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La présente invention a pour objet un procédé de préparation et d'obtention d'un antibiotique nouveau tiré des streptomycètes, doué de proprié- tés bactériostatiques et fongistatiques. Il se trouve dans le bouillon de cultu- re, ainsi qu'en petites quantités dans le mycélium d'un nouveau streptomycète , et la demanderesse l'a dénommé phyllomycine, en raison de son efficacité contre les moisissures pathogènes des végétaux.
Le streptomycète isolé de la vase des rivières, qui a reçu le nom de Streptomyces umbrosus et qui a été déposé sous cette dénomination au "Cen- tralbureau voor Schimmelkultures" à Baarn (Pays Bas), n'est identique à aucun des streptomycètes connus.
D'après l'ouvrage intitulé "Actynomycetes and their Antibiotics", de S.A. Waksman et H.A. Lechevalier, page 66, il est comme type chromogène, analogue au Streptomyces viridoflavus, un pigment soluble dans tous les mi- lieux organiques, mais s'en distingue cependant par des caractères distinctifs essentiels. D'après les méthodes de diagnose de W. Lindenbein (Archiv für Mikrobiologie, 17, 361-381 (1952 , les caractéristiques de cette nouvelle espè- ce sont celles réunies dans le Tableau 1 ci-après
Tableau 1.
Propriétés des cultures de Streptomyces umbrosus.
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Tableau 1.
(suite) Propriété des cultures de Streptomyces umbrosus
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On peut cultiver le Streptomyces umbrosus, avec formation du pro- duit actif, sur des solutions nutritives, par exemple avec de la glycérine ou de l'extrait de malt comme source de carbone, de la peptone, de l'eau de macéra- tion du mais, de la levure de brasserie, ou de l'hydrolysat de caséine comme source d'azote, avec addition de sels minéraux, comme par exemple de chlorure de sodium,
de phosphate acide dipotassique, de sulfate ferreux et de sulfate de magnésium. En outre, le milieu de culture doit renfermer les traces d'élé- ments essentiels, qui se trouvent habituellement dans l'eau de ville, ainsi que dans les additifs naturels des milieux de culture, par exemple la levure de bras- serie. Avant l'ensemencement, le pH de la solution nutritive doit être compris entre 6,5 et 7,5. La demanderesse a observé que dans presque tous les essais sur les cultures, le milieu devient au début lentement acide. Comparativement aux autres substances actives, la formation de l'antibiotique se fait très tôt, et atteint déjà son maximum au bout de trois jours de culture. De petites quan- tités de phyllomycine se forment dans le ballon à secousses; ou bien dans la culture superficielle.
Pour préparer des quantités plus importantes de l'anti- biotique, on donne la préférence à la culture aérobie agitée et immergée. Pour arriver à un accroissement aussi rapide que possible, et à une durée de fermen- tation de ce fait plus courte, on ensemence toujours abondamment avec une sus- pension de spores fraîchement préparée, ou bien avec une culture préalable sub- mergée correspondante. On cultive le Stceptomyces umbrosus à une température com- prise entre 26 et .32 , et de préférence à 29 .
La préparation des substances
<Desc/Clms Page number 3>
actives n'est cependant pas limitée à l'application du Streptomyces umbrosus, mais elle comprend aussi des mutations de cette souche, que l'on obtient par l'action d'agents de mutation, par exemple de rayons ultra-violets, de rayons de Roentgen et de substances chimiques. -
On détermine la concentration de l'antibiotique dans les filtrats et extraits de culture à l'aide de la Rhodotorula flava CBS 331 à titre..d'orga- nisme d'épreuve. Un filtrat de culture typique, sur un milieu'de culture conve- nant pour les levures ,enraye encore, la croissance à la dilution de 1:50, lors de l'essai à la plaquette trouée.
On peut extraire l'antibiotique des filtrats de culture, soit par extraction, soit par adsorption. L'acétate d'éthyle et l'acétate de butyle con- viennent particulièrement pour l'extraction, mais les hydrocarbures chlorés, l'éther, les cétones et les alcools sont aussi applicables. On évapore dans le vide l'extrait du jus de culture, on sépare par précipitation les substances étrangères au moyen d'hydrocarbures, et après avoir chassé les hydrocarbures sous vide, on mélange le résidu huileux avec un alcool inférieur , de préféren- ce avec du méthanol. Après séparation des parties insolubles dans le méthanol, on obtient après concentration une huile brune (fraction insaponifiable de 1' huile = 20%; indice d'iode = 290), qui se montre encore active, à une dilution de 1:1.000.000, par l'essai à la plaquette trouée, envers la Rhodotorula flava.
Avec ce concentrat huileux de Phyllomycine, on a effectué les essais biologi- ques ci-dessous. Pour purifier plus 'à fond le fongistatique, on divise en dix fractions le concentrat de phyllomycine ayant une activité de 1:1.000.000 , en contre courant avec le système :13 parties en volume de ligroïne 6 parties en volume d'acétate de butyle, 2 parties en volume de di-n-butyléther, 14 par- ties en volume de N-diméthylformamide, et 7 parties en volume d'eau ; évapo- re à sec sous vide la fraction cinq et à partir du résidu solide subsistant, on obtient après cristallisation dans la méthyl propyl cétone, la phyllomycine en aiguilles disposées en rosaces, et ayant les caractéristiques suivantes :
Point de fusion :
177 - 178 C (non corrigé) [[alpha]] 21D = +75 (c = 0,834% dans du chloroforme)
C = 57,70%; h = 5,77 %; N = 5,88 %; 0 = 30,74 %. lambda max 322 m mu avec alpha = 9970 lambda max 225 m mu avec alpha = 60 (alpha = Coefficient d'extinction spécifique = Extinction pour c = 1 g/litre et d = 1 cm3)a
La phyllomycine possède des bandes d'absorption caractéristiques dans l'infra-rouge, pour les longueurs d'onde suivantes :
(Comprimé avec KBr; les valeurs entre parenthèses indiquent les transparences en %) : 2,97 (50,7%), 3937 (54,8%), 5,72 (7,1 %), 5,97 (27,7%) 6,10 (34,6%), 6,21 (37,0%), 6,29 (47,3%), 6,55 (17,1%) 6,87 (47,8%), 6,98 (48,4%), 7,36 (30,0%), 7,52 (43,2%) 7,64 (48,8%), 7,84 (36,3%), 7,98 (24,2%), 8,49 (17,0%) 8,66 (17,2%), 9,28 (36,9%), 9,30 (37,1%), 9,49 (49,0%) et 9,85 mu (44,6%).
