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La présente invention a pour objet des substances thérapeutiques nouvelles que l'on a identifiées comme étant des antibiotiques du groupe déméthyltétracycline (comprenant la déméthyltétracycline, la chlorodéméthyltétracycline et la. bromodéméthyltétracycline) et leurs épimères .
Les nouveaux antibiotiques suivant la présente invention se forment dans un processus de fermentation dans lequel on utilise des souches mutantes de Streptomyces aureofaciens. Les nouveaux antibiotiques semblent étroitement apparentés aux membres de la famille tétracycline décrits antérieurement, mais ils en sont nettement différents..Ils sont caractérisés par une stabilité marquée aussibien en milieu alcalin qu'en milieu acide, et sont supérieurs aux tétracyclines à cet égard. Ils ont une activité antibioti- que similaire et peuvent servir aux mêmes usages, et de la même façon'générale, que les tétracyclines actuellement con- nues .
Suivant l'invention, on fournit un procédé pour la préparation des antibiotiques du groupe déméthyltétracycline (comprenant la déméthyltétracycline, la chlorodéméthyltétra- cycline et la bromodéméthyltétracycline) et de leurs épimères, procédé qui consiste à faire fermenter dans des conditions aérobies un milieu nutritif aqueux d'une teneur réglée en ions'chlorure et/ou bromure, avec une souche de S. aureofa- ciens productrice de déméthyltétracycline, à récupérer si on le désire les antibiotiques déméthyltétracycline obtenus, à partir du milieu de fermentation, et, si on le désire, à ajuster le pH d'une solution concentrée de cet antibiotique pour en obtenir les épimères .
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Chacun des antibiotiques tétracyclines antérieure- ment connus qui sont produits par fermentation avec le S. aureofaciens dans des conditions particulières, à savoir, la tétracycline, la chlorotétracycline et la bromotétracycli- ne possède sa contre-partie dans la nouvelle série d'anti- biotiques. Autrement dit, suivant le procédé de la présente invention, en utilisant certaines souches mutatntes de S. aureofaciens qui seront plus particulièrement décrites ci- après, on obtient une substance antibiotique similaire à la tétracycline, une autre similaire à la chlorotétracycline et une autre analogue à la bromotétracycline. Le nouvel anti- biotique particulier qui se forme à la suite du processus de fermentation dépend de la nature du milieu nutritif et des autres conditions du processus.
Dans un milieu exempt de chlorures, l'antibiotique qui prédomine est l'analogue non chloruré de la tétracycline. Dans un milieu riche en brome, il se forme l'antibiotique bromé; et dans un milieu riche en chlore, l'antibiotique prédominant sera un antibiotique chlo- ré analogue à la chlorotétracycline. Ordinairement, il se forme aussi de la tétracycline, de la chlorotétracycline et/ou de la bromotétracycline pendant le processus de fermen- tation, et leurs proportions relatives dépendent de la teneur du milieu en ions chlorures et/ou bromure, et de la souche de microorganisme utilisée- En sélectionnant soigneuesment la souche de S. aurecfaciens, il est possible d'éliminer presque complètement la formation de ces antibiotiques connus du groupe tétracycline.
Les nouveaux antibiotiques suivant la présente invention peuvent être convertis en épimères comme décrits ci-après, de façon similaire à la conversion des tétracycli- nes en quatrimycines .
Les déméthyltétracyclines chlorées et bromées, suivant la présente invention peuvent être déshalogénées par
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hydrogénation, avec un catalyseur palladium sur charbon de bois, de même que l'on convertit la chloroté-gracycline ou la bromotétracycline en tétracycline pure et simple .
Des analyses chimiques, et l'examen des propriétés chimiques et physiques des nouveaux composés, indiquent qu'ils diffèrent essentiellement des tétracyclines correspondantes par le fait qu'ils contiennent un groupe méthyle en moins. Le groupe méthyle en question est très vraisemblablement celui qui occupe la position 6 sur le noyau naphtacène des tétra- cyclines . En conséquence, l'analogue de la tétracycline s'appellera 4-diméthylamino-l,4, 4a,5,5a,6,11.,12a-octahydro- 3,6,10,12,12a-pentahydroxy-1,11-dioxo-2-naphtacène-carboxa.- mide. Dans le cas des analogues chlorés et bromes, le sub- stituant halogène doit être en position 7, et on les dénomme- ra en conséquence.
Les noms courants appropriés de ces nou- veaux antibiotiques seraient déméthyltétracycline, chlorodémé- thyltétracycline et bromodéméthyltétracycline, et on utilise- ra ici cette nomenclature. Mais il est entendu que la struc- ture postulée n'a pas été prouvée par une synthèse non équi- voque, et pourrait"être trouvée erronée par la suite. La pré- sente invention concerne de nouveaux composés qui possèdent des propriétés déterminées, et n'est pas limitée par un sys- tème particulier de nomenclature ni par une structure proba- ble.
Les nouveaux antibiotiques suivant l'invention sont produits par certaines souches mutantes de S. aureofaciens.
Ces souches sont sans aucun doute de l'espèce Streptomyces aureofaciens, puisqu'elles dérivent de la souche primitive- A-377 isolée par le Dr B.M. Duggar, et déposée aux Northern Regional Research Laborabories à Peoria (Illinois, Etats-Unis), et indexées en ce Laboratoire sous le n NRRL 2209. Les mutations comportant un traitement de la souche
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A-377 par des agents mutagènes, comprenant successivement l'irradiation ultra-violette, la nicotine et le chlorhydrate de 2,2-dichloro-N-méthyldiéthylamine, ont été utilisées pour créer l'une des souches. Diverses' autres souches ont été ob- tenues par mutation' spontanée et par traitement à l'aide d'agents mutagènes .
Ces diverses souches qui produisent les nouveaux antibiotiques en différentes proportions et avec des rendements divers, présentent les caractéristiques générales de l'espèce .aureofaciens. Elles diffèrent un peu entre elles et aussi des souches de S. aureofaciens antérieurement décri- tes, principalement par leur pigmentation et leur propriété de produire les nouveaux antibiotiques. Bans la plupart des - cas, on note un pigment brun-rougeâtre lorsque les microorga- nismes sont cultivés sur des milieux de culture ordinaires.
Les nuances du pigment varient de la nuance pêche ou du brun cuivré jusqu'à un acajou foncé, suivant la souche particulière et le milieu nutritif utilisé. Bien que la propriété de pro- duire les nouveaux antibiotiques de la présente invention 'soit généralement associée à des souches qui présentent ce type de pigmentation, cette formation de pigment et la produi - tion des nouveaux antibiotiques ne sont pas nécessairement des propriétés solidaires. Toutes les souches étudiées pro- duisent de la chlorotétracycline , et généralement de la té- ' tracycline, bien que les Reportions relatives de ces anti- biotiques varient considérablement suivant la nature du mi- lieu de fermentation, les conditions de fermentation et la souche particulière choisie.
Dans certains cas, la production de chlorotétracycline et de tétracycline est très faible, de l'ordre de quelques % sur le total de l'antibiotique produit par la fermentation.
Les souches mutantes qui produisent les nouveaux antibiotiques de la présente invention possèdent les mêmes caractéristiques générales que les souches qui produisent
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les tétracyclines, et elles diffèrent entre elles de la même façon générale que les souches productrices de tétracyline diffèrent l'une de l'autre, ainsi qu'on l'a expliqué dans plusieurs articles scientifiques qui ont été publiés. Bien- que de nombreuses souches de S, aureofaciens soient à la dis- position du public dans les collections de cultures et aient été décrites dans la littérature scientifique, les données suivantes serviront à illustrer le type de va.riation des nou- velles souches, par rapport à la souche primitive A-377 qui se trouve sous la désignation NRL 2209.
Comparsison des souches de S. aureofaciens
S-604 et A-377 sur divers milieux.-
Le Streptomyces aureofaciens souche S-604 qui produit la chlorodéméthyltétracycline et la déméthyltétracy- cline a été comparé au Streptomyces aureffqciens souche A-377 (NRRL 2209) par observation des caractéristiques de croissance sur divers milieux incubés à 26-27 C.
Les observations faites sont les suivantes :
1.- Glycérol, asparagine, extrait de boeuf, agar-agar:
EMI5.1
<tb> Glycérol <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Asparagine-L <SEP> 0,05%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 0,2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,05%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> 1,5%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillé <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> ajustement <SEP> du <SEP> pH <SEP> 100%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> par <SEP> KOH <SEP> à <SEP> 50%:
<SEP> 7,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,1
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
Streptomyces aureofaciens
EMI6.1
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Croissance <SEP> Abondante, <SEP> couleur <SEP> Assez <SEP> abondante
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "Venetian <SEP> Red;
<SEP> ( )
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Abondants, <SEP> blanc <SEP> à <SEP> Blancs, <SEP> unifor-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "Rose <SEP> grey" <SEP> ( ) <SEP> mes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporulation <SEP> Légère, <SEP> devenant <SEP> Aucune
<tb>
<tb>
<tb> abondante
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusi- <SEP> Brun-rougeâtre <SEP> Jaune
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ble
<tb>
EMI6.2
Envers ItBro\"1l1 Mahogany"( ) Jaune à jaune
EMI6.3
<tb> orange <SEP> clair
<tb>
( ) Désignation des nuances d'après le "Color
Harmony Manual" 3ème édition, édité par
Container Corporation of America 2.-'Dextrine, Czapek-Dox, agar-agar .-
EMI6.4
<tb> Dextrine <SEP> 1%
<tb>
<tb> NaN03 <SEP> 0,2%
<tb>
<tb> K2HP04 <SEP> 0,1%
<tb>
EMI6.5
²S04.7H20 0,
05%
EMI6.6
<tb> KC1 <SEP> 0,05%
<tb>
EMI6.7
. FeSO.?H0 0,001%
EMI6.8
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> 1,5%
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée, <SEP> q, <SEP> s. <SEP> pour <SEP> 100,0%
<tb>
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,0
<tb>
EMI6.9
Streptomyces aureofaciens -
EMI6.10
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Croissance <SEP> Rare, <SEP> hyaline <SEP> Profuse
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Absents <SEP> Abondants, <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lead <SEP> grey" <SEP> ( )
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Globules <SEP> superficiels
<tb>
<tb>
<tb> incolores
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporulation <SEP> Aucune <SEP> Abondante
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Aucun <SEP> Léger:
<SEP> jaune <SEP> pâle
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Envers <SEP> non <SEP> pigmenté <SEP> Non <SEP> pigmenté
<tb>
( ) voir note précédente.
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
3. -Liqueur de macération de mais, èJ.1ar-agar:
EMI7.2
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,4%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 1,0%
<tb>
EMI7.3
jgSO,.7H 0 0,025% 1\H2P04 0,2% (NH4)zHP04 0,2% Agar-agar Bacto 2,0
EMI7.4
<tb> Eau <SEP> du <SEP> robinet, <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> pour <SEP> 100,0%
<tb>
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 63,
<tb>
EMI7.5
Streptomyces aurenfaciens
EMI7.6
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> 'Souche <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb> Croissance <SEP> Profuse <SEP> Profuse
<tb>
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Abondants <SEP> "rose <SEP> Abondants,
<tb> taupe" <SEP> (')foncé <SEP> "Beaver"
<tb>
EMI7.7
Sporulation Très abondante, LÎr.èfu¯ab.ondteJ,
EMI7.8
<tb> uniforme <SEP> uniforme
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Très <SEP> concentré, <SEP> Jaune <SEP> verdâtre
<tb> "deep <SEP> brown" <SEP> à <SEP> clair
<tb> "deep <SEP> brown <SEP> Mahogany"
<tb>
EMI7.9
Envers "Brown 3Mariogany" "Covert Brown"
EMI7.10
<tb> foncé <SEP> ( ) <SEP> ( <SEP> ) <SEP>
<tb>
( ) voir notes précédentes.
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
4.- Autres milieu-x Streptomyces aureofaciens
EMI8.2
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> nutri- <SEP> Croissance <SEP> médiocre, <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> a-
<tb>
<tb> tif <SEP> "Tauppe <SEP> brown" <SEP> à <SEP> bondante. <SEP> Pas <SEP> d'hy-
<tb>
<tb> "dark <SEP> brown"( ).Pas <SEP> phes <SEP> aériens. <SEP> Envers
<tb>
<tb>
<tb> d'hyphes <SEP> aériens. <SEP> :
jaune <SEP> pâle.Pigment
<tb>
EMI8.3
Envers "Taupe brown" soluble jaune à jaune
EMI8.4
<tb> ( ).Pigment <SEP> soluble <SEP> ne <SEP> brunâtre <SEP> clair.
<tb>
<tb> brun <SEP> rougeâtre
<tb>
<tb> Glucose,aspara- <SEP> Croissance <SEP> abondante. <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> a-
<tb>
<tb> gine, <SEP> extrait <SEP> de <SEP> Gros <SEP> hyphes <SEP> aériens <SEP> bondante.Hyphes <SEP> aé-
<tb>
<tb> viande, <SEP> agar-agar <SEP> bigarrés:"rose <SEP> taupe" <SEP> riens <SEP> blancs <SEP> deve-
<tb>
EMI8.5
ou "fawn" ou IIcamelll(O)nant de plus en plus.
EMI8.6
<tb>
-Sporulation:abondante.- <SEP> gris <SEP> quand <SEP> la <SEP> forma-'Envers:"Taupe <SEP> brown" <SEP> tion <SEP> de <SEP> spores <SEP> aug-
<tb> ( ).Pigment <SEP> soluble <SEP> mente.Envers:jaune
<tb> brun <SEP> rougeâtre. <SEP> clair.Pigment <SEP> soluble <SEP> jaune <SEP> clair.
<tb>
<tb>
Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Croissance <SEP> profuse <SEP> hu- <SEP> Croissance <SEP> profuse
<tb> mide,lisse,nodulée: <SEP> lisse,humide,nodu-
<tb>
EMI8.7
"Dark broim j-iahogaily" lée:"Light Nie llon ( ) avec trace de yellow"( ) à "asti- "peàch tan"( ).Hyphes que rose"( ).Hyphes
EMI8.8
<tb> aériens <SEP> :absents <SEP> à <SEP> abon- <SEP> aériens:trace.Pas
<tb>
<tb> dants,devenant <SEP> blancs <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble.
<tb>
EMI8.9
à 11 C ame lÉ! ( ) . Sporula-
EMI8.10
<tb> tion <SEP> abondante <SEP> dans
<tb>
<tb> les <SEP> zones <SEP> de <SEP> forte <SEP> for-
<tb>
<tb> mation <SEP> d'hyphes <SEP> aériens.
<tb>
<tb>
Pigment <SEP> soluble <SEP> "choco-
<tb>
EMI8.11
late" ( ) "chocolate
EMI8.12
<tb> broi,ni" <SEP> ( <SEP> <SEP> ) <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Lait <SEP> pourpre <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> crois- <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sance <SEP> "Deep <SEP> red <SEP> Maho- <SEP> croissance <SEP> blanc <SEP> à
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> gany"( ). <SEP> Peu <SEP> de <SEP> varia- <SEP> jaune <SEP> pâle.
<SEP> Pe <SEP> u <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> tion <SEP> notable <SEP> du <SEP> pH,peu <SEP> variation <SEP> notalde
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> peptonisation <SEP> appa- <SEP> du <SEP> pH, <SEP> peu <SEP> de <SEP> pept
<tb>
<tb>
<tb> rente.Légère <SEP> réaction <SEP> nisation <SEP> apparente
<tb>
<tb>
<tb> colorée <SEP> faussement <SEP> alca- <SEP> en <SEP> 15 <SEP> jours
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> line <SEP> due <SEP> à <SEP> la <SEP> diffusion
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> du <SEP> pigment <SEP> soluble.
