SEP> tan <SEP> Bonne <SEP> croissance. <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> blancs
<tb> asparagine, <SEP> foncé <SEP> (1) <SEP> ( <SEP> dark <SEP> luggage <SEP> tan ). <SEP> Hyphes <SEP> devenant <SEP> de <SEP> plus <SEP> en <SEP> plus <SEP> gris <SEP> quand <SEP> la
<tb> extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> aériens <SEP> abondants<B>:</B> <SEP> blancs <SEP> à <SEP> fauve. <SEP> Spo- <SEP> formation <SEP> des <SEP> spores <SEP> croît. <SEP> Envers <SEP> : <SEP> jaune
<tb> rulation <SEP> abondante. <SEP> Envers <SEP> :
<SEP> tan <SEP> foncé <SEP> clair <SEP> à <SEP> orange <SEP> rosé. <SEP> Trace <SEP> de <SEP> pigment
<tb> ( <SEP> dark <SEP> luggage <SEP> tan<B> ).</B> <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> soluble <SEP> jaune <SEP> orangé.
<tb> brun-orange.
<tb> Agar-agar <SEP> AP4 <SEP> Bonne <SEP> croissance <SEP> chameau <SEP> (1) <SEP> à <SEP> brun <SEP> Excellente <SEP> croissance. <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> pro avec <SEP> liqueur <SEP> chêne <SEP> (1). <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> bons <SEP> à <SEP> abon- <SEP> fus. <SEP> Sporulation <SEP> profuse <SEP> : <SEP> fauve <SEP> (1). <SEP> En de <SEP> macération <SEP> dants, <SEP> fauves <SEP> (1). <SEP> Sporulation: <SEP> bonne <SEP> à <SEP> vers <SEP> : <SEP> tan <SEP> clair <SEP> (1). <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> jaune
<tb> de <SEP> maïs <SEP> abondante. <SEP> Envers:
<SEP> brun <SEP> chocolat <SEP> (1). <SEP> clair <SEP> à <SEP> ambre.
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> brun-orange <SEP> foncé <SEP> avec
<tb> couches <SEP> vert-jaune.
<tb> Agar-agar <SEP> AP6 <SEP> Croissance <SEP> abondante: <SEP> rouge <SEP> brique <SEP> (1) <SEP> Excellente <SEP> croissance. <SEP> Mycélium <SEP> aérien
<tb> avec <SEP> liqueur <SEP> à <SEP> brun <SEP> cuivré <SEP> (1). <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> abon- <SEP> profus. <SEP> Sporulation <SEP> profuse, <SEP> fauve <SEP> (1).
<tb> de <SEP> macération <SEP> dants <SEP> à <SEP> profus, <SEP> beiges <SEP> (1). <SEP> Sporulation <SEP> Envers: <SEP> tan <SEP> (1). <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> ambre
<tb> de <SEP> maïs <SEP> abondante. <SEP> Envers <SEP> :
<SEP> brun <SEP> chocolat <SEP> (1). <SEP> clair.
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> brun-rouge <SEP> foncé <SEP> avec
<tb> couches <SEP> vert-jaune.
EMI0004.0001
Milieu <SEP> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb> Agar-agar <SEP> Q4 <SEP> Excellente <SEP> croissance: <SEP> brun <SEP> cuivré <SEP> (1) <SEP> à <SEP> Excellente <SEP> croissance: <SEP> jaune <SEP> pâle. <SEP> Mycé brun-chocolat <SEP> (1). <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> pro- <SEP> lium <SEP> aérien <SEP> profus <SEP> : <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> (1). <SEP> Spo fus, <SEP> beige <SEP> (1). <SEP> Sporulation <SEP> profuse. <SEP> En- <SEP> rulation <SEP> profuse. <SEP> Envers<B>:</B> <SEP> orangé <SEP> à <SEP> jaune vers:
<SEP> brun-chocolat <SEP> (1). <SEP> Pigment <SEP> solu- <SEP> orange. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> brun-orangé.
<tb> ble <SEP> brun-rouge <SEP> très <SEP> foncé <SEP> .avec <SEP> couches
<tb> vert-jaune.
<tb> Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Croissance <SEP> profuse, <SEP> lisse, <SEP> nodulée <SEP> :
<SEP> rouille <SEP> Croissance <SEP> profuse, <SEP> humide, <SEP> lisse, <SEP> nodulée
<tb> orangé <SEP> (1) <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> (1) <SEP> ou <SEP> brun <SEP> jaune-brun <SEP> (1) <SEP> clair <SEP> à <SEP> beige <SEP> (1) <SEP> ou <SEP> cèdre
<tb> clair <SEP> (1). <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble. <SEP> (1). <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble.
<tb> Lait <SEP> pourpre <SEP> Collier <SEP> de <SEP> croissance, <SEP> léger <SEP> mais <SEP> défini, <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> croissance <SEP> blanc <SEP> à <SEP> jaune
<tb> jaune-chartreuse <SEP> vif <SEP> (1). <SEP> Peptonisation <SEP> pâle.
<SEP> Peu <SEP> de <SEP> variation <SEP> significative <SEP> du
<tb> partielle <SEP> apparente <SEP> mais <SEP> peu <SEP> de <SEP> varia- <SEP> pH, <SEP> et <SEP> peu <SEP> de <SEP> peptonisation <SEP> apparente <SEP> en
<tb> tion <SEP> significative <SEP> du <SEP> pH. <SEP> 14 <SEP> jours.
<tb> (1) <SEP> Couleurs: <SEP> voir <SEP> remarque <SEP> plus <SEP> haut.
EMI0004.0002
<I>5. <SEP> Observations <SEP> microscopiques</I>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureo <SEP> f <SEP> aciens</I>
<tb> Souche <SEP> S1308 <SEP> Souche <SEP> A377
<tb> Milieu <SEP> Mycélium <SEP> Spores <SEP> Mycélium <SEP> Spores
<tb> Agar-agar <SEP> avec <SEP> gly- <SEP> Flexueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdales <SEP> à <SEP> ovoï- <SEP> Flexueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdales <SEP> à <SEP> ovoï cérol, <SEP> asparagine, <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> dates. <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> dates.