On trouvera sur les Figures 1 et 2 l'allure exacte des cour- bes d'absorption, dans les domaines ultra-violet et infra-rouge du spectre. A la Fig. 1 le coefficient d'extinction spécifique a est porté en ordonnées et la longueur d'onde m mu en abscisses.
La phyllomycine résiste à l'action de la température dans des limi- tes définies; à 20 l'activité envers la Rhodotorula flava se conserve plus de 7 heures; à 50 ,et dans des conditions d'essai comparables, l'efficacité est de 100% après 3 heures, de 95% après 7 heures; à 100 , elle est de 100% après
<Desc/Clms Page number 4>
1/2 heure ; de 80% après 3 heures, de 18 % après 7 heures; à 150 elle est de 3 % après 1/2 heure, de 0% après 3 heures. La phyllomycine est sensible aux al- calis.
Sur le chromatogramme circulaire de partage, on trouve les valeurs ci-après de RF dans le milieu de partage suivant 0,13 avec : 1 partie en volume d'eau, 1 partie en volume d'éthylèneglycol, 4 parties en volume de N-diméthylformamide, 3 parties en volume de di-n-butyl-éther, 3 parties en vo- lume de ligroine, 0,31 avec : 1 partie en volume d'éthylène-glycol, 2 parties en volume de N-diméthylformamide, 1 partie en volume de di-n-butyléther, 2 par- ties en volume de ligroine; 0,68 avec : 1 partie en volume d'eau, 2 parties en volume de méthanol, 2 parties en volume de N-diméthylformamide, 2 parties en volume d'acétate de butyle, 3 parties en volume de ligroine, et 0,88 avec :
1 partie en volume d'eau, 3 parties en volume d'éthylène glycol, 2 parties en volume de N-diméthylformamide, 3 parties en volume d'acétate de butyle, 2 par- ties en volume de ligro ine. Pour réaliser le chromatogramme, on asperge des papiers filtres coupés en cercles (Schleicher et Schüll 2043 b) avec la phase hydrophile de chacun des milieux de partage, d'abord mise en équilibre par agi- tation prolongée, puis on les développe avec la phase hydrofuge. Après séchage du chromatogramme, on découpe suivant un rayon une bande de 0,5 mm de largeur, et on la pose sur une plaque d'agar ensemencée de rhodotorula flava.
A l'en- droit où se trouve la substance active, il se forme au cours de l'incubation une zone d'inhibition claire d'iù l'on peut calculer le RF qui est le rapport du parcours de l'antibiotique au parcours de la phase hydrofuge (=front du sol- vant).
A l'essai à la plaquette trouée, la phyllomycine cristallisée, à la dilution de 1:50.000.000 jusqu'à 1.100.000.000 enraye le développement de la Rhodotorula flava.
D'autre part, on peut extraire la phyllomycine du milieu de culture en mélangeant la solution de culture centrifugée ou filtrée avec un adsorbant, en particulier avec du charbon activé, en séparant l'adsorbat, et en désorbant l'agent actif à l'aide de solvants organiques, particulièrement à l'aide d'hy- drocarbures chlorés et d'alcools.
Outre la phyllomycine les filtrats de cultures renferment encore un autre antibiotique, qui est également actif contre les moisissures, par ex- emples contre la Rhodotorula flava et le Cladosporium cucumérinum. Lors de l'ex- traction par des solvants organiques, comice l'acétate de butyle ou l'acétate d'éthyle, il demeure dans la phase aqueuse.
La phyllomycine possède une activité prononcée contre des organis- mes pathogènes des végétaux, in vivo et in vitro. Pour les essais, on a utilisé un concentrat de phyllomycine (activité envers la Rhodotorula flava :1 : 1.000.000), dont l'efficacité in vitro, dans l'essai de dilution en petit tube, tout comme dans l'essai à la plaquette trouée, contre des moisissures et des bactéries est indiquée dans.le Tableau 2, et l'efficacité in vivo sur des végé- taux est indiquée dans le Tableau 3. Cependant , l'efficacité de l'antibiotique n'est pas limitée aux organismes indiqués dans les Tableaux 2 et 4. La phyllo- mycine peut trouver une utilisation comme agent de protection systémique des plantes.
Le coefficient, d'attaque de l'Omphalia flavida sur les plantes du $genre coléus, est de 52 après imprégnation de la terre avec une solution de phyl- lomycine à 1% ,et de 68 avec une solution à 0,1% (Témoin 100) (voir le Tableau 3).
Le concentrat de phyllomycine à 1 :1.000.000 ne possède qu'une phytotoxicité peu importante (voir Tableau 4). Sans aucune exception , on n'a observé aucun dommage avec une solution à 0,1%. Même les constatations effectuées avec une solution à 1% sont peu importantes.
Comme antibiotiques fongistatiques tirés des streptomycètes, on con- naissait un groupe de composés, comme par exemple la fongicidine (=nystatine)
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(J.D. Putcher, G. BOyack, S.Fox,Antibiotics Annual , 1953-1954, page 191), l' eurocidine (Y. Okami, R.Wahara, S.Nakomura, H.Umezawa, Journal of Antibiotics, Japon 7A, page 98, 1954), le flavacide (J.Takahachi, Journal of Antibiotics, Japon, 6A, page 117, 1953), la condicidine (H.A.Lechevalier, R.F.Acker, C.T.
Corke, C.M.Haenseler, S.A.Waksman, Mycologia, 45, page 155, 1953), qui se dis- tinguent chimiquement par une chaîne de doubles liaisons conjuguées, et possè- dent un spectre d'adsorption typique de cette constitution, avec trois maxima très voisins les uns des autres, par exemple la fongicidine (=nystatine) à 292, 304 et 318 m mu, l'urocidine à 318, 333 et 351 m mu, le falvacide à 341, 358 et 379 m mu et la candicidine à : 359,5, 3795 et 401,5 m mu. Le présent antibiotique, la phyllomycine, n'a pas, comme on peut le voir d'après le spec- tre ci-joint, de spectre d'absorption typique de ce genre, et doit être nette- ment différent des composés cités. Il existe pareillement une nette différence entre l'actidion (A.D.Whiffen, R.L.