<tb>
( ) voir notes précédentes.
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
Sur tous les agar-agars, 'excepté dextrine ' Czapek-Doc,, mais y compris la c'u1.t\\1.r'e inclinée sur pomme de terre, le .aurèofacien9 souche 'S-.604 ,produit une pigmen- tation fo'Hcee caractéristrque, apparaissant généralement ave la croissance. De même, il est facile d'observer le pigment caractéristique soluble 'brun rougeâtre.
EMI9.2
5.- Observatin'mJ.croscopiques.
EMI9.3
' Stre tom ces aureofacièzis
EMI9.4
<tb> Milieu <SEP> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377 <SEP> . <SEP>
<tb>
<tb>
Mycélium <SEP> Spores <SEP> Mycélium <SEP> Spores
<tb>
<tb> Glycérol, <SEP> Sinueux, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> Sinueux, <SEP> Sphéroïdaux
<tb>
EMI9.5
asparagine, continu , à ovoïdaux. sontinu, -à ovolàaux. extrait de ramifié. Diamètre ramifié. a ovo aux. boeuf, Diamètre 1,5 - 2,0 Diamètre diamètre agar-agar o8 à microns 0,7 à 1,3 - 270 ,l,a micron 1,0 micron microns Liqueur de Sinueux, Sphérodidaux Sinueux, Sphéroidaux maaération continu, à ovoïdaux. continu, à ovoïdaux.
EMI9.6
<tb> de <SEP> mais <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> ramifié!.
<SEP> Diamètre
<tb>
EMI9.7
agar-agar Diamètre l5 - 2O a Diamètre 1,5 - 2,0
EMI9.8
<tb> 0,8 <SEP> à <SEP> microns <SEP> 0,8 <SEP> à <SEP> microns
<tb>
EMI9.9
].,0 micron ]1,0 micron
La morphologie du mycélium et des spores pour la souche S-604 est apparemment similaire à celle observée pour la souche A-377. Les deux souches montrent un mycélium continu, sinueux, ramifié, avec tendance occasionnelle des
EMI9.10
hyphes aériens à la spiralisatioii. Les spores caractéristi- ques sont ovoïdaux à sphéroidaux.
<Desc/Clms Page number 10>
Pour illustrer les variations de couleur parmi les différentes souches de s.aureofacieus qui produisent les déméthyltétracyclines, on a cultivé quatre souches sélection- nées sur de l'agar-agar avec liqueur de macération de mais, et on a fait les observations suivantes :
Observations de couleur( ); Streptomyces aureofa- ciens :
Agar-Agar avec liqueur de macération de mais (AP): :Incubation 4 ,jours à 27 C.
EMI10.1
<tb>
Souche <SEP> Colonies <SEP> isolées <SEP> Croissance <SEP> en <SEP> masse
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S-604M1 <SEP> "Deep <SEP> red <SEP> mahogany" <SEP> "Deep <SEP> red <SEP> mahogany"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S1071 <SEP> "Copper <SEP> brown" <SEP> "Deep <SEP> brown <SEP> mahogany"
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> "Red <SEP> mahogany"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> V-62 <SEP> Large <SEP> zone <SEP> marginale <SEP> "Light <SEP> copper <SEP> brown"
<tb>
<tb>
<tb> "peach <SEP> tan" <SEP> devenant
<tb>
<tb>
<tb> "light <SEP> copper <SEP> brown"
<tb>
<tb>
<tb> au <SEP> centre <SEP> de <SEP> la <SEP> colo-
<tb>
<tb>
<tb> nie.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
B-740 <SEP> "Dark <SEP> Wine" <SEP> "Burgundy"
<tb>
( ) couleurs suivant l'ouvrage déjà cité/
Une méthode relativement simple pour sélectionner une souche de S.aureofaciens capable de produire les nou- veaux antibiotiques, consiste à choisir une souche de S.au- reofaciens qui présente des colonies marron foncé quand on la cultive sur un milieu d'agar-agar et de liqueur de macération de mais. On prépare des inocula avec ces colonies et on con- duit une fermentation comme expliqué dans les exemples 1 et
2 ci-après. A la fin de la période de fermentation, on acidi- fie une certaine quantité de la liqueur de fiermentation à un pH voisin de 1,5 pour solubiliser l'antibiotique et on filtre pour obtenir une solution aqueuse limpide.
On place une ou deux gouttes du filtrat sur une bande de papier et on les chromatographie, par des méthodes ordinaires de dévelop-
<Desc/Clms Page number 11>
pement chromatographique. On utilise comme solvant du buta- nol équilibré avec un tampon phosphate aqueux 0,3 M au pH 3.
On développe les bandes de papier par chromatographie des- cendants avec la phase solvant du mélange équilibré. L'empla- cement des taches correspondant aux déméthyltétracyclines est facile à déterminer par inspection aux rayons ultra-vio- lets. Une autre autre méthode, plus sensible, consiste à pla- cer la bande sur un plateau d'agar-agar ensemencé avec des mi- croorganismes sensibles aux antibiotiques tels que le Bacillus cereus ou le Bacillus subtilis,- et à faire incuber les pla- teaux. Des zones d'inhibition apparaissent dans les régions correspondant aux taches d'antibiotique.
La comparaison des taches avec des échantillons témoins d'antibiotique pur et les indices "Rf" donnés ci-après, fournissent une base pour détecter la présence des nouveaux antibiotiques dans la li- que.ur fermentée, et une base semi-quantitative pour détermi- ner la quantité présente.
On peut donner une illustration de cette technique à l'aide de la figure 1 du dessin qui montre comment la chro- matographie sur bande de papier peut séparer et détecter les diverses tétracyclines et les produits de la présente inven- tion. Le dessin représente une bande de papier, 1, sur la- quelle on a placé, au point 2, une petite quantité d'une solu tion d'antibiotique contenant de la tétracycline, de la chlorodéméthyltétracycline, de la déméthyltétracycline et de la chlorodéméthyltétracycline. L'activité antibiotique totale de la solution placée au point 2 est de 30 microgrammes, expri mée en tétracycline. On développe alors les bandes de pa- pier comme décrit plus haut.
Au bout d'un certain temps, on examine les bandes aux rayons ultra-violets, avec les résul- tats indiqués sur le dessin. Le front du solvant s'est avan- cé jusqu'au point indiqué par le trait plein, 3. Le constitu- ant tétracycline de la solution mixte d'antibiotique s'est
<Desc/Clms Page number 12>
avancé jusqutau point 5 et la chlorotétracycline s'est avau- cée jusqu'au point 7. Le nouvel antibiotique, déméthyltétra- cycline, s'est avancé jusqu'au point 4, et l'antibiotique chlorodéméthyltétracycline te trouve au point 6. Les indices Rf de ces antibiotiques sont aussi indiqués sur le dessin.
L'indice Rf est par définition la distance entre la tache et le point d'origine, 2, divisée par la distance entre le front de solvant, 3, et l'origine, 2, et bien entendu il est tou- jours inférieur à 1. On peut utiliser divers système sol- vants pour obtenir une série d'indices Rf pour tel ou tel an- tibiotique particulier, et ces indices sont considérés comme très précieux pour identifier les antibiotiques et les.dis- tinguer d'autres.
Les indices Rf de quelques tétracyclines, quatri- mycines et déméthyltétracyclines dans deux systèmes solvants précis indiqués dans le tableau suivant.
EMI12.1
<tb>
Antibiotique <SEP> Acétate <SEP> d'éthyle/ <SEP> 90/10 <SEP> chloroforme/
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> 4,7, <SEP> tampon <SEP> butanol,
<tb>
<tb>
<tb> citrate-phosphate <SEP> H3PO4 <SEP> aqueux <SEP> 0,3M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (Mac <SEP> Elvain)' <SEP> 0,1% <SEP> acide <SEP> tri-
<tb>
<tb>
<tb> chloracétique,
<tb>
<tb> pH <SEP> 1,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorotétracycline <SEP> 0,76 <SEP> - <SEP> 0,80 <SEP> 0,61
<tb>
EMI12.2
Bromotétracyclitite 0,76 - 0,80 0,61 Tétracycline 0 .6 - 0 .7 0 z0 Quatrimycine 0,14 - 0,16 0$12 Chloroquatrimycine OY27 - O28 ,33 Bromoquatrimycine ,27 - 0)28 o33 Oxyquatrimycine OYOO - 0,06 0,11
EMI12.3
<tb> Chlorodéméthyltétracycline <SEP> 0,68 <SEP> - <SEP> 0,72 <SEP> 0,39
<tb>
<tb> Déméthyltétracyclitle <SEP> 0,27 <SEP> 0,2q
<tb>
<tb> Epichlorodméthyltétra-
<tb>
EMI12.4
cycline ,25 - 0,27 0,
20
EMI12.5
<tb> Epidéméthyltétracycline <SEP> 0,09 <SEP> 0,10
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
Plusieurs souches de S.aureofaciens qui produisent les nouveaux antibiotiques ont été déposées à l'American Type Culture Collection, à Washington; et sont cataloguées sous les n ATCC 12551, 12552, 12553 et 12554. Il est entendu que des mutantes produisant aussi les nouveaux antibiotiques peuvent être tirées de ces souches par des méthodes courantes, et en fait, il faut s'attendre à ce que certaines d'entre elles possèdent la propriété de produire des rendements plus élevés d'un ou plusieurs des nouveaux antibiotiques, dans des conditions favorables.
Ces mutantes peuvent varier quelque peu quant à leurs caractéristiques morphologiques générales, de même que les diverses souches de l'espèce S.aureofaciens.
On s'attend aussi à ce que d'autres souches de S.aureofaciens productrices de déméthyltétracycline puissent être trouvées dans la nature et puissent être créées à partir des souches. actuellement isolées de S.aureofaciens qui ne produisent pas ces nouveaux antibiotiques.
L'un des avantages les plus importants de la démé- thyltétracycline sur les tétracyclines décrites antérieure- ment, est sa stabilité accrue en milieu acide et alcalin.
L'instabilité de la tétracycline en milieu acide et l'insta- bilité de la chlorotétracycline en milieu alcalin sont bien connus. La chlorotétracycline en solution aqueuse avec un tampon carbonate de sodium au pH 9,85 a une demi-vie de 29,2 minutes à 23 C. Par contre, la chlorodéméthyltétracycline ne perd pas plus de 6% de son activité en 24 heures dans les mêmes conditions. La tétracycline est complètement détruite en meins de 5 minutes dans l'acide sulfurique 1N à 100 C.
Par contre, la chlorodéméthyltétracyline perd seulement 2% environ de son activité dans l'acide sulfurique 1N à 100 C au bout de 15 minutes. De même,le nouvel antibiotique déméthyl-
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tétracycline ne perd qu'environ 33% de son activité dans l'a- cide chlorhydrique 1N à 100 C, en 6 minutes. Dans la soude 0,1N à 50 C, la déméthyltétracycline a une demi-vie d'environ
20 heures, contre 3,3 heures pour la tétracycline. Ces proprié -tés inattendues sont très précieuses, étant donné que l'in- stabilité de la tétracycline en milieu acide et l'instabili- té de la chlorotétracycline en milieu alcalin limitent ou empêchent complètement l'emploi de ces substances précieuses dans de nombreuses applications.
Grâce à la stabilité beaucoup meilleure des nouveaux antibiotiques, il est cessible de pré- parer de nombreux produits pharmaceutiques qui ne/pouvaient pas être préparés de façon satisfaisante avec les tétracycli= nes. La stabilité accrue permet aussi d'améliorer les procé- dés de récupération et de raffinage, car on peut avoir re- cours à ces conditions plus rigoureuses de pH et de tempéra- tured, et on peut donc améliorer l'efficacité de diverses éta- pes du procédé .
Les analyses chimiques d'échantillons très puri- fiés de chlorodéméthyltétracycline concordent avec la formule empirique calculée C21H21C108' l'erreur se situant dans la marge expérimentale. La méthode Kuhn-Roth pour la détermina- tion des groupes méthyle donne une valeur extrêmement faible, indiquant qu'il n'y a pas de groupe méthyle en position 6 du noyau naphtocène. En conséquence, le nom de chlorodéméthyl- tétracycline apparait approprié. Cela est encore confirmé par la comparaison des spectres d'absorption d'ultra-violet et d'infra-rouge des produits, avec deux des différentes té= tracylclines.
Le point de fusion de la chlorodéméthyltétracycli- ne sous sorme de base libre, mesuré sur une plate-forme chau- de, est de 170-175 C avec décomposition. Le point de fusion de la chloro tétracylline est de 168-169 C. La démé- thyltétracycline base libre fond à 170-177 C, avec décomposa
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tion, tandis que la tétracycline fond sur la plate-forme chau- de à 160-168 C.
Voici d'autres comparaisons entre la chlorotétra- cycline et la chlorodéméthyltétracycline. La chlorodéméthyl- tétracycline présente un indice pHa de 4,45 dans un mélange de diméthylformamids et d'eau à 50/50. La rotation optique de la chlorodéméthyltétracycline dans l'acide chlorhydrique
0,03N à une concentration de 0,5% est de [o(725D= 261 ; pour la chlorotétracycline, ' on trouve -243 Les déméthyltétracy- clines .semblent être plus solubles dans l'eau que les tétra- cyclines correspondantes. Par exemple, le chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline est soluble dans l'eau à raison d'environ 45 mg/cm , contre environ 14 mg/cm pour la chlorotétracycline.
L'activité antibactérienne des tétracyclines et des' déméthyltétracycline est généralement similaire, mais avec des différentes nettes comme on le verra par le tableau suivant.
Ce tableau compara les concentrations de chloroté- tracycline et de chlorodémétyyltétracycline qui sont néces- saires pour réaliser une inhibition demiàmaximum de la crois- 'sance, exprimées en microgrammes d'antibiotique par cm3 de solution, en des laps de temps variant de 4 à 48 heures avec divers microorganismes. Les chiffres faibles indiquent une inhibition plus efficace de la croissance .
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TABLEAU I. -
Antibiotique
EMI16.1
Microorganisme chlorotétracycline ch10rodéTIéthyltêtracyclinE Teups en heures Temps en heures ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯4 8 4 1$ - 8 24 48
EMI16.2
<tb> Staphylococcus
<tb> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538 <SEP> P <SEP> 0,041 <SEP> 0,072 <SEP> 0,57 <SEP> 4,1 <SEP> 0,065 <SEP> 0,094 <SEP> 0,41 <SEP> 0,68
<tb>
<tb> Staphylococcus
<tb> albus <SEP> 7,5 <SEP> 20,5 <SEP> >50,0 <SEP> >50,0 <SEP> 16,5 <SEP> 50,0 <SEP> >50,0 <SEP> > <SEP> 50,0
<tb>
EMI16.3
Escherichia coli 0,12 0,27 1,5 10,2 0,16 0,3 0,66 ±. 1,56 O,8 Salmonella galli- 0 0,74 4 65 37, 0 0, l 0, 56 1, 06 1,1 narum Bacillus cereus (0,02;
5 0,035 0,15 1,1 0,015 0,039 0,077 0,19 Pseudomouas
EMI16.4
<tb> aeruginosa <SEP> 0,31 <SEP> 0,56 <SEP> 6,3 <SEP> 35,0 <SEP> 0,94 <SEP> 1,3 <SEP> 4,3 <SEP> 6,7
<tb> Streptococcus
<tb>
EMI16.5
pyrogenes bêta 11,5 1r3,0 >50,0 >50,0 14,A 41,0 >50,0 50,0
EMI16.6
<tb> hémolytique
<tb>
EMI16.7
Proteus vulgsris 0>28 0,56 9,2 50,0 0,62 1,12 JY38 4,4
EMI16.8
<tb> Escherichia <SEP> coli
<tb>
<tb> ATCC <SEP> 9637 <SEP> 0,54 <SEP> 1,18 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 34,0 <SEP> 0,43 <SEP> 0,67 <SEP> 0,97 <SEP> 1,8
<tb>
Comme on le verra en examinant les chiffres du
EMI16.9
tableau ci-dessus, la chlorotétr:cyclizze, de façon générale; est légèrement plus active en un laps de temps de 4 heures.
