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Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique L'invention se rapporte à la préparation d'un nouveau composé chimique possédant de précieuses propriétés antibiotiques, et de ses sels. Ce nouvel antibiotique sera dénommé dans ce qui suit paroinomycine 5>.
La paromomycine est une substance blanche, amorphe et stable, très soluble dans l'eau, modérément soluble dans le méthanol et peu soluble dans l'éthanol absolu. Elle est optiquement active et a un pouvoir rotatoire [ ]D d'environ -;- 640 (à 1,% dans l'eau).
La paromomycine contient seulement les éléments carbone, hydrogène, azote et oxygène. Elle a la formule
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La paromomycine donne un essai positif à la nin- hydrine, un essai positif Elson-Morgan pour un amino-sucre, un essai négatif pour le maltol après chauffage avec un alcali, et un essai Sakaguchi négatif pour les guanidines.
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge de la paromomycine en employant un gâchis d'huile minérale formé de la substance pulvérisée et d'huile minérale, est caractérisé par des sommets d'absorption aux longueurs d'onde de 2,93 et 6,25 microns. La fig. 1 montre le spectre d'absorption de la paromomycine dans l'infrarouge. La paromomycine forme des sels d'addition avec les acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et semblables.
La paromomycine donne un chlorhydrate ayant un pouvoir rotatoire [a]D d'environ -I- 56,5o ( à 1 % dans l'eau). Son pKa est égal à 6,3 et 8,35. Ce chlor- hydrate est plus soluble dans l'éthanol froid que dans l'éthanol chaud.
Le spectre d'absorption du chlorhydrate de paro- momycine dans l'infrarouge en employant un gâchis à l'huile minérale est caractérisé par des sommets d'absorption à des longueurs d'onde de 6,23, 6,61, 6,66, 8,72, 9,53 et 9,70 microns et une inflexion. à 2,95 microns. La fig. 2 montre le spectre d'absorption du chlorhydrate de paromomycine dans l'infrarouge.
La paromomycine forme un sulfate ayant un pou- voir rotatoire [a]D d'environ -I- 50,50 (à 1,5 % dans l'eau). Le spectre d'absorption du sulfate de paromo- mycine dans l'infrarouge en employant un gâchis à l'huile minérale est caractérisé par des sommets d'absorption prononcés à des longueurs d'onde de 6,17 et 6,55 microns, et une inflexion à 3,1 microns.
La fig. 3 montre le spectre d'absorption du sulfate de paro- momycine dans l'infrarouge.
La paromomycine est préparée, selon l'invention, en inoculant un milieu nutritif aqueux stérile ayant un pH entre 6 et 8,5, et contenant une source de carbone assimilable et une source d'azote et des substances minérales, avec du Streptomyces rimosus, forme paromomycinus, en soumettant à l'incubation le milieu inoculé à une température de 20 à 35o C en aérobie, en enlevant les matières solides présentes dans le milieu incubé et en isolant l'antibiotique produit de la solution ainsi obtenue, sous forme de base libre ou sous forme d'un sel d'addition d'acide.
Le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus est un microorganisme inconnu jusqu'ici, qui se rencontre dans les sols. Il a été isolé pour la première fois d'un échantillon de sol pris à Hacienda Tierra- dura, Miranda, Colombie, Amérique du Sud.
On peut obtenir des cultures de ce microorganisme en préparant une, suspension dans de l'eau stérile d'un échantillon du sol le contenant, en laissant les particules plus lourdes se déposer, en étendant la suspension surnageante résultante de ce sol en une série de dilutions sur des plaques d'agar nutritif, en soumettant ces plaques à l'incubation à 24 - 280 C pour produire le développement des microorganismes, et en transplantant des colonies individuelles choisies ressemblant au Streptomyces rimosus forme paromomycinus sur des plaques fraîches d'agar nutritif.
Après sélections répétées et transplantations de colonies non contaminées et caractéristiques sur des plaques frai- ches d'àgar nutritif, on obtient des thalles qui constituent des cultures pures du microorganisme cherché.