Emmerson, N.H. Bohonos, brevet des Etats Unis D'Amérique N 205740519 du 13 Novembre 1951 ; UpjohnCompany) et la phyl- lomycine, car l'actidion, à l'essai de dilution en petit tube n'empêche la crois- sance du Cladosporium cumumerinum qu 'à la dilution de 1: 50.000, tandis que la phyllomycine est encore efficace à 1 s 10.000.000 . Il faut aussi noter des différences d'activité biologique marquées entre la phyllomycine et les antibio- tiques connus tirés des streptomycètes; la streptomycine, la tétracycline, la viomycine, l'érythromycine, le chloramphénicol et la novobiocine.
C'est ainsi qu'à l'essai à la plaquette trouée, le concentrat de phyllomycine donne, à la dillution de 1 200.000 une zone d'inhibition de 19 mm avec le Candida utilis CBS 840, alors que la streptomycine à la dilution de 1 : 400, la tétracycline à la dilution de 1 : 400, la viomycine à la dilution de 1 : 400, l'érythromyci- ne à la dilution de 1 :4.000, le chloramphénicol à la dilution de 1 : 4000, et la novobiocine à la dilution de 1 s 6000 sont inefficaces. Il existe égale- ment des différences entre la phyllomycine et l'antimycine A, un antibiotique découvert par C.
Leben et G.W. Keitt (Phytopathology, 37. 14, 1947, et 38. 899, 1948). Même le Strptomyces NRRL 'produisant l'antimycine" révèle vis à vis du Streptomyces umbrinus, qui donne naissance à de la phyllomycine, des diffé- rences de culture nettes, comme le montre le Tableau 5.
Une comparaison directe entre une préparation authentique d'antimycine A et de phyllomycine donne des différences de point de fusion (non corrigé); Antimyoine A : 136-137 ; Phyllo- mycine :: 177-178,5 , point de fusion en mélange : 129-130 , et comme le montre la Figure 3 (dans laquelle le demi-cercle supérieur est relatif à l'antimycine A et le demi-cercle inférieur à la phyllomycine), des différences des valeurs de RF sur le chromatogramme de partage circulaire, en utilisant un milieu de partage composé de :6 parties en volume de ligroine, 1 partie en volume de di-n-butyléther, 3 parties en volume d'acétate de butyle, 7 parties en volume de N-diméthylformamide, 3 parties en volume d'eau et en utilisant la technique décrite plus haut, (voir Fig. 3).
On a développé le chromatogramme avec de l'acide sulfanilique diazoté. Etant donné qu'il existe également des différen- ces qualitatives et quantitatives entre les activités biologiques des deux fongistatiques ,(voir Tableau 6), il faut sans aucun doute considérer la phyl- lomycine comme étant un nouvel antibiotique.
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TABLEAU 2.
Efficacité in vitro du concentrat de phyllomycine (Activité à la dilution de 1:1.000.000 sur la Rhodotorula flava) Nature Dilution limite d'efficacité Organisme de l' Diamètre de la zone d'inhibition essayé essai de l'essai à la plaquette trouée (#)
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P1= Essai à la plaquette trouée.
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Tableau 3
Efficacité in vivo du concentrat de phyllomycine (Activité à la dilution de 1:1.000.000 .sur la Rhodotorula flava)
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+) La terre a été imbibée de la solution à essayer.
(= Examen de l'efficacité systémique).
<Desc/Clms Page number 8>
Tableau 4 Phytotoxicité du concentrat de phyllomycine ----------- (Activité à la dilution de 1:1.000.000 sur la Rhodotorula flava)
EMI8.1
<tb> Plantes <SEP> d'essai <SEP> Concentration <SEP> Constatation
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<Desc/Clms Page number 9>
Tableau 5 Différenciation du Streptomyces "produisant de l'antimycine" et du Streptomyces umbrinus.
-----------
EMI9.1
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Tableau 6 Efficacité à l'essai à la plaque trouée,
de l'antimycine A et de la phyllomycine, sur trois levures différentes.
EMI9.2
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<tb> glutinis <SEP> 1:
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<tb> (Fres.) <SEP> Harrison <SEP> 1 <SEP> :160.000 <SEP> # <SEP> 18,0 <SEP> 1:2.500.000 <SEP> # <SEP> 14,0
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<Desc/Clms Page number 10>
Exemple 1
Dans un erlenmeyer de 1 litre,on verse 150 cm3 d'une solution nutritive ayant la composition suivante :
2 % de glycérine 0,1 % de peptone 0,25% de glycocolle
0,1 % de NaCl 0,1 % de K2H PO4 0,02% de FeS04 . 7H20 0,02% de MgSO4 . 7H2O on stérilise à 120 C pendant 20 minutes;on ensemence après refroidissement avec une suspension de spores de Streptomyces umbrosus nov. spec., qui s'était développé sur un milieu nutritif de la même composition, avec 2 % d'agar, et on fait fermenter à 29 , sur une machine à secousses fonctionnant à 240 tours minute. Après une durée de culture de 72 heures le bouillon de fermentation, à la dilution ,de 1 : 50, inhibe la Rhodotorula flava.
Avec deux litres de cet- te culture préliminaire en croissance, on ensemence un fermenteur de 1.000 li- tres, garni de la solution nutritive suivante :
2 % de glycérine
1 % de levure de bière sèche 0,25 % de glycocolle 0,1 % de NaCl 0,1 % de K2H P04 0,02 % de FeS04 . 7H20 0,02 % de MgS04 , 7H2O 0,1 % d'huile de silicone (produit commercial) qui avait été stérilisé deux jours consécutifs pendant 20 minutes à 120 , puis on l'agite énergiquement pendant 72 heures, en faisant entrer de l'air à raison de 350 litres par minute. L'efficacité contre la Rhodotorula flava est alors de 1 : 50.
Immédiatement après, on débarrasse le jus de fermentation du mycélium par centrifugation, on extrait une fois le liquide de centrifugation avec 300 litres d'acétate de butyle, on concentre à 50 et sous vide l'extrait coloré en vert jaune à 4 litres, on ajoute 16 litres de ligroine, on sépare un précipité brun verdâtre, et on chasse le solvant à 50 sous vide. Le résidu visqueux restant, qui renferme encore l'huile de silicone ajoutée comme anti- mousse, est extrait deux fois avec chaque fois 3 litres de méthanol, on isole la phase huileuse qui se sépare, et on chasse le méthanol par distillation sous vide. On obtient 30 grammes environ d'huile brune, qui à la dilution de 1 :
1.000.000 arrête la croissance de la Rhodotorula flava, et que l'on utilise comme produit de départ pour des essais sur les plantes.
Pour continuer la purification de l'antibiotique, on verse dans huit ampoules à séparation de 10 litres chacune, chaque fois 4 litres de la phase organique du milieu de partage : 13 parties en volume de ligroine, 6 parties en volume d'acétate de butyle, 2 parties en volume de di-n-butyléther, 14 par- ties en volume de N-diméthylformamide, et 7 parties en volume d'eau; on dissout
400 grammes de concentrat précédent de phyllomycine (ayant une activité de 1 :
1.000.000) dans 4 litres de la phase aqueuse du milieu de partage indiqué, et on l'agite un certain temps, avec 4 litres de la phase organique de la première ampoule à séparation. On isole la phase aqueuse, on l'ajoute à la phase organi- que de la deuxième ampoule à séparation, et on verse ensuite dans la première ampoule 4 litres de phase aqueuse fraîche.
On agite un certain temps les deux ampoules à séparation. On recommence le processus sur huit stades dans le sens d'un partage, à contre-courant. On soutire les huit phases aqueuses, on ajoute aux phases organiques 2 litres d'acétate d'éthyle, et on agite une fois avec de l'eau. (on jette l'eau). On ajoute les huit phases aqueuses aux phases orga- niques correspondantes, on agite les huit fractions, et on isole les phases
<Desc/Clms Page number 11>
aqueuses. Celles-ci renferment encore de petites quantités de phyllomycine. On agite trois fois les phases organiques obtenues avec chaque fois 2 litres d'eau chacune, (on jette l'eau) ,et on distille à sec sous vide, sur un bain à 60 .
Les fractions quatre, cinq et six renferment la majeure partie du produit ac- tif. On obtient, en recristallisant trois fois la fraction cinq dans de la mé- thyl propyl cétone, 2 grammes de phyllomycine en aiguilles en forme de rosaces, qui arrêtent encore la croissance de la Rhodotorula flava, à la dilution de
1 : 50.000.000 à 1 : 100.000.000.
Point de fusion : 177-178,5 (non corrigé).
21 [a] D = +75 (C = 0,834 % dans du chloroforme)
C = 57,70 % H = 5,77 % N = 5,79 % et 0 = 30,74 %
Lambda max = 332 m mu avec alpha = 9,70
Lambda max = 225 m mu avec alpha = 60.
Exemple 2.
On centrifuge 10 litres de jus de culture dé Streptomyces umbrosus nov. spec. ayant une efficacité de 1 :50 contre la Rhodotorula flava; on agite le liquide centrifugé clair avec 50 grammes de charbon activé, et on sépare le charbon par centrifugation. Dans le milieu de culture débarrassé de l'agent ad- sorbant, subsistent 10 % environ de l'efficacité. On sèche le produit adsorbé, on l'agite pendant 30 minutes à 50 avec 1 litre de chloroforme, on le centri- fuge à nouveau, et on distille à sec la solution chloroformique surnageante.
Il reste comme résidu 1,7 gramme d'une huile , qui a la dilution de 1 : 200. 000 arrête encore la croissance de la Rhodotorula flava, et que l'on peut le cas échéant encore purifier comme indiqué plus haut.
<Desc / Clms Page number 1>
The present invention relates to a process for preparing and obtaining a novel antibiotic derived from streptomycetes, endowed with bacteriostatic and fungistatic properties. It is found in the culture broth, as well as in small quantities in the mycelium of a new streptomycete, and the Applicant has called it phyllomycin, because of its efficacy against pathogenic molds in plants.
The streptomycete isolated from river silt, which has received the name Streptomyces umbrosus and which has been deposited under this name at the "Centerbureau voor Schimmelkultures" in Baarn (Netherlands), is not identical to any of the known streptomycetes.
According to the work entitled "Actynomycetes and their Antibiotics", by SA Waksman and HA Lechevalier, page 66, it is as a chromogenic type, analogous to Streptomyces viridoflavus, a pigment soluble in all organic media, but distinguishes however by essential distinctive characters. According to the diagnostic methods of W. Lindenbein (Archiv für Mikrobiologie, 17, 361-381 (1952, the characteristics of this new species are those gathered in Table 1 below)
Table 1.
Properties of Streptomyces umbrosus cultures.
EMI1.1
<tb>
Medium <SEP> Develop- <SEP> Color <SEP> of <SEP> Color <SEP> of <SEP> Structure <SEP> Remar-
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<Desc / Clms Page number 2>
5 10 15 20
Table 1.
(continued) Property of Streptomyces umbrosus cultures
EMI2.1
<tb> Middle <SEP> Develop- <SEP> Color <SEP> of <SEP> Color <SEP> of <SEP> Structure <SEP> Remar-
<tb>
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Streptomyces umbrosus can be cultivated, with formation of the active product, on nutrient solutions, for example with glycerin or malt extract as carbon source, peptone, water of maceration. corn, brewer's yeast, or casein hydrolyzate as a source of nitrogen, with the addition of inorganic salts, such as for example sodium chloride,
dipotassium acid phosphate, ferrous sulphate and magnesium sulphate. In addition, the culture medium must contain traces of essential elements, which are usually found in tap water, as well as in natural additives to culture medium, for example brewer's yeast. Before seeding, the pH of the nutrient solution should be between 6.5 and 7.5. The Applicant has observed that in almost all the tests on cultures, the medium initially becomes slowly acidic. Compared to other active substances, the formation of the antibiotic takes place very early, and already reaches its maximum after three days of culture. Small amounts of phyllomycin form in the shaker flask; or in the superficial culture.