Cependant, on notera qu'après un certain temps de repos des solutions, la croissance bactérienne reprend dans le cas de la chlorotétracycline, mais qu'elle est encore généralement inhibée dans les solutions qui contiennent de la chlorodémé thyltétracycline. C'est en effet de la stabilité meilleure de ce dernier antibiotique. On observe des résultats similai- res quand on compare la tétracyline à la déméthyltétracycli- ne et la bromotétracycline à la bromodéméthyltétracycline.
On a trouvé aussi que les d'éméthyltétracyclines sont considé-
EMI16.10
rablement supérieures à ltoxytétracycline dans le même type
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On a aussi¯comparé les déméthyltétracyclines avec les tétracyclines dans des tests in vivo, et on a trouvé qu'il n'y a pas de différence appréciable dans l'activité antibac- térienne des déméthyltétracyclines en comparaison de leurs, analogues tétracyline. On en conclut donc que cesnouveaux antibiotiques meuvent servir au traitement des mêmes maladies de la même façon générale que les tétracyclines actuellement employées .
Les spectres d'absorption d'ultra-violet des tétra- cyclines et des déméthyltétracyclines sont très similaires.
La figure 2 des dessins montre la comparaison entre lé spec- tre d'absorption d'ultra-violet de la chlortétracycline et de la chlorodéméthyltétracycline à la même concentration.
Comme on le notera, la forme des courbes est essentiellement la même, mais il y a toutefois un léger flottement du spec- tre d'absorption de la chlorodéméthyltétracycline au voisina- ge de 260 millimicrons .
On voit une autre comparaison des spectres d'absrop- tion d'ultra-violet des tétracyclines dans le tableau II, qui indique les/coefficients d'extinction E 1cm (absorption spectrophotométrique d'une solution à 1% mesurée dans une cellule de 1 cm) mesurée au maxima et aux minima des minima des différents antibiotiques. On a calculé les valeurs d'a- près les courbes d'absorption d'ultra-violet, en corrigeant à 1% les concentrations auxquelles on a fait les essais.
Tous les échantillons ont été mesurés dans une solution de H2SO4 0,1N.
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TABLEAU II
EMI18.1
<tb> Max. <SEP> Mih. <SEP> Max. <SEP> Min. <SEP> Max.
<tb>
Antibiotique <SEP> e <SEP> 1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milliE1cm <SEP> micron <SEP> E1cm <SEP> micron <SEP> E1cm <SEP> micron <SEP> E1cm <SEP> micron <SEP> e1cm <SEP> micron
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorotétracycline <SEP> 209 <SEP> 368 <SEP> 135 <SEP> 302 <SEP> 356 <SEP> 265 <SEP> 288 <SEP> 242 <SEP> 343 <SEP> 228
<tb> Epichlorotétracycline <SEP> -NH4 <SEP> 170 <SEP> 368 <SEP> 100 <SEP> 302 <SEP> 332 <SEP> 254 <SEP> 290 <SEP> 242 <SEP> 342 <SEP> 228
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> tétracycline <SEP> 305 <SEP> 355 <SEP> 182 <SEP> 299 <SEP> 393 <SEP> 268 <SEP> 191 <SEP> 232 <SEP> 289 <SEP> 217
<tb> Epitétracycline-NH4 <SEP> 290 <SEP> 355 <SEP> 140 <SEP> 299 <SEP> 326 <SEP> 254 <SEP> 200 <SEP> 232 <SEP> 275 <SEP> 216
<tb> Déméthyltétracyline <SEP> neutre <SEP> 292 <SEP> 353 <SEP> 169 <SEP> 298
<SEP> 395 <SEP> 268 <SEP> 202 <SEP> 232 <SEP> 299 <SEP> 217
<tb> Chlorhydrate <SEP> d'épidéméthyltétracycline <SEP> 310 <SEP> 355 <SEP> 162 <SEP> 299 <SEP> 367 <SEP> 255 <SEP> 228 <SEP> 232 <SEP> 306 <SEP> , <SEP> 217
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorodéméthyltétracycline <SEP> 249 <SEP> 368 <SEP> 160 <SEP> 299 <SEP> 362 <SEP> 268 <SEP> 270 <SEP> 238 <SEP> 357 <SEP> 227
<tb> Chlorhydrate <SEP> d'épichlorodéméthyltétracycline <SEP> 242 <SEP> 368 <SEP> 130 <SEP> 300 <SEP> 348 <SEP> 254 <SEP> 289 <SEP> 238 <SEP> 346 <SEP> 227
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
Les spectres d'absorption d'infra-rouge de plusieurs des produits nouveaux sont représentés sur les autres figures du dessin.
La figure 3 est une représentation du spectre d'ab- sorption d'infra-rouge du chlorhydrate de chlorodéméthylté- tracycline. La figure 4 représente la comparaison des spectres d'absorption d'infra-rouge de la tétracycline base libre et de la déméthyltétracycline base libre. Comme on le voit, il y a plusieurs différences nettes, et aussi des similitudes.
La figure 5 montre le spectre d'absorption d'infra-rouge du chlorhydrate d'épichlorodéméthyltétracycline, et la figure 6 est le spectre d'absorption du chlorhydrate d'épidéméthyl- tétracycline. Ces courbes ont été obtenues sur un spectropho- tomètre automatique enregistreur à infra-rouge Perkin- Elmer modèle 21, avec les antibiotiques en phase solide, comprimés en un disque avec KBr. Voici d'autres données : prisme - NaC1; résolution - 2; réponse - 1 - 1; gain - 5; , vitesse 1/2 mn/micron; suppression - 2; et échelle : 50,8 mn pour un micron.
Diverses méthodes ont été mises au point pour ti- trer les tétracyclines, et certaines d'entre elles peuvent servir à titrer lesdéméthyltétracyclines, avec, bien entendu des modifications appropriées. Le titrage fluorométrique de la. chlorotétracycline est basé sur un accroissement de fluores -cence par suite de la formation d'une isochlorotétracycli- ne en milieu alcalin. On dissout l'échantillon à titrer dans un tampon phosphate alcalin, et on détermine la fluorescence de la solution dans un fluorophotomètre au temps zéro (immé- diatement après la préparation de la solution), et à nouveau après repos pour permettre à l'isomérisation de se produire.
L'augmentation de fluorescence correspond à la quantité de chlorotétracycline présente. riais la présence de chlorodémé- thyltétracycline dans la solution peut interférer avec la réaction de la chlorotétracycline, tendant à donner l'illusion
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d'une teneur moindre en chlorotérracycline. Une méthode plus digne de confiance pour déterminer la chlorotétracycline dans des mélanges avec la chlorodéméthyltétracycline est basée sur le fait' que le produit de dégradation alcaline de la chlorotétracycline n'absorbe pas à 380 m millimicron. On pré- pare l'échantillon au pH 10 au moyen d'un tampon carbonate, et on mesure la vàriation d'absorption à 380 m millimicron après 30 minutes de repos (environ trois demi-vies de chloro- tétracycline).
La chlorotétracycline et la chlorodéméthylté- tracycline absorbent toutes deux avant la dégradation alcali.. ne, mais seule la chlorodéméthyltétracycline absorbe après le traitement de dégradation; et la diminition d'absorption est la mesure de la chlorotétracycline primitivement présente dans l'échantillon.
Un titrage spécifique de la chlorodéméthyltétracy- cline en présence d'autres antibiotiques du groupe tétra- cycline est basé sur la méthode Hiscox. Un traitement acide modéré, de 15 minutes à 100 C par HC1 1N détruit toutes les tétracyclines excepté la chlorodéméthyltétracycline. Puis on soumet une portion de l'échantillon ainsi traité à un traitement acide énergique de 15 minutes à 100 C par HC1 6N, pour détruire la chlorodéméthyltétracycline. On calcule la teneur en chlorodéméthyltétracycline en mesurant la perte d'absorption spectrophotométrique à 369 m millimicron eu l'augmentation à 430 m millimicron, qui est réalisée par le traitement acide énergique, et en comparant avec un témoin.
Un mélange contenant seulement deux constituants, par exemple un mélange contenant les deux membres d'un couple épimérique,:peut être titré par spectrophotométrie. On dé- termine les absorptions spectrophotoinétriques pour deux lon- gueurs d'onde, et on interpose linéairement le rapport de ces deux absorptions entre les valeurs connues nour les consti-
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tuants purs. On peut ainsi déterminer- la composition centé- simale du mélange..
La façon la plus simple de titrer la bromodéméthyl- tétracycline consiste à analyser la. teneur en brome par des méthodes courantes de microanalyse.
Comme on l'indique plus haut,, on peut obtenir la bromodéméthyltétracycline comme antibiotique principal de la fermentation, en réglant la teneur en halogène du milieu de fermentation. Généralement, le milieu nutritif aqueux doit contenir au moins 50 parties par million d'ions bromure et la teneur en ions chlorure doit être maintenue aussi basse que possible, moins de 50 parties par million environ d'ions chlorure. L'ion bromure peut être fourni par n'importe quel bromure soluble dans l'eau, par exemple le bromure de potas- sium, qui libère des ions bromure pour servir à la synthèse biologique de l'antibiotique.
A part le réglage de la teneur en ions halogènes de la fermentation, le procédé de préparation de la bromodé- méthyltétracycline est similaire à celui de préparation de la déméthyltétracycline et de la chlorodéméthyltétracycline, décrit plus haut. Les souches de S.aureofaciens qui produi- sent la déméthyltétracycline peuvent aussi servir à produirè l'analogue bromé.
La bromodéméthyltétracycline a à peu près la même activité antibactérienne que la chlorodéméthyltétracycline, et elle peut servir aux mêmes usages et de la même façon.
Il n'est pas nécessaire de séparer la broinodénié- thyltétracycline des autres antibiotiques qui peuvent se former concurremment durant la fermentation, car un mélange. des diverses déméthyltértracyclines est utile à de nombreux usages; par exemple, on peut concentrer le milieu nutritif fermenté et l'utiliser directement pour sa teneur en antibio-
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tiques. Une autre façon de l'utiliser est d'acidifier la li- queur fermentée, de filtrer pour éliminer le mycélium et les matières insolubles; de neutraliser et de concentrer pour obtenir une poudre sèche que l'on peut mélanger à des aliments pour animaux. Les antibiotiques mélangés sont utiles pour stimuler la croissance de nombreux animaux.
Une forme brute de bromodéméthyltétracycline, et des mélanges de celle-ci avec d'autres antibiotiques, peuvent servir à préserver les viandes, volailles et poissons de la même façon que l'on emploie actuellement les tétracyclines.
Dans ces compositions, il n'est guère nécessaire de faire at- tention aux proportions des diverses tétracyclines qu'elles peuvent contenir.
Au cas où l'on désire séparer la bromodéméthylté- tracycline des autres antibiotiques contenus dans la liqueur fermentée, on peut le faire par plusieurs moyens qui apparaî- tront à l'homme de l'art. Par exemple, le traitement par un acide détruit la tétracycline, et le traitement par un alcali détruit la chlorotétracycline et la chlorotétracycline dans la liqueur fermentée. On peut récupérer la bromodéméthyltétra- cycline à partir des solutions résultantes; grâce à une chro- matographie fractionnée en utilisant de la terre d'infusoi- res dans la colonne. Un mélange de chloroforme et de butanol au pH 2,0 environ élue les antibiotiques de la terre d'infu- soires.
La bromodéméthyltétracycline sort de la colonne en avant de la déméthyltétracycline et on peut la récupérer à partir de ltéluant. On peut aussi séparer la bromodéméthylté- tracycline pour obtenir un seul constituant antibiotique, grâ- ce à la technique de distribution à contre-courant de Craig.
Les épidéméthyltétracyclines de la présente inven- tion sont considérées comme des isomères des déméthyltétracy-
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clines. La différence structurale semble être basée sur un réarrangement du groupe diméthylamine sur l'atome de carbone en position 4. Apparemment, dans certaines conditions qui se- ront décrites plus en détail ci-après, l'inversion se produit et on obtient un mélange à l'équilibre de déinéthyltétracycli- ne et de son épimère. On peut séparer les deux pour obtenir des produits pratiquement purs.
Pour chacun des corps, démé- thyltétracycline, chlorodéméthyltétracycline et bromodéméthylJ tétracycline, il existe un isomère correspondant que l'on ap' pellera épidéméthyltétracycline, épichlorodéméthyltétracycli- ne, et épibromodéméthyltétracycline. On peut convertir les déméthyltétracyclines en leurs formes isomères en ajustant simplement le pH d'une solution concentrée de l'antibiotique entre 3,0 et 5,0 et en laissant reposer la solution jusqutà ce que l'isomérisation soit parvenue à un équilibre. Les con- ditions les plus importantes qu'il est nécessaire de régler pour convertir les déméthyltétracyclines en leurs isomères sont la concentration, le pH, le temps et la température.
Le plus commode est de réaliser l'isomérisation à la température ambiante, mais à des températures plus élevées, on obtient un taux de conversion plus élevé. Le pH doit être compris entre 3,0 et 5,0 environ, de préférence entre 3,5 et 4,5. Il se produit une certaine épimérisation à des pH sor- tant de cet intervalle, et même dans l'eau distillée ; mais la vitesse est très faible. La concentration de l'antibioti- que dans la solution aqueuse doit être aussi élevée que pos- sible si lton veut obtenir des vitesses d'épimérisation plus grandes. L'équilibrage complet peut nécessiter une durée d'en- viron 24 heures à 25 C, mais on peut obtenir une équilibrage satisfaisant en un temps beaucoup plus court dans des condi- tions déterminées.
Ordinairement toutefois, on obtient les meilleurs résultats en laissant reposer la solution pendant
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des durées d'une semaine ou davantage. Il semble que l'équi- libre soit atteint, dans la plupart des cas, à 50% environ ; autrement dit, à l'équilibre la moitié environ de la déméthyl- tétracycline est convertie en épimère.
Etant donné que la concentration est un facteur im- portant pour obtenir des rendements élevés en de courts laps de temps, il faut choisir un système solvant qui donne la plus forte concentration de déméthyltétracycline. Il faut tamponner ces systèmes solvants pour obtenir un pH compris dawi (eutre l'intervalle préférentiel. Les divers solvants compren- nent le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétone, le 2- éthoxyéthanol, le 2-méthoxypropanol, le tétrahydrofurane, la- diméthylformamide et les mélanges de ces solvants. On peut utiliser d'autres solvants encore. Un tampci préférentiel est le phosphate monosodique, mais on peut utiliser d'autres tampons et couples de tampons qui maintiennent le pH dans l'intervalle désiré.
On peut récupérer les épimères des déméthyltétra- cyclines à partir des solutions aqueuses, de la même façon générale que l'on récupère les tétracyclines. Bien qu'ils aient une activité antibactérienne, in vitro et in vivo, lé- gèrentent inférieure à celle des déméthyltétracyclines, ils sont encore très utiles dans le traitement des maladies cau- sées par les bactéries, grâce à leur activité antibactérien- ne appréciable.
Comme on pourrait s'y attendre, les déméthyltétra- cyclines forment des sels et des complexes du même type, et de la même façon générale, que les tétracyclines. Le traite- ment par les acides à un pH inférieur à 4 environ aboutit à la formation de sels d'acides. On peut obtenir la base libre à un pH de 4 à 6 environ ; et aux pH supérieurs à 8, on ob-
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tient des sels avec dès bases, par exemple le sel de calcium.
De môme,on forme dès sels des ép'imères.
Gomme on l'a indiqué précédemment, le procédé de préparation des nouveaux antibiotiques suivant la présente invention sera général-ement le même' que les procédés de produ< -ion de chlorotétracycline, de tétracycline et de bromotétre cycline, les principales différences résidant dans le fait .
EMI25.1
que l'on choisit une souche mutante due S. aureofaciens qui produit la déméthyltétracycline désirée au lieu de l'une des tétracyclines.
La composition' du milieu de fermentation, le degré d'aération, le temps, la température', le contrôle des ions hydrogène, le mode d'inoculation et analogues, appli- qués lors de la production de chlorotétracycline, de bromo- tétracycline et de tétracycline conviennent peur la productio des nouvelles déméthyltétracyclines.
Afin que le processus de fermentation suivant l'in- vention' puisse être plus complètement compris on le décrira maintenant en se référant aux exemples précis qui suivent.
EXEMPLE 1. -
On peut préparer Lui milieu approprié pour la pré- paration d'inocula destinés à des fermentations, avec les substances suivantes :
EMI25.2
<tb> Sucrose <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb>
EMI25.3
(NH)50, -S'J 2 g/1
EMI25.4
<tb> CaC03 <SEP> 7 <SEP> g/1
<tb>
Liqueur de macération de mais 16,5 cm3/1
Le pH du milieu ainsi obtenu est d'environ 6,8.
On mesure une portion de 8 cm3 que l'on introduit dans un tube Brewer de 20 cm, et on stérilise à 120 C pendant 20 minutes. On inocule alors le milieu stérilisé avec 0,5 cm3 d'une suspension aqueuse de spores d'une souche de S.aureofa
EMI25.5
ciens capable de produire de la chiarodéméthyltétracycline,
<Desc/Clms Page number 26>
par exemple la souche S-604 , la suspension contenant environ 40-60 millions de spores par cm3. On fait incuber le milieu inoculé pendant 24 heures à 28 C, sur une secoueuse alterna- tive fonctionnant à 110 cycles par minute.
Un milieu de fermentation approprié contient de l'eau et un milieu typique qui convient pour produire, de la chlorodéméthyltétracycline est le suivant :
EMI26.1
<tb> amidon <SEP> de <SEP> mais <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 57 <SEP> g/1
<tb>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 2g/1
<tb>
EMI26.2
FeS04-7H20 l0 z:ng/1 MnS04-4H20 50 rr/1
EMI26.3
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 100 <SEP> mg/1
<tb>
EMI26.4
CoCl 2 ¯6H 2 0 5 mg/1
EMI26.5
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> 2,0% <SEP> en <SEP> volume
<tb>
Quand on restreint la teneur de ce milieu en ions chlorure cela tend à augmenter la quantité de déméthyltétracycline aux dépens de la production de chlorodéméthyltétracycline.
EEMPLE 2. -
On conduit une fermentation en flacons de secoueus? qui aboutit à former une certaine quantité de déméthyltétra- cycline et de chlorodéméthyltétracycline , avec un milieu préparé comme suit :
EMI26.6
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb>
<tb> huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> 2% <SEP> en <SEP> volume
<tb>
<tb> amidon <SEP> de <SEP> mais <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb>
<tb> CaC03 <SEP> 7 <SEP> g/1
<tb>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 5 <SEP> g/1
<tb>
<Desc/Clms Page number 27>
EMI27.1
<tb> NH4C1 <SEP> 1,5g/1
<tb>
EMI27.2
ZnS04..7H20 100 n/1 MhSO,.4HO 50 m/.
EMI27.3
<tb> CoC12.6H2O <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb>
On mesure une portion de 25 cm3 que l'on introduit
EMI27.4
dans un flacon d'Erleiimeyer de 250 con3, on stérilise pendant. 20 minutes à 120 C et on inocule avec 1 cm3 de culture mycé- lionne préparée comme dans l'exemple 1. Après incubation de 120 heures à 26 C sur une secoueuse ratative à 186 t/mm, on titre la liqueur et on trouve qu'elle ne contient pas plus de 70 microgrammes environ de chlorotétracycline par cm3,
EMI27.5
environ 450 mfucrogrammes de déméthyltétracycl ine par cm3, et environ 900 microgrammes de chlorodéméthyltêtracycline par cm3.
EXEMPLE 3. -
Fermentation en' cuve.-
On conduit une fermentation de 40 litres dans . une cuve pilote, essentiellement suivant la méthode décrite à l'exemple 2. Après avoir préparé le milieu, on le stérili- se pendant 25 minutes à 125 C et on l'inocule avec un inocu- lum de souche S-604 préparé comme indiqué par Duggar, brevet des Etats-Unis d'Amérique n 2.482.055 du 13 septembre 1949.
On conduit la fermentation avec agitation continue à une temp -rature de 28 C pendant les 24 premières heures et 25 C, jusqu'à achèvement, en 135 heures. On introduit de l'air stérile à raison de 0,3 1/1/mm pendant les seize premières heures, puis à raison de 0,5 1/1/mm jusqu'à la. récolte.
Les exemples suivants illustrent la récupération, le raffinage et la séparation des antibiotiques.
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EXEMPLE A. - Raffinage de la chlorodéméthyltétracycline et de la déméthyl tétracycline.-
On prépare 25,8 litres de liqueur comme dans l'exem- ple 3, on les traites par 200 cm3 d'acide chlorhydrique concer -tré pour ajuster le pH à 1,5. On filtre la liqueur traitée, après l'avoir mélangée à 2,8 Kg d'un adjuvant de filtration, pour obtenir 16,3 litres de filtrat. On reprend le tourteau de filtration par 25 litres d'eau à une température d'environ 50 C et in ajuste au pH 1,5. Après avoir agité pendant 30 minutes, on filtre le tourteau délayé et on réunit le filtrat au filtrat précédent, pour former une masse de 42,3 litres.
On traite le filtrat réuni avec 6,76 kg de chlorure de so- dium et on extrait à quatre reprises par le butanol à raison de 15% du volume du filtrat. On réunit les extraits, on les clarifie par filtration et on les concentre sous vide à 25- 30 C jusqu'à un volume final de o litres.
EXEMPLE B. -
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Séparation chromatograDhique de la chlorodéméthyltétracycli- ne et de la déméthyltétracycline.-
On divise le concentré au butanol de l'exemple A -,en deux portions égales, on concentre l'une à 900 cm3 et on concentre l'autre à 610 cm3 sous vide. On filtre les concen- trés et on les ajuste au pH 2 avec de la soude à 50%.
Pour préparer le système solvant utilisé pour la séparation chromatographique, on équilibre un mélange à 80% de butanol et 20% de chloroforme avec de l'eau ajustée au pH 2 au moyen d'acide chlorhydrique. Les colonnes sont des colonnes de verre de 15 cm de diamètre garnies de 2,8 kg de terre d'infusoires lavée à 1'acide. On équilibre les colonnes avec la phase aqueuse du système solvant avant l'usage.
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On traiteles deux concentrés au butanol, sur des. colonnes séparées. On verse doucement les concentrés dans le haut des colonnes. Puis on élue les colonnes avec la phase solvant que l'on fait passer au travers à raison d'environ 10 litres par heure. Dans chaque cas, on prend 40 tranches de 500 cm3 et on détermine la teneur en antibiotique de chacune par chromatographie sur bande de papier. Dans la portion de 900 cm3, les tranches 6 à 17 contiennent la chlorodéméthyl- tétracycline et la chlorotétracycline, et les/tranches 24 à 40 contiennent la déméthyltétracycline et la tétracycline.
Dans la pottion de 610 cm3, les tranches 7 à 18 contiennent la chlorodéméthyltétracycline et la chlorotétracycline,et les tranches 19 à 31 contiennent la déméthyltétracycline et la. tétracycline.
EXEMPLE G. - Récupération de la chlorodéméthyltértrcycline à partir de fractions de colonne.-
On réunit les fractions contenant de la chlorodémé-- thyltétracycline et provenant de l'exemple B, pour obtenir un volume d'environ 12 litres. On ajoute une égale quantité d'eau, et on concentre le mélange sous vide jusqu'à 1810 cm3 de solution aqueuse. On ajuste le pH du concentré à 2,3-1,9 par addition d'acide chlorhydrique. On lave à deux reprises le concentré acidifié avec 180 cm3 de chloroforme, on filtre et on concentre sous vide jusqu'à un volume de 360 cm3. On ajuste le pH du concentré entre 1,2 et 2,8, avec de la soude à 50%.
On sèche la solution par congélation pour donner 18,56 g de chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline amorphe titrant 550 microgrammes par mg.
EXEMPLE D. - Récupération de la déméthyltétracycline à partir de fractions de colonne.-
On réunit les tranches de l'exemple B qui contien-
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tient la déméthyltétracycline pour obtenir un volume de 14 li- tres. On ajoute un égal volume d'eau et on concentre le mé- lange sous vide à 24 C jusqu'à un volume de 565 cm3 de solu- tion aqueuse. On ajuste le pH du concentré à 1,65 en ajoutant de l'acide chlorhydrique concentré, et on lave la solution à deux reprises avec 55 cm3 de chloroforme. On filtre la solu- tion lavée et on l'ajuste au pH 5,8 avec de la soude à 505.
Après vieillissement de 3 heures à la température ambiante, et 15 heures à 4 C, on filtre la bouillie cristalline obtenue et on lave le produit à l'eau et on sèche sous vide à 40 C.
On obtient un rendement de 4,7 g de déméthyltétracycline neu- tre brute titrant 880 microgrammes par mg exprimés en chlorhy. drate de tétracycline, ce qui représente un rendement d'en- semble de 73% à partir du concentré âqueux.
EXEMPLE E.- Cristallisation du chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycli- ne par le mélange acétone-éther.-
Un prend le,56 g de chlorodéméthyltétracycline séchée par congélation comme dans l'exemple C, on agite dans un mélange de 55 cn3 d'acétone, 7,4 cm3 d'eau et 3,7 cm3 d'acide chlorhydrique concentré. On filtre la solution et on rince les solides à deux reprises avec un total de 55 cm3 d'acétone contenait 1,85 cm3 d'eau. On réunit les filtrats, le pH étant de 0,8, et on traite par 55 cm3 d'éther. On ensemence le mélange, on laisse vieillir 18 heures à la tempé- rature ambiante avec agitation constante, et on enlève par filtration les cristaux qui se forment.
On lave le pràduit avec un mélange d'acétone, d'eau et d'éther, puis avec de l'a- cétone et finalement avec de l'éther, et on sèche sous vide à 40 C. On obtient un rendement de 4,74 g de chlorhydrate de
<Desc/Clms Page number 31>
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chlorodémétl1ylt±tracycli:le cristallin titrant 1090 uticrogram- nies par mag, ce qui -représente LUI lende;uelU' d! op(:ratloll de 50,0;,;. Le produit contient 11 dé chlor8t'3tracrcliile.
(..." 1C'..J. .-J J F, ¯ ¯ L,ristallisatii; du clil,riiv -dr de c]ilorodéinéthjrl.t4tracyclî,ie , ' à partir d'un talazye butatzol-eel7¯orolve.- On prend une portion de 50,4 g de chlorodéméthyl- tétracycline séchée par congélation, préparée comme dans
EMI31.2
l'exemple G, et titrant 7fla3 microgrammes par tztJ, oz1 la délaie dans 22,5 cm3 de cellosolve, et à la solution résultante on ajoute, au total, 205 cm3 de butanol. On ajuste le pH à 0,8 par addition de 11 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et on laisse vieillir le mélange 51 heures avec agitation. On enlè- ve les cristaux obtenus par filtration, on lave avec un mé- lange à 90/10 de butanol et de cellosolve, puis avec du chloroforme et on sèche sous vide.
On obtient un rendement de
EMI31.3
3036 g de chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline, titrant 1053. microgrammes par soit un rendement de 4;j*.
EXTMPLE G. - 4ecristallisatioii de la cI1l0r¯od6méthyltétracyclil!.e de manière à détruire la chloro6étracirclin;. -
On prend lg de la chlorodéméthyltétracycline pré- parée dans lexemple E, pn la délaie dans 3 cm3 de mélange à 90% de butanol et 10% de cellosolve, et on y ajoute 3 cm3 de triéthylamine pour ajuster le pH à 10,4. On laisse reposer la solution incomplète à la température ambiante pendant 24 heures pour détruire la chlorotétracycline qui peut être présente, et au bout de ce temps, on aïeule de l'acide chlor- hydrique concentré pour abaisser la pH à 0,5, et on laisse
EMI31.4
vieillir le m'lau;e nendant 4 heures avec agitation.
Ou fil- tre le produit cristallin, ou la lave avec un mélange d 90% de butanol et 10% de cellosolve puis au chloroforme et on
<Desc/Clms Page number 32>
che sous vide à 40 C. On obtient un rendement de 0,36 g de .
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c".pri.iydrate de chlorodémêthyltétracycline, titrant 1228 microgrammes par mg et contenant environ 2,5% de chlorotétra- cycline, ce qui représente un rendement de 40%
Les exemples suivants illustrent la conversion des antibiotiques en diverses formes :
EXEMPLE H. - Broitihydrate de chlorodéméthyltétracycline.-
On dissout 1,0 g de chlorodéméthyltétracycline- ammonium dans 20 cm3 d'eau et on traite la solution par 0,6 cm3 d'acide bromhydrique à 48% pour ajuster le pH à 1,6.
On laisse vieillir le mélange pendant 18 heures en agitant, à là température ambiante, et au bout de ce temps on trouve des cristaux en aiguilles allongées de bromhydrate de chlorodémé- thyltétracycline. On filtre le produit, on le lave aven 6 cm3 d'eau ajustée au pH 2,2 avec de l'acide bromhydrique, et on sèche sous vide pendant 5 heures à 44 C. On obtient un rende- ment de 750 mg de bromhydrate de chlorodéméthyltétracycline.
EMI32.2
Analyse calculée pour ClIi2ZNC1Br0$ : 0=46,2; H=1,,1; N=5,1; Ci=6,5; Br=l4,6; 0=23,4.
Analyse effective : 0=45,94; H=4,44; N=4,71; C1= 6,78, 6,47; Br=13,74; 0(différence : 24,39; 24,70).
EXEMPLE I. - Préparation du sel d'ammonium de chlorodéméthyltétracycline.'
On prend une portion de 100 mg de la chlorodémé- thyltétracycline préparée dans l'exemple E, on la dissout dans 0,5 cm3 de mélange à 90;3 de butanol et 10% de cellosolve et on fait barboter du gaz ammoniac dans la solution jusqu'à ce qu'il apparaisse un solide épais. On dilue la bouillie a- vec une petite quantité d'ammoniaque aqueuse concentrée, on
EMI32.3
laisse; re'fiY0\-ge#!' à la température ambiante pendant 5 heures et on filtre. On lave le produit avec un mélange à 90% de
<Desc/Clms Page number 33>
butanol et 10% de cellosolve, puis à l'acétone, et on sèche sous vide.