Le Streptomyces rimosus, forme paromomycimis a les caractères suivants : quand il s'est développé sur un milieu glycérine-asparagine-agar, le mycélium inférieur est jaune pâle à brun, et le mycélium aérien est blanc ; quand il a poussé sur un milieu amidon synthétique-agar, le mycélium inférieur est brun clair et le mycélium aérien est blanc ; sur un milieu malate de calcium-agar, le mycélium inférieur est jaune brun clair et le mycélium aérien est blanc; sur un milieu agar nutritif, le mycélium inférieur est jaune orange brun clair et il n'y a que peu ou pas de mycélium aérien ;
sur un milieu glucose-tryptone-agar, le mycélium inférieur est jaune clair à brun clair, le mycélium aérien est blanc, et une faible coloration brune apparait dans le milieu d'agar. Les colonies de surface sont élevées, unies, ridées ou plissées, et lézardées dans les aires de croissance épaisse ; souvent l'agar est aussi lézardé. Vus au microscope, les hyphes aériens sont irrégulièrement ramifiés ; les branches latérales sont courtes et incurvées en spirales. Les spirales sont nombreuses sur la plupart des milieux et se trouvent souvent en groupes denses. Les parties distales des hyphes aériens se subdivisent en chaînes de spores.
Le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus liquéfie la gélatine avec formation de peu ou pas de couleur dans le milieu et en général il ne peptonise pas le lait de tournesol. Dans le milieu synthétique d'agar (Pridham and Gottlieb, J.
Bact. 56, 108 (1948)), cet organisme utilise de nombreuses sources de carbone, y compris l'adonite, la cellobiose, la dex- trine, le dextrose, le d-galactose, la glycérine, l'i-ino- site, le lactose, le lévulose, le maltose, la d-mannite, le d-mannose, le mélibiose, la sorbite, l'amidon et le tréhalose ; il utilise moins facilement le l-arabinose, le raffinose et le xylose ;
il n'utilise pas l'esculine, la dulcite, l'inuline, le mélécitose, le rhamnose, la sali- cine et le sucrose. Cet organisme utilise de nombreuses sources d'azote, parmi lesquelles la dl-alanine, la l-arginine, l'acide dl-aspartique, la l-cystine, la l-cys- téine, l'acide 1-glutamique, la glycyl-glycine, la l-his- tidine, la 1-leucine, la l-lysine, la l-phénylalanine, la L-proline, la dl-sérine, la dl-thréonine,
la dl-valine, le sulfate d'ammonium et le nitrate de sodium; il utilise moins facilement la l-hydroxyproline, la dl-isoleucine, la dl-méthionine, le l-tryptophane, la l-tyrosine, la dl- norleucine, l'urée, et le carbonate d'ammonium.
Morphologiquement, le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus ressemble étroitement au Streptomyces rimosus (décrit par Sobin et al, au brevet U.S. 2516080 et conservé sous la désignation
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<tb> Table <SEP> 1
<tb> Comparaisons <SEP> de <SEP> colorations <SEP> du <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus, <SEP> forme <SEP> paromomycinus
<tb> et <SEP> du <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> NRRL <SEP> 2234,
<SEP> cultivés <SEP> sur <SEP> divers <SEP> milieux <SEP> à <SEP> agar
<tb> Milieu <SEP> Partie <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus
<tb> à <SEP> agir <SEP> caractéristique <SEP> forme <SEP> paromomycinus <SEP> NRRL <SEP> 2234
<tb> Glycérine- <SEP> Mycélium <SEP> inférieur <SEP> Jaune <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair <SEP> Jaune <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair
<tb> Asparagine <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> Blanc
<tb> Substratum <SEP> Aucune <SEP> Légèrement <SEP> brun <SEP> clair
<tb> Amidon <SEP> Mycélium <SEP> inférieur <SEP> Brun <SEP> clair <SEP> Brun <SEP> clair
<tb> synthétique <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> (faiblement <SEP> aérien)
<SEP> Blanc
<tb> Substratum <SEP> Aucune <SEP> Aucune
<tb> Malate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> Mycélium <SEP> inférieur <SEP> Jaune <SEP> brun <SEP> Jaune <SEP> brun
<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> Blanc
<tb> Substratum <SEP> Aucune <SEP> Légèrement <SEP> brun <SEP> clair
<tb> Milieu <SEP> nutritif <SEP> Mycélium <SEP> inférieur <SEP> Jaune <SEP> clair <SEP> - <SEP> brun <SEP> orangé <SEP> clair <SEP> Jaune <SEP> brun <SEP> clair
<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Pas <SEP> de <SEP> myc.
<SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> (faiblement <SEP> aérien)
<tb> Substratum <SEP> Aucune <SEP> Aucune
<tb> Glucose <SEP> Treptone <SEP> Mycélium <SEP> inférieur <SEP> Jaune <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair <SEP> Jaune <SEP> brun <SEP> à <SEP> brun <SEP> orangé
<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> Blanc
<tb> Substratum <SEP> Légèrement <SEP> brun <SEP> clair <SEP> Brun <SEP> clair
NRRL 2234 dans la collection de culture permanente de la Northern Utilization Research Branch à Peoria, Illinois). Ces deux microorganismes présentent des colorations semblables de leurs mycéliums inférieurs et aériens, comme cela est indiqué à la table 1.
Le S. rimosus est quelque peu plus, foncé et colore souvent l'agar plus que ne le fait le Strepto- myces rimosus, forme paromomycinus. Dans les essais d'utilisation du carbone, le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus et le S. rimosus utilisent les mêmes sources de carbone sauf le l-arabinose, que le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus n'utilise que faiblement tandis que le S. rimosus l'utilise bien (Table II).
En ce qui concerne l'utilisation de l'azote, les deux organismes sont semblables (Table III). Microscopiquement, le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus ressemble étroitement au S. rimostrs. Les deux organismes forment des groupes denses de spirales sur des milieux agar et glycérine- asparagine, amidon synthétique, malate de calcium et glucose-tryptone. Sur un milieu d'agar nutritif les deux organismes ne forment que peu de mycélium aérien, et au microscope, leurs filaments aériens sont pour la plupart courts et droits, avec seulement des spirales fortuites.
Avec les deux organismes, la croissance en surface et l'agar se fondent souvent aux endroits de développement épais sur divers milieux agar.
Du fait que le Streptomyces rimosus, forme paro- momycinus ressemble étroitement au S. rimosus, NRRL 2234, morphologiquement et à bien des égards physiologiquement, on conclut que le Strep- tomyces rimosus, forme paromomycinus représente une forme nouvelle et distincte du Streptomyces ri- mosus. Une culture de Streptomyces rimosus, forme paromomycinus est conservée dans la collection de culture permanente du Bureau de Culture de Parke, Davis & Co., Detroit, Michigan, sous No 04998,
et à la Culture Collection of the Fermentation Division (collection de cultures de la Division de Fermentation), Northern Utilization Research Branch, Département de l'Agriculture des U.S., Peoria, Illinois, sous No NRRL 2455.
Pour l'inoculation, on peut employer des spores ou conidies du Streptomyces rimosus, forme paromo- mycinus. Des suspensions aqueuses, de ceux-ci, cou- tenant une faible proportion de savon ou autre agent mouillant, peuvent aussi être utilisées. Pour des fermentations en grand, il est préférable d'employer des cultures vigoureuses et jeunes du microorganisme.
Comme source de carbone assimilable dans le milieu nutritif aqueux, on peut employer soit des hydrates de carbone purs, soit les mélanges d'hydrates de carbone disponibles dans le commerce. Comme exemples de ces substances qui conviennent pour ce but, on peut citer le glucose, le d-mannose, le d-ga- lactose, le sirop de maïs, l'amidon, l'amidon soluble, les liqueurs de malt, les mélasses, les amidons hydrolysés, la glycérine, etc.
La quantité d'hydrate de car- bone présente dans le milieu de culture n'est pas particulièrement critique ; elle peut varier de 0,5 1/o à 5 'o/o en poids du poids total dudit milieu.
La source d'azote dans le milieu nutritif peut être de nature organique, inorganique ou organique- inorganique en mélange. Comme exemples des diverses substances azotées pouvant être employées dans le milieu nutritif, on peut citer les aminoacides, les peptones, les protéines hydrolysées ou non hydrolysées, la farine de poissons, la farine de soya, la liqueur de macération de maïs, des extraits de viande,
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<tb> Table <SEP> II
<tb> Comparaison <SEP> de <SEP> l'utilisation <SEP> du <SEP> carbone <SEP> par <SEP> le <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus, <SEP> forme <SEP> paromomycinus,
<tb> et <SEP> le <SEP> S.
<SEP> rimosus <SEP> NRRL <SEP> 2234
<tb> Sources <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus
<tb> de <SEP> carbone <SEP> forme <SEP> paromomycinus <SEP> NRRL2234
<tb> Monosaccharides
<tb> Pentoses
<tb> L-Arabinose <SEP> 0 <SEP> à <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Rhamnose <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> D-Xylose <SEP> 0 <SEP> à <SEP> + <SEP> 0 <SEP> à <SEP> -I-Hexoses
<tb> Dextrose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Galactose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Lévulose <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> D-Mannose <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Disaccharides
<tb> Cellobiose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Lactose <SEP> ++ <SEP> à <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Maltose <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Mélibiose <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> à <SEP> ++++
<tb> Sucrose <SEP> 0
<SEP> 0
<tb> Tréhalose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Trisaccharides
<tb> Mélécitose <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Raffinose <SEP> . <SEP> + <SEP> à <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> à <SEP> + <SEP> +
<tb> Polysaccharides
<tb> Dextrine <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Inuline <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Amidon <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Alcools <SEP> polyhydroxyliques
<tb> Adonite <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Dulcite <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Glycérine <SEP> +++ <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> i-Inosite <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Mannite <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++++
<tb> D-Sorbite <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Divers
<tb> Aesculine <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Salicine <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 0 <SEP> = <SEP> pas <SEP> de <SEP> croissance
<tb> + <SEP> = <SEP>
croissance <SEP> faible
<tb> + <SEP> + <SEP> = <SEP> croissance <SEP> assez <SEP> bonne
<tb> + <SEP> + <SEP> -I- <SEP> = <SEP> bonne <SEP> croissance
<tb> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> = <SEP> très <SEP> bonne <SEP> croissance.
<tb> Chaque <SEP> source <SEP> de <SEP> carbone <SEP> a <SEP> été <SEP> essayée <SEP> à <SEP> une <SEP> concentration <SEP> de <SEP> 0,1 <SEP> /a <SEP> en <SEP> poids, <SEP> dans <SEP> le <SEP> milieu <SEP> synthétique <SEP> à <SEP> agar <SEP> décrit
<tb> par <SEP> Pridham <SEP> et <SEP> Gottlieb, <SEP> J. <SEP> Bact., <SEP> 56, <SEP> 108, <SEP> 1948.
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Table l11 Comparaison de l'utilisation de l'azote par le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus, et le S.
rimosus, NRRL 2234 Streptomyces rimosus Streptomyces rimosus Sources d'azote* forme paromomycinus NRRL 2234 Inorganiques Nitrate de sodium + + + + + + + + Sulfate d'ammonium + + + + + + + + Ammonium + + + + Organiques Dl-Alanine + + + + + + + + L-Arginine + + + + + + + + Acide dl-aspartique + + + + + + + + L-Cystine + + + + + + + L-Cystéine + + + + + + + + Acide 1-glutamique + + + + + + + + Glycyl-glycine + + + + + + + + L-Histidine + + + + + + + L-Hydroxyproline + + Dl-Isoleucine + + + + L-Leucine + + + + + + + L-Lysine ++++ +++ Dl-Méthionine + + + L-Phénylalanine + + + + + + + + L-Proline ++++ ++++ Dl-Sérine + + + + + + + Dl-Thréonine + + + + + + + + L-Tryptophane + + L-Tyrosine + + Dl-Norleucine + + + + + DL-Valine + + + + + + + + Urée + + + + @ 'k Chaque source d'azote a été essayée à une concentration 0,
01 M d'équivalent d'azote dans le milieu synthétique à agar décrit par Pridham et Gottlieb, J. Bact. 56, 108, 1948, modifié par omission du sulfate d'ammonium et adjonction de 1,0 /o en poids de dextrose. la farine d'arachide, les nitrates inorganiques, l'urée, les sels d'ammonium, etc. Vu la nature brute de la plupart des substances azotées facilement disponibles, la quantité qu'il faut en ajouter au milieu nutritif varie quelque peu selon leur degré de pureté. On peut dire cependant qu'en pratique les substances azotées ne doivent pas excéder 6 % en poids du poids total du milieu de fermentation.
II est nécessaire qu'il y ait une certaine quantité de sels minéraux pour obtenir les meilleurs rendements en paromomycine. En général, beaucoup des matières brutes telles que la liqueur de macération de maïs, les résidus de la fermentation butanol-acétone, les préparations de levures, la farine de soya avec l'huile, etc., contiennent des quantités suffisantes de sels minéraux. Cependant, pour assurer la présence de quantités adéquates des composants minéraux du milieu, il est en général avantageux d'ajouter de faibles quantités de sels inorganiques tels que le chlorure de sodium, le bicarbonate de sodium, le carbonate de calcium, l'acétate de sodium, etc.
La con- centration préférée en sels minéraux est de 0,1 à 1 % du milieu nutritif. La culture du Streptomyces rimosus, forme paro- momycinus dans le milieu nutritif aqueux peut être effectuée de diverses manières. Par exemple, le microorganisme peut être cultivé en aérobie à la surface du milieu, ou bien il peut être cultivé au-dessous de la surface du milieu, c'est-à-dire à l'état submergé, à condition de fournir simultanément de l'oxygène.
Le mode de faire préféré pour produire la paro- momycine sur une large échelle comprend l'emploi de cultures submergées, ou en profondeur du Strep- tomyces rimosus, forme paromomycinus. Dans cette manière de mettre en oeuvre l'invention, on inocule un milieu nutritif aqueux stérile avec du Streptomyces rimosus, forme paromomycinus et soumet le milieu à l'incubation avec agitation et aération à une température entre 20 et 351, C,
de préférence dans le voisinage de 23 - 300 C jusqu'à ce qu'il se soit produit une concentration maximum de la paromomycine dans le liquide de culture. Le temps requis pour cette production maximum de paromomycine varie avec les dimensions et le genre de l'appareil employé. Par exemple, pour une fermentation industrielle sur une
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large échelle, telle qu'on l'effectue dans les appareils de fermentation du type à réservoir, la production maximum de paromomycine est atteinte en environ trois à six jours.
On peut limiter la période d'incubation à des temps plus courts, mais les rendements sont en général inférieurs. Des périodes d'incubation plus longues ne paraissent pas diminuer la quantité de paromomycine présente dans le liquide de culture. Lorsqu'on emploie, pour l'incubation, des ballons se- coueurs, le temps pour la production maximum peut être un peu plus long que celui requis avec les cuves de fermentation en grand.
Dans des conditions de culture submergée, le microorganisme se développe sous forme de particules plus ou moins séparées, dispersées dans tout le milieu nutritif, contrastant avec la pellicule plus ou moins continue qui se forme à la surface du milieu dans la méthode de culture en surface. Grâce à cette distribution de l'organisme dans la masse du milieu, on peut cultiver de grands volumes du milieu nutritif inoculé en une seule fois dans les grands réservoirs ou cuves ordinairement employés dans l'industrie de la fermentation.
Les, appareils de fermentation à réservoir stationnaire, munis de dispositifs convenables d'agitation et d'aération, de même que les appareils de fermentation à tambour rotatif, se sont trouvés particulièrement adaptés à ces fins. Cependant, pour la préparation de plus petites quantités de l'antibiotique ou de cultures du microorganisme, la méthode à culture submergée peut être exécutée dans de petits ballons ou vases qui peuvent être secoués ou agités par des moyens mécaniques convenables.
L'agitation et l'aération du mélange de culture peuvent être réalisées de différentes manières. L'agitation peut être obtenue par des turbines, des palettes, des propulseurs ou tout autre dispositif mécanique d'agitation, par renversement ou secouage du récipient de fermentation lui-même, par des dispositifs de pompage, ou encore par le passage d'air à travers le milieu.
L'aération peut être effectuée en injectant de l'air dans le milieu de fermentation par des tuyaux ouverts, à travers des tuyaux perforés ou des moyens de diffusion poreux tels que des pièces de charbon, du carborundum, du verre aggloméré, etc. ; elle peut aussi être réalisée en pulvérisant, giclant ou versant le mélange dans ou à travers une atmosphère contenant de l'oxygène.
La production de paromomycine par culture en surface comprend l'inoculation d'une couche peu profonde, en général de moins de 2 cm, d'un milieu nutritif aqueux stérile avec du Streptomyces rimosus, forme paromomycinus et en soumettant le mélange à une incubation en aérobie à une température de 20 à 350 C. Il est en général nécessaire que la période d'incubation soit plus longue que dans l'incubation en profondeur pour obtenir la production maximum de paromomycine. En général, cette ,période d'incubation est de dix à quinze jours.
Lorsque la phase d'incubation est terminée, le mycélium est enlevé du liquide, lequel contient la paromomycine cherchée, et le produit est isolé du liquide de culture par les méthodes décrites ci-après.
Après achèvement de la phase de fermentation du procédé, la matière solide présente dans le mélange de culture est enlevée de toute manière convenable, par exemple par filtration, centrifugation, etc., et la paromomycine est isolée du liquide de culture restant. L'isolement peut se faire de façon commode par les méthodes d'échange d'ions, de préférence par adsorption et élution de la paromomycine en employant un échangeur de cations sous sa forme de sel.
La paro- momycine contenue dans l'éluat peut être isolée par concentration à siccité, ou, si on le désire, elle peut être encore purifiée, avant de l'isoler, par des adsorptions et élutions répétées.
Selon l'une des méthodes préférées pour isoler la paromomycine du mélange de culture, on soumet le milieu de culture résiduaire à l'adsorption et l'élu- tion à l'aide d'une résine d'échange de cations sous sa forme de sel, on concentre l'éluat, on fait adsorber l'éluat concentré sur du charbon activé, on extrait la paromomycine du charbon et récupère de l'extrait la paromomycine à l'état libre ou sous forme d'un sel d'addition avec un acide minéral.
Selon cette méthode, le liquide de culture obtenu en enlevant la matière solide du mélange de culture de fermentation, est ajusté à un pH d'approximativement 6,8 à 7,5, puis on le fait passer à travers une colonne d'adsorption contenant une résine à acide carboxylique sous forme de sel, tel que le sel de sodium, de potassium ou d'ammonium. La résine contenant la paromomy- cine adsorbée est lavée avec de l'eau puis est éluée avec un acide minéral aqueux dilué tel que l'acide chlorhydrique, ou une base telle que l'hydroxyde d'ammonium.
On concentre l'éluat, on y mélange du charbon activé, et le charbon contenant la paroma- mycine ou son sel adsorbé est retiré du mélange ; la paromomycine ou le sel de paromomycine est ensuite élué de ce charbon avec un solvant organique convenable, tel qu'un alcool aliphatique inférieur aqueux ou anhydre, ou une cétone. La paromomy- cine ou son sel peut être isolée de cet éluat en éliminant le solvant dans le vide ou par précipitation.
Dans certains cas, après élution de la paromomy- cine de l'échangeur de cations, il est désirable, surtout si des quantités notables de sels minéraux sont présents, d'élever le pH de l'éluat par addition d'une base avant l'adsorption sur du charbon activé. Dans ces cas, on ajuste l'éluat à un pH d'environ 9 à 9,7, on mélange du charbon activé avec cet éluat, retire du mélange le charbon contenant la paromomycine adsorbée et le lave avec de l'eau, puis la paromomy- cine en est éluée avec un acide minéral dilué.
La paromomycine contenue dans l'éluat résultant est isolée de façon commode en faisant passer l'éluat à travers un échangeur contenant une résine à échange d'anions sous forme hydroxyle, en recueillant et neutralisant le percolat, et en traitant ce percolat neutre par échange avec une résine d'échange de cations, en
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éluant avec de l'hydroxyde d'ammonium et en lyophilisant l'éluat.
Selon une autre méthode préférée pour isoler la paromomycine, le liquide de culture de fermentation est adsorbé et élué de la façon ci-dessus décrite en employant une résine échangeuse de cations, le pH de l'éluat résultant est ajusté, si nécessaire, à environ 4,5 - 7, et l'on fait passer l'éluat à travers une colonne contenant un mélange en quantités à peu près égales de charbon activé et de terres de diatomées. Le sel de paromomycine qui est retenu par la colonne, est élué par lavage avec de l'eau.
Des quantités supplémentaires de paromomycine restant dans la colonne après lavage avec de l'eau peuvent être récupérées par un nouveau lavage avec des solvants organiques aqueux dilués ou avec un acide minéral aqueux dilué. Le sel d'acide minéral de la paromomy- cine peut être retiré de ces liquides de lavage en éliminant le solvant dans le vide, ou par précipitation.
La paromomycine peut être dégradée par hydrolyse avec un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique en donnant un sel cristallin contenant, à l'ana- lyse élémentaire, 32 - 33 '% de carbone, 7'% d'hy- drogène,
9 - 10 % d'azote et 23 - 24 % de chlore. Les produits d'une telle hydrolyse par acide miné- ral sont sans activité antibactérielle appréciable.
La paromomycine est fortement active bactério- statiquement contre une grande variété d'organismes pathogènes. En particulier, elle est pleinement active in vitro contre les espèces de staphylocoques qui résistent à l'oxytétracycline, l'érythromycine ou la car- bomycine. La table IV montre le spectre antibactériel de la paromomycine employée comme sulfate, in vitro.
EMI7.47
Table !v Spectre antibactériel du sulfate de paromomycine l\ Concentration inhibitrice minimum du sulfate de paromomycine Culture en #tg/ml Clostridium. perfringens . . . . . . . . . . . 100.0 Coryn.ebacterium diphtheriae . . . . . . . .
0.39 Diplococcus pneumoniae . . . . . . . . . . 100.0 Micrococcus pyogenes var. aureus . . . . . . 0.78 Streptococcus pyogenes . . . . . . . . . . . 25.0 Streptococcus salivarius . . . . . . . . . . . 50.0 Aerobacter aerogenes . . . . . . . . . . . . 6.25 Brucella suis . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.13 Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . 12.5 Klebsiella pneumoniae . . . . . . . . . . . . 1.56 Neisseria catarrhalis . . . . . . . . . . . . . 0.78 Pasteurella multocida . . . . . . . . . . . . 6.25 Proteus vulgaris . . . . . . . . . . . . . . . 3.13 Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . - 50.0 Salmonella paratyphi . . . . . . . . . . . . 1.56 Salmonella schottmuelleri . . . . . . . . . . 12.5 Salmonella typhosa . . . . . . . . . . . . . 6.25 Shigella dysenteriae . . . . . . . . . . . . . 12.5 Shigella paradysenteriae . . . . . . . . . . . 12.5 Shigella sonnei . . .
. . . . . , . . . . . . . 12.5 Vibrio comma . . . . . . . . . . . . . . . . 25.0 Mycobacterium phlei . . . . . . . . . . . . 0.19 Mycobacterium tuberculosis var. hominis. . 0.19 Déterminée par des essais faits deux fois sur des séries de dilutions de bouillon. Pureté estimée à 60-70 /a. La paromomycine est un agent utile pour la prévention d'une infection possible par des microorganismes pathogènes.
La paromomycine possède d'importantes propriétés antiparasites et est particulièrement utile pour combattre l'Endomoeba histolytica, agent produisant l'ameliasis. Elle est aussi utile pour le traitement d'infections locales en surface, causées par divers microbes pathogènes ; elle est particulièrement applicable au traitement d'infections, causées par des espèces de staphylococcus qui résistent aux divers antibiotiques ordinairement employés, soit l'oxytétracycline, l'érythromycine, la carbomycinë, etc.
Pour ces applications, la paromomycine peut être employée sous forme de base libre ou de sel par addition d'acide minéral tel que le chlorhydrate, le sulfate, etc. Elle peut être appliquée sous diverses formes qui conviennent, par exemple comme poudre en mélange avec un diluant inerte tel que le talc, l'amidon, etc., ou comme onguent, contenant une base inerte pour pommade et une faible proportion de
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paromomycine, ou encore en solution aqueuse diluée contenant, si on le désire, un agent tension-actif compatible.
Sous ces formes, la paromomycine peut être avantageