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RECHERCHE ET INDUSTRIE THERAPEUTIQUES, en abrégé "R.I.T.", résidant à GENVAL,
PREPARATION DE SUBSTANCES ANTIBIOTIQUES.
La présente invention, due à Messieurs Pierre De Somer, docteur en médecine et Paul Van Dijck, ingénieur des industries agricoles, est rela- tive à un procédé de préparation d'une substance antibiotique dénommée gri- séomycine.
La résistance des souches bactériennes aux antibiotiques connus va en croissant. C'est ainsi qu'on isole fréquemment dans les laboratoires de bactériologie des staphylocoques résistant à tous les antibiotiques em- ployés, comme l'auréomycine, la terramycine, la pénicilline et la streptomy- cine
On a découvert récemment deux nouveaux antibiotiques l'érythro- mycine et la magnamycine, qui inhibent principalement les microbes Gram-posi- tifs et les rickettsies, Leur spectre antibiotique est comparable à celui de la pénicilline. Ces deux antibiotiques présentent comme principal intérêt leur activité dans le cas de microbes devenus résistant aux autres antibio- tiques, surtout à la pénicilline.
Dans un vaste programme de sélection de streptomyces du sol, la demanderesse a pu isoler une substance appartenant au même groupe que l'éry- thromycine et le magnamycine, aussi bien par ses propriétés chimiques que par ses propriétés biologiques. Cette substance a été dénommée griséomycine, parce qu'elle provient d'un microorganisme de l'espèce des streptomyces du type Streptomyces Griseolus. La souche productrice est déposée à L'Université de Louvain, Département de Bactériologie, sous la référence Streptomyces 151.
Le mycélium de la souche submergé a une coloration neutre,sur la plupart des milieux de culture à base d'agar; après une incubation de quatre à cinq jours, la masse se couvre d'un mycélium aérien blanc et l'agar se co- lore de brun par la diffusion d'un pigment soluble. Après sporulation, la sur- face prend un aspect poudreux et une couleur légèrement blanchâtre, On trouve, à l'examen microscopique, un mycélium se divisant en conidies rondes ou ova- les ;il n'y a pas d'anthrospores.
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La souche se développe encore très bien à une température dépas- sant 30 Co @ ces conditions,on trouve seulement des formes bacillaires qui ne collent pas à la surface du milieu de culture et qui se désagrègent facilement. Le streptomyces en cause liquéfie la gélatine. En bouillon glu- cosé, le développement est maigre et le milieu s'acidifie légèrement. Comme source d'hydrates de carbone, la demanderesse a constaté que seuls., l'amidon et le glucose donnent de bons résultatso Le saccharose, le maltose et le lac- tose ne sont pas fermentes. Les nitrates sont transformés en nitrites. Le lait n'est pas caillé, mais légèrement peptonisé.
Les données qui précèdent n'ont pas permis à la demanderesse d'i- dentifier le streptomyces d'après Bergey's Manual. Les différences entre ce streptomyces et les streptomyces Erythreus et Halstedii, respectivement pro- ducteurs de l'érythromycine et de la magnamycine, sont nettes.
D'après le docteur De Vries du "Centraalbureau voor schimmelcul- tures te Baarn", le streptomyces en cause appartient au type Streptomyces Griseolus Waksman, malgré les différences suivantes :
1 / l'inversion de sucre est positive,
2 / le mycélium aérien n'est pas grisâtre, mais blanc, après cul- ture pendant dix jours sur un milieu agar-glucose et agar-amidon,
3 / Inaction'des diastases est bonne et non "fair", d'après la terminologie de Waksman,
4 / le tallus a une coloration moins prononcée sur agar-amidon,
5 / le tallus ne devient pas noir, mais brun-olive sur le milieu pomme de tare-glycérine,
6 / il ne se forme pas de mycélium aérien sur gélatine et "glucose broth".
La présente invention a pour but l'obtention, dans de bonnes con- ditions de rendement et de pureté, de la nouvelle substance antibiotique. A cet effet, dans le procédé selon l'invention, on cultive artificiellement des microorganismes de l'espèce des streptomyces capables de produire la griséo- mycine, notamment des streptomyces du type Streptomyces Griseolus, on sépare la griséomycine du bouillon de culture, de préférence par extraction dans un solvant organique non miscible à l'eau à un pH alcalin, suivie d'une réextrac- tion en milieu aqueux à un pH acide.
Dans une forme de réalisation avantageuse, pour l'extraction de la griséomycine, on ajoute au milieu de culture filtré, environ 1/10 de son volume d'un solvant organique non miscible à l'eau, tel que le chloroforme, l'éther, etc.009, le pH du mélange étant ensuite amené entre 8 à 10.
Dans une forme de réalisation particulière, le solvant organique contenant la griséomycine est additionné d'eaû acidulée jusqu'à un pH compris entre 1; 5 et 2,de préférence avec agitation, puis alcalinisé à un pH de 7,5 environ, le cycle des opérations étant éventuellement répété plusieurs fois, pour arriver au degré de pureté désiré.
La présente invention a encore pour objet la nouvelle substance dénommée griséomycine et qui peut être obtenue par le procédé mentionné ci- avant.
D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description, donnée ci-après à titre d'exemples non limitatifs, de di- vers modes de réalisation du procédé selon l'invention.
On produit la nouvelle substance antibiotique, dénommée griséomy- cine, par culture dans des conditions très artificielles, des microorganismes qui la produisent en inoculant un milieu convenable avec des spores de l'or- ganisme ou par culture submergée.