On obtient un rendement de 41;4mg de sel d'ammo- nium de chlorodéméthyltétracycline, titrant 1148 microgram- mes p'ar mg en chlorhydrate de chlorotétracycline (rendement 44%).
EXEMPLE J. -
Préparation de la chlorodéméthyltétracycline neutre.':::
On prend une portion de 50 mgr de la chlorodémé- thy1tétracyc1ine obtenue dans l'exemple E, titrant 1090 micro" grammes par mg, on la dissout dans 1,3 cm3 dieàù et on traite la solution par le carbonate de sodium sec jusqu'à un'pH de 7-8. On élimine par centrifugation le précipité amorphe ob- tenu, et on ajuste au pH 5,4, le liquide limpide de décanta- tion et on le laisse vieillir 16 heures à la température am- binate.
On filtre le produit, on le lave à l'eau et on le sè- che sous vide à 35 C pour obtenir 21,9 mgr de chlorodéméthl. tétracycline neutre cristalline titrant 1250 microgrammes par mg (rendement 50%)
EXEMPLE K.- Réduction de la chlorodéméthyltétracycline en déméthyltétra- cycline. -
On dissout dans de l'eau un échantillon de 12,5 mg: de chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline cristallin et on y ajoute une goutte de triéthylamine.
On mélange la solu-' tion avec 10 mg de palladium à 10% sur charbon, et on agite sous atmosphère d'hydrogène pendant 20 minutes. On filtre la solution obtenue pour éliminer le catalyseur.Les spectres ultra-violets aussi bien que la chromatographie sur papier indiquent que la déchloration se produit et donne la démé- thyltétracycline.
Comme indiqué plus haut, les sels de déméthylté- tracyclines peuvent se former par un traitement avec des
<Desc/Clms Page number 34>
acides et des bases. L'acide chlorhydrique est un acide préférentiel parce que les sels de cet acide et des déméthyl- tétracyclines sont des produits très utiles. On peut communi- quer des propriétés spéciales en utilisant d'autres acides, tels que l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide acétique, l'acide borique, et les autres acides organiques et inorganiques. On peut préparer des sels avec des bases, en utilisant les hydroxydes alcalins tels que la soude et les hydroxydes alcalino-terreux, comme indiqué plus haut.
Le sel de calcium est particulièrement utile, et on peut le préparer en ajustant simplement au pH 6-10 une solution a- queuse de l'une des déméthyltétracyclines, avec au moins un équivalent molaire de calcium dans la solution. On peut pré- parer les sels de baryum, de magnésium, de strontium[, etc... de façon similaire. Il se forme aussi des complexes des dé- méthyltétracyclines avec le bore, le zirconium et d'autres ions métalliques polyvalents, comme dans le cas des tétracy- clines.
Evidemment, si le milieu de fermentation ne contient pas de chlore ni de brome, on ne peut pas former de chloro- déméthyltétracycline ni de bromodéméthyltétracycline. En pareil cas, l'antibiotique principal sera la déméthyltétra- cycline. Quand on élève la teneur en ions chlorure, particu- lièrement au-dessus de 50 parties par million, il se forme des quantités notables de chlorodéinéthyltétracycline, car 1 partie d'ion chlorure peut amener la formation d'environ 14 parties de chlorodéméthyltétracycline. On.peut régler la quantité de ce dernier antibiotique.
Lorsqu'on prépare cet antibiotique, il est préférable que le milieu de fermenta- . tion contienne plus de 50 parties par million d'ion chlorure, et on peut porter cette ouantité jusqu'à 1000 parties par million ou même davantage pour avoir une production maximum
<Desc/Clms Page number 35>
de chlorodéméthyltétracycline.
Une petite concentration d'ion bromure dans le milieu de fermentation,' d'environ' 10 parties par million à plusieurs %, tend à diminuer la formation de chlorodéméthyl- tétracycline, et la formation de déméthyltétracycline est généralement accrue. Quand le milieu de fermentation, contient moins de 50 parties par million environ d'ions chlorure, et plus de 50 parties par million environ d'ions bromure, la
EMI35.1
formation de la bromodéraéthy1tétracycline est favorisée; et avec des souches de S.aureofaciens qui sont bonnes prôductri- ces d'antibiotique, la liqueur fermentée obtenue peut conte- nir la bromotétracycline en tant qu'antibiotique prédominant.
REVENDICATIONS.-
1.- Procédé pour la préparation des antibiotiques du groupe déméthyltétracycline (comprenant la déméthyltétra-
EMI35.2
cycline, la chlorodéméthy1tétra'èyèline et" la Éfôhiodéméthylté- tracycline), et de leurs épimères, dans lequel on fait fer- menter, dans des conditions aérobies, un milieu nutritif a- queux d'une teneur contrôlée en ions chlorure et/ou bromure, avec une souche de s.aureofaciens productrice de déméthylté- tracycline, on récupère si on le désire les antibiotiques du milieu de fermentation et, si on le désire, on ajuste le pH d'une solution concentrée pour obtenir les épimères.
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The present invention relates to novel therapeutic substances which have been identified as antibiotics of the demethyltetracycline group (including demethyltetracycline, chlorodemethyltetracycline and bromodemethyltetracycline) and their epimers.
The new antibiotics according to the present invention are formed in a fermentation process in which mutant strains of Streptomyces aureofaciens are used. The new antibiotics appear to be closely related to members of the tetracycline family described previously, but are markedly different from them. They are characterized by marked stability in both alkaline and acidic environments, and are superior to tetracyclines in this regard. They have similar antibiotic activity and can serve the same uses, and in the same general way, as the tetracyclines currently known.
According to the invention, there is provided a process for the preparation of antibiotics of the demethyltetracycline group (including demethyltetracycline, chlorodemethyltetracycline and bromodemethyltetracycline) and their epimers, which process comprises aerobic fermentation of an aqueous nutrient medium of 'a regulated content of ions' chloride and / or bromide, with a strain of S. aureofa- ciens producer of demethyltetracycline, to recover if desired the obtained demethyltetracycline antibiotics, from the fermentation medium, and, if desired , in adjusting the pH of a concentrated solution of this antibiotic to obtain the epimers.
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Each of the previously known tetracycline antibiotics which are produced by fermentation with S. aureofaciens under specific conditions, namely, tetracycline, chlorotetracycline and bromotetracycline has its counterpart in the new series of antibiotics. . In other words, according to the process of the present invention, by using certain mutant strains of S. aureofaciens which will be more particularly described below, one obtains an antibiotic substance similar to tetracycline, another similar to chlorotetracycline and another similar to bromotetracycline. The particular new antibiotic which is formed as a result of the fermentation process depends on the nature of the nutrient medium and other conditions of the process.
In a chloride-free medium, the predominant antibiotic is the unchlorinated analogue of tetracycline. In a medium rich in bromine, the brominated antibiotic is formed; and in a medium rich in chlorine, the predominant antibiotic will be a chlorinated antibiotic similar to chlorotetracycline. Usually, tetracycline, chlorotetracycline and / or bromotetracycline are also formed during the fermentation process, and their relative proportions depend on the chloride and / or bromide ion content of the medium, and on the strain of. microorganism used - By careful selection of the strain of S. aurecfaciens, it is possible to almost completely eliminate the formation of these known antibiotics of the tetracycline group.
New antibiotics according to the present invention can be converted to epimers as described below, similar to the conversion of tetracyclins to quatrimycins.
Chlorinated and brominated demethyltetracyclines according to the present invention can be dehalogenated by
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hydrogenation, with a palladium-on-charcoal catalyst, as well as converting chlorote-gracycline or bromotetracycline into pure and simple tetracycline.
Chemical analyzes, and examination of the chemical and physical properties of the new compounds, indicate that they differ essentially from the corresponding tetracyclines in that they contain one less methyl group. The methyl group in question is most likely that which occupies the 6-position on the naphtacene ring of tetracyclins. Accordingly, the tetracycline analog will be called 4-dimethylamino-1,4,4a, 5,5a, 6,11., 12a-octahydro- 3,6,10,12,12a-pentahydroxy-1,11 -dioxo-2-naphtacene-carboxamide. In the case of chlorine and bromine analogues, the halogen substitute should be in the 7-position, and will be named accordingly.
Appropriate common names for these new antibiotics would be demethyltetracycline, chlorodemethyltetracycline and bromodemethyltetracycline, and this nomenclature will be used herein. But it is understood that the postulated structure has not been proven by unequivocal synthesis, and could be "later found to be erroneous. The present invention relates to novel compounds which possess certain properties, and is not limited by a particular system of nomenclature nor by a probable structure.
The new antibiotics according to the invention are produced by certain mutant strains of S. aureofaciens.
These strains are undoubtedly of the species Streptomyces aureofaciens, since they derive from the primitive strain - A-377 isolated by Dr. BM Duggar, and deposited at the Northern Regional Research Laborabories in Peoria (Illinois, United States), and indexed in this Laboratory under n NRRL 2209. Mutations involving treatment of the strain
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A-377 by mutagens, successively comprising ultraviolet irradiation, nicotine and 2,2-dichloro-N-methyldiethylamine hydrochloride, were used to create one of the strains. Various other strains have been obtained by spontaneous mutation and by treatment with mutagens.
These various strains, which produce the new antibiotics in different proportions and with varying yields, exhibit the general characteristics of the .aureofaciens species. They differ a little from each other and also from the strains of S. aureofaciens previously described, mainly by their pigmentation and their property of producing new antibiotics. In most cases, a reddish-brown pigment is noted when the microorganisms are grown on ordinary culture media.
The undertones of the pigment vary from a peach or coppery brown shade to a dark mahogany, depending on the particular strain and the nutrient medium used. Although the property of producing the novel antibiotics of the present invention is generally associated with strains which exhibit this type of pigmentation, this pigment formation and the production of the new antibiotics are not necessarily integral properties. All the strains studied produce chlorotetracycline, and generally tetracycline, although the relative ratios of these antibiotics vary considerably depending on the nature of the fermentation medium, the fermentation conditions and the particular strain. chosen.
In some cases, the production of chlorotetracycline and tetracycline is very low, of the order of a few% of the total antibiotic produced by fermentation.
The mutant strains which produce the novel antibiotics of the present invention have the same general characteristics as the strains which produce
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tetracyclines, and they differ from each other in the same general way that tetracyline-producing strains differ from each other, as has been explained in several published scientific articles. Although many strains of S. aureofaciens are available to the public in culture collections and have been described in the scientific literature, the following data will serve to illustrate the type of variation of the new strains, compared to the primitive strain A-377 which is under the designation NRL 2209.
Comparison of S. aureofaciens strains
S-604 and A-377 on various environments.
Streptomyces aureofaciens strain S-604 which produces chlorodemethyltetracycline and demethyltetracycline was compared to Streptomyces aureofaciens strain A-377 (NRRL 2209) by observing the growth characteristics on various media incubated at 26-27 C.
The observations made are as follows:
1.- Glycerol, asparagine, beef extract, agar-agar:
EMI5.1
<tb> Glycerol <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Asparagine-L <SEP> 0.05%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Extract <SEP> of <SEP> beef <SEP> 0.2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0.05%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> 1.5%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> q.s. <SEP> for <SEP> adjustment <SEP> of <SEP> pH <SEP> 100%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> by <SEP> KOH <SEP> at <SEP> 50%:
<SEP> 7.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> 7.1
<tb>
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Streptomyces aureofaciens
EMI6.1
<tb> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Growth <SEP> Abundant, <SEP> color <SEP> Fairly <SEP> abundant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "Venetian <SEP> Red;
<SEP> ()
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hyphae <SEP> aerial <SEP> Abundant, <SEP> white <SEP> to <SEP> White, <SEP> unifor-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "Rose <SEP> gray" <SEP> () <SEP> mes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporulation <SEP> Slight, <SEP> becoming <SEP> None
<tb>
<tb>
<tb> abundant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusi- <SEP> Reddish brown <SEP> Yellow
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ble
<tb>
EMI6.2
Reverse ItBro \ "1l1 Mahogany" () Yellow to yellow
EMI6.3
<tb> orange <SEP> light
<tb>
() Designation of shades according to "Color
Harmony Manual "3rd edition, edited by
Container Corporation of America 2 .- 'Dextrin, Czapek-Dox, agar-agar .-
EMI6.4
<tb> Dextrin <SEP> 1%
<tb>
<tb> NaN03 <SEP> 0.2%
<tb>
<tb> K2HP04 <SEP> 0.1%
<tb>
EMI6.5
²S04.7H20 0,
05%
EMI6.6
<tb> KC1 <SEP> 0.05%
<tb>
EMI6.7
. FeSO.?H0 0.001%
EMI6.8
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> 1.5%
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water, <SEP> q, <SEP> s. <SEP> for <SEP> 100.0%
<tb>
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> 7.0
<tb>
EMI6.9
Streptomyces aureofaciens -
EMI6.10
<tb> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Growth <SEP> Rare, <SEP> hyaline <SEP> Profuse
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hyphae <SEP> aerial <SEP> Absent <SEP> Abundant, <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lead <SEP> gray "<SEP> ()
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Superficial <SEP> blood cells
<tb>
<tb>
<tb> colorless
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporulation <SEP> None <SEP> Abundant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> None <SEP> Light:
<SEP> pale yellow <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Reverse <SEP> no <SEP> pigmented <SEP> No <SEP> pigmented
<tb>
() see previous note.
<Desc / Clms Page number 7>
EMI7.1
3. -Maceration liquor of corn, èJ.1ar-agar:
EMI7.2
<tb> Liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 0.4%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 1.0%
<tb>
EMI7.3
jgSO, .7H 0 0.025% 1 \ H2P04 0.2% (NH4) zHP04 0.2% Agar-agar Bacto 2.0
EMI7.4
<tb> Water <SEP> from <SEP> tap, <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> for <SEP> 100.0%
<tb>
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> 63,
<tb>
EMI7.5
Streptomyces aurenfaciens
EMI7.6
<tb> Strain <SEP> S-604 <SEP> 'Strain <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb> Growth <SEP> Profuse <SEP> Profuse
<tb>
<tb> Hyphae <SEP> aerial <SEP> Abundant <SEP> "pink <SEP> Abundant,
<tb> taupe "<SEP> (') dark <SEP>" Beaver "
<tb>
EMI7.7
Sporulation Very abundant, LÎr.èfūab.ondteJ,
EMI7.8
<tb> uniform <SEP> uniform
<tb>
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Very <SEP> concentrated, <SEP> Yellow <SEP> greenish
<tb> "deep <SEP> brown" <SEP> to <SEP> clear
<tb> "deep <SEP> brown <SEP> Mahogany"
<tb>
EMI7.9
Reverse "Brown 3Mariogany" "Covert Brown"
EMI7.10
<tb> dark <SEP> () <SEP> (<SEP>) <SEP>
<tb>
() see previous notes.
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
4.- Other medium-x Streptomyces aureofaciens
EMI8.2
<tb> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar-agar <SEP> nutri- <SEP> Poor growth <SEP>, <SEP> Growth <SEP> fairly <SEP> a-
<tb>
<tb> tif <SEP> "Tauppe <SEP> brown" <SEP> to <SEP> bouncy. <SEP> No <SEP> of hy-
<tb>
<tb> "dark <SEP> brown" (). No aerial <SEP> <SEP> phes. <SEP> Reverse
<tb>
<tb>
<tb> of aerial <SEP> hyphae. <SEP>:
Pale <SEP> yellow Pigment
<tb>
EMI8.3
Yellow to yellow soluble "Taupe brown" reverse
EMI8.4
<tb> (). Pigment <SEP> soluble <SEP> not <SEP> brownish <SEP> clear.