<tb> extrait <SEP> de <SEP> viande. <SEP> 1,2-2,0 <SEP> u. <SEP> Diamètre <SEP> 1,2-1,5 <SEP> #t. <SEP> 1,0-1,2'u.
<SEP> Diamètre <SEP> 1,2-1,5
<tb> Agar-agar <SEP> AP4 <SEP> avec <SEP> Flexueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroidaies <SEP> à <SEP> ovoï- <SEP> Flexueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdales <SEP> à <SEP> ovoï liqueur <SEP> de <SEP> macéra- <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> Jales. <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> dates.
<tb> tion <SEP> de <SEP> maïs. <SEP> 0,8-1,0 <SEP> I,. <SEP> Diamètre <SEP> 1,2-1,5 <SEP> tt. <SEP> 0,8-1,0 <SEP> ;ti. <SEP> Diamètre <SEP> 1,2-1,5 La morphologie du mycélium et des spores, pour la souche S1308, est apparemment similaire à celle observée pour la souche A377. Les deux souches présentent un mycélium continu, flexueux, ramifié, avec tendance occasionnelle des hyphes aériens à la forme spirale. Les spores caractéristiques sont ovoïdales à sphéroïdales.
Des cultures viables de S. aureofaciens souche S1308 et plusieurs de ses variantes qui produisent les nouveaux antibiotiques ont été déposées à l'American Type Culture Collection, à Washington, et le numéro d'inscription ATCC 12748 a été attribué à la souche S1308, le No ATCC 12749 à la souche S1308-29, le No ATCC 12750 à la souche S1308-V146, et le No ATCC <B>12751</B> à la souche S1308-V237.
Les conditions de fermentation avec les nouvelles souches mutantes de<I>S.</I> aureofaciens de la présente in vention, en vue de préparer la 5a(lla)-déhydrotétra- cycline, sont généralement les mêmes que dans les méthodes actuellement connues de préparation de la chlorotétracycline par fermentation, excepté que le milieu de fermentation doit être pauvre en ions chlo rure. Autrement dit, le milieu de fermentation con tient les substances nutritives et minérales usuelles.
Des substances nutritives appropriées qui peuvent fournir les corps nécessaires sont notamment l'ami don, le dextrose, le sucre de canne, le glucose, la mé- lasse, la farine de soja, la farine d'arachide, la levure, les extraits de viande, la peptone, le sulfate d'ammo nium, l'urée, la liqueur de macération de maïs, les produits solubles de distillerie, la farine de poisson et d'autres substances courantes. Les sels inorganiques comprennent notamment le carbonate de calcium, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, et les divers oligo-éléments tels que le manganèse, le co balt, le zinc, le cuivre, le fer, etc.
Les autres conditions générales de la fermentation telles que le pH, la température, le temps, le taux d'aération, la préparation de l'inoculum, la stérilisa tion, l'inoculation, etc., sont usuelles et peuvent être similaires à celles de la production de la chlorotétra- cycline qui sont décrites dans le brevet américain No 2482055 de Duggar déjà cité.
Mais il existe un point qui s'écarte des conditions de fermentation de la chlorotétracycline et qui a une signification considérable. Les nouvelles souches mu tantes de S. aureofaciens apparaissent comme des or- ganismes déficients en riboflavine, et par suite les rendements en antibiotiques nouveaux sont faibles lorsqu'on conduit des fermentations avec des milieux qui ont une teneur faible ou nulle en riboflavine. Par exemple, lorsqu'on conduit la fermentation avec un milieu ordinaire de liqueur de macération de maïs, sans y ajouter de riboflavine, on obtient 2500 à 4000,! par cm- d'antibiotiques nouveaux.
L'addition de tra ces de riboflavine à ces milieux donne une augmen tation de puissance. C'est pourquoi il est préférable d'utiliser un milieu de liqueur de macération de maïs riche en riboflavine et à ce point de vue on a trouvé que lorsque le milieu contient de 0,1 à 2,0 parties par million environ de riboflavine ajoutée, la puissance de la liqueur de fermentation va jusqu'à 8000 à 10 000 ,, par cm @, ce qui démontre que les nouvelles mutantes sont des souches productrices d'antibiotique à grand rendement.
Pendant la fermentation, il se forme aussi de peti tes quantités de chlorotétracycline et de tétracycline. Habituellement, les quantités ne sont pas assez gran des pour gêner le produit principal de la fermentation ni pour valoir la peine d'une opération séparée de récupération, car elles ne dépassent généralement pas 200-400 y par cm' environ dans le milieu de fermen tation, bien due la proportion relative de ces trois ;antibiotiques puisse varier considérablement suivant la souche mutante particulière, le milieu et les condi tions de fermentation utilisés.
Le composé non chloré peut être réduit catalyti- quement en tétracycline ou il peu!. être converti bio- logiquement en tétracycline par des procédés de fer mentation appropriés.
Afin d'obtenir ce nouvel antibiotique: non chloré, il suffit de modifier le milieu de fermentation qui contient la riboflavine, de la façon indiquée dans le brevet américain N 2734018 de Minieri de façon que le milieu obtenu soit pauvre en chlorure disponible, c'est-à-dire qu'il contienne moins de 50 parties par million environ d'ion chlorure. En conduisant la fer mentation dans ce milieu pauvre en chlorures, avec les nouvelles souches mutantes, on peut obtenir des quantités satisfaisantes de 5a(llcr)-déhydrotétracy- cline.
On peut isoler la déhydrotétracycline de la liqueur de fermentation par tous moyens appropriés. Une mé thode préférentielle comporte une séparation chroma- tographique, dans laquelle on acidifie la liqueur de fermentation en ajustant le pH à 1-2, avec un acide approprié tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfu rique, etc. On filtre alors la liqueur et on met le filtrat aqueux acidifié qui contient l'activité en contact avec un alcool, par exemple le butanol-n, pour former un extrait alcoolique de l'activité.
On concentre l'extrait puis on le chromatographie sur une colonne de terre d'infusoires, de la façon usuelle, et on développe la colonne avec un mélange à 80% de butanol-n et 200/(> de chloroforme. On concentre les fractions éluées et on les sèche par congélation. On dissout dans le méthanol la matière brute séchée par congélation, et la cristallisation de l'antibiotique sous forme neutre se fait rapidement. On filtre les cristaux, on les lave et on les sèche sous vide de la façon usuelle.
Toute la chlorotétracycline et la tétracycline résiduelle qui peut être présente peut être enlevée par un procédé de re- cristallisation qui consiste à dissoudre l'antibiotique dans du méthanol acidifié, à filtrer, à neutraliser par un alcali faible et à cristalliser la 5a(lla)-déhydro- tétracycline purifiée.
Le nouvel antibiotique a une forme épinière sur l'atome de carbone en position 4, ainsi qu'on l'a dé crit à propos d'autres composés du type tétracycline. On peut former ce nouvel isomère en ajustant simple ment entre 3,0 et 5,0 le pH d'une solution concentrée de l'antibiotique, et en laissant reposer la solution jusqu'à ce que l'isomérisation soit parvenue à l'équi libre.
Le plus commode est de conduire l'isomérisation à la température ambiante, bien que l'on obtienne un taux de conversion supérieur aux températures plus élevées. Le pH doit être compris entre 3,0 et 5,0 envi ron, de préférence entre 3,5 et 4,5. Il se produit une certaine épimérisation aux pH qui sortent de ces intervalles, et même dans l'eau distillée, mais la vi tesse est très faible.
La concentration de l'antibiotique dans la solution aqueuse doit être aussi élevée que possible afin de .donner de plus grandes vitesses d'épimérisation. L'équilibrage complet peut nécessiter une durée d'environ 24 heures à 25() C, mais un équi librage satisfaisant peut être obtenu en un temps con sidérablement plus court dans des conditions précises. Habituellement toutefois, on obtient les meilleurs ré sultats en laissant reposer les solutions pendant une semaine ou davantage.
Il semble que l'équilibre soit atteint dans la plupart des cas aux environs de 50 % ; autrement dit, la moitié environ de l'antibiotique se convertit en épinière à l'équilibre.
Etant donné que la concentration est un facteur important pour obtenir des rendements élevés en de courts laps de temps, il faut choisir un système sol vant qui donne la concentration la plus élevée d'anti biotique. Ces systèmes solvants doivent être tampon nés pour donner un pH compris dans l'intervalle pré férentiel. Parmi les solvants, on citera le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétone, le 2-éthoxyéthanol, le 2-méthoxypropanol, le tétrahydrofurane, la .diméthyl- formamide et les mélanges de ces corps. On peut en core utiliser d'autres solvants.
Le tampon préférentiel est le phosphate monosodique, mais on peut utiliser d'autres tampons et couples de tampons susceptibles de maintenir le pH dans la gamme désirée.
Le nouvel antibiotique forme des sels du même type général et de la même manière générale que les tétracyclines connues, c'est-à-dire que l'on peut faci lement préparer les sels d'acides minéraux, les sels alcalins et les sels alcalino-terreux des nouvelles tétra cyclines. Ainsi, on peut préparer les sels d'acides minéraux en traitant par des acides tels que l'acide chlorhydrique à un pH inférieur à 4 environ. On petit obtenir la base libre à un pH compris entre 4 et 7 environ. On peut former simplement les sels alcalins et alcalino-terreux en traitant le composé amphotère par un équivalent environ de la base choisie, c'est- à-dire la soude, la potasse, la chaux éteinte, etc., à un pH d'environ 7 -ou au-dessus.
De même, on peut pré parer des sels du composé épinière.
Process for preparing a compound of the tetracycline series The subject of the present invention is a process for preparing a new compound of the tetracycline series, namely 5a (11a) -dehydro-tetra-cycline, corresponding to the formula
EMI0001.0004
The new compound of the tetracycline series is produced by certain mutant strains of <I> S. </I> au- reofaciens. The new mutant strains are species of S.
aureofaciens, because they all descend directly from the species of <I> S. </I> aureofaciens producing chlorotetracycline called A377 and described in US patent Duggar N, 2482055, and filed at the Northern Regional Research Laboratory, at Peoria, Illinois, under the reference NRRL 2209.
To obtain the new strains of <I> S. </I> aureofaciens by shooting the primitive strain A377 isolated from the soil, the strain A377 was treated with mutagens, in particular by ultraviolet irradiation and by nicotine. and nitrogenous mustard gas. The spontaneous mutation of strains of <I> S. </I> aureofaciens producing chlorotetracycline results in strains which also produce the new antibiotics.
The process according to the invention for preparing 5a (11a) -dehydro-tetracycline consists in aerobically closing an ordinary aqueous nutrient medium deficient in chloride ions using a strain of <I> Streptomyces </I> aureofaciens capable of producing the compound of formula I.
The primitive strain of <I> S. </I> aureofaciens which has been called S1308 and which gives rise to the new antibiotics is somewhat unstable. When subcultured, it quickly degenerates into a mixed culture in which several more stable variants of different appearance can be isolated. In general, all these strains are characteristic of the species <I> S. </I> aureofaciens but differ somewhat from each other and from the strains of <I> S. </I> aureofaciens previously described, mainly in terms of pigmentation.
Almost all of these strains exhibit characteristic ultraviolet fluorescence at 3600 A when grown on agar-agar and corn maceration liquor media.