Des variations considérables sont possibles dans la composition du milieu de culture, surtout en ce qui concerne la présence des constituants
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organiques et minéraux.
On peut utiliser comme sourc.e d'azote l'une des nombreuses sour- ces déjà employées dans les laboratoires de microbiologie pour la culture de microorganismes;, par exemple les peptones, les extraits de viandes, les ex- traits de levures, des farines de maïs, de soya, d'arachide, de poisson, etc.... Certaines de ces sources s'avèrent particulièrement avantageuses; ce sont le lait battu, le mais germé, la farine de palme et les hydrolysats de levure,,
Comme hydrates de carbone, le glucose et l'amidon donnent seuls de sons résultats, dans la proportion de 10 à 50 grammes par litre du milieu de culture. La présence de ces hydrates de carbone n'est pas absolument né- cessaire pour arriver à une production, mais ils contribuent à l'augmentation du rendement.
Le microorganisme 151 ne semble pas avoir d'exigences spéciales en éléments minéraux pour la production de son antibiotique. Les sources d'hy- drates de carbone et de protéines,énumérées ci-dessus, contiennent suffisam- ment de ces éléments pour permettre une production optima de l'antibiotique.
Une teneur trop grande en métaux lourds (fer, cuivre, cobalt) nuit à la pro- duction.
Il est avantageux, mais pas absolument nécessaire d'ajouter une proportion de carbonate de calcium variant entre 2 et 10 grs par litre, afin de neutraliser les acides qui sont formés pendant la culture par la fermenta- tion des sucres.
Les milieux de culture suivants conviennent bien pour la produc- tion de la griséomycine. a) Farine de poisson 20 grs
Hydrolysat de levure 3 grs
Sulfate ammonique 2 grs
Chlorure de sodium 5 grs
Fécule de pommes de terre-20 grs
Huile de maïs 1cc
Phosphate acide de potassium 0,2 gr
Eau de la ville 1000cc.
Après 48 heures d'incubation à 26 C dans des flacons posés sur une table agitante, on obtient environ 220 microgrammes de griséomycine par ce. b) Hydrolysat de levure 3 grs
Chlorure de sodium 5 grs
Fécule de pomme de terre 15 grs
Farine d'arachides 10 grs
Extrait de viande vendu sous le nom "Liebig" n 2003 5 grs
Huile de maïs 1cc.
Eau de la ville lOOOcc.
Le pH est réglé à 6,8 avec de la soude à 30%.
Après 48 heures d'incubation à 26 C dans des flacons posés sur une table agitante, on obtient environ 280 microgrammes de griséomycine par ce. c) Hydrolysat de levure 3 grs
Sérum de lait 20 grs
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<tb> Farine <SEP> de <SEP> poisson <SEP> 3 <SEP> grs
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 30 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> gr <SEP> s <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> mais <SEP> 1cc.
<tb>
<tb>
<tb>
Eau. <SEP> de <SEP> la <SEP> ville <SEP> 1000cc
<tb>
Après la même incubation que celle indiquée précédemment,la pro- duction de mycélium est abondante et après 72 heures, la teneur en griséomy- sine s'élève à environ 450 microgrammes par ce.
Dans les exemples cités, l'eau de la ville peut être remplacée par de l'eau distillée
En utilisant les milieux-décrits ou d'un type équivalent, on peut produire la griséomycine en culture, soit immobile, soit immergée.On obtient les meilleurs résultats à une température comprise entre 24 et 28 C et en maintenant le pH de la culture entre 6 et 7. Cette dernière condition est réalisée ou bien en ajoutant du carbonate de calcium, comme il a été dit pré- cédemment, ou bien en neutralisant le milieu toutes les 24 heures au moyen de soude, de potasse, de carbonate de sodium ou d'une autre substance alca- line, qui ne nuit pas au développement du microorganisme.
Pour séparer la substance antibiotique du bouillon de culture et pour la purifier ultérieurement,on peut adopter le procédé selon la présente invention, dans lequel on procède à l'extraction par un solvant organique à un pH alcalin et à une réextraction dans l'eau à un pH acide. L'extraction se fait sur le filtrat du milieu de culture préalablement acidifié à un pH de 2 environ et éventuellement additionné d'un agent filtrant. On peut en principe se servir pour l'extraction de tous les solvants organiques non mis- cibles à l'eau, par exemple l'éther, le chloroforme,le benzène d'éthyle, le méthyl isobutylcétone, etc....
L'alcanisation du milieu se fait à un pH de 8 à 10 de préférence au moyen d'une solution alcaline à une concentration variant de 0,1 à 10 N.
On opère en présence d'un solvant organique pour éviter la destruction de la substance active. En effet, la griséomycine base est stable quand elle est dissoute dans un solvant organique, mais se détériore rapidement en mi- lieu aqueux. Il n'est pas nécessaire de dépasser un volume de solvant orga- nique égal à 1/10 du volume du milieu de culture à traiter.On décante le solvant riche en antibiotique et on procède à la réextraction en agitant le solvant décanté en présence d'un acide dilué.La griséomycine se concentre dans la phase aqueuse.
Après deux ou trois opérations similaires, on peut séparer un sol- vant riche en griséomycine et suffisamment pur pour donner soit, sous un pH alcalin, un précipité que l'on fait sécher,soit, sous un pH acide, du chlor- hydrate de griséomycine que l'on recueille en cristaux, après évaporation du solvant.