<tb>
<tb> brown <SEP> reddish
<tb>
<tb> Glucose, aspara- <SEP> Abundant <SEP> growth. <SEP> Growth <SEP> fairly <SEP> a-
<tb>
<tb> gine, <SEP> extract <SEP> from <SEP> Large <SEP> aerial <SEP> hyphae <SEP> bounding.Hyphae <SEP> a-
<tb>
<tb> meat, <SEP> agar-agar <SEP> variegated: "pink <SEP> taupe" <SEP> nothing <SEP> white <SEP> deve-
<tb>
EMI8.5
or "fawn" or IIcamelll (O) more and more.
EMI8.6
<tb>
-Sporulation: abundant.
<tb> () .Pigment <SEP> soluble <SEP> lying. Reverse: yellow
<tb> reddish brown <SEP>. <SEP> clear Pigment <SEP> soluble <SEP> yellow <SEP> clear.
<tb>
<tb>
Apple <SEP> of <SEP> earth <SEP> Profuse <SEP> growth <SEP> hu- <SEP> Profuse <SEP> growth
<tb> mide, smooth, nodulated: <SEP> smooth, wet, nodu-
<tb>
EMI8.7
"Dark broim j-iahogaily" lée: "Light Nie llon () with trace of yellow" () to "asti-" peàch tan "(). Hyphae that pink" () .Hyphae
EMI8.8
<tb> air <SEP>: absent <SEP> to <SEP> subscriber- <SEP> air: trace.No
<tb>
<tb> dants, becoming <SEP> white <SEP> of <SEP> pigment <SEP> soluble.
<tb>
EMI8.9
at 11 C ame! (). Sporula-
EMI8.10
<tb> <SEP> abundant <SEP> in
<tb>
<tb> the <SEP> zones <SEP> of <SEP> strong <SEP> for-
<tb>
<tb> <SEP> mation of aerial <SEP> hyphae.
<tb>
<tb>
Pigment <SEP> soluble <SEP> "choco-
<tb>
EMI8.11
late "()" chocolate
EMI8.12
<tb> broi, ni "<SEP> (<SEP> <SEP>) <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Milk <SEP> purple <SEP> Light <SEP> collar <SEP> of <SEP> believe- <SEP> Light <SEP> collar <SEP> of
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> session <SEP> "Deep <SEP> red <SEP> Maho- <SEP> growth <SEP> white <SEP> to
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> gany "(). <SEP> Little <SEP> of <SEP> varia- <SEP> pale yellow <SEP>.
<SEP> Pe <SEP> u <SEP> from
<tb>
<tb>
<tb> significant <SEP> <SEP> of <SEP> pH, little <SEP> variation <SEP> notalde
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> of <SEP> peptonization <SEP> appa- <SEP> of <SEP> pH, <SEP> little <SEP> of <SEP> pept
<tb>
<tb>
<tb> rent.Light <SEP> reaction <SEP> apparent <SEP> nization
<tb>
<tb>
<tb> colored <SEP> falsely <SEP> alca- <SEP> in <SEP> 15 <SEP> days
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> line <SEP> due <SEP> to <SEP> the <SEP> broadcast
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> of <SEP> soluble <SEP> pigment.
<tb>
() see previous notes.
<Desc / Clms Page number 9>
EMI9.1
On all agar-agars, 'except dextrin' Czapek-Doc ,, but including the tilted c'u1.t \\ 1.r'e on potato, the .aurèofacien9 strain 'S-.604, produces a characteristically strong pigmentation, usually appearing with growth. Likewise, the characteristic reddish brown soluble pigment is easy to observe.
EMI9.2
5.- Croscopic observations.
EMI9.3
'Stre tom ces aureofacièzis
EMI9.4
<tb> Medium <SEP> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377 <SEP>. <SEP>
<tb>
<tb>
Mycelium <SEP> Spores <SEP> Mycelium <SEP> Spores
<tb>
<tb> Glycerol, <SEP> Sinuous, <SEP> Spheroidal <SEP> Sinuous, <SEP> Spheroidal
<tb>
EMI9.5
asparagine, continuous, to ovoid. areinu, -to ovolate. branched extract. Branched diameter. a ovo aux. beef, Diameter 1.5 - 2.0 Diameter diameter agar-agar o8 to microns 0.7 to 1.3 - 270, l, a micron 1.0 micron microns Liquor of Sinuous, Spherodidals Sinuous, Spheroidal maaeration continuous, to ovoid . continuous, to ovoid.
EMI9.6
<tb> of <SEP> but <SEP> branched. <SEP> Branched <SEP> diameter !.
<SEP> Diameter
<tb>
EMI9.7
agar-agar Diameter l5 - 2O a Diameter 1.5 - 2.0
EMI9.8
<tb> 0.8 <SEP> to <SEP> microns <SEP> 0.8 <SEP> to <SEP> microns
<tb>
EMI9.9
]., 0 micron] 1.0 micron
The morphology of the mycelium and the spores for strain S-604 is apparently similar to that observed for strain A-377. Both strains show a continuous, sinuous, branched mycelium with occasional tendency to
EMI9.10
aerial hyphae with spiralisatioii. The characteristic spores are ovoid to spheroidal.
<Desc / Clms Page number 10>
To illustrate the color variations among the different strains of s.aureofacieus which produce demethyltetracyclines, four selected strains were grown on agar-agar with corn maceration liquor, and the following observations were made:
Color observations (); Streptomyces aureofa- ciens:
Agar-Agar with corn maceration liquor (AP):: Incubation 4, days at 27 C.
EMI10.1
<tb>
Strain <SEP> Isolated <SEP> colonies <SEP> Growth <SEP> in <SEP> mass
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S-604M1 <SEP> "Deep <SEP> red <SEP> mahogany" <SEP> "Deep <SEP> red <SEP> mahogany"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> S1071 <SEP> "Copper <SEP> brown" <SEP> "Deep <SEP> brown <SEP> mahogany"
<tb>
<tb>
<tb> to <SEP> "Red <SEP> mahogany"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> V-62 <SEP> Large <SEP> zone <SEP> marginal <SEP> "Light <SEP> copper <SEP> brown"
<tb>
<tb>
<tb> "peach <SEP> tan" <SEP> becoming
<tb>
<tb>
<tb> "light <SEP> copper <SEP> brown"
<tb>
<tb>
<tb> at <SEP> center <SEP> of <SEP> the <SEP> colo-
<tb>
<tb>
<tb> denies.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
B-740 <SEP> "Dark <SEP> Wine" <SEP> "Burgundy"
<tb>
() colors according to the work already cited /
A relatively simple method of selecting a strain of S. aureofaciens capable of producing the new antibiotics is to choose a strain of S. au- reofaciens which shows dark brown colonies when grown on agar-agar medium. and corn maceration liqueur. Inocula were prepared with these colonies and fermentation was carried out as explained in Examples 1 and.
2 below. At the end of the fermentation period, a certain amount of the fermentation liquor is acidified to a pH in the region of 1.5 to solubilize the antibiotic and filtered to obtain a clear aqueous solution.
One or two drops of the filtrate are placed on a strip of paper and chromatographed, by ordinary methods of development.
<Desc / Clms Page number 11>
chromatographic method. As the solvent, butanol equilibrated with a 0.3 M aqueous phosphate buffer at pH 3 is used.
The paper bands are developed by chromatography on the basis of the solvent phase of the equilibrated mixture. The location of the spots corresponding to the demethyltetracyclines is easily determined by inspection with ultraviolet rays. Another, more sensitive method consists of placing the strip on an agar-agar tray inoculated with microorganisms sensitive to antibiotics such as Bacillus cereus or Bacillus subtilis, - and incubating the plates. teaux. Zones of inhibition appear in the regions corresponding to the antibiotic spots.
Comparison of the spots with control samples of pure antibiotic and the "Rf" indices given below, provide a basis for detecting the presence of the new antibiotics in the fermented liquor, and a semi-quantitative basis for determining. - determine the quantity present.
This technique can be illustrated with the aid of Figure 1 of the drawing which shows how paper tape chromatography can separate and detect the various tetracyclines and products of the present invention. The drawing shows a strip of paper, 1, on which has been placed, at point 2, a small amount of an antibiotic solution containing tetracycline, chlorodemethyltetracycline, demethyltetracycline and chlorodemethyltetracycline. The total antibiotic activity of the solution placed at point 2 is 30 micrograms, expressed as tetracycline. The strips of paper are then developed as described above.
After a certain time, the bands are examined with ultraviolet rays, with the results shown in the drawing. The solvent front has advanced to the point indicated by the solid line, 3. The tetracycline component of the mixed antibiotic solution has developed.
<Desc / Clms Page number 12>
advanced to point 5 and the chlorotetracycline is swallowed up to point 7. The new antibiotic, demethyltetracycline, has advanced to point 4, and the antibiotic chlorodemethyltetracycline is found at point 6. The clues Rf of these antibiotics are also indicated in the drawing.
The Rf index is by definition the distance between the spot and the point of origin, 2, divided by the distance between the solvent front, 3, and the origin, 2, and of course it is always less than 1. A variety of solvent systems can be used to derive a series of Rf indices for a particular antibiotic, and these indices are considered to be very valuable in identifying antibiotics and distinguishing them from others.
The Rf numbers of some tetracyclines, fourth-mycines and demethyltetracyclines in two precise solvent systems indicated in the following table.
EMI12.1
<tb>
Antibiotic <SEP> Ethyl acetate <SEP> / <SEP> 90/10 <SEP> chloroform /
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> 4.7, <SEP> buffer <SEP> butanol,
<tb>
<tb>
<tb> citrate-phosphate <SEP> H3PO4 <SEP> aqueous <SEP> 0.3M
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (Mac <SEP> Elvain) '<SEP> 0.1% <SEP> acid <SEP> tri-
<tb>
<tb>
<tb> chloroacetic,
<tb>
<tb> pH <SEP> 1.9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorotetracycline <SEP> 0.76 <SEP> - <SEP> 0.80 <SEP> 0.61
<tb>
EMI12.2
Bromotetracyclititis 0.76 - 0.80 0.61 Tetracycline 0 .6 - 0 .7 0 z0 Quatrimycin 0.14 - 0.16 $ 0 12 Chloroquatrimycin OY27 - O28, 33 Bromoquatrimycin, 27 - 0) 28 o33 Oxyquatrimycin OYOO - 0, 06 0.11
EMI12.3
<tb> Chlorodemethyltetracycline <SEP> 0.68 <SEP> - <SEP> 0.72 <SEP> 0.39
<tb>
<tb> Demethyltetracyclitle <SEP> 0.27 <SEP> 0.2q
<tb>
<tb> Epichlorodmethyltetra-
<tb>
EMI12.4
cyclin, 25 - 0.27 0,
20
EMI12.5
<tb> Epidemethyltetracycline <SEP> 0.09 <SEP> 0.10
<tb>
<Desc / Clms Page number 13>
Several strains of S. aureofaciens which produce the new antibiotics have been deposited with the American Type Culture Collection in Washington; and are cataloged under ATCC Nos. 12551, 12552, 12553 and 12554. It is understood that mutants which also produce the new antibiotics can be derived from these strains by current methods, and indeed, it is to be expected that some of them have the property of producing higher yields of one or more of the new antibiotics, under favorable conditions.
These mutants may vary somewhat in their general morphological characteristics, as may the various strains of the species S. aureofaciens.
It is also expected that other strains of S. aureofaciens producing demethyltetracycline could be found in nature and could be created from the strains. currently isolated from S. aureofaciens which do not produce these new antibiotics.
One of the most important advantages of demethyltetracycline over the tetracyclines described previously is its increased stability in acidic and alkaline media.
The instability of tetracycline in an acidic medium and the instability of chlorotetracycline in an alkaline medium are well known. Chlorotetracycline in aqueous solution with sodium carbonate buffer at pH 9.85 has a half-life of 29.2 minutes at 23 C. On the other hand, chlorodemethyltetracycline does not lose more than 6% of its activity in 24 hours in same conditions. Tetracycline is completely destroyed within 5 minutes in 1N sulfuric acid at 100 C.
On the other hand, chlorodemethyltetracyline loses only about 2% of its activity in 1N sulfuric acid at 100 ° C. after 15 minutes. Likewise, the new antibiotic demethyl-
<Desc / Clms Page number 14>
tetracycline loses only about 33% of its activity in 1N hydrochloric acid at 100 C in 6 minutes. In 0.1N sodium hydroxide at 50 C, demethyltetracycline has a half-life of approximately
20 hours, against 3.3 hours for tetracycline. These unexpected properties are very valuable, since the instability of tetracycline in an acidic medium and the instability of chlorotetracycline in an alkaline medium limit or completely prevent the use of these valuable substances in many applications. .
Due to the much better stability of the new antibiotics, it is transferable to prepare many pharmaceuticals which could not / could not be prepared satisfactorily with the tetracyclines. The increased stability also improves the recovery and refining processes, since these more stringent conditions of pH and temperature can be used, and thus the efficiency of various stages can be improved. process weight.
Chemical analyzes of highly purified samples of chlorodemethyltetracycline agree with the calculated empirical formula C21H21C108 'the error being within the experimental range. The Kuhn-Roth method for the determination of methyl groups gives an extremely low value, indicating that there is no methyl group at position 6 of the naphthocene ring. Accordingly, the name chlorodemethyltetracycline appears appropriate. This is further confirmed by the comparison of the ultraviolet and infra-red absorption spectra of the products, with two of the different tees = tracylclines.
The melting point of chlorodemethyltetracycline as free base, measured on a hot platform, is 170-175 C with decomposition. The melting point of chloro tetracylline is 168-169 C. Demethyltetracycline free base melts at 170-177 C, with decomposed
<Desc / Clms Page number 15>
tion, while tetracycline melts on the hot platform at 160-168 C.
Here are other comparisons between chlorotetracycline and chlorodemethyltetracycline. Chlorodemethyltetracycline has a pHa value of 4.45 in a 50/50 mixture of dimethylformamids and water. Optical rotation of chlorodemethyltetracycline in hydrochloric acid
0.03N at a concentration of 0.5% is [o (725D = 261; for chlorotetracycline, -243 The demethyltetracyclines appear to be more soluble in water than the corresponding tetracyclines. For example, chlorodemethyltetracycline hydrochloride is soluble in water at a rate of approximately 45 mg / cm, compared with approximately 14 mg / cm for chlorotetracycline.
The antibacterial activity of tetracyclines and 'demethyltetracyclines is generally similar, but with marked differences as will be seen from the following table.
This table compared the concentrations of chlorotetracycline and chlorodemetyyltetracycline which are necessary to achieve half-maximum inhibition of growth, expressed in micrograms of antibiotic per cm3 of solution, over time periods varying from 4 to 48. hours with various microorganisms. Low numbers indicate more effective inhibition of growth.