In order to prepare larger amounts of the antibiotic, preference is given to the agitated and submerged aerobic culture. In order to achieve as rapid an increase as possible, and therefore a shorter fermentation time, one always sows abundantly with a freshly prepared spore suspension, or else with a corresponding submerged pre-culture. Stceptomyces umbrosus is grown at a temperature between 26 and 32, and preferably at 29.
Preparation of substances
<Desc / Clms Page number 3>
active agents is not, however, limited to the application of Streptomyces umbrosus, but it also includes mutations of this strain, which are obtained by the action of mutating agents, for example ultraviolet rays, rays Roentgen and chemicals. -
The concentration of the antibiotic in the filtrates and culture extracts is determined using Rhodotorula flava CBS 331 as a test organism. A typical culture filtrate, on a culture medium suitable for yeasts, further suppresses growth at the 1:50 dilution, when tested with the perforated plate.
The antibiotic can be extracted from the culture filtrates, either by extraction or by adsorption. Ethyl acetate and butyl acetate are particularly suitable for extraction, but chlorinated hydrocarbons, ether, ketones and alcohols are also applicable. The extract of the culture juice is evaporated in a vacuum, the foreign substances are separated by precipitation by means of hydrocarbons, and after having removed the hydrocarbons under vacuum, the oily residue is mixed with a lower alcohol, preferably with methanol. After separation of the parts insoluble in methanol, a brown oil is obtained after concentration (unsaponifiable fraction of the oil = 20%; iodine number = 290), which is still active, at a dilution of 1: 1,000,000. , by the test with the perforated plate, against Rhodotorula flava.
With this oily Phyllomycin concentrate, the biological tests below were carried out. To further purify the fungistatic, the phyllomycin concentrate having an activity of 1: 1,000,000 is divided into ten fractions, in countercurrent with the system: 13 parts by volume of ligroin 6 parts by volume of butyl acetate , 2 parts by volume of di-n-butyl ether, 14 parts by volume of N-dimethylformamide, and 7 parts by volume of water; Fraction five is evaporated to dryness under vacuum and from the solid residue remaining, after crystallization from methyl propyl ketone, phyllomycin is obtained in needles arranged in rosettes, and having the following characteristics:
Fusion point :
177 - 178 C (uncorrected) [[alpha]] 21D = +75 (c = 0.834% in chloroform)
C, 57.70%; h = 5.77%; N, 5.88%; 0 = 30.74%. lambda max 322 m mu with alpha = 9970 lambda max 225 m mu with alpha = 60 (alpha = Specific extinction coefficient = Extinction for c = 1 g / liter and d = 1 cm3) a
Phyllomycin has characteristic absorption bands in the infrared, for the following wavelengths:
(Tablet with KBr; values in brackets indicate transparency in%): 2.97 (50.7%), 3937 (54.8%), 5.72 (7.1%), 5.97 (27, 7%) 6.10 (34.6%), 6.21 (37.0%), 6.29 (47.3%), 6.55 (17.1%) 6.87 (47.8% ), 6.98 (48.4%), 7.36 (30.0%), 7.52 (43.2%) 7.64 (48.8%), 7.84 (36.3%) , 7.98 (24.2%), 8.49 (17.0%) 8.66 (17.2%), 9.28 (36.9%), 9.30 (37.1%), 9.49 (49.0%) and 9.85 mu (44.6%).
Figures 1 and 2 show the exact shape of the absorption curves in the ultra-violet and infrared regions of the spectrum. In Fig. 1 the specific extinction coefficient a is plotted on the ordinate and the wavelength m mu on the abscissa.
Phyllomycin is resistant to the action of temperature within defined limits; at 20 activity against Rhodotorula flava keeps for more than 7 hours; at 50, and under comparable test conditions, the efficiency is 100% after 3 hours, 95% after 7 hours; at 100, it is 100% after
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1/2 hour; 80% after 3 hours, 18% after 7 hours; at 150 it is 3% after 1/2 hour, 0% after 3 hours. Phyllomycin is sensitive to alkalis.
On the circular partition chromatogram, the following values of RF are found in the following partition medium 0.13 with: 1 part by volume of water, 1 part by volume of ethylene glycol, 4 parts by volume of N- dimethylformamide, 3 parts by volume of di-n-butyl-ether, 3 parts by volume of ligroin, 0.31 with: 1 part by volume of ethylene glycol, 2 parts by volume of N-dimethylformamide, 1 part by volume of di-n-butyl ether, 2 parts by volume of ligroin; 0.68 with: 1 part by volume of water, 2 parts by volume of methanol, 2 parts by volume of N-dimethylformamide, 2 parts by volume of butyl acetate, 3 parts by volume of ligroin, and 0.88 with:
1 part by volume of water, 3 parts by volume of ethylene glycol, 2 parts by volume of N-dimethylformamide, 3 parts by volume of butyl acetate, 2 parts by volume of ligroin. To perform the chromatogram, filter papers cut into circles (Schleicher and Schüll 2043 b) are sprayed with the hydrophilic phase of each of the partition media, first brought into equilibrium by prolonged stirring, then developed with the phase. water repellent. After drying the chromatogram, a strip 0.5 mm wide is cut along a radius and placed on an agar plate seeded with rhodotorula flava.
At the place where the active substance is found, during incubation a clear zone of inhibition is formed from which the RF can be calculated which is the ratio of the course of the antibiotic to the course. of the water-repellent phase (= solvent front).
When tested with the perforated plate, crystallized phyllomycin, at a dilution of 1: 50,000,000 to 1,100,000,000, stops the development of Rhodotorula flava.
On the other hand, phyllomycin can be extracted from the culture medium by mixing the centrifuged or filtered culture solution with an adsorbent, in particular with activated charcoal, separating the adsorbate, and desorbing the active agent with it. using organic solvents, especially using chlorinated hydrocarbons and alcohols.
In addition to phyllomycin, the culture filtrates contain yet another antibiotic, which is also active against molds, for example against Rhodotorula flava and Cladosporium cucumérinum. On extraction with organic solvents, such as butyl acetate or ethyl acetate, it remains in the aqueous phase.
Phyllomycin has marked activity against plant pathogens, in vivo and in vitro. For the tests, a phyllomycin concentrate (activity against Rhodotorula flava: 1: 1,000,000) was used, the efficacy of which in vitro, in the small tube dilution test, as well as in the test in perforated blister pack against mold and bacteria is shown in Table 2, and in vivo efficacy on plants is shown in Table 3. However, the efficacy of the antibiotic is not limited to organisms shown in Tables 2 and 4. Phyllomycin may find use as a systemic plant protection agent.
The coefficient of attack of Omphalia flavida on plants of the genus coleus is 52 after impregnation of the soil with a 1% phylomycin solution, and 68 with a 0.1% solution ( Indicator 100) (see Table 3).
The phyllomycin concentrate at 1: 1,000,000 has only low phytotoxicity (see Table 4). Without any exception, no damage was observed with a 0.1% solution. Even the findings made with a 1% solution are unimportant.
As fungistatic antibiotics from streptomycetes a group of compounds were known, for example fungicidin (= nystatin)
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(JD Putcher, G. BOyack, S. Fox, Antibiotics Annual, 1953-1954, page 191), eurocidin (Y. Okami, R.Wahara, S.Nakomura, H. Umezawa, Journal of Antibiotics, Japan 7A, page 98, 1954), flavacid (J.Takahachi, Journal of Antibiotics, Japan, 6A, page 117, 1953), condicidin (HALechevalier, RFAcker, CT
Corke, CMHaenseler, SAWaksman, Mycologia, 45, page 155, 1953), which are distinguished chemically by a chain of conjugated double bonds, and possess an adsorption spectrum typical of this constitution, with three very high maxima neighbors to each other, for example fungicidin (= nystatin) at 292, 304 and 318 m mu, urocidin at 318, 333 and 351 m mu, falvacid at 341, 358 and 379 m mu and candicidin at: 359.5, 3795 and 401.5 m mu. The present antibiotic, phyllomycin, does not have, as can be seen from the accompanying spectrum, an absorption spectrum typical of this kind, and should be markedly different from the compounds mentioned. There is also a clear difference between actidion (A.D. Whiffen, R.L.
Emmerson, N.H. Bohonos, U.S. Patent No. 205740519, November 13, 1951; UpjohnCompany) and phyl- lomycin, because the actidion, in the small tube dilution test, prevents the growth of Cladosporium cumumerinum only at the dilution of 1: 50,000, while phyllomycin is still effective at 1 s 10,000,000. There are also marked differences in biological activity between phyllomycin and known antibiotics from streptomycetes; streptomycin, tetracycline, viomycin, erythromycin, chloramphenicol and novobiocin.
Thus, in the test with the perforated plate, the phyllomycin concentrate gives, at the dilution of 1,200,000, a zone of inhibition of 19 mm with Candida utilis CBS 840, while streptomycin at the dilution of 1: 400, tetracycline at a dilution of 1: 400, viomycin at a dilution of 1: 400, erythromycin at a dilution of 1: 4000, chloramphenicol at a dilution of 1: 4000, and novobiocin at the dilution of 1 s 6000 are ineffective. There are also differences between phyllomycin and antimycin A, an antibiotic discovered by C.
Leben and G.W. Keitt (Phytopathology, 37. 14, 1947, and 38. 899, 1948). Even the antimycin producing Strptomyces NRRL '"shows clear differences in culture with respect to Streptomyces umbrinus, which gives rise to phyllomycin, as shown in Table 5.
A direct comparison between an authentic preparation of antimycin A and phyllomycin gives differences in melting point (uncorrected); Antimony A: 136-137; Phyllomycin :: 177-178.5, mixed melting point: 129-130, and as shown in Figure 3 (in which the upper semi-circle is relative to antimycin A and the lower semi-circle to phyllomycin), differences in RF values on the circular partition chromatogram, using a partition medium composed of: 6 parts by volume of ligroin, 1 part by volume of di-n-butyl ether, 3 parts by volume of Butyl acetate, 7 parts by volume of N-dimethylformamide, 3 parts by volume of water and using the technique described above (see Fig. 3).
The chromatogram was developed with diazotized sulfanilic acid. Since there are also qualitative and quantitative differences between the biological activities of the two fungistats (see Table 6), phylomycin should definitely be considered as a new antibiotic.
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TABLE 2.
Efficacy in vitro of the phyllomycin concentrate (Activity at a dilution of 1: 1,000,000 on Rhodotorula flava) Nature Dilution limit of efficacy Organism Diameter of the zone of inhibition tested test of the test with the perforated plate (#)
EMI6.1
<tb> R <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 10. <SEP> 000.000 <SEP> Cladosporium <SEP> eucumerinum
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> R <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 500.000 <SEP> Cladosporium <SEP> sp. (Hops) <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> R <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 500.000 <SEP> Bartrytis <SEP> cinerea
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> R <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 750.000 <SEP> Xanthomonas <SEP> malvacearum
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Strain <SEP> RI
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> R <SEP> 1 <SEP>:
<SEP> 750.000 <SEP> Xanthomonas <SEP> Malvaoearum
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Strain <SEP> RII
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP> 2.000 <SEP> # <SEP> 20 <SEP> mm <SEP> Cerospora <SEP> musae
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 4.000 <SEP> # <SEP> 14 <SEP> mm
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 500 <SEP> # <SEP> 14 <SEP> mm <SEP> Xanthomonas <SEP> malvacearum
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP>: <SEP> 1. <SEP> 000 <SEP> # <SEP> 8.5 <SEP> mm <SEP> Strain <SEP> RI
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP> # <SEP> 11.5 <SEP> mm <SEP> Xanthomonas <SEP> malvacearum
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP>: <SEP> 1.000 <SEP> # <SEP> 8,0 <SEP> mm <SEP> Strain <SEP> RII
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> P1 <SEP> 1 <SEP>:
<SEP> 500 <SEP> # <SEP> 22.5 <SEP> mm <SEP> Xanthomonas <SEP> malvacearum
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 1.000 <SEP> # <SEP> 15.0 <SEP> mm <SEP> Strain <SEP> 1.002. '
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> P1 <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 10.000 <SEP> # <SEP> 38,0 <SEP> mm <SEP> Sarcina <SEP> lutea
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> P1 <SEP> 1 <SEP> 500.000 <SEP> # <SEP> 17 <SEP> mm <SEP> Rhodotorula <SEP> flava <SEP> CBS <SEP> 331
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pl <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 200,000 <SEP> # <SEP> 19 <SEP> mm <SEP> Candida <SEP> utilis <SEP> CBS <SEP> 840
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pl <SEP> ineffective <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus
<tb>
R = Small tube dilution test.