Les détails des différentes phases du procédé sont donnés dans les exemples suivants :
EMI4.2
EXEHPIE .1- On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante
EMI4.3
<tb> Bacto-peptone <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> n <SEP> 1011 <SEP> vendu
<tb> par <SEP> la <SEP> Compagnie <SEP> Liebig <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
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EMI5.1
<tb> Fécule <SEP> de <SEP> pommes <SEP> de <SEP> terre <SEP> 15 <SEP> grs
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 1cc.
<tb>
<tb> Eau <SEP> de <SEP> la <SEP> ville <SEP> 1000cc.
<tb>
On introduit 80cco de ce milieu dans des flacons de 300oc. et on stérilise 25 minutes à 120 C Après refroidissement, on inocule les flacons, soit avec une suspension de spores, obtenue dans un tube d'agar, soit avec un inoculum végétatif âgé de 24 heures et de même composition que le milieu de production,,
Les flacons sont alors secoués sur des tables agitantes, ayant un déplacement d'environ 25 mm. et tournant à 200 tours par minute, pendant une période de 48 heures à 26 C Après ce temps, on constate que le bouillon de fermentation présente une 'activité biologique de 240 microgrammes par ce. en- vers le bacillus subtilis, suivant la méthode de diffusion en gélose à partir de petits cylindres ("Cylinder-plate ASSAY method").
Le pH du bouillon est d'environ 6,8 à la fin de la fermentation.
Pour faciliter la filtration et pour bien dissoudre la substance active, on ajoute de l'acide chlorhydrique 1/2 N. pour régler'le pH à 2, on agite dans le liquide une petite quantité d'un agent filtrant, par exemple la matière vendue sous le nom de "clarcel DIC" et on filtre le mélange sur des filtres du type Buchner. Le pH du filtrat est ensuite amené à 8 et on ajoute 10cc. de chloroforme pour chaque 100cc. de filtrat.
On agite pendant 15 minutes à la température ambiante; après ce temps, on laisse reposer le mélange pour que les liquides se séparent. Le bouillon, qui est épuisé par le chloroforme, est jeté et on récupère la cou- che de chloroforme.
Par l'extraction,88% de la substance active sont passés dans le solvant organique. Ce dernier est évaporé sous vide jusqu'à siccité et on obtient une'substance brunâtre, résineuse. On ajoute alors trois fois, suc- cessivement, 1,5cc. d'eau distillée au résidu d'évaporation et on règle cha- que fois le pH à 2 avec de l'acide chlorhydrique dilué 1/2 N. Les fractions ainsi obtenues sont réunies, ce qui donne un liquide brunâtré contenant à peu près 60% de l'activité initiale.A ce liquide, on ajoute, goutte à gout- te,de la soude à 30% pour arriver à un pH de 7,5.
Par le changement de pH, il se forme un précipité abondant qui contient la substance active. Ce précipité est recueilli et séché sous vide; on obtient ainsi une poudre jaunâtre qui, à l'essai biologique indiqué ci- avant, donne une activité de 800 microgrammes par milligramme. La substance obtenue de cette façon présente une toxicité faible pour les souris.
EXEMPLE On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante s
EMI5.2
<tb> Farine <SEP> de <SEP> poisson <SEP> 20 <SEP> grs
<tb>
<tb> Levure <SEP> séchée <SEP> de <SEP> brasserie <SEP> 3 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> ammonique <SEP> 2 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 30 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> mais <SEP> lcco
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> de <SEP> la <SEP> ville <SEP> 1000cc.
<tb>
On règle le pH à 6,8 avec de la soude à 30% et on ajoute 4 grs de carbonate de calcium .
Dans des flacons de 300cco,on introduit 80 cc. du milieu préparé et on stérilise 25 minutes à 120 C. Après refroidissement, les flacons sont
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ensemencés avec 3% d'ion inoculum végétatif,, provenant d'une culture agitée pendant 24 retires à 26 C.
Le milieu que 1 *on utilise pour obtenir la culture de départ con- tient :
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<tb> Peptone <SEP> blanche <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb> Hydrolysat <SEP> de <SEP> levure <SEP> 3 <SEP> grs
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb> Fécule <SEP> de <SEP> pommes <SEP> de <SEP> terre <SEP> 15 <SEP> grs
<tb>
<tb> Eau <SEP> de <SEP> la <SEP> ville <SEP> 1000cc.
<tb>
On introduit 80cc. de ce dernier milieu dans des flacons de 380cc. et on stérilise comme indiqué pour le milieu de production.
Après 48 heures d'inoculation dans le milieu de production,à 26 C et en agitant comme dans l'exemple I, on trouve, au dosage biologique, une activité de 220 microgrammes par ce.
Le bouillon de fermentation est séparé des substances solides en suspension dans le milieu, par filtration après acidification préalable à l'a- cide sulfurique à 10%, pour amener le pH à 2. La filtration peut être faci- litée par l'addition d'un agent filtrant.
Le pH du bouillon clair est ensuite réglé à 8 environ et on ajou- te 10% en volume de benzol. Le bouillon et le solvant organique sont intime- ment mélangés par une agitation violente pendant 15 minutes environ. On peut répéter l'extraction décrite pour en augmenter l'efficacité.
Par la double extraction, il passe 80% de la substance active dans le benzol. Après séparation par centrifugation du solvant organique,on a- joute un volume d'eau distillée égal à 5% du volume du benzol et on acidifie avec de l'acide chlorhydrique 1/2 N jusqu'à un pH de 1,5. Après une violente agitation pendant 15 minutes, comme pour la première extraction, on récupère la phase aqueuse par centrifugation. On refait de la même façon une deuxième réextraction dans l'eau.
La griséomycine a passé alors dans la phase aqueuse à raison de 60% environ de la quantité initiale.On ajoute ensuite un volume de chloro- forme égal à 10% du volume d'eau, on ajuste le pH à 8 avec de la soude à 30%, on mélange intimement et on sépare le chloroforme par centrifugation. La gri- séomycine passe pour ainsi dire complètement dans le solvant organique; la perte due au dernier traitement est donc minime.
Ensuite, pour chaque 10cc. de chloroforme, on ajoute 1cc. d'eau distillée et on agite fortement,au moyen d'un agitateur mécanique, en acidi- fiant le mélange avec de l'acide chlorhydrique 12 N, jusqu'au moment où l'on arrive à un pH stable de 2.
On centrifuge le mélange pour séparer les deux phases. L'eau, qui contient beaucoup d'impuretés et peu de substance active,est jetée.On ré- pète encore deux fois le traitement, qui a pour but une purification et la transformation de la substance basique en chlorhydrate de griséomycine.
Le chloroforme contient à peu près 55% de l'activité initiale.
Il est évaporé sous vide jusqu'à complète siccité. On obtient de cette façon, un sel cristallin de griséomycine titrant 1000 microgrammes de griséomycine par milligramme de produit.
La griséomycine est une substance alcaline peu soluble dans l'eau (¯2 mg par ce.),mais très soluble dans beaucoup de solvants organiques, tels que le chloroforme, l'éthanol, le butanol, le benzol, l'acétone, l'acétate d'éthyle. La substance pure est blanche et a un goût amer. Elle cristallise en lames et fond, probablement avec décomposition, entre 76 et 80 C.
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En solution de 1% dans le chloroforme, elle a un pouvoir rotatoire o( 25 = + 52 . Son spectre infra-rouge dans le chloroforme présente une série de maxima à 3471, 2932, 2800,1748, 1700, 1649, 1641, 1461, 1384, 1363, 1276, 1167, 1113, 1097, 1077 982, 956, 944, 883, 835 cm-1.
Le chlorhydrate de griséomycine est très soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol et le chloroforme, peu soluble dans beaucoup d'autres solvants organiques. Ce sel fond à 120 Co Il est précipité de la solution aqueuse par l'acide picrique,les sels de Reinecke et les autres précipitants des alcaloïdes.
La stabilité de la griséomycine, contrairement à celle de l'éry- thromycine, est très bonne pour un pH de 2. Le produit est rapidement détruit en milieu alcalin et après chauffage à 100 C.
Le poids moléculaire de la griséomycine serait d'environ 530 et la formule brute du chlorhydrate serait de C25 H46 N1 O8 C11.
Il résulte de ce qui précède que la griséomycine a beaucoup de caractéristiques communes avec la magnamycine et l'érythromycine, notamment en ce qui concerne la solubilité dans l'eau et'les solvants organiques, le spectre infra-rouge, les activités biologiques, etc..., mais que les diffé- rences entre ces substances sont cependant nettes. C'est ainsi notamment que le point de fusion de la griséomycine est particulièrement bas et que son pouvoir rotatoire a une valeur très différente de celui des deux autres substances.
La comparaison des spectres antibiotiques résulte du tableau ci- après dans lequel la concentration minium inhibant complètement le développe- ment des microbes examinés est donnée pour la griséomycine, l'érythromycine et la magnamycine.
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Organismes <SEP> :Concentration <SEP> bactériostatique
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<tb> Organismes <SEP> minimum
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<tb> : <SEP> Erythro- <SEP> Magna- <SEP> : <SEP> Griséo-
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<tb> : <SEP> mycine <SEP> : <SEP> mycine <SEP> : <SEP> mycine
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<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> (var.aureus) <SEP> 0.75 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> :
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<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> (var.aureus)
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<tb> (résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> pénicilline) <SEP> - <SEP> - <SEP> 0.5
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<tb> Neisseria <SEP> (isolé <SEP> d'un <SEP> cas <SEP> clinique) <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 5
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<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 0.2 <SEP> 0.2 <SEP> s <SEP> 0.2
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<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus- <SEP> -. <SEP> 0. <SEP> 3
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<tb> Corynebacterium <SEP> pseudodiphteriae <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 2
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<tb> Corynebacterium <SEP> diphteriae <SEP> 0.2 <SEP> 0.2 <SEP> 0.2
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<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> :> <SEP> 1000 <SEP> > <SEP> 1000
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<tb> Bacillus <SEP> typhosus <SEP> 400 <SEP> >1000 <SEP> : <SEP> > <SEP> 1000
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<tb> Shigella <SEP> Flexner <SEP> 400 <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> : <SEP> > <SEP> 1000
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<tb> Shigella <SEP> dysenteriae <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> >1000
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<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 1.2 <SEP> : <SEP> 0.5 <SEP> : <SEP> 0.5
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<tb> Pseudo <SEP> anthrax <SEP> (isolé <SEP> d'un <SEP> cas <SEP> clinique) <SEP> 7- <SEP> 0. <SEP> 7 <SEP> 0. <SEP> 7
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<tb> organismes <SEP> Concentration <SEP> bactériostatique
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rgansme 1IlJJlJ.mum .. :Erythro- : Magna- Griséo- ; mycine : mycine : mycine l-fycobacteri-#'l tuberculosis (HRV37) - - 187 le02acterium lacticola 0 e.2 0.2 0.2 Hyccbacterium smegma 15 0.2 15 Candida albicans )1000 > 1000 ]I0p0
On peut en déduire que la griséomycine est active pour les mi- crobes Gram-positifs et pour les Neisseria. Les Gram-négatifs sont seule- ment inhibés par les très fortes doses. Les trois spectres montrent beaucoup de ressemblance.