<Desc / Clms Page number 16>
TABLE I. -
Antibiotic
EMI16.1
Microorganism chlorotetracycline ch10rodeTIethyltestracycline Times in hours Time in hours ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯4 8 4 1 $ - 8 24 48
EMI16.2
<tb> Staphylococcus
<tb> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538 <SEP> P <SEP> 0.041 <SEP> 0.072 <SEP> 0.57 <SEP> 4.1 <SEP> 0.065 <SEP> 0.094 <SEP> 0.41 <SEP> 0.68
<tb>
<tb> Staphylococcus
<tb> albus <SEP> 7.5 <SEP> 20.5 <SEP>> 50.0 <SEP>> 50.0 <SEP> 16.5 <SEP> 50.0 <SEP>> 50.0 < SEP>> <SEP> 50.0
<tb>
EMI16.3
Escherichia coli 0.12 0.27 1.5 10.2 0.16 0.3 0.66 ±. 1.56 0.8 Salmonella galli- 0 0.74 465 37.0 0.1 0.56 1.06 1.1 narum Bacillus cereus (0.02;
5 0.035 0.15 1.1 0.015 0.039 0.077 0.19 Pseudomouas
EMI16.4
<tb> aeruginosa <SEP> 0.31 <SEP> 0.56 <SEP> 6.3 <SEP> 35.0 <SEP> 0.94 <SEP> 1.3 <SEP> 4.3 <SEP> 6 , 7
<tb> Streptococcus
<tb>
EMI16.5
pyrogenes beta 11.5 1r3.0> 50.0> 50.0 14, A 41.0> 50.0 50.0
EMI16.6
<tb> hemolytic
<tb>
EMI16.7
Proteus vulgsris 0> 28 0.56 9.2 50.0 0.62 1.12 JY38 4.4
EMI16.8
<tb> Escherichia <SEP> coli
<tb>
<tb> ATCC <SEP> 9637 <SEP> 0.54 <SEP> 1.18 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 34.0 <SEP> 0.43 <SEP> 0.67 <SEP> 0.97 <SEP> 1.8
<tb>
As will be seen by examining the figures of the
EMI16.9
table above, chlorotetr: cyclizze, in general; is slightly more active within 4 hours.
However, it will be noted that after a certain standing time of the solutions, bacterial growth resumes in the case of chlorotetracycline, but that it is still generally inhibited in solutions which contain chlorodeme thyltetracycline. This is indeed the better stability of the latter antibiotic. Similar results are observed when comparing tetracyline to demethyltetracycline and bromotetracycline to bromodemethyltetracycline.
It has also been found that emethyltetracyclines are considered
EMI16.10
significantly superior to ltoxytetracycline in the same type
<Desc / Clms Page number 17>
The demethyltetracyclines were also compared with the tetracyclines in in vivo tests, and it was found that there is no appreciable difference in the antibacterial activity of the demethyltetracyclines compared to their tetracyclines analogues. It is therefore concluded that these new antibiotics can be used for the treatment of the same diseases in the same general way as the tetracyclines currently used.
The ultraviolet absorption spectra of tetracyclines and demethyltetracyclines are very similar.
Figure 2 of the drawings shows the comparison between the ultraviolet absorption spectrum of chlortetracycline and chlorodemethyltetracycline at the same concentration.
As will be appreciated, the shape of the curves is essentially the same, but there is, however, a slight fluctuation in the absorption spectrum of chlorodemethyltetracycline near 260 millimicrons.
Another comparison of the ultraviolet absorption spectra of tetracyclines is seen in Table II, which shows the extinction coefficients E 1cm (spectrophotometric absorption of a 1% solution measured in a cell of 1 cm) measured at the maximum and minimum of the minimum of the different antibiotics. The values were calculated from the UV absorption curves, correcting to 1% the concentrations at which the tests were made.
All samples were measured in 0.1N H2SO4 solution.
<Desc / Clms Page number 18>
TABLE II
EMI18.1
<tb> Max. <SEP> Mih. <SEP> Max. <SEP> Min. <SEP> Max.
<tb>
Antibiotic <SEP> e <SEP> 1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milli- <SEP> E1% <SEP> milliE1cm <SEP> micron <SEP> E1cm <SEP> micron <SEP> E1cm <SEP> micron <SEP> E1cm <SEP> micron <SEP> e1cm <SEP> micron
<tb> Chlorotetracycline <SEP> hydrochloride <SEP> 209 <SEP> 368 <SEP> 135 <SEP> 302 <SEP> 356 <SEP> 265 <SEP> 288 <SEP> 242 <SEP> 343 <SEP > 228
<tb> Epichlorotetracycline <SEP> -NH4 <SEP> 170 <SEP> 368 <SEP> 100 <SEP> 302 <SEP> 332 <SEP> 254 <SEP> 290 <SEP> 242 <SEP> 342 <SEP> 228
<tb> <SEP> Tetracycline Hydrochloride <SEP> 305 <SEP> 355 <SEP> 182 <SEP> 299 <SEP> 393 <SEP> 268 <SEP> 191 <SEP> 232 <SEP> 289 <SEP > 217
<tb> Epitetracycline-NH4 <SEP> 290 <SEP> 355 <SEP> 140 <SEP> 299 <SEP> 326 <SEP> 254 <SEP> 200 <SEP> 232 <SEP> 275 <SEP> 216
<tb> Demethyltetracyline <SEP> neutral <SEP> 292 <SEP> 353 <SEP> 169 <SEP> 298
<SEP> 395 <SEP> 268 <SEP> 202 <SEP> 232 <SEP> 299 <SEP> 217
<tb> Epidemethyltetracycline hydrochloride <SEP> 310 <SEP> 355 <SEP> 162 <SEP> 299 <SEP> 367 <SEP> 255 <SEP> 228 <SEP> 232 <SEP> 306 <SEP>, <SEP> 217
<tb> Chlorodemethyltetracycline <SEP> hydrochloride <SEP> 249 <SEP> 368 <SEP> 160 <SEP> 299 <SEP> 362 <SEP> 268 <SEP> 270 <SEP> 238 <SEP> 357 <SEP > 227
<tb> Epichlorodemethyltetracycline hydrochloride <SEP> <SEP> 242 <SEP> 368 <SEP> 130 <SEP> 300 <SEP> 348 <SEP> 254 <SEP> 289 <SEP> 238 <SEP> 346 <SEP> 227
<tb>
<Desc / Clms Page number 19>
The infrared absorption spectra of several of the new products are shown in the other figures of the drawing.
Figure 3 is a representation of the infra-red absorption spectrum of chlorodemethylteracycline hydrochloride. FIG. 4 represents the comparison of the infrared absorption spectra of free base tetracycline and free base demethyltetracycline. As we can see, there are several clear differences, and also similarities.
Figure 5 shows the infrared absorption spectrum of epichlorodemethyltetracycline hydrochloride, and Figure 6 is the absorption spectrum of epidemethyltetracycline hydrochloride. These curves were obtained on a Perkin-Elmer model 21 automatic infrared recording spectrophotometer, with the solid phase antibiotics, compressed into a disc with KBr. Here are other data: prism - NaC1; resolution - 2; answer - 1 - 1; gain - 5; , speed 1/2 min / micron; deletion - 2; and scale: 50.8 min for one micron.
Various methods have been developed to titrate tetracyclines, and some of them can be used to titrate demethyltetracyclines, of course with appropriate modifications. The fluorometric titration of the. Chlorotetracycline is based on an increase in fluorescence due to the formation of an isochlorotetracycline in an alkaline medium. The sample to be titrated is dissolved in an alkaline phosphate buffer, and the fluorescence of the solution is determined in a fluorophotometer at time zero (immediately after preparation of the solution), and again after standing to allow isomerization. to occur.
The increase in fluorescence corresponds to the amount of chlorotetracycline present. but the presence of chlorodemethyltetracycline in the solution may interfere with the reaction of chlorotetracycline, tending to give the illusion
<Desc / Clms Page number 20>
with a lower content of chloroterracycline. A more reliable method for determining chlorotetracycline in mixtures with chlorodemethyltetracycline is based on the fact that the alkaline degradation product of chlorotetracycline does not absorb at 380 m millimicron. The sample is prepared at pH 10 with a carbonate buffer, and the absorption change is measured at 380 m millimicron after standing for 30 minutes (about three half-lives of chlorotetracycline).
Chlorotetracycline and chlorodemethyltetracycline both absorb before alkali degradation, but only chlorodemethyltetracycline absorb after degradation treatment; and the decrease in absorption is the measure of the chlorotetracycline originally present in the sample.
A specific titration of chlorodemethyltetracycline in the presence of other antibiotics of the tetracycline group is based on the Hiscox method. A moderate acid treatment for 15 minutes at 100 ° C. with 1N HCl destroys all the tetracyclines except chlorodemethyltetracycline. Then a portion of the sample thus treated is subjected to a vigorous acid treatment for 15 minutes at 100 ° C. with 6N HCl, in order to destroy the chlorodemethyltetracycline. The chlorodemethyltetracycline content is calculated by measuring the spectrophotometric absorption loss at 369 m millimicron and the increase at 430 m millimicron, which is achieved by the vigorous acid treatment, and comparing with a control.
A mixture containing only two constituents, for example a mixture containing the two members of an epimeric couple,: can be titrated by spectrophotometry. We determine the spectrophotoinometric absorptions for two wavelengths, and we interpose linearly the ratio of these two absorptions between the known values in the consti-
<Desc / Clms Page number 21>
pure killers. It is thus possible to determine the percentage composition of the mixture.
The easiest way to titrate bromodemethyltetracycline is to test for. bromine content by common methods of microanalysis.
As indicated above, bromodemethyltetracycline can be obtained as the main fermentation antibiotic by controlling the halogen content of the fermentation medium. Generally, the aqueous nutrient medium should contain at least 50 parts per million bromide ions and the chloride ion content should be kept as low as possible, less than about 50 parts per million chloride ions. The bromide ion can be provided by any water soluble bromide, for example potassium bromide, which releases bromide ions to serve in the biological synthesis of the antibiotic.
Apart from controlling the halogen ion content of the fermentation, the process for preparing bromode-methyltetracycline is similar to that for preparing demethyltetracycline and chlorodemethyltetracycline, described above. Strains of S. aureofaciens which produce demethyltetracycline can also be used to produce the brominated analog.
Bromodemethyltetracycline has approximately the same antibacterial activity as chlorodemethyltetracycline, and it can be used for the same uses and in the same way.
It is not necessary to separate broinodenethyltetracycline from other antibiotics which may concurrently form during fermentation because a mixture. of the various demethyltertracyclines is useful for many uses; for example, the fermented nutrient medium can be concentrated and used directly for its antibiotic content.
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ticks. Another way to use it is to acidify the fermented liquor, filter to remove mycelium and insolubles; to neutralize and concentrate to obtain a dry powder which can be mixed with animal feed. Mixed antibiotics are useful in stimulating the growth of many animals.
A crude form of bromodemethyltetracycline, and mixtures of this with other antibiotics, can be used to preserve meats, poultry and fish in the same way that tetracyclines are currently used.
In these compositions, little need be paid to the proportions of the various tetracyclines which they may contain.
In the event that it is desired to separate the bromodemethyltetracycline from the other antibiotics contained in the fermented liquor, this can be done by several means which will be apparent to those skilled in the art. For example, treatment with acid destroys tetracycline, and treatment with alkali destroys chlorotetracycline and chlorotetracycline in the fermented liquor. Bromodemethyltetracycline can be recovered from the resulting solutions; through fractional chromatography using diatomaceous earth in the column. A mixture of chloroform and butanol of about pH 2.0 elutes antibiotics from the diatomaceous earth.
The bromodemethyltetracycline exits the column ahead of the demethyltetracycline and can be recovered from the eluent. Bromodemethyltetracycline can also be separated into a single antibiotic component, using Craig's countercurrent delivery technique.
The epidemethyltetracyclines of the present invention are considered to be isomers of demethyltetracy-
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clines. The structural difference appears to be based on a rearrangement of the dimethylamine group on the carbon atom in position 4. Apparently, under certain conditions which will be described in more detail below, the inversion occurs and a mixed mixture is obtained. the equilibrium of deinethyltetracycline and its epimer. The two can be separated to obtain practically pure products.
For each of the bodies, demethyltetracycline, chlorodemethyltetracycline and bromodemethyltetracycline, there is a corresponding isomer which will be called epidemethyltetracycline, epichlorodemethyltetracycline, and epibromodemethyltetracycline. Demethyltetracyclines can be converted to their isomeric forms by simply adjusting the pH of a concentrated solution of the antibiotic to between 3.0 and 5.0 and allowing the solution to stand until the isomerization has reached equilibrium. The most important conditions that need to be set in order to convert the demethyltetracyclines to their isomers are concentration, pH, time and temperature.
The most convenient is to carry out the isomerization at room temperature, but at higher temperatures a higher conversion rate is obtained. The pH should be between about 3.0 and 5.0, preferably between 3.5 and 4.5. Some epimerization occurs at pHs outside this range, and even in distilled water; but the speed is very low. The concentration of the antibiotic in the aqueous solution should be as high as possible if faster epimerization rates are to be obtained. Complete equilibration may take about 24 hours at 25 ° C., but satisfactory equilibration can be obtained in a much shorter time under specified conditions.
Usually, however, best results are obtained by allowing the solution to stand for
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durations of a week or more. It seems that the equilibrium is reached, in most cases, at about 50%; that is, at equilibrium about half of the demethyltetracycline is converted to the epimer.
Since concentration is an important factor in obtaining high yields in short periods of time, a solvent system should be chosen which gives the highest concentration of demethyltetracycline. These solvent systems must be buffered to obtain a pH within the range of dawi (whatever the preferred range. The various solvents include methanol, ethanol, butanol, acetone, 2-ethoxyethanol, 2-methoxypropanol, tetrahydrofuran, dimethylformamide and mixtures of these solvents. Still other solvents can be used. A preferred buffer is monosodium phosphate, but other buffers and pairs of buffers can be used which maintain the pH in the desired range. .
The epimers of the demethyltetracyclines can be recovered from aqueous solutions, in the same general way as the tetracyclines are recovered. Although they have mild antibacterial activity in vitro and in vivo than the demethyltetracyclines, they are still very useful in the treatment of diseases caused by bacteria, due to their appreciable antibacterial activity.
As might be expected, the demethyltetracyclines form salts and complexes of the same type, and in the same general way, as the tetracyclines. Treatment with acids at a pH below about 4 results in the formation of acid salts. The free base can be obtained at a pH of about 4 to 6; and at pH greater than 8, we obtain
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holds salts with bases, for example calcium salt.
Likewise, epimers are formed from salts.
As indicated above, the process for preparing the new antibiotics according to the present invention will generally be the same as the processes for producing chlorotetracycline, tetracycline and bromoteter cycline, the main differences residing in the process. made .
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that we choose a mutant strain of S. aureofaciens which produces the desired demethyltetracycline instead of one of the tetracyclines.
The composition 'of the fermentation medium, the degree of aeration, the time, the temperature', the control of hydrogen ions, the mode of inoculation and the like, applied in the production of chlorotetracycline, bromotetracycline and tetracyclines are suitable for the production of the new demethyltetracyclines.
In order that the fermentation process according to the invention may be more fully understood, it will now be described with reference to the specific examples which follow.
EXAMPLE 1. -
A suitable medium for the preparation of inocula intended for fermentation can be prepared with the following substances:
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<tb> Sucrose <SEP> 30 <SEP> g / 1
<tb>
EMI25.3
(NH) 50, -S'J 2 g / 1
EMI25.4
<tb> CaC03 <SEP> 7 <SEP> g / 1
<tb>
Corn maceration liquor 16.5 cm3 / 1
The pH of the medium thus obtained is approximately 6.8.
We measure an 8 cm3 portion which is introduced into a 20 cm Brewer tube, and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. The sterilized medium is then inoculated with 0.5 cm3 of an aqueous suspension of spores from a strain of S. aureofa.
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ciens capable of producing chiarodemethyltetracycline,
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for example strain S-604, the suspension containing about 40-60 million spores per cm3. The inoculated medium is incubated for 24 hours at 28 ° C., on a reciprocating shaker operating at 110 cycles per minute.