Although the new strains of S. aureofaciens and their variants differ mainly from the strains of <I> S. </I> aureofaciens previously described by the nature of the antibiotics produced, the strains studied so far differ somewhat in their pigmentation. mentation on various culture media, as indicated below.
EMI0001.0036
<I> Comparison <SEP> of <SEP> fluorescent <SEP> diffusible <SEP> pigments </I>
<tb> <I> in <SEP> medium <SEP> of agar-agar </I>
<tb> Strain <SEP> Agar-agar <SEP> Q4 <SEP> Agar-agar <SEP> AP4
<tb> A377 <SEP> none <SEP> none
<tb> S1308 <SEP> green-yellow <SEP> bright <SEP> green-yellow <SEP> bright
EMI0002.0001
<I> Formula <SEP> of <SEP> agar-agar <SEP> Q4:
</I>
<tb> sucrose <SEP> <B> .... </B> <SEP> __.._-.... -.-...- <B> ---- </B> < SEP>. <B> ------ </B> <SEP> - <B> ---- </B> <SEP> ..._ <SEP> 10 <SEP> g
<tb> MgS04, <SEP> 7H20 <SEP> .. <B> ------ </B> <SEP>. <B> ---------- <SEP> --- ------ <SEP> - <SEP> -------- </B> <SEP> 0.25 <SEP> g
<tb> KH2P04 --- <B> ----------- </B> <SEP>. <B> ------------------ ---- </B> <SEP> -.- .. <B> ------- </B> <SEP> 4 <SEP> g
<tb> ## <SEP> PO <SEP> g
<tb> #l \ L1 <SEP> 4) 3 <SEP> 4 <SEP> .. <B> ----------------- </B> <SEP>. _.... <B> ---------- </B> <SEP> ._..... <SEP> 2
<tb> liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> ... <SEP> 7,5 <SEP> cm3
<tb> agar-agar <SEP> brut <SEP> <B> ----- <SEP> ---- </B> <SEP> ..... <SEP> ....... .....-... <SEP>. <SEP> 30 <SEP> g
<tb> H20 <SEP> <B> --------------- </B> <SEP> .... <B> ------- </B> <SEP>. <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> for <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb> pH <SEP> adjusted <SEP> to <SEP> 6.5
EMI0002.0002
<I> <SEP> formula of <SEP> agar-agar <SEP> AN: </I>
<tb> sucrose <SEP> <B> ------- </B> <SEP>. <SEP> .. <SEP> 10 <SEP> g
<tb> MgS04, <SEP> 7H20 <SEP> .. <SEP> 0.25 <SEP> g
<tb> KH.P04 <SEP> <B> ---- <SEP> - </B> <SEP> ..... <SEP> ... <SEP> 2 <SEP> g
<tb> (NHIP04 <SEP> __. - .... <SEP> ... <SEP> - <SEP> ..- <SEP>. <SEP> <B> ----- </ B> <SEP> - <B> ----- </B> <SEP> - <B> ...... </B> <SEP> ... <SEP> 2 <SEP> g
<tb> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> 4 <SEP> g
<tb> refined <SEP> agar-agar <SEP> Bacto <SEP> _. <SEP> 20 <SEP> g
<tb> H20 <SEP>. <SEP> ......... <SEP>. <SEP> .. <SEP>. <SEP> - <SEP> q. <SEP> s. <SEP> for <SEP> 1000 <SEP> cm '
<tb> <I> Formula <SEP> of <SEP> agar-agar <SEP> AP6:
</I> Like AP4 agar-agar, except that the proportion of corn maceration liquor is 6 g per liter.
Strain S1308 grows vigorously on Q4 agar, giving abundant dark gray spores. On AP4 and AP6 agar, the typical colony is strongly pigmented in dark yellow-brown and turns brown or red-brown in the light of an incandescent lamp; it is cohesive but with a diffuse, convex and smooth margin, and becomes piled up in the center as it ages.
The growth and culture of the primitive strain S1308 have made it possible to observe and isolate several aberrant types of different appearance, ranging in color from white to pale yellow, dark orange, light brown, and typical yellow-brown and red-brown shades. All exhibit the characteristic ultraviolet fluorescence at 3600 A, except the white outliers.
To illustrate the color variations of the new strains of S. aureofaciens which produce the novel antibiotic in question, six selected strains were grown on corn maceration liquor and agar-agar, and the following observations were made.
EMI0002.0018
<I> Observations <SEP> on <SEP> the <SEP> color <SEP> (1) <SEP>: </I> <SEP> S. <SEP> aureofaciens
<tb> <I> agar-agar <SEP> AP4 <SEP> with <SEP> liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn;
</I>
<tb> <I> six <SEP> days <SEP> of incubation <SEP> at <SEP> 26.5o <SEP> C </I>
<tb> Colonies <SEP> Growth
<tb> Strain <SEP> separated <SEP> in <SEP> mass
<tb> S1308 <SEP> brown <SEP> copper <SEP> brown <SEP> dark
<tb> S1308-V146 <SEP> cedar <SEP> mahogany <SEP> dark
<tb> S1308-V237 <SEP> tan <SEP> dark <SEP> (<SEP> dark <SEP> amber
<tb> luggage <SEP> tan <SEP>)
<tb> S1308-29 <SEP> rust-orange <SEP> rust-orange
<tb> (1) <SEP> The <SEP> colors <SEP> are <SEP> conforming <SEP> to <SEP> <SEP> Color <SEP> Har mony <SEP> Manual <SEP>, <SEP> 3e <SEP> edition, <SEP> Container <SEP> Corpora tion <SEP> of <SEP> America.
