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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES DE PREPARATION D'ANTIBIOTIQUES.
L'invention a pour objet un procédé pour la préparation d'un anti- biotique, dénommé P.A. 86, par fermentation bactérienne et des méthodes pour récupérer l'antibiotique et pour concentrer et purifier celui-ci à partir de solutions brutes, y compris des bouillons de fermentation. L'invention vise donc la préparation du P.A. 86 à l'état brut ou purifié et à l'état cristal- lisé.
L'antibiotique est obtenu pendant la culture, dans des conditions réglées, d'une nouvelle souche formée à partir de l'espèce de micro-organismes dénommés Streptomyces rimosus. Cette nouvelle souche, isolée d'une terre pré- levée au sol, a été désignée par le nombre de culture 4622-21. Les souches dé- couvertes jusqu'ici du Streptomyces rimosus fournissent la Terramycine (mar- que de fabrique) comme indiqué dans la demande de brevet belge déposée le 28 avril 1950 au même nom et sous le titre "Perfectionnements apportés aux pro- cédés pour la préparation d'antibiotiques" et dans la littérature scientifi- que courante. La même espèce de Streptomyces fournit également l'antibioti- que P. A. 85 dont il est question dans la demande de brevet U.S.A. déposée le 26.6.1950 sous le n 170.478 au nom de Davisson et consort.
On a découvert maintenant que la souche particulière n 4622-21 de Streptomyces rimosus fournit, en plus des agents bactériens susdits, un an- tibiotique que 1 'on a dénommé P. A. 86. Les tableaux comparatifs; indiqués plus loin, montrent que la culture n 4622-21 ne correspond pas'exactement à la des- cription, donnée généralement, du S. rimosus. On a trouvé toutefois, par hasard, des colonies du S. rimosus connu dont l'aspect est différent, sous certains points de vue, de la culture initiale et des agents mutagéniques augmentant le nombre de ces colonies ainsi que leur degré de variabilité.
Pour ces rai- sons et comme ces cultures s'approchent tellement des souches de S. rimosus
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connu, en ce qui concerne ses caractéristiques essentielles, la souche n 4622-21 a été classée comme un genre de S. rimosus à sporulation faible.
Les indications données dans les tableaux ci-dessous'sont basées sur des con tatations faites avec six tubes ou plaques. Les couleurs, accompagnées de la lettre R, sont celles indiquées par Robert Ridgway dans son traité "Color St dards and Nomenclature" paru en 1912.
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Milieu <SEP> Culture
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<tb> N 4622-21 <SEP> Description <SEP> publiée <SEP> du <SEP> S. <SEP> rimor
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<tb> sont <SEP> essentiellement <SEP> semblables;
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<tb> N <SEP> 4622-21 <SEP> Description <SEP> publiée <SEP> du
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<tb> S. <SEP> rimosus
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<tb> Remarques <SEP> :
<SEP> bonne <SEP> liquéfaction,modérée
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<tb> pellicules <SEP> de <SEP> cou- <SEP> épaisses;
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<tb> leur <SEP> crème
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<tb> crème
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<tb> cun <SEP> tube <SEP> d'essai <SEP> plus <SEP> clai-
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Remarques <SEP> : <SEP> bonne <SEP> pas <SEP> d'hydrolyse <SEP> ou <SEP> pep-
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<tb> coagulation <SEP> en <SEP> 9 <SEP> tonisation; <SEP> pH <SEP> inchangé.
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<tb> jours <SEP> ; <SEP> pas <SEP> de <SEP> diges-
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<tb> tion <SEP> ; <SEP> pH <SEP> inchangé
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<tb> Glucose- <SEP> croissance <SEP> ; <SEP> bonne <SEP> ; <SEP> modérée <SEP> ; <SEP> surface <SEP> sèche
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<tb> agar <SEP> rimose <SEP> superficielle <SEP> et <SEP> craquelée.par <SEP> crois-
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<tb> sance <SEP> continuelle <SEP> des
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<tb> hyphes <SEP> végétatives;
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<tb> Sporulation:
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<tb> d'un <SEP> jaune <SEP> tilleul <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R)
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<tb> Pigment <SEP> soluble <SEP> : <SEP> brun <SEP> jaunâtre
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<tb> presque <SEP> cannelle <SEP> rosâ- <SEP> à <SEP> Saune <SEP> miel <SEP> (R).
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<tb> presque <SEP> jaune <SEP> miel <SEP> ve <SEP> ocreux <SEP> (R).
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L'antibiotique P.A.86 se distingue par ses propriétés bactériologiques et physiques des autres antibiotiques,connus, plus spécialement de la P.A.85 ou de la Terramycine produites en même temps. Il est très anti-fongi mais n' a qu'une activité réduite contre les bactéries en se distinguant ainsi net- tement, sur ce point, de la Terramycine qui est active contre les bactéries gram-négatives et gram-positives. Ses propriétés physiques sont nettement différentes du P.A.85.
L'activité de l'antibiotique P.A.86 peut être essayée par dif- férentes méthodes. Ainsi le Trichlophyton gypseum peut être utilisé comme mi- cro-organisme normalisé. L'activité d'un échantillon donné du P.A. 86 est' alors exprimée en unités de dilution (UDT) dans le Trichophyton gypseum. Cet- te unité est le volume maximum de la solution, exprimé en millilitres, dans laquelle 1 mgr de la préparation particulière de P.A.86 peut être dilué tout en comportant encore une culture normalisée de Trichophyton gypseum dans¯un bouillon de Babaroud, après une incubation de 72 heures à 28 . Une autre mé- thode d'essai se fait à l'aide d'une culture normalisée, le Saccharomyces cerevisiae, sur une plaque d'agar. L'activité du P.A.86 purifié est d'envi- ron 280 UDT/mg ou 8000 unités de levure/mg.
Le P.A.86 présente une activité élevée contre divers fongi, comme indiqué dans le tableau suivant. La préparation cristallisée, utilisée pour ces essais, est obtenue par la méthode décrite dans l'exemple II, donné ci- dessous. Elle a une activité d'environ 280 UDT/mg ou 8000 unités/mg pour l'es- sai à la levure.
Les essais sont faits sur de l'agar Mycophile avec une incu- bation à 28 pendant 12 jours.
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EMI6.1
<tb> Fongi <SEP> phatogéniques <SEP> Concentration <SEP> du <SEP> P.A.86
<tb>
<tb> (en <SEP> mcg/ml)
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------------------- ;------------------------------------------------- 7---- --
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<tb> Blastomyces <SEP> brasiliensis <SEP> +- <SEP> -
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<tb> Phialophora <SEP> verrucosâ <SEP> +- <SEP> -
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<tb>
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP> +- <SEP> -
<tb>
La nouvelle souche de Streptomyces rimosus peut être cultivée à peu près dans les mêmes conditions que celles indiquées dans la demande de brevet belge, citée en premier lieu. Des matières nutritives pour le milieu de fermentation comprennent de l'amidon, du sucrose, du glucose, de la farine de soja, de la farine d'arachides, la lactalbumine, des hydrolysats ou des produits de digestion de protéines telles que la caséine, des solubles de dis- tilleries, des extraits de levure et divers sels, le chlorure de sodium, des phosphates et plus particulièrement du nitrate de sodium.
Le milieu nécessite généralement la présence d'un agent tampon, tel que le carbonate de calcium, pour conserver le pH optimum. Des huiles peuvent être utilisées pour empêcher la formation de mousses, des silicones, de l'huile de saindoux, de l'huile de soja , etc. convenant très bien.
Il est préférable d'effectuer la fermentation dans des conditions submergées et aérobiques en agitant. L'aération doit se faire à une vitesse comprise entre environ 0,5 et 2 volumes d'air par volume du milieu liquide et par minute. L'agitation doit être suffisamment rapide pour que l'on évite 1' agglomération de cellules et pour obtenir une répartition uniforme de l'air dans le milieu. En général la fermentation se fait avec le plus de succès à une température d'environ 25 à 30 . La durée, pour laquelle on obtient une production maximum de P.A.86, varie naturellement avec les appareils utilisés, la nature du milieu et d'autres facteurs qui dépendent les uns des autres.
Toutefois, au moins environ deux jours et au plus environ une semaine corres- pondant à la période usuelle nécessaire pour obtenir les meilleurs résultats.
Pour effectuer la fermentation des conditions stériles doivent être conservées pendant tout le traitement. La croissance du micro-organisme débute générale- ment sur des lames d'agar. Des cellules ou des spores peuvent être transférés depuis les lames dans des flacons contenant un milieu nutritif liquide, ces flacons étant ensuite secoués jusqu'à ce qu'une croissance suffisante soit ob- tenue. Cette culture est transférée dans des vases d'incoulum aérés et munis d'agitateurs et de là dans la cuve de fermentation finale.
Il existe plusieurs méthodes particulièrement bonnes pour récupé- rer l'antibiotique à partir de bouillon de fermentation. Les bouillons ont une activité en P.A.86 d'environ 40 à environ 80 UDT/ml. Une méthode de récupération consiste à séparer le mycélium par filtration du bouillon, de préférence à un pH acide, avec l'aide d'un agent facilitant la filtration. Le bouillon est a-
<Desc/Clms Page number 7>
lors extrait avec du butanol. La séparation de la phase butanol, l'évaporation dans le vide jusqu'à un petit volume et le refroidissement donnent lieu à la formation de cristaux de l'antibiotique. Pendant la concentration du buta- nol il est à conseiller de conserver un peu d'eau dans la solution. Il en ré- sulte l'évaporation d'azéotrope butanol-eau.
Apparemment l'antibiotique a une solubilité plus grande dans le butanol humide que dans la matière anhydre.
Quand l'extrait est réduit à un volume assez convenable l'addition de l'eau peut être interrompue et l'antibiotique se sépare du butanol sec.
Les cristaux du P.A.86 se présentent généralement sous la forme de petites plaques mais ils peuvent se présenter autrement, par.exemple à l'état d'aiguilles. Sans la recristallisation leur activité donné généralement à 1' essai environ 250 UDT/mg. Ils ont une solubilité modérée dans le méthanol et peuvent être recristallisés par addition d'eau à une solution de méthanol.
Des cristaux fortement purifiés donnent, à l'essai, une activité d'environ 280 UDT/mg ou 8000 unités de levure/ mg. Après que les cristaux ont été enle- vés, le liquide résiduel peut être évaporé davantage pour obtenir une quanti- té plus grande d'antibiotique, qui a généralement une activité un peu moindre.
La stabilité du P.A.86 est suffisante pour qu'il puisse être uti- lisé avantageusement comme agent thérapeutique mais il ne doit pas être con- servé trop longtemps, plus particulièrement dans les bouillons de fermentation usuels. Pour cette raison,il est à conseiller de l'extraire à un pH approxi- mativement neutre ou légèrement basique. Bien que le butanol ait été indiqué comme un agent d'extraction convenable, d'autres solvants non-miscibles à 1' eau et du type alcool, tels que l'alcool benzylique ou amylique, peuvent être utilisés.
Le P.A.86 purifié a une solubilité réduite dans l'eau et dans di- vers solvants organiques, tels que des alcools, des éthers, des cétones, etc.
Comme indiqué plus haut, des mélanges d'alcools et d'eau dissolvent une quan- tité plus grande du composé que les solvants anhydres. Les cristaux obtenus comme indiqué plus haut peuvent être aisément recristallisés par dissolution dans de l'acétone chaud contenant 50 % d'eau. La solubilité n'est pas élevée et d'environ 1 gr dans 300 ml du solvant. En concentrant la solution, on ob- tient la séparation de fines aiguilles blanches de P.A.86. A l'essai cette matière donne environ 8000 unités de levuer par mg ou 280 UDT/mg. Le P.A.86, après séchage à 56 pendant deux heures sous vide, donne à 1-'analyse élémen- taire les résultats suivants : Carbone = 60,3 %; hydrogène = 8,30 %; azote = 3,41 %; oxygène (par différence) = 27,99 %. Il ne parait pas contenir du soufre, de l'halogène ou du phosphore.
Le composé présente quatre maxima dans la région ultra-violette du spectre, respectivement à 279, 291, 304 et 318 millimicrons. Cette déter- mination est faite à l'aide d'une solution contenant 5 mg de la matière cris- tallisée dans 600 ml de méthanol à 80 %. Les cristaux de P.A.86 ne paraissent pas avoir un pouvoir rotatoire quand ils sont dissous dans les solvants or- dinaires. Ils se décomposent quand ils sont chauffés dans un tube capillaire à environ 230 - 235 . Il se produit une légère décoloration jusqu'à ce que cette température .soit atteinte.
Un gâchis du P.A. 86 cristallisé dans une huile minérale présente plusieurs bandes d'absorption caractéristiques dans l'infrarouge. Parmi ces bandes on peut citer les fréquences suivants (en cm-1) 1725, 1708, 1630, 1605, 1580, 1347, 1266, 1228, 1196, 1112, 1083, 1070, 1047, 1003, 933, 890, 862, 850, 822, 803 et 785. Le spectre d'absorption dans l'infrarouge de ce gâchis dans l'huile minérale pour les longueurs d'ondes caractéristiques com- prises entre 1350 et 625 cm-1, est montré sur le schéma de la figure unique ci-annexée.