L'érythromycine serait un peu plus active pour certains Gram-négatifs; elle exerce moins d'activité pour le bacille anthracoïde précité que la griséomycine.
Il existe, d'autre part, une résistance croisée entre l'érythro- mycine, la magnamycine et la griséomycine, en ce sens que des microbes deve- nus résistant à un de ces antibiotiques, sont également résistant aux deux autres. Ce phénomène dénote une action similaire dans le métabolisme micro- bien.
La griséomycine appartient donc au même groupe que l'érythromycine et la magnamycine, mais elle se distingue cependant nettement de ces deux antibiotiques.
Il doit être entendu-que l'invention nest nullement limitée aux modes de réalisation décrits et que bien des modifications peuvent être ap- portées à ceux-ci sans sortir du cadre du présent brevet. 11 n'est pas exclu, notamment qu'il existe d'autres souches de départ que celle décrite ci-a- vant.
REVENDICATIONS. le Procédé de préparation d'une substance antibiotique dénommée griséomycine, caractérisé en ce qu'on cultive artificiellement des microor- ganismes de l'espèce des streptomyces capables de produire la griséomycine, notamment des streptomyces du type Streptomyces Griseolus, on sépare la gri- séomycine du bouillon de culture, de préférence par extraction dans un sol- vant organique non miscible à l'eau à un pH alcalin, suivie d'une réextrac- tion en milieu aqueux à un pH acide.
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THERAPEUTIC RESEARCH AND INDUSTRY, abbreviated "R.I.T.", residing in GENVAL,
PREPARATION OF ANTIBIOTIC SUBSTANCES.
The present invention, due to Messrs Pierre De Somer, doctor of medicine and Paul Van Dijck, engineer of agricultural industries, relates to a process for preparing an antibiotic substance called griseomycin.
The resistance of bacterial strains to known antibiotics is increasing. For example, staphylococci resistant to all the antibiotics used, such as aureomycin, terramycin, penicillin and streptomycin, are frequently isolated in bacteriological laboratories.
Two new antibiotics have recently been discovered, erythromycin and magnamycin, which mainly inhibit Gram-positive microbes and rickettsiae. Their antibiotic spectrum is comparable to that of penicillin. The main advantage of these two antibiotics is their activity in the case of microbes which have become resistant to other antibiotics, especially penicillin.
In a vast soil streptomyces selection program, the Applicant was able to isolate a substance belonging to the same group as erythromycin and magnamycin, both by its chemical properties and by its biological properties. This substance was called griseomycin because it originates from a microorganism of the species of streptomyces of the type Streptomyces Griseolus. The producing strain is deposited at the University of Louvain, Department of Bacteriology, under the reference Streptomyces 151.
The mycelium of the submerged strain is neutral in color, on most agar-based culture media; after an incubation of four to five days, the mass becomes covered with a white aerial mycelium and the agar turns brown by diffusion of a soluble pigment. After sporulation, the surface takes on a powdery appearance and a slightly whitish color. On microscopic examination, a mycelium is found dividing into round or oval conidia; there are no anthrospores.
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The strain still grows very well at a temperature above these conditions, only bacillary forms are found which do not stick to the surface of the culture medium and which disintegrate easily. The streptomyces involved liquefies the gelatin. In a carbohydrate broth, development is poor and the medium becomes slightly acidic. As a source of carbohydrates, the Applicant has found that only starch and glucose give good results. Sucrose, maltose and lactose are not fermented. Nitrates are transformed into nitrites. The milk is not curdled, but slightly peptonized.
The above data did not allow the Applicant to identify streptomyces according to Bergey's Manual. The differences between this streptomyces and the streptomyces Erythreus and Halstedii, respectively producers of erythromycin and magnamycin, are clear.
According to Dr De Vries of the "Centraalbureau voor schimmelcul- tures te Baarn", the streptomyces in question belongs to the type Streptomyces Griseolus Waksman, despite the following differences:
1 / the sugar inversion is positive,
2 / the aerial mycelium is not greyish, but white, after culturing for ten days on an agar-glucose and agar-starch medium,
3 / Inaction of diastases is good and not "fair", according to Waksman's terminology,
4 / tallus has a less pronounced coloration on agar-starch,
5 / the tallus does not turn black, but olive-brown on the apple of tare-glycerin middle,
6 / aerial mycelium does not form on gelatin and "glucose broth".
The object of the present invention is to obtain, under good conditions of yield and purity, the new antibiotic substance. To this end, in the process according to the invention, microorganisms of the streptomyces species capable of producing griseomycin are artificially cultivated, in particular streptomyces of the Streptomyces Griseolus type, griseomycin is separated from the culture broth, preferably by extraction in an organic solvent immiscible with water at alkaline pH, followed by back-extraction in aqueous medium at acidic pH.
In an advantageous embodiment, for the extraction of griseomycin, approximately 1/10 of its volume of an organic solvent immiscible with water, such as chloroform, ether is added to the filtered culture medium. , etc.009, the pH of the mixture then being brought to between 8 and 10.
In a particular embodiment, the organic solvent containing the griseomycin is added with acidulated water to a pH of between 1; 5 and 2, preferably with stirring, then basified to a pH of approximately 7.5, the cycle of operations optionally being repeated several times, to achieve the desired degree of purity.
A further subject of the present invention is the novel substance called griseomycin and which can be obtained by the process mentioned above.
Other details and features of the invention will emerge from the description, given below by way of nonlimiting examples, of various embodiments of the process according to the invention.