EMI0002.0019
<I> Observations <SEP> on <SEP> the <SEP> colors <SEP> (1) <SEP>: </I> <SEP> S. <SEP> aureofaciens
<tb> <I> agar-agar <SEP> AP6 <SEP> with <SEP> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn </I>
<tb> <I> six <SEP> days <SEP> of incubation <SEP> at <SEP> 26.50 <SEP> C </I>
<tb> Colonies <SEP> Growth
<tb> Strain <SEP> <U> s </U> spared <SEP> in <SEP> mass
<tb> S1308 <SEP> henna <SEP> to <SEP> dark <SEP> brown <SEP> dark <SEP> brown
<tb> S1308-V146 <SEP> sandalwood <SEP> brown <SEP> chestnut
<tb> S1308-V237 <SEP> tan <SEP> dark <SEP> (<SEP> dark <SEP> tan <SEP> dark <SEP> (<SEP> dark
<tb> luggage <SEP> tan <SEP>) <SEP> luggage <SEP> tan <SEP>)
<tb> <U> S1308-29 <SEP> ro </U> uille- <U> or </U> angel <SEP> rust-orange
<tb> (1) <SEP> Same <SEP> remark <SEP> as <SEP> above.
The mutant strains which produce the new antibiotics have the same general characteristics as the strains which produce the tetra cyclins, and they differ from each other in the same general way as that the strains producing tetracycline and the strains producing chlorotetracycline differ from each other. others, as has been indicated in several scientific articles that have been published. The data below will be used to illustrate the differences between the new strains and the primitive strain A377 found under the reference NRRL 2209.
The differences between S. aureofaciens strain S1308 and <I> S. </I> aureofaciens strain A377 (NRRL 2209) were established by observing the growth characteristics on various media, with incubation at 26.5o C.
EMI0002.0027
<I> 1. <SEP> Agar-agar <SEP> with <SEP> glycerol, <SEP> asparagine </I>
<tb> <I> and <SEP> extract <SEP> from <SEP> b # uf </I>
<tb> glycerol <SEP>. <SEP> 1.0 <SEP> o / 0
<tb> L-asparagine <SEP> ... <SEP> 0.05%
<tb> extract <SEP> from <SEP> b # uf <SEP> ... <SEP> 0.2 <SEP> 0/0
<tb> KH., P04 <SEP>. <SEP>. <SEP> .. <SEP> <B><I>0,0501o</I> </B>
<tb> refined <SEP> agar-agar <SEP> Bacto <SEP> 1.5 <SEP>%
<tb> <SEP> distilled water <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> for <SEP> 100.0 <SEP> 0/0
<tb> <SEP> adjustment of <SEP> pH <SEP> with <SEP> KOH <SEP> to <SEP> 50 <SEP> 0l0
<tb> pH <SEP> _ <SEP> 7.0
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> 7.2
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> <U> Strain <SEP> S </U> 1 <U> 308 <SEP> Strain <SEP> A </U> 377
<tb> growth <SEP> good, <SEP> color <SEP> good
<tb> camel <SEP> (1)
<tb> hyphae <SEP> aerial <SEP> light <SEP> light <SEP> to <SEP> fairly
<tb> to <SEP> moderate <SEP> important
<tb> white <SEP> to <SEP> gray <SEP> white
<tb> to <SEP> gray <SEP> light
<tb> sporulation <SEP> fairly <SEP> significant <SEP> gray <SEP> light
<tb> to <SEP> gray <SEP> fires
<tb> pigment <SEP> green-yellow <SEP> light <SEP> yellow <SEP> light
<tb> diffusible <SEP> camel <SEP> yellow <SEP> to <SEP> yellow <U> reverse </U> <SEP> to <SEP> brown <SEP> light <SEP> orange <SEP> light
<tb> (1) <SEP> Colors: <SEP> same <SEP> remark <SEP> as <SEP> above.
EMI0003.0001
<I> 2. <SEP> Agar-agar <SEP> Czapek-Dox <SEP> to <SEP> the <SEP> dextrin </I>
<tb> dextrin <SEP> = .. <SEP> _...... <SEP> .. <SEP> 1.0 <SEP> 0/0
<tb> NaNO .; <SEP> .......... <B> ...... </B> <SEP>. <B> .... </B> <SEP> 0.2 <SEP> %
<tb> K.HP04 <SEP> .. <SEP> .... <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> .... <SEP> .. <SEP>. <SEP> ... <SEP> .. <SEP> .. <SEP> 0.1 <SEP> 0/0
<tb> MgS04, <SEP> 7H.0 <SEP> ... <SEP> .. <SEP> ........ <SEP> .. <SEP> .. <SEP> 0.05 < SEP> 0/0
<tb> KCl <SEP>. <SEP>. <SEP> ... <SEP> .. <SEP> .. <SEP>. <SEP> ... <SEP>. <SEP> 0;
05 <SEP>%
<tb> FeS04, <SEP> 7H0 <SEP> ........ <SEP> .. <SEP>. <SEP> .. <SEP> ... <SEP>. <SEP> <B> 0.001% </B>
<tb> refined <SEP> agar-agar <SEP> Bacto <SEP> ..1,5 <SEP> 0/0
<tb> <SEP> distilled water <SEP>. <SEP>. <SEP> q. <SEP> s. <SEP> for <SEP> 100.0 <SEP>%
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> 7.2
<tb> <I> Streptofnyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> Strain <SEP> S1308 <SEP> Strain <SEP> A377
<tb> poor <SEP> growth, good <SEP>
<tb> hyaline
<tb> hyphae <SEP> aerial <SEP> none <SEP> abundant, <SEP> gray
<tb> mouse <SEP> (1) <SEP> to
<tb> gray <SEP> lead
<tb> (1), <SEP> globules
superficial <tb>
<tb> colorless
<tb> sporulation <SEP> none <SEP> profuse
<tb> pigment <SEP> diffusible <SEP> none <SEP> trace
<tb> pale yellow <SEP>
<tb> reverse <SEP> trace <SEP> of <SEP> pigment <SEP> not <SEP> pigmented,
<tb> red-orange <SEP> trace <SEP> of <SEP> pink
<tb> (1) <SEP> same <SEP> remark <SEP> as <SEP> above.