Les exemples ci-dessous sont donnés à titre illustratif mais nul- lement restrictif ou limitatif en ce sens qu'ils ne doivent pas être considé-
<Desc/Clms Page number 8>
rés comme étant les seules manières convenant à la mise en oeuvre de l'inven- tion.
EXEMPLE 1
Un milieu de fermentation est préparé à l'aide des ingrédients suivants :
EMI8.1
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb> cerelose <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb> solubles <SEP> de <SEP> distillation <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
<tb> eau <SEP> distilles <SEP> jusqu'à <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Le pH du mélange est réglé à 7 avec de la potasse caustique et on ajoute 1 g de carbonate de calcium par litre. Des portions de 500 ml du milieu sont in- troduitps dans les flacons de Fernbach qui sont alors stérilisés à 121 pen- dant 30 minutes. Les flacons sont refroidis et inoculés avec une suspension d'une souche n 4622-21 du So rimosus obtenue à la surface de lames d'agar nu- tritif. Les flacons sont chauffés pendant quatre jours à 28 dans un secoueur rotatif. A la fin de cette période le bouillon contient une quantité de P.A.
86 correspondant à 50 DDT/ml. Le mycélium est séparé du bouillon, à un pH = 2, par filtration à l'aide d'un agent facilitant la filtration.
EXEMPLE II
L'ensemble du bouillon de fermentation obtenu selon l'exemple I, est utilisé pour inoculer une cuve de fermentation, du type à submersion, de 75 litres. Le milieu de fermentation est préparé comme dans l'exemple I. Après réglage du pH, de l'huile de soja est ajoutée pour empêcher la formation de mousse. Le mélange stérilisé est agité rapidement et est aéré avec de l'air stérile à une vitesse d'environ 1 volume par volume du mélange de fermenta- tion par minute. Après quatre jours le bouillon de fermentation est récolté.
Le filtrat acide est réglé à un pH = 7,8. Une portion de 25 litres de ce bouillon filtré est extraite avec deux portions à 8 litres de butanol. Le cas échéant,des émulsions sont obtenues à cette phase. Elles peuvent être sépa- rées en faisant le mélange dans un séparateur centrifuge, du type écrémeuse ou un appareil similaire. L'extrait au butanol est séparé et évaporé sous vide.
De l'eau est ajoutée à des fréquents intervalles au butanol. L'évaporation est interrompue quand le volume est réduit à 2.000 ml. L'extrait au butanol anhydre est conservé pendant une nuit dans un réfrigérateur. On obtient un précipité pesant 4,65 g et il donne à l'essai environ 200 UDT/ mg. En évapo- rant davantage le butanol jusqu'à obtenir un volume total de 550 ml, on ob- tient un rendement plus élevé de 1,7 g du précipité. Le produit solide est dissous dans 1000 ml de méthanol par chauffage, la solution chaude est fil- trée et 300 ml d'eau ajoutés. La solution est évaporée par chauffage jusqu'à ce que la plus grande partie du méthanol ait été séparée. Une masse solide et amorphe commence à se séparer. Cette masse se transforme bientôt en des rosettes de petits cristaux. Le volume final de la solution est de 175 ml.
La suspension de cristaux est laissée au repos, pendant la nuit, dans un ré- frigérateur et le produit est ensuite filtré. Cette matière, qui pèse 900 mg, donne à l'essai une activité de 280 UDT/mg en P.A. 86.
EXEMPLE III
Une charge de 15 litres d'un bouillon de fermentation clarifié de P.A.86 donnant à l'essai 40 UDT/m1, est extraite deux fois avec quatre portions d'un litre de butanol, la phase aqueuse ayant un pH d'environ 9. 'Les extraits au butanol sont mélangés et évaporés avec addition d'eau. Le concen- trat,ayant un volume d'un litre, est conservé pendant la nuit dans un réfri- gérateur. On obtient des cristaux, en forme d'aiguilles, par filtration et sé-
<Desc/Clms Page number 9>
chage. Ils pèsent 3,8 g et donnent à cessai 250 UDT/ mgo Quand cette matière est recristallisée hors du méthanol à 80%,on obtient un produit dont l'ana- lyse donne des résultats très voisins de ceux indiqués plus haut pour la ma- tière fortement purifiée.