The new antibiotic substance, called griseomycin, is produced by culturing, under very artificial conditions, the microorganisms which produce it by inoculating a suitable medium with spores of the organism or by submerged culture.
Considerable variations are possible in the composition of the culture medium, especially with regard to the presence of constituents
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organic and mineral.
One of the many sources already used in microbiological laboratories for the culture of microorganisms can be used as a nitrogen source, for example peptones, meat extracts, yeast extracts, corn, soy, peanut, fish, etc. flour. Some of these sources are particularly advantageous; these are beaten milk, germinated corn, palm flour and yeast hydrolysates,
As carbohydrates, glucose and starch alone give its results, in the proportion of 10 to 50 grams per liter of the culture medium. The presence of these carbohydrates is not absolutely necessary to achieve production, but they contribute to increasing yield.
Microorganism 151 does not appear to have special mineral requirements for the production of its antibiotic. The sources of carbohydrates and proteins, listed above, contain sufficient of these elements to allow optimum production of the antibiotic.
Too high a heavy metal content (iron, copper, cobalt) adversely affects production.
It is advantageous, but not absolutely necessary to add a proportion of calcium carbonate varying between 2 and 10 grams per liter, in order to neutralize the acids which are formed during cultivation by the fermentation of the sugars.
The following culture media are well suited for the production of griseomycin. a) Fish flour 20 grs
Yeast hydrolyzate 3 grs
Ammonic sulphate 2 grs
Sodium chloride 5 grs
Potato starch-20 grs
Corn oil 1tsp
Potassium acid phosphate 0.2 gr
City water 1000cc.
After 48 hours of incubation at 26 ° C. in flasks placed on a shaking table, approximately 220 micrograms of griseomycin are obtained by this. b) Yeast hydrolyzate 3 grs
Sodium chloride 5 grs
Potato starch 15 grs
Peanut flour 10 grs
Meat extract sold under the name "Liebig" n 2003 5 grs
Corn oil 1tsp.
City water lOOOcc.
The pH is adjusted to 6.8 with 30% sodium hydroxide.
After 48 hours of incubation at 26 ° C. in flasks placed on a shaking table, approximately 280 micrograms of griseomycin are obtained by this. c) Yeast hydrolyzate 3 grs
Milk serum 20 grs
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EMI4.1
<tb> Flour <SEP> of <SEP> fish <SEP> 3 <SEP> grs
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 30 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> gr <SEP> s <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Oil <SEP> of <SEP> but <SEP> 1cc.
<tb>
<tb>
<tb>
Water. <SEP> of <SEP> the <SEP> city <SEP> 1000cc
<tb>
After the same incubation as indicated above, the production of mycelium is abundant and after 72 hours the content of griseomysin amounts to about 450 micrograms per cc.
In the examples cited, city water can be replaced by distilled water
Using the media described or equivalent, griseomycin can be produced in culture, either immobile or submerged. Best results are obtained at a temperature between 24 and 28 C and maintaining the pH of the culture between 6 and 7. This last condition is achieved either by adding calcium carbonate, as has been said previously, or by neutralizing the medium every 24 hours by means of soda, potash, sodium carbonate or another alkaline substance, which does not interfere with the development of the microorganism.
In order to separate the antibiotic substance from the culture broth and to purify it further, the process according to the present invention can be adopted, in which extraction is carried out with an organic solvent at alkaline pH and re-extraction in water at an acidic pH. The extraction is carried out on the filtrate of the culture medium previously acidified to a pH of approximately 2 and optionally added with a filtering agent. In principle, it is possible to use for the extraction of all organic solvents which are not used with water, for example ether, chloroform, ethyl benzene, methyl isobutyl ketone, etc.
The alkalization of the medium is carried out at a pH of 8 to 10, preferably using an alkaline solution at a concentration varying from 0.1 to 10 N.
The operation is carried out in the presence of an organic solvent to avoid destruction of the active substance. This is because griseomycin base is stable when it is dissolved in an organic solvent, but deteriorates rapidly in aqueous medium. It is not necessary to exceed a volume of organic solvent equal to 1/10 of the volume of the culture medium to be treated. The solvent rich in antibiotic is decanted and the re-extraction is carried out by stirring the decanted solvent in the presence of 'a dilute acid. Griseomycin concentrates in the aqueous phase.
After two or three similar operations, a solvent rich in griseomycin and sufficiently pure to give either, under alkaline pH, a precipitate which is dried, or, under acidic pH, sodium hydrochloride. griseomycin which is collected in crystals after evaporation of the solvent.
The details of the different phases of the process are given in the following examples:
EMI4.2
EXHPIE .1- A culture medium is prepared having the following composition
EMI4.3
<tb> Bacto-peptone <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb> Extract <SEP> of <SEP> meat <SEP> n <SEP> 1011 <SEP> sold
<tb> by <SEP> the <SEP> Company <SEP> Liebig <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb> Extract <SEP> of <SEP> yeast <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb> Chloride <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<Desc / Clms Page number 5>
EMI5.1
<tb> Starch <SEP> from <SEP> apples <SEP> from <SEP> earth <SEP> 15 <SEP> grs
<tb>
<tb> <SEP> corn <SEP> oil <SEP> 1cc.
<tb>
<tb> Water <SEP> from <SEP> the <SEP> city <SEP> 1000cc.