EMI0003.0002
<I> 3. <SEP> Agar-agar <SEP> AN </I>
<tb> <I> with <SEP> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn </I>
<tb> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP>. <SEP> ... <SEP> 0.4 <SEP> 0/0
<tb> sucrose <SEP> .. <SEP> .... <SEP>. <SEP> ... <SEP> .1,0 <SEP>%
<tb> MgS04, <SEP> 7H.0 <SEP>. <SEP> 0.025%
<tb> KH2P04 <SEP>. <SEP>. <SEP> .......... <SEP> ...... <SEP> 0.2 <SEP> 0/0
<tb> (NH4) 2HP04 <SEP> ... <SEP>. <SEP> _ <SEP> ............ <SEP> .. <SEP>. <SEP> ..... <SEP> 0.2 <SEP> 0/0
<tb> refined <SEP> agar-agar <SEP> Bacto <SEP>. <SEP> _ <SEP> .. <SEP> 2,0 <SEP>%
<tb> water <SEP> from <SEP> tap <SEP> <B> ----- </B> <SEP> ... <SEP> .. <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> for <SEP> 100.0 <SEP>%
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> 6.5
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> Strain <SEP> S1308 <SEP> Strain <SEP> A377
<tb> growth <SEP> good <SEP> excellent
<tb> hyphae <SEP> aerial <SEP> moderate <SEP> abundant,
<tb> to <SEP> abundant <SEP> wild animals <SEP> (1)
<tb> wild animals <SEP> (1)
<tb> abundant <SEP> sporulation, profuse <SEP>,
<tb> uniform <SEP> uniform
<tb> pigment <SEP> soluble <SEP> brown-orange <SEP> yellow <SEP> light
<tb> dark <SEP> to <SEP> amber
<tb> with <SEP> layers
<tb> green-yellow
<tb> reverse <SEP> brown <SEP> chocolate <SEP> tan <SEP> light <SEP> (1)
<tb> (1)
<tb> (1) <SEP> same <SEP> remark <SEP> as <SEP> above.
EMI0003.0003
<I> -1. <SEP> Other <SEP> <SEP> agar-agar media </I>
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aicreofaciens </I>
<tb> Medium <SEP> Strain <SEP> S1308 <SEP> Strain <SEP> A377
<tb> Agar-agar <SEP> nutritious <SEP> Fairly <SEP> good <SEP> growth: <SEP> hyphae <SEP> aerial <SEP> Good <SEP> growth, <SEP> no <SEP> of hyphae Aerial <SEP>.
<tb> putty <SEP> (1) <SEP> to <SEP> brown <SEP> mustard <SEP> (1). <SEP> En- <SEP> Reverse <SEP>: <SEP> pale yellow <SEP>. <SEP> Soluble <SEP> Pigment
<tb> to <SEP>: <SEP> mastic <SEP> becoming <SEP> mustard-brown. <SEP> pale yellow <SEP>.
<tb> No <SEP> of soluble <SEP> pigment <SEP>.
<tb> Glucose, <SEP> Abundant <SEP> growth <SEP>:
<SEP> cinnamon <SEP> (1) <SEP> to <SEP> tan <SEP> Good <SEP> growth. <SEP> White <SEP> aerial <SEP> hyphae
<tb> asparagine, <SEP> dark <SEP> (1) <SEP> (<SEP> dark <SEP> luggage <SEP> tan). <SEP> Hyphae <SEP> becoming <SEP> from <SEP> plus <SEP> to <SEP> plus <SEP> gray <SEP> when <SEP> the
<tb> extract <SEP> of <SEP> meat <SEP> aerial <SEP> abundant <B>: </B> <SEP> white <SEP> to <SEP> tawny. <SEP> Spo- <SEP> <SEP> formation of <SEP> spores <SEP> is growing. <SEP> Reverse <SEP>: <SEP> yellow
<tb> abundant <SEP> rulation. <SEP> To <SEP>:
<SEP> tan <SEP> dark <SEP> light <SEP> to <SEP> orange <SEP> pinkish. <SEP> Trace <SEP> of <SEP> pigment
<tb> (<SEP> dark <SEP> luggage <SEP> tan <B>). </B> <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> soluble <SEP> yellow <SEP> orange.
<tb> brown-orange.
<tb> Agar-agar <SEP> AP4 <SEP> Good <SEP> growth <SEP> camel <SEP> (1) <SEP> to <SEP> brown <SEP> Excellent <SEP> growth. <SEP> Mycelium <SEP> aerial <SEP> pro with <SEP> liquor <SEP> oak <SEP> (1). <SEP> Air <SEP> hyphae <SEP> good <SEP> to <SEP> abon- <SEP> fus. <SEP> Profuse <SEP> sporulation <SEP>: <SEP> fawn <SEP> (1). <SEP> In <SEP> maceration <SEP> dants, <SEP> wild animals <SEP> (1). <SEP> Sporulation: <SEP> good <SEP> to <SEP> to <SEP>: <SEP> tan <SEP> clear <SEP> (1). <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> yellow
<tb> of <SEP> corn <SEP> abundant. <SEP> Reverse:
<SEP> brown <SEP> chocolate <SEP> (1). <SEP> clear <SEP> to <SEP> amber.
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> brown-orange <SEP> dark <SEP> with
<tb> green-yellow <SEP> layers.
<tb> Agar-agar <SEP> AP6 <SEP> Abundant <SEP> growth: <SEP> red <SEP> brick <SEP> (1) <SEP> Excellent <SEP> growth. Aerial <SEP> Mycelium <SEP>
<tb> with <SEP> liquor <SEP> to <SEP> brown <SEP> copper <SEP> (1). <SEP> Aerial <SEP> hyphae <SEP> abon- <SEP> profuse. <SEP> Profuse <SEP> sporulation, fawn <SEP> <SEP> (1).