P1 = Test with the perforated plate.
<Desc / Clms Page number 7>
Table 3
In vivo efficacy of the phyllomycin concentrate (Activity at the dilution of 1: 1,000,000 on Rhodotorula flava)
EMI7.1
<tb> Concentration <SEP> Parasite <SEP> Host <SEP> Coefficient
<tb>
<tb>
attack <tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,2 <SEP>% <SEP> Phytophtora <SEP> Plants <SEP> of <SEP> tomatoes <SEP> 52
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> infestans
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.1 <SEP>% <SEP> d <SEP> d <SEP> 59
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> no <SEP> processed <SEP> d <SEP> d <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.1 <SEP>% <SEP> Alternaria <SEP> Plants <SEP> of <SEP> tomatoes <SEP> 19
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> solani
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,
01% <SEP> d <SEP> d <SEP> 51
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> no <SEP> processed <SEP> d <SEP> d <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.05% <SEP> Peronospora <SEP> Plants <SEP> of <SEP> vines <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.01% <SEP> d <SEP> d <SEP> 37
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.005% <SEP> d <SEP> d <SEP> 40
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> no <SEP> processed <SEP> d <SEP> d <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.025% <SEP> Pericular <SEP> oricae <SEP> Plants <SEP> of <SEP> rice <SEP> 66
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> no <SEP> processed <SEP> d <SEP> d <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.05 <SEP>% <SEP> Omphalia <SEP> flavida <SEP> Plants <SEP> of <SEP> coffee <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.005% <SEP> d <SEP> d <SEP> 1.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,
0005% <SEP> d <SEP> d <SEP> 78
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> no <SEP> processed <SEP> d <SEP> d <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP>% <SEP> +) <SEP> d <SEP> Coleus <SEP> 52
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.1% <SEP> +) <SEP> d <SEP> d <SEP> 63
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> no <SEP> processed <SEP> d <SEP> d <SEP> 100
<tb>
+) The earth has been soaked with the solution to be tested.
(= Review of systemic effectiveness).
<Desc / Clms Page number 8>
Table 4 Phytotoxicity of phyllomycin concentrate ----------- (Activity at dilution of 1: 1,000,000 on Rhodotorula flava)
EMI8.1
<tb> Test <SEP> plants <SEP> Concentration <SEP> Finding
<tb>
<tb> sprayed <SEP>,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bean <SEP> 1 <SEP>% <SEP> Necrosis <SEP> of the <SEP> edges <SEP> of the <SEP> leaves;
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> New <SEP> normal <SEP> growth.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
"<SEP> 0.1 <SEP>% <SEP> No <SEP> of <SEP> damage
<tb>
<tb>
<tb> New <SEP> normal <SEP> growth.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
"<SEP> 0.05 <SEP>% <SEP> No <SEP> of <SEP> damage
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> New <SEP> normal <SEP> growth.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
"<SEP> 0.01 <SEP>% <SEP> No <SEP> of <SEP> damage
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> New <SEP> normal <SEP> growth.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Cotton <SEP> 1 <SEP>% <SEP> Necrosis <SEP> of the <SEP> edges <SEP> of the <SEP> leaves
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP> 0.1 <SEP>% <SEP> No <SEP> of <SEP> damage
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Coffee <SEP> 0.1 <SEP>% <SEP> No <SEP> of <SEP> damage
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Banana <SEP> - <SEP> 1 <SEP>% <SEP> Stains <SEP> of the <SEP> leaves <SEP> to <SEP> the <SEP> base
<tb>
<tb>
<tb> of the <SEP> sheets <SEP> of the <SEP> core
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "<SEP> '<SEP> 0.1 <SEP>% <SEP> No <SEP> of <SEP> damage
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Rice <SEP> 0.1 <SEP>% <SEP> No <SEP> of <SEP> damage
<tb>
<Desc / Clms Page number 9>
Table 5 Differentiation of "antimycin producing" Streptomyces and Streptomyces umbrinus.
-----------
EMI9.1
<tb> Streptomyces <SEP> NRRL <SEP> 2288 <SEP> Streptomyces
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "producing <SEP> from <SEP> anti- <SEP> umbrinus
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mycine "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Color <SEP> of the <SEP> mycelium <SEP> aerial
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> on <SEP> glucose-asparagine- <SEP> From <SEP> white <SEP> to <SEP> cream <SEP> Gray
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> agar,
<SEP> glucose-agar- <SEP> and
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nutrient <SEP> agar
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Microscopic <SEP> image <SEP> No <SEP> of <SEP> spirals <SEP> Spirals <SEP> with
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> of <SEP> mycelium <SEP> aerial <SEP> spirals <SEP> from <SEP> 2 <SEP> to <SEP> 5 <SEP> with
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> turns
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Color <SEP> of the <SEP> substratum <SEP> on
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> culture <SEP> medium <SEP> containing <SEP> From colorless <SEP> to <SEP> light- <SEP> Brown <SEP> dark.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mant <SEP> of <SEP> peptone <SEP> (Agar <SEP> ment <SEP> yellowish
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nutritious <SEP> and <SEP> agar-gelatin)
<tb>
Table 6 Efficiency in the perforated plate test,
antimycin A and phyllomycin, on three different yeasts.