<tb>
80cc of this medium is introduced into 300oc flasks. and sterilized for 25 minutes at 120 C. After cooling, the vials are inoculated, either with a suspension of spores, obtained in an agar tube, or with a vegetative inoculum aged 24 hours and of the same composition as the production medium, ,
The vials are then shaken on shaking tables, having a displacement of about 25 mm. and rotating at 200 rpm, for a period of 48 hours at 26 ° C. After this time, the fermentation broth was found to exhibit a biological activity of 240 micrograms per cc. towards the bacillus subtilis, according to the agar diffusion method from small cylinders ("Cylinder-plate ASSAY method").
The pH of the broth is around 6.8 at the end of fermentation.
To facilitate filtration and to dissolve the active substance well, 1/2 N hydrochloric acid is added to adjust the pH to 2, a small amount of a filter medium, for example material, is stirred in the liquid. sold under the name "clarcel DIC" and the mixture is filtered through filters of the Buchner type. The pH of the filtrate is then brought to 8 and 10 cc is added. of chloroform for every 100cc. of filtrate.
Stirred for 15 minutes at room temperature; after this time, the mixture is allowed to stand for the liquids to separate. The broth, which is depleted by chloroform, is discarded and the chloroform layer is collected.
By extraction, 88% of the active substance passed into the organic solvent. The latter is evaporated under vacuum to dryness and a brownish, resinous substance is obtained. Then added three times, successively, 1.5 cc. of distilled water to the evaporation residue and the pH is adjusted each time to 2 with dilute 1/2 N hydrochloric acid. The fractions thus obtained are combined, giving a brownish liquid containing about 60 % of the initial activity. To this liquid is added, drop by drop, sodium hydroxide at 30% to obtain a pH of 7.5.
By the change in pH, an abundant precipitate is formed which contains the active substance. This precipitate is collected and dried under vacuum; a yellowish powder is thus obtained which, in the biological test indicated above, gives an activity of 800 micrograms per milligram. The substance obtained in this way exhibits low toxicity to mice.
EXAMPLE A culture medium is prepared having the following composition s
EMI5.2
<tb> Flour <SEP> of <SEP> fish <SEP> 20 <SEP> grs
<tb>
<tb> Dried <SEP> yeast <SEP> from <SEP> brewery <SEP> 3 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> ammonium <SEP> 2 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Chloride <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 30 <SEP> grs
<tb>
<tb>
<tb> Oil <SEP> from <SEP> but <SEP> lcco
<tb>
<tb>
<tb> Water <SEP> from <SEP> the <SEP> city <SEP> 1000cc.
<tb>
The pH is adjusted to 6.8 with 30% sodium hydroxide and 4 grams of calcium carbonate are added.
In bottles of 300cco, we introduce 80 cc. of the prepared medium and sterilized for 25 minutes at 120 C. After cooling, the vials are
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seeded with 3% vegetative inoculum ion, obtained from shaken culture for 24 withdrawals at 26 C.
The medium which is used to obtain the starting culture contains:
EMI6.1
<tb> Peptone <SEP> white <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb> Hydrolyzate <SEP> of <SEP> yeast <SEP> 3 <SEP> grs
<tb>
<tb> Chloride <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> grs
<tb>
<tb> Starch <SEP> from <SEP> apples <SEP> from <SEP> earth <SEP> 15 <SEP> grs
<tb>
<tb> Water <SEP> from <SEP> the <SEP> city <SEP> 1000cc.
<tb>
We introduce 80cc. of the latter medium in 380cc flasks. and sterilized as indicated for the production medium.
After 48 hours of inoculation into the production medium, at 26 ° C. and with stirring as in Example I, the biological assay shows an activity of 220 micrograms per ec.
The fermentation broth is separated from the solid substances suspended in the medium, by filtration after prior acidification with 10% sulfuric acid, to bring the pH to 2. Filtration can be facilitated by the addition of 'a filtering agent.
The pH of the clear broth is then adjusted to about 8 and 10% by volume of benzol is added. The broth and the organic solvent are thoroughly mixed by vigorous stirring for about 15 minutes. The extraction described can be repeated to increase its efficiency.
By the double extraction, 80% of the active substance passes into the benzol. After separation by centrifugation of the organic solvent, a volume of distilled water equal to 5% of the volume of the benzol is added and the mixture is acidified with 1/2 N hydrochloric acid to a pH of 1.5. After vigorous stirring for 15 minutes, as for the first extraction, the aqueous phase is recovered by centrifugation. A second re-extraction in water is carried out in the same way.
The griseomycin has then passed into the aqueous phase at a rate of approximately 60% of the initial quantity. A volume of chloroform equal to 10% of the volume of water is then added, the pH is adjusted to 8 with sodium hydroxide. 30%, mixed thoroughly and the chloroform separated by centrifugation. The griseomycin passes almost completely into the organic solvent; the loss due to the last treatment is therefore minimal.
Then for each 10cc. of chloroform, 1cc is added. of distilled water and stirred vigorously with a mechanical stirrer, acidifying the mixture with 12 N hydrochloric acid, until a stable pH of 2 is reached.
The mixture is centrifuged to separate the two phases. The water, which contains a lot of impurities and little active substance, is discarded. The treatment is repeated twice more, with the aim of purifying and transforming the basic substance into griseomycin hydrochloride.
Chloroform contains approximately 55% of the initial activity.
It is evaporated under vacuum until it is completely dry. In this way, a crystalline salt of griseomycin is obtained, assaying 1000 micrograms of griseomycin per milligram of product.
Griseomycin is an alkaline substance sparingly soluble in water (¯2 mg per cc.), But very soluble in many organic solvents, such as chloroform, ethanol, butanol, benzol, acetone, l 'ethyl acetate. The pure substance is white and has a bitter taste. It crystallizes in plates and melts, probably with decomposition, between 76 and 80 C.