<tb> of <SEP> maceration <SEP> dants <SEP> to <SEP> profuse, <SEP> beige <SEP> (1). <SEP> Sporulation <SEP> Reverse: <SEP> tan <SEP> (1). <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> amber
<tb> of <SEP> corn <SEP> abundant. <SEP> To <SEP>:
<SEP> brown <SEP> chocolate <SEP> (1). <SEP> clear.
<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> brown-red <SEP> dark <SEP> with
<tb> green-yellow <SEP> layers.
EMI0004.0001
Medium <SEP> Strain <SEP> S1308 <SEP> Strain <SEP> A377
<tb> Agar-agar <SEP> Q4 <SEP> Excellent <SEP> growth: <SEP> brown <SEP> copper-colored <SEP> (1) <SEP> to <SEP> Excellent <SEP> growth: <SEP> yellow <SEP> pale. <SEP> Chocolate brown myce <SEP> (1). <SEP> Mycelium <SEP> aerial <SEP> pro <SEP> lium <SEP> aerial <SEP> profuse <SEP>: <SEP> brown <SEP> dark <SEP> (1). <SEP> Spo fus, <SEP> beige <SEP> (1). <SEP> Profuse <SEP> sporulation. <SEP> En- <SEP> rulation <SEP> profuse. <SEP> Reverse <B>: </B> <SEP> orange <SEP> to <SEP> yellow towards:
<SEP> chocolate brown <SEP> (1). <SEP> Pigment <SEP> solu- <SEP> orange. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> brown-orange.
<tb> ble <SEP> brown-red <SEP> very <SEP> dark <SEP> .with <SEP> layers
<tb> green-yellow.
<tb> Apple <SEP> of <SEP> earth <SEP> Growth <SEP> profuse, <SEP> smooth, <SEP> nodulated <SEP>:
<SEP> rust <SEP> Growth <SEP> profuse, <SEP> wet, <SEP> smooth, <SEP> nodulated
<tb> orange <SEP> (1) <SEP> to <SEP> brown <SEP> dark <SEP> (1) <SEP> or <SEP> brown <SEP> yellow-brown <SEP> (1) <SEP > light <SEP> to <SEP> beige <SEP> (1) <SEP> or <SEP> cedar
<tb> clear <SEP> (1). <SEP> No <SEP> of soluble <SEP> pigment <SEP>. <SEP> (1). <SEP> No <SEP> of soluble <SEP> pigment <SEP>.
<tb> Milk <SEP> purple <SEP> Collar <SEP> of <SEP> growth, <SEP> light <SEP> but <SEP> defined, <SEP> Light <SEP> collar <SEP> of <SEP> growth <SEP> white <SEP> to <SEP> yellow
<tb> chartreuse yellow <SEP> bright <SEP> (1). <SEP> Pale peptonization <SEP>.
<SEP> Little <SEP> of <SEP> significant <SEP> variation <SEP> of
<tb> partial <SEP> apparent <SEP> but <SEP> little <SEP> of <SEP> varia- <SEP> pH, <SEP> and <SEP> little <SEP> of <SEP> peptonization <SEP> apparent <SEP> in
<tb> Significant <SEP> <SEP> of the <SEP> pH. <SEP> 14 <SEP> days.
<tb> (1) <SEP> Colors: <SEP> see <SEP> remark <SEP> plus <SEP> above.
EMI0004.0002
<I> 5. <SEP> Microscopic <SEP> observations </I>
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureo <SEP> f <SEP> aciens </I>
<tb> Strain <SEP> S1308 <SEP> Strain <SEP> A377
<tb> Medium <SEP> Mycelium <SEP> Spores <SEP> Mycelium <SEP> Spores
<tb> Agar-agar <SEP> with <SEP> gly- <SEP> Flexuous, <SEP> continuous, <SEP> Spheroidal <SEP> to <SEP> ovoid- <SEP> Flexuous, <SEP> continuous, <SEP > Spheroidal <SEP> to <SEP> ovoi cerol, <SEP> asparagine, <SEP> branched. <SEP> Diameter <SEP> dates. Branched <SEP>. <SEP> Diameter <SEP> dates.
<tb> extract <SEP> from <SEP> meat. <SEP> 1,2-2,0 <SEP> u. <SEP> Diameter <SEP> 1,2-1,5 <SEP> #t. <SEP> 1.0-1.2'u.
<SEP> Diameter <SEP> 1.2-1.5
<tb> Agar-agar <SEP> AP4 <SEP> with <SEP> Flexuous, <SEP> continuous, <SEP> Spheroidea <SEP> to <SEP> ovoid- <SEP> Flexuous, <SEP> continuous, <SEP> Spheroidal <SEP> to <SEP> ovoï liqueur <SEP> of <SEP> macerated- <SEP> branched. <SEP> Diameter <SEP> Jales. Branched <SEP>. <SEP> Diameter <SEP> dates.
<tb> <SEP> tion of <SEP> corn. <SEP> 0.8-1.0 <SEP> I ,. <SEP> Diameter <SEP> 1.2-1.5 <SEP> tt. <SEP> 0.8-1.0 <SEP>; ti. <SEP> Diameter <SEP> 1.2-1.5 The morphology of the mycelium and the spores, for strain S1308, is apparently similar to that observed for strain A377. Both strains exhibit a continuous, flexuous, branched mycelium with occasional tendency for aerial hyphae to spiral in shape. The characteristic spores are ovoid to spheroidal.
Viable cultures of S. aureofaciens strain S1308 and several of its variants that produce the new antibiotics have been deposited with the American Type Culture Collection, Washington, and the strain S1308 has been assigned ATCC registration number 12748, the ATCC No. 12749 to strain S1308-29, ATCC No. 12750 to strain S1308-V146, and ATCC No. <B> 12751 </B> to strain S1308-V237.