EXEMPLE IV
Une charge de 24 litres d'un bouillon de fermentation clarifié de P.A. 86 est extraite deux foisà un pH = 7,7, avec six portions d'un li- tre de butanol. Les extraits au butanol sont mélangés et concentrés en présence d'eau à 175 mlo La solution est conservée, pendant la nuit, dans un ré- frigérateur et donne un produit pesant 6,6 g avec une activité de 200 DDT/mg.
Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède,1-'invention ne se limite aucunement à celui de ses modes d'applica- tion non plus qu'à ceux des modes de réalisation de ses diverses parties, ayant plus spécialement été indiqués; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de préparation d'un antibiotique, dénommé P.A. 86, dans lequel on,cultive une souche n 4622021 du Streptomyces rimosus dans un milieu aqueux contenant un nutritif, dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'une activité anti-bactérienne substantielle, soit procurée audit milieu.
<Desc / Clms Page number 1>
IMPROVEMENTS MADE TO ANTIBIOTIC PREPARATION PROCESSES.
The invention relates to a process for the preparation of an antibiotic, called PA 86, by bacterial fermentation and to methods for recovering the antibiotic and for concentrating and purifying the latter from crude solutions, including fermentation broths. The invention therefore relates to the preparation of P.A. 86 in the crude or purified state and in the crystallized state.
The antibiotic is obtained during the cultivation, under controlled conditions, of a new strain formed from the species of microorganisms called Streptomyces rimosus. This new strain, isolated from soil taken from the ground, was designated by the crop number 4622-21. The strains discovered hitherto of Streptomyces rimosus provide Terramycin (trade mark) as indicated in the Belgian patent application filed on April 28, 1950 under the same name and under the title "Improvements in processes for preparation of antibiotics "and in the current scientific literature. The same species of Streptomyces also provides the antibiotic P. A. 85 referred to in U.S. patent application filed June 26, 1950 under No. 170,478 in the name of Davisson et al.
It has now been found that the particular strain No. 4622-21 of Streptomyces rimosus provides, in addition to the above bacterial agents, an antibiotic which has been referred to as P. A. 86. Comparative Tables; reported below, show that culture No. 4622-21 does not correspond exactly to the generally-given description of S. rimosus. However, colonies of the known S. rimosus were found, by chance, which in some respects differed in appearance from the initial culture and mutagenic agents increased the number of these colonies as well as their degree of variability.
For these reasons and as these cultures are so similar to the strains of S. rimosus
<Desc / Clms Page number 2>
Known, with regard to its essential characteristics, strain No. 4622-21 has been classified as a low-sporulating genus of S. rimosus.
The indications given in the tables below are based on conditions made with six tubes or plates. The colors, accompanied by the letter R, are those indicated by Robert Ridgway in his treatise "Color St dards and Nomenclature" published in 1912.
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Medium <SEP> Culture
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<tb> sporulated <SEP> at <SEP> colonial <SEP> (R) <SEP> at <SEP> edge;
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<tb> and <SEP> moderately <SEP> nes, <SEP> 0.6-0.7 <SEP> x0.8-1.4 / u;
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<SEP> short <SEP> and <SEP> cylindrical <SEP> spores;
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<tb> formed <SEP> by <SEP> of
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<tb> conidia <SEP> cylin-
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<tb> Medium <SEP> Culture
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The activity of the antibiotic P.A.86 can be tested by various methods. Thus, Trichlophyton gypseum can be used as a standardized microorganism. The activity of a given sample of P.A. 86 is then expressed in dilution units (UDT) in Trichophyton gypseum. This unit is the maximum volume of the solution, expressed in milliliters, in which 1 mgr of the particular preparation of PA86 can be diluted while still including a standardized culture of Trichophyton gypseum in Babaroud broth, after incubation. from 72 hours to 28. Another test method is done using a standard culture, Saccharomyces cerevisiae, on an agar plate. The activity of the purified P.A.86 is approximately 280 TDU / mg or 8000 yeast units / mg.
P.A.86 shows high activity against various fungi, as shown in the following table. The crystallized preparation, used for these tests, is obtained by the method described in Example II, given below. It has an activity of about 280 TDU / mg or 8000 units / mg for the yeast test.