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In solution of 1% in chloroform, it has a rotary power o (25 = + 52. Its infrared spectrum in chloroform presents a series of maxima at 3471, 2932, 2800,1748, 1700, 1649, 1641, 1461 , 1384, 1363, 1276, 1167, 1113, 1097, 1077 982, 956, 944, 883, 835 cm-1.
Griseomycin hydrochloride is very soluble in water, methanol, ethanol and chloroform, sparingly soluble in many other organic solvents. This salt melts at 120 Co. It is precipitated from the aqueous solution by picric acid, Reinecke's salts and other alkaloid precipitants.
The stability of griseomycin, unlike that of erythromycin, is very good for a pH of 2. The product is quickly destroyed in an alkaline medium and after heating to 100 C.
The molecular weight of griseomycin would be about 530 and the molecular weight of the hydrochloride would be C25 H46 N1 O8 C11.
It follows from the above that griseomycin has many characteristics in common with magnamycin and erythromycin, in particular with regard to the solubility in water and organic solvents, the infra-red spectrum, the biological activities, etc. ..., but that the differences between these substances are nonetheless clear. It is thus in particular that the melting point of griseomycin is particularly low and that its optical rotation has a value very different from that of the other two substances.
The comparison of the antibiotic spectra results from the table below in which the minimum concentration completely inhibiting the development of the microbes examined is given for griseomycin, erythromycin and magnamycin.
EMI7.1
<tb>
Organisms <SEP>: Bacteriostatic <SEP> concentration
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Minimum <SEP> organizations
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>: <SEP> Erythro- <SEP> Magna- <SEP>: <SEP> Griséo-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>: <SEP> mycine <SEP>: <SEP> mycine <SEP>: <SEP> mycine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> @
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeroginosa <SEP>:> <SEP> 1000 <SEP>:> <SEP> 1000 <SEP>> <SEP> 1000 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> (var.aureus) <SEP> 0.75 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP>:
<SEP> 0.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> (var.aureus)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (resistant <SEP> to <SEP> <SEP> penicillin) <SEP> - <SEP> - <SEP> 0.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Neisseria <SEP> (isolated <SEP> from a <SEP> clinical <SEP> case) <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 0.2 <SEP> 0.2 <SEP> s <SEP> 0.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus- <SEP> -. <SEP> 0. <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Corynebacterium <SEP> pseudodiphteriae <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0. <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Corynebacterium <SEP> diphteriae <SEP> 0.2 <SEP> 0.2 <SEP> 0.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP>:> <SEP> 1000 <SEP>:
> <SEP> 1000 <SEP>> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP>> <SEP> 1000 <SEP>:> <SEP> 1000 <SEP>> <SEP> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> typhosus <SEP> 400 <SEP>> 1000 <SEP>: <SEP>> <SEP> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Shigella <SEP> Flexner <SEP> 400 <SEP>> <SEP> 1000 <SEP>: <SEP>> <SEP> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Shigella <SEP> dysenteriae <SEP>> <SEP> 1000 <SEP>> <SEP> 1000 <SEP>> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb> Brucella <SEP> abortus <SEP> 1000 <SEP> 200 <SEP>:> 1000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> mesentericus <SEP> 1.4 <SEP> 0.2 <SEP>: <SEP> 1.3
<tb>
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<tb> Bacillus <SEP> mycoides <SEP>: <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP>: <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP>: <SEP> 0.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> s <SEP> 0. <SEP> 2 <SEP> 0.2 <SEP>:
<SEP> 0.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 1.2 <SEP>: <SEP> 0.5 <SEP>: <SEP> 0.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudo <SEP> anthrax <SEP> (isolated <SEP> from a <SEP> clinical <SEP> case) <SEP> 7- <SEP> 0. <SEP> 7 <SEP> 0. <SEP> 7
<tb>
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EMI8.1
<tb> organisms <SEP> Bacteriostatic <SEP> concentration
<tb>
EMI8.2
rgansme 1IlJJlJ.mum ..: Erythro-: Magna- Griseo-; mycine: mycin: mycin l-fycobacteri - # 'l tuberculosis (HRV37) - - 187 le02acterium lacticola 0 e.2 0.2 0.2 Hyccbacterium smegma 15 0.2 15 Candida albicans) 1000> 1000] I0p0
It can be deduced from this that griseomycin is active for Gram-positive microbes and for Neisseria. Gram-negatives are only inhibited by very high doses. The three spectra show a lot of resemblance.
Erythromycin would be a little more active for some Gram-negative; it exerts less activity for the aforementioned anthracoid bacillus than griseomycin.
There is, on the other hand, cross resistance between erythromycin, magnamycin and griseomycin, in the sense that microbes which have become resistant to one of these antibiotics are also resistant to the other two. This phenomenon denotes a similar action in microbial metabolism.
Griseomycin therefore belongs to the same group as erythromycin and magnamycin, but it is however clearly distinguished from these two antibiotics.
It should be understood that the invention is in no way limited to the embodiments described and that many modifications can be made thereto without departing from the scope of the present patent. It is not excluded, in particular that there are other starting strains than that described above.
CLAIMS. the process for preparing an antibiotic substance called griseomycin, characterized in that microorganisms of the species of streptomyces capable of producing griseomycin, in particular streptomyces of the Streptomyces griseolus type, are artificially cultivated, the griseomycin is separated culture broth, preferably by extraction in a water-immiscible organic solvent at alkaline pH, followed by back-extraction in aqueous medium at acidic pH.