EMI9.2
<tb>
Yeast <SEP> Antimycin <SEP> A <SEP> Phyllomycin
<tb>
<tb>
<tb> Dilution <SEP> (- <SEP> # <SEP> mm <SEP> of <SEP> the <SEP> Dilution <SEP> (- <SEP> # <SEP> mm <SEP> of <SEP> the
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> inhibition <SEP> zone <SEP> inhibition <SEP> zone)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> lypolytica <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 10. <SEP> 000 <SEP> # <SEP> 21.8 <SEP> 1: 640.000 <SEP> # <SEP> 27, 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (Harrison) <SEP> Diddens <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 40.000 # <SEP> 20.5 <SEP> 1 <SEP>: 2.500.000 <SEP> # <SEP> 20.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> and <SEP> Lodder. <SEP> 1 <SEP>: 160.000 <SEP> # <SEP> 18.0 <SEP> 1: 10,000.000 <SEP> # <SEP> 12.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sporolobomyces <SEP> 1 <SEP>:
<SEP> 10.000 <SEP> # <SEP> 22.2 <SEP> 1: 640.000 <SEP> # <SEP> 25.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> holsaticus <SEP> 1: <SEP> 40,000 <SEP> # <SEP> 21.0 <SEP> 1: 2.500.000 <SEP> # <SEP> 19.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Windisch <SEP> 1: 160.000 <SEP> # <SEP> 18.0 <SEP> 1: 10,000.000 <SEP> # <SEP> 15.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Rhodotorula <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 10.000 # <SEP> 21.8 <SEP> 1 <SEP>: 160.000 <SEP> # <SEP> 29.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> glutinis <SEP> 1:
<SEP> 40,000 <SEP> # <SEP> 20.6 <SEP> 1: 640.000 <SEP> # <SEP> 21.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (Fres.) <SEP> Harrison <SEP> 1 <SEP>: 160.000 <SEP> # <SEP> 18.0 <SEP> 1: 2.500.000 <SEP> # <SEP> 14.0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<Desc / Clms Page number 10>
Example 1
150 cm3 of a nutrient solution having the following composition are poured into a 1 liter Erlenmeyer flask:
2% glycerin 0.1% peptone 0.25% glycocoll
0.1% NaCl 0.1% K2H PO4 0.02% FeSO4. 7H20 0.02% MgSO4. 7H2O is sterilized at 120 C for 20 minutes; it is inoculated after cooling with a suspension of spores of Streptomyces umbrosus nov. Spec., Which had grown on a nutrient medium of the same composition, with 2% agar, and it is fermented at 29, on a shaking machine operating at 240 rpm. After a culture period of 72 hours, the fermentation broth, at a dilution of 1:50, inhibits Rhodotorula flava.
With two liters of this growing preliminary culture, a 1,000-liter fermenter is inoculated, filled with the following nutrient solution:
2% glycerin
1% dry brewer's yeast 0.25% glycocoll 0.1% NaCl 0.1% K2H P04 0.02% FeS04. 7H20 0.02% MgSO4, 7H2O 0.1% silicone oil (commercial product) which had been sterilized two consecutive days for 20 minutes at 120, then stirred vigorously for 72 hours, bringing in water. air at the rate of 350 liters per minute. The efficacy against Rhodotorula flava is then 1: 50.
Immediately afterwards, the fermentation juice is freed from the mycelium by centrifugation, the centrifugation liquid is extracted once with 300 liters of butyl acetate, the extract is concentrated to 50 and the extract colored in yellow green to 4 liters in vacuo. 16 liters of ligroin are added, a greenish-brown precipitate is separated, and the solvent is removed at 50 in vacuo. The remaining viscous residue, which still contains the silicone oil added as an anti-foaming agent, is extracted twice with 3 liters of methanol each time, the oily phase which separates is isolated, and the methanol is removed by vacuum distillation. About 30 grams of brown oil are obtained, which at a dilution of 1:
1,000,000 stops the growth of Rhodotorula flava, and is used as a starting material for tests on plants.
To continue the purification of the antibiotic, are poured into eight separating funnels of 10 liters each, each time 4 liters of the organic phase of the partition medium: 13 parts by volume of ligroin, 6 parts by volume of butyl acetate , 2 parts by volume of di-n-butyl ether, 14 parts by volume of N-dimethylformamide, and 7 parts by volume of water; we dissolve
400 grams of the previous phyllomycin concentrate (having an activity of 1:
1,000,000) in 4 liters of the aqueous phase of the indicated partition medium, and stirred for some time with 4 liters of the organic phase from the first separating funnel. The aqueous phase is isolated, added to the organic phase of the second separatory funnel, and then 4 liters of fresh aqueous phase are poured into the first funnel.
The two separating funnels are stirred for a while. We start the process over eight stages in the direction of sharing, against the tide. The eight aqueous phases are withdrawn, 2 liters of ethyl acetate are added to the organic phases, and the mixture is stirred once with water. (we throw the water). The eight aqueous phases are added to the corresponding organic phases, the eight fractions are stirred, and the phases are isolated.
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watery. These still contain small amounts of phyllomycin. The organic phases obtained are stirred three times, each time with 2 liters of water each (the water is thrown off), and the mixture is distilled to dryness under vacuum on a bath at 60.
Fractions four, five and six contain most of the active product. By recrystallizing fraction five three times from methyl propyl ketone, 2 grams of phyllomycin in rosette-shaped needles, which still stop the growth of Rhodotorula flava, are obtained at the dilution of
1: 50,000,000 to 1: 100,000,000.
Melting point: 177-178.5 (uncorrected).
21 [a] D = +75 (C = 0.834% in chloroform)
C = 57.70% H = 5.77% N = 5.79% and 0 = 30.74%
Lambda max = 332 m mu with alpha = 9.70
Lambda max = 225 m mu with alpha = 60.
Example 2.
10 liters of culture juice from Streptomyces umbrosus nov. Spec. Are centrifuged. having an efficacy of 1: 50 against Rhodotorula flava; The clear centrifuged liquid is stirred with 50 grams of activated charcoal, and the charcoal is separated by centrifugation. In the culture medium freed from the adsorbent agent, approximately 10% of the efficiency remains. The adsorbed product is dried, stirred for 30 minutes at 50 with 1 liter of chloroform, centrifuged again, and the supernatant chloroform solution is distilled to dryness.
There remains as a residue 1.7 grams of an oil, which has a dilution of 1: 200,000 still stops the growth of Rhodotorula flava, and which can if necessary be further purified as indicated above.