A suitable fermentation medium contains water, and a typical medium which is suitable for producing chlorodemethyltetracycline is as follows:
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<tb> starch <SEP> from <SEP> but <SEP> 55 <SEP> g / 1
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 57 <SEP> g / 1
<tb>
<tb> (NH4) 2SO4 <SEP> 2g / 1
<tb>
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FeS04-7H20 l0 z: ng / 1 MnS04-4H20 50 rr / 1
EMI26.3
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 100 <SEP> mg / 1
<tb>
EMI26.4
CoCl 2 ¯6H 2 0 5 mg / 1
EMI26.5
<tb> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 30 <SEP> g / 1
<tb>
<tb> flour <SEP> of <SEP> seed <SEP> of <SEP> cotton <SEP> 2 <SEP> g / 1
<tb>
<tb> Oil <SEP> from <SEP> lard <SEP> 2.0% <SEP> by <SEP> volume
<tb>
When the chloride ion content of this medium is restricted, it tends to increase the amount of demethyltetracycline at the expense of the production of chlorodemethyltetracycline.
EAMPLE 2. -
Do we carry out fermentation in shaker flasks? which results in the formation of a certain quantity of demethyltetracycline and chlorodemethyltetracycline, with a medium prepared as follows:
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<tb> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 30 <SEP> g / 1
<tb>
<tb> <SEP> lard oil <SEP> <SEP> 2% <SEP> by <SEP> volume
<tb>
<tb> starch <SEP> from <SEP> but <SEP> 55 <SEP> g / 1
<tb>
<tb> flour <SEP> of <SEP> seed <SEP> of <SEP> cotton <SEP> 2 <SEP> g / 1
<tb>
<tb> CaC03 <SEP> 7 <SEP> g / 1
<tb>
<tb> (NH4) 2SO4 <SEP> 5 <SEP> g / 1
<tb>
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<tb> NH4C1 <SEP> 1,5g / 1
<tb>
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ZnS04..7H20 100 n / 1 MhSO, .4HO 50 m /.
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<tb> CoC12.6H2O <SEP> 5 <SEP> mg / 1
<tb>
We measure a portion of 25 cm3 that we introduce
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in a 250 cc Erleiimeyer flask, sterilize during. 20 minutes at 120 C and inoculated with 1 cm3 of mycelion culture prepared as in Example 1. After incubation for 120 hours at 26 C on a ratative shaker at 186 t / mm, the liquor is titrated and it is found that '' it does not contain more than approximately 70 micrograms of chlorotetracycline per cm3,
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about 450 micrograms of demethyltetracycline per cm3, and about 900 micrograms of chlorodemethyltestracycline per cm3.
EXAMPLE 3. -
Fermentation in vats.
A fermentation of 40 liters is carried out in. a pilot tank, essentially according to the method described in example 2. After having prepared the medium, it is sterilized for 25 minutes at 125 C and inoculated with an inoculum of strain S-604 prepared as indicated by Duggar, U.S. Patent No. 2,482,055 of September 13, 1949.
The fermentation is carried out with continuous agitation at a temperature of 28 ° C. for the first 24 hours and 25 ° C., until complete, in 135 hours. Sterile air is introduced at a rate of 0.3 1 / mm during the first sixteen hours, then at a rate of 0.5 1/1 / mm until the. harvest.
The following examples illustrate the recovery, refining and separation of antibiotics.
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EXAMPLE A. Refining of chlorodemethyltetracycline and of demethyltetracycline.
25.8 liters of liquor are prepared as in Example 3, treated with 200 cc of concentrated hydrochloric acid to adjust the pH to 1.5. The treated liquor is filtered, after having mixed it with 2.8 kg of a filter aid, to obtain 16.3 liters of filtrate. The filter cake is taken up in 25 liters of water at a temperature of about 50 ° C. and adjusted to pH 1.5. After stirring for 30 minutes, the diluted cake is filtered and the filtrate is combined with the previous filtrate, to form a mass of 42.3 liters.
The combined filtrate is treated with 6.76 kg of sodium chloride and extracted four times with butanol at 15% of the volume of the filtrate. The extracts are combined, clarified by filtration and concentrated in vacuo at 25-30 ° C to a final volume of 0 liters.
EXAMPLE B. -
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Chromatographic separation of chlorodemethyltetracycline and demethyltetracycline.
The butanol concentrate of Example A - is divided into two equal portions, one is concentrated to 900 cm3 and the other is concentrated to 610 cm3 under vacuum. The concentrates are filtered off and adjusted to pH 2 with 50% sodium hydroxide.
To prepare the solvent system used for the chromatographic separation, a mixture of 80% butanol and 20% chloroform is equilibrated with water adjusted to pH 2 by means of hydrochloric acid. The columns are 15 cm diameter glass columns packed with 2.8 kg of acid washed diatomaceous earth. The columns are equilibrated with the aqueous phase of the solvent system before use.
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The two concentrates are treated with butanol, on. separate columns. The concentrates are slowly poured into the top of the columns. The columns are then eluted with the solvent phase which is passed through at a rate of about 10 liters per hour. In each case, 40 slices of 500 cm3 are taken and the antibiotic content of each is determined by chromatography on a strip of paper. In the 900cc portion, slices 6 through 17 contain chlorodemethyltetracycline and chlorotetracycline, and slices 24 through 40 contain demethyltetracycline and tetracycline.
In the 610 cc pot, slices 7 to 18 contain chlorodemethyltetracycline and chlorotetracycline, and slices 19 to 31 contain demethyltetracycline and 1a. tetracycline.
EXAMPLE G. - Recovery of chlorodemethyltertrcycline from column fractions.
The fractions containing chlorodeme-thyltetracycline from Example B are combined to give a volume of about 12 liters. An equal amount of water is added, and the mixture is concentrated in vacuo to 1810 cm3 of aqueous solution. The pH of the concentrate is adjusted to 2.3-1.9 by adding hydrochloric acid. The acidified concentrate is washed twice with 180 cm3 of chloroform, filtered and concentrated in vacuo to a volume of 360 cm3. The pH of the concentrate is adjusted to between 1.2 and 2.8 with 50% sodium hydroxide.
The solution was dried by freezing to give 18.56 g of amorphous chlorodemethyltetracycline hydrochloride titrating 550 micrograms per mg.
EXAMPLE D. Recovery of demethyltetracycline from column fractions.
The slices of example B are combined which contain
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holds demethyltetracycline to obtain a volume of 14 liters. An equal volume of water is added and the mixture is concentrated in vacuo at 24 ° C. to a volume of 565 cc of aqueous solution. The pH of the concentrate is adjusted to 1.65 by adding concentrated hydrochloric acid, and the solution is washed twice with 55 cm 3 of chloroform. The washed solution is filtered and adjusted to pH 5.8 with 505 sodium hydroxide solution.
After aging for 3 hours at room temperature and 15 hours at 4 ° C., the crystalline slurry obtained is filtered and the product is washed with water and dried under vacuum at 40 ° C.
A yield of 4.7 g of crude neutral demethyltetracycline is obtained, assaying 880 micrograms per mg expressed as hydrochloride. tetracycline drate which represents an overall yield of 73% from the tart concentrate.
EXAMPLE E. Crystallization of chlorodemethyltetracycline hydrochloride with an acetone-ether mixture.
One takes the, 56 g of freeze-dried chlorodemethyltetracycline as in Example C, stirred in a mixture of 55 cn3 of acetone, 7.4 cm3 of water and 3.7 cm3 of concentrated hydrochloric acid. The solution was filtered and the solids rinsed twice with a total of 55 cm3 of acetone contained 1.85 cm3 of water. The filtrates are combined, the pH being 0.8, and treated with 55 cm3 of ether. The mixture is seeded, left to age for 18 hours at room temperature with constant agitation, and the crystals which form are removed by filtration.
The product is washed with a mixture of acetone, water and ether, then with acetone and finally with ether, and dried under vacuum at 40 C. A yield of 4 is obtained. , 74 g of hydrochloride
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chlorodemetlylt ± tracycli: the lens titrating 1090 micrograms per mag, which -represents HIM lende; uelU 'd! op (: ratloll of 50.0;,;. The product contains 11 de chlor8t'3tracrcliile.
(... "1C '.. J..-JJF, ¯ ¯ L, ristallisatii; du clil, riiv -dr de c] ilorodeinéthjrl.t4tracyclî, ie,' from a talazye butatzol-eel7¯orolve.- A 50.4 g portion of freeze-dried chlorodemethyltetracycline is taken, prepared as in
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Example G, and assaying 7fla3 micrograms per tztJ, oz1 dilutes it in 22.5 cm3 of cellosolve, and to the resulting solution is added a total of 205 cm3 of butanol. The pH is adjusted to 0.8 by adding 11 cm3 of concentrated hydrochloric acid and the mixture is allowed to age for 51 hours with stirring. The crystals obtained are removed by filtration, washed with a 90/10 mixture of butanol and cellosolve, then with chloroform and dried in vacuo.
We obtain a yield of
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3036 g of chlorodemethyltetracycline hydrochloride, assaying 1053. micrograms by a yield of 4; j *.
EXTMPLE G. - 4ecrystallization of cIl0r¯od6methyltetracyclil! .E so as to destroy chloro6etracirclin ;. -
1g of the chlorodemethyltetracycline prepared in Example E is taken, diluted in 3 cm3 of a mixture of 90% butanol and 10% cellosolve, and 3 cm3 of triethylamine is added thereto to adjust the pH to 10.4. The incomplete solution is allowed to stand at room temperature for 24 hours to destroy any chlorotetracycline which may be present, and at the end of this time, concentrated hydrochloric acid is added to lower the pH to 0.5, and the pH is reduced to 0.5. leash
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age the m'lau; for 4 hours with agitation.
Either filter the crystalline product, or wash it with a mixture of 90% butanol and 10% cellosolve followed by chloroform and
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che under vacuum at 40 C. A yield of 0.36 g of.
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c ". chlorodemethyltetracycline trihydrate, assaying 1228 micrograms per mg and containing approximately 2.5% of chlorotetracycline, which represents a yield of 40%
The following examples illustrate the conversion of antibiotics into various forms:
EXAMPLE H. - Chlorodemethyltetracycline broitihydrate.
1.0 g of chlorodemethyltetracycline-ammonium is dissolved in 20 cm3 of water and the solution is treated with 0.6 cm3 of 48% hydrobromic acid to adjust the pH to 1.6.
The mixture was allowed to age for 18 hours with stirring at room temperature and at the end of this time elongated needle crystals of chlorodemethyltetracycline hydrobromide were found. The product is filtered, washed with 6 cm3 of water adjusted to pH 2.2 with hydrobromic acid, and dried under vacuum for 5 hours at 44 ° C. A yield of 750 mg of hydrobromide is obtained. of chlorodemethyltetracycline.
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Analysis calculated for ClI12ZNC1Br0 $: 0 = 46.2; H = 1,, 1; N = 5.1; Ci = 6.5; Br = 14.6; 0 = 23.4.
Effective Analysis: 0 = 45.94; H = 4.44; N = 4.71; C1 = 6.78, 6.47; Br = 13.74; 0 (difference: 24.39; 24.70).
EXAMPLE I. Preparation of the ammonium salt of chlorodemethyltetracycline.
A 100 mg portion of the chlorodemethyltetracycline prepared in Example E is taken, dissolved in 0.5 cm3 of a mixture of 90; 3 of butanol and 10% cellosolve and ammonia gas is bubbled through the solution. until a thick solid appears. The slurry is diluted with a small amount of concentrated aqueous ammonia,
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leash; re'fiY0 \ -ge #! ' at room temperature for 5 hours and filtered. The product is washed with a 90% mixture of
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butanol and 10% cellosolve, then with acetone, and dried under vacuum.
A yield of 41.4 mg of chlorodemethyltetracycline ammonium salt is obtained, assaying 1148 micrograms per mg of chlorotetracycline hydrochloride (44% yield).
EXAMPLE J. -
Preparation of neutral chlorodemethyltetracycline. ':::
A 50 mg portion of the chlorodemethy1tetracycine obtained in Example E, titrating 1090 micrograms per mg, is taken, it is dissolved in 1.3 cm3 of dieàù and the solution is treated with dry sodium carbonate until pH 7-8 The amorphous precipitate obtained is removed by centrifugation and the clear settling liquid is adjusted to pH 5.4 and allowed to age 16 hours at ambient temperature.
The product is filtered, washed with water and dried under vacuum at 35 ° C. to obtain 21.9 mg of chlorodemethl. crystalline neutral tetracycline assaying 1250 micrograms per mg (yield 50%)
EXAMPLE K. Reduction of Chlorodemethyltetracycline to Demethyltetracycline. -
A 12.5 mg sample of crystalline chlorodemethyltetracycline hydrochloride is dissolved in water and a drop of triethylamine is added thereto.
The solution is mixed with 10 mg of 10% palladium on charcoal, and stirred under a hydrogen atmosphere for 20 minutes. The resulting solution is filtered to remove the catalyst. Ultraviolet spectra as well as paper chromatography indicate that dechlorination occurs to give demethyltetracycline.
As indicated above, salts of demethyltetracyclines can be formed by treatment with
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acids and bases. Hydrochloric acid is a preferred acid because the salts of this acid and of the demethyltetracyclines are very useful products. Special properties can be imparted by using other acids, such as sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, boric acid, and other organic and inorganic acids. Salts can be prepared with bases, using alkali hydroxides such as sodium hydroxide and alkaline earth hydroxides, as indicated above.
The calcium salt is particularly useful, and can be prepared by simply adjusting to pH 6-10 an aqueous solution of one of the demethyltetracyclines, with at least one molar equivalent of calcium in the solution. The salts of barium, magnesium, strontium [, etc ... can be prepared in a similar manner. Complexes of demethyltetracyclines are also formed with boron, zirconium and other polyvalent metal ions, as in the case of tetracyclines.
Obviously, if the fermentation medium does not contain chlorine and bromine, neither chlorodemethyltetracycline nor bromodemethyltetracycline can be formed. In such a case, the main antibiotic will be demethyltetracyclin. When the content of chloride ions is raised, particularly above 50 parts per million, significant amounts of chlorodeinethyltetracycline are formed, since 1 part of chloride ion can cause the formation of about 14 parts of chlorodemethyltetracycline. The amount of the latter antibiotic can be adjusted.
When preparing this antibiotic, it is preferable that the fermenta-. tion contains more than 50 parts per million of chloride ion, and this quantity can be increased up to 1000 parts per million or even more to have a maximum production
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of chlorodemethyltetracycline.
A small concentration of bromide ion in the fermentation medium, from about 10 parts per million to several%, tends to decrease the formation of chlorodemethyltetracycline, and the formation of demethyltetracycline is generally increased. When the fermentation medium contains less than about 50 parts per million of chloride ions, and more than about 50 parts per million of bromide ions, the
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formation of bromoderaethyltetracycline is favored; and with strains of S. aureofaciens which are good antibiotic processors, the obtained fermented liquor may contain bromotetracycline as the predominant antibiotic.
CLAIMS.-
1.- Process for the preparation of antibiotics of the demethyltetracycline group (comprising demethyltetra-
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cycline, chlorodemethyltetra'elyelin and "Efohiodemethylteracycline), and their epimers, in which an aqueous nutrient medium is fermented under aerobic conditions with a controlled content of chloride and / or bromide ions. , with a strain of s.aureofaciens producing demethylteracycline, the antibiotics are recovered if desired from the fermentation medium and, if desired, the pH of a concentrated solution is adjusted to obtain the epimers.