The fermentation conditions with the new mutant strains of <I> S. </I> aureofaciens of the present invention, with a view to preparing 5a (11a) -dehydro-tetra-cyclin, are generally the same as in the currently known methods. preparation of chlorotetracycline by fermentation, except that the fermentation medium must be poor in chloride ions. In other words, the fermentation medium contains the usual nutrients and minerals.
Suitable nutrients which can supply the necessary bodies include friend, dextrose, cane sugar, glucose, molasses, soybean meal, peanut meal, yeast, extracts of sugar. meat, peptone, ammonium sulfate, urea, corn maceration liquor, soluble distillers' products, fish meal and other common substances. Inorganic salts include in particular calcium carbonate, ammonium sulphate, ammonium chloride, and the various trace elements such as manganese, co balt, zinc, copper, iron, etc.
Other general fermentation conditions such as pH, temperature, time, rate of aeration, preparation of inoculum, sterilization, inoculation, etc. are customary and may be similar to those of the production of chlorotetracyclin which are described in US Pat. No. 2,482,055 to Duggar already cited.
But there is one point which deviates from the fermentation conditions of chlorotetracycline and which has considerable significance. New mutant strains of S. aureofaciens appear to be riboflavin deficient organisms, and as a result the yields of new antibiotics are low when fermentations are carried out with media which have little or no riboflavin content. For example, when the fermentation is carried out with ordinary corn maceration liquor medium, without adding riboflavin to it, 2500 to 4000! per cm- of new antibiotics.
Addition of riboflavin trays to these media results in an increase in potency. Therefore, it is preferable to use a corn liquor medium rich in riboflavin and from this point of view it has been found that when the medium contains about 0.1 to 2.0 parts per million of added riboflavin , the potency of the fermentation liquor ranges up to 8000-10000, per cm @, demonstrating that the new mutants are high yield antibiotic producing strains.
During fermentation, small amounts of chlorotetracycline and tetracycline are also formed. Usually the amounts are not large enough to interfere with the main fermentation product or to be worth a separate recovery operation, as they generally do not exceed about 200-400 y per cm 'in the fermentation medium. However, the relative proportion of these three antibiotics can vary considerably depending on the particular mutant strain, the medium and the fermentation conditions used.
The non-chlorinated compound can be catalytically reduced to tetracycline or it little !. be biologically converted to tetracycline by suitable fermentation methods.
In order to obtain this new antibiotic: non-chlorinated, it suffices to modify the fermentation medium which contains the riboflavin, as indicated in the American patent N 2734018 of Minieri so that the obtained medium is poor in available chloride, that is, that is, it contains less than about 50 parts per million of chloride ion. By carrying out the fermentation in this medium poor in chloride, with the new mutant strains, satisfactory quantities of 5a (llcr) -dehydrotetracycline can be obtained.
The dehydrotetracycline can be isolated from the fermentation liquor by any suitable means. A preferred method involves chromatographic separation, in which the fermentation liquor is acidified by adjusting the pH to 1-2, with a suitable acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, etc. The liquor is then filtered and the acidified aqueous filtrate which contains the activity is contacted with an alcohol, for example n-butanol, to form an alcoholic extract of the activity.
The extract is concentrated and then chromatographed on a diatomaceous earth column, in the usual manner, and the column is developed with a mixture of 80% n-butanol and 200% chloroform. The fractions are concentrated. The freeze-dried crude material was dissolved in methanol, and the antibiotic crystallized in neutral form rapidly. The crystals were filtered off, washed and dried under vacuum from the eluted and freeze-dried. usual way.
Any residual chlorotetracycline and tetracycline that may be present can be removed by a recrystallization process which consists of dissolving the antibiotic in acidified methanol, filtering, neutralizing with weak alkali and crystallizing 5a (lla) -purified dehydro-tetracycline.
The new antibiotic has a spinal form on the carbon atom in position 4, as has been described in connection with other tetracycline-like compounds. This new isomer can be formed by simply adjusting the pH of a concentrated solution of the antibiotic to between 3.0 and 5.0, and allowing the solution to stand until isomerization has reached equilibrium. free.
The most convenient is to carry out the isomerization at room temperature, although a higher conversion rate is obtained at higher temperatures. The pH should be between 3.0 and 5.0 approximately, preferably between 3.5 and 4.5. Some epimerization occurs at pHs outside these ranges, and even in distilled water, but the speed is very low.
The concentration of the antibiotic in the aqueous solution should be as high as possible in order to give higher rates of epimerization. Complete equilibration may take about 24 hours at 25 () C, but satisfactory equilibration can be obtained in a considerably shorter time under precise conditions. Usually, however, the best results are obtained by allowing the solutions to stand for a week or more.
It seems that equilibrium is reached in most cases around 50%; that is, about half of the antibiotic converts to the spinal cord at equilibrium.
Since concentration is an important factor in obtaining high yields in short periods of time, one should choose a soil system which gives the highest concentration of antibiotic. These solvent systems must be buffered to give a pH within the preferential range. Among the solvents, there will be mentioned methanol, ethanol, butanol, acetone, 2-ethoxyethanol, 2-methoxypropanol, tetrahydrofuran, dimethylformamide and mixtures of these substances. It is also possible to use other solvents.
The preferred buffer is monosodium phosphate, but it is possible to use other buffers and pairs of buffers capable of maintaining the pH in the desired range.
The new antibiotic forms salts of the same general type and in the same general manner as the known tetracyclines, i.e. the salts of mineral acids, alkali salts and alkaline salts can easily be prepared. -terreux of the new tetra cyclines. Thus, the salts of mineral acids can be prepared by treating with acids such as hydrochloric acid at a pH below about 4. We can obtain the free base at a pH of between 4 and 7 approximately. The alkali and alkaline earth salts can be formed simply by treating the amphoteric compound with about an equivalent of the selected base, i.e. soda, potash, slaked lime, etc., at a pH of. about 7 -or above.
Likewise, salts of the spinal compound can be prepared.