The tests are carried out on Mycophilic agar with an incubation at 28 for 12 days.
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The new strain of Streptomyces rimosus can be cultivated under roughly the same conditions as those indicated in the Belgian patent application cited first. Nutrients for the fermentation medium include starch, sucrose, glucose, soybean flour, peanut flour, lactalbumin, hydrolysates, or protein digestion products such as casein, distilleries solubles, yeast extracts and various salts, sodium chloride, phosphates and more particularly sodium nitrate.
The medium generally requires the presence of a buffering agent, such as calcium carbonate, to maintain the optimum pH. Oils can be used to prevent the formation of foams, silicones, lard oil, soybean oil, etc. fitting very well.
It is preferable to carry out the fermentation under submerged and aerobic conditions with stirring. The aeration should take place at a speed of between approximately 0.5 and 2 volumes of air per volume of the liquid medium and per minute. The stirring should be fast enough to prevent cell agglomeration and to achieve a uniform distribution of air in the medium. In general, fermentation is most successful at a temperature of around 25 to 30. The duration, for which a maximum production of P.A.86 is obtained, naturally varies with the devices used, the nature of the environment and other factors which depend on each other.
However, at least about two days and at most about one week correspond to the usual period necessary to obtain the best results.
To carry out fermentation sterile conditions must be maintained throughout the processing. Growth of the microorganism usually begins on agar slides. Cells or spores can be transferred from the slides to vials containing liquid nutrient medium, which vials are then shaken until sufficient growth is obtained. This culture is transferred to aerated incoulum vessels fitted with agitators and from there to the final fermentation tank.
There are several particularly good methods of recovering the antibiotic from fermentation broth. The broths have a P.A.86 activity of about 40 to about 80 TDU / ml. One method of recovery is to separate the mycelium by filtration from the broth, preferably at acidic pH, with the help of a filtration aid. The broth is a-
<Desc / Clms Page number 7>
then extracted with butanol. Separation of the butanol phase, evaporation in a vacuum to a small volume and cooling results in the formation of crystals of the antibiotic. During the concentration of butanol it is advisable to keep a little water in the solution. This results in the evaporation of the butanol-water azeotrope.
Apparently the antibiotic has a greater solubility in wet butanol than in anhydrous material.
When the extract is reduced to a sufficiently suitable volume the addition of water can be discontinued and the antibiotic separates from the dry butanol.
The crystals of P.A.86 are generally in the form of small plates but they can be presented in other ways, for example as needles. Without recrystallization their activity generally gives in the test about 250 TDU / mg. They have moderate solubility in methanol and can be recrystallized by adding water to a solution of methanol.
Highly purified crystals give, when tested, an activity of about 280 TDU / mg or 8000 yeast units / mg. After the crystals have been removed, the residual liquid can be evaporated further to obtain a greater amount of antibiotic, which generally has somewhat less activity.
The stability of P.A.86 is sufficient for it to be usefully used as a therapeutic agent, but it should not be stored too long, more particularly in usual fermentation broths. For this reason, it is advisable to extract it at an approximately neutral or slightly basic pH. Although butanol has been indicated as a suitable extractant, other water-immiscible and alcohol-type solvents, such as benzyl or amyl alcohol, can be used.
Purified P.A.86 has reduced solubility in water and in various organic solvents, such as alcohols, ethers, ketones, etc.
As indicated above, mixtures of alcohols and water dissolve a greater amount of the compound than anhydrous solvents. The crystals obtained as indicated above can be easily recrystallized by dissolving in hot acetone containing 50% water. The solubility is not high and about 1 g in 300 ml of the solvent. Concentrating the solution results in the separation of fine white needles of P.A.86. When tested, this material gives about 8000 levuer units per mg or 280 TDU / mg. P.A.86, after drying at 56 for two hours in vacuo, gave the following basic analysis on basic analysis: Carbon = 60.3%; hydrogen = 8.30%; nitrogen = 3.41%; oxygen (by difference) = 27.99%. It does not appear to contain sulfur, halogen or phosphorus.
The compound exhibits four maxima in the ultra-violet region of the spectrum, at 279, 291, 304 and 318 millimicrons, respectively. This determination is made using a solution containing 5 mg of the crystallized material in 600 ml of 80% methanol. Crystals of P.A.86 do not appear to have rotatory power when dissolved in ordinary solvents. They break down when heated in a capillary tube to around 230 - 235. Slight discoloration occurs until this temperature is reached.
A mess of P.A. 86 crystallized in mineral oil exhibits several characteristic absorption bands in the infrared. Among these bands we can cite the following frequencies (in cm-1) 1725, 1708, 1630, 1605, 1580, 1347, 1266, 1228, 1196, 1112, 1083, 1070, 1047, 1003, 933, 890, 862, 850 , 822, 803 and 785. The infrared absorption spectrum of this waste in mineral oil for characteristic wavelengths between 1350 and 625 cm-1, is shown in the diagram of figure single attached.
The examples below are given by way of illustration but are in no way restrictive or limiting in the sense that they should not be considered.
<Desc / Clms Page number 8>
res as being the only manners suitable for practicing the invention.
EXAMPLE 1
A fermentation medium is prepared using the following ingredients:
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The pH of the mixture is adjusted to 7 with caustic potash and 1 g of calcium carbonate is added per liter. 500 ml portions of the medium are introduced into the Fernbach flasks which are then sterilized at 121 for 30 minutes. The flasks are cooled and inoculated with a suspension of a strain No. 4622-21 of So rimosus obtained on the surface of nutritional agar slides. The vials are heated for four days at 28 in a rotary shaker. At the end of this period the broth contains a quantity of P.A.
86 corresponding to 50 DDT / ml. The mycelium is separated from the broth, at a pH = 2, by filtration using an agent which facilitates the filtration.
EXAMPLE II
The whole of the fermentation broth obtained according to Example I is used to inoculate a fermentation tank, of the submersion type, of 75 liters. The fermentation medium is prepared as in Example I. After adjusting the pH, soybean oil is added to prevent foaming. The sterilized mixture is stirred rapidly and is aerated with sterile air at a rate of about 1 volume per volume of fermentation mixture per minute. After four days the fermentation broth is harvested.
The acidic filtrate is adjusted to a pH = 7.8. A 25-liter portion of this filtered broth is extracted with two 8-liter portions of butanol. Where appropriate, emulsions are obtained in this phase. They can be separated by mixing in a centrifugal separator, skimmer type or similar apparatus. The butanol extract is separated and evaporated in vacuo.
Water is added at frequent intervals to the butanol. Evaporation is stopped when the volume is reduced to 2,000 ml. The anhydrous butanol extract is stored overnight in a refrigerator. A precipitate weighing 4.65 g is obtained and gives on the test about 200 TDU / mg. By further evaporating the butanol to a total volume of 550 ml, a higher yield of 1.7 g of the precipitate is obtained. The solid product is dissolved in 1000 ml of methanol by heating, the hot solution is filtered and 300 ml of water added. The solution is evaporated by heating until most of the methanol has been separated. A solid, amorphous mass begins to separate. This mass soon turns into rosettes of small crystals. The final volume of the solution is 175 ml.
The crystal suspension is left to stand overnight in a refrigerator and the product is then filtered. This material, which weighs 900 mg, gives in the test an activity of 280 TDU / mg in P.A. 86.
EXAMPLE III
A 15 liter charge of a clarified fermentation broth of PA86 giving the test 40 UDT / ml, is extracted twice with four one liter portions of butanol, the aqueous phase having a pH of about 9. 'The butanol extracts are mixed and evaporated with the addition of water. The concentrate, having a volume of one liter, is stored overnight in a refrigerator. Needle-shaped crystals are obtained by filtration and separation.
<Desc / Clms Page number 9>
chage. They weigh 3.8 g and give at least 250 UDT / mgo When this material is recrystallized from 80% methanol, a product is obtained, the analysis of which gives results very close to those indicated above for the substance. highly purified.
EXAMPLE IV
A 24 liter charge of a clarified P.A. 86 fermentation broth is extracted twice at pH = 7.7, along with six one liter portions of butanol. The butanol extracts are mixed and concentrated in the presence of water to 175 ml. The solution is stored overnight in a refrigerator and gives a product weighing 6.6 g with an activity of 200 DDT / mg.
As goes without saying and as it follows moreover already from the foregoing, the invention is in no way limited to that of its modes of application or to those of the embodiments of its various parts. , having more especially been indicated; on the contrary, it embraces all the variants.
CLAIMS.
1. A process for the preparation of an antibiotic, designated PA 86, in which a strain No. 4622021 of Streptomyces rimosus is cultivated in an aqueous medium containing a nutrient, under aerobic conditions until a substantial anti-bacterial activity. , or provided to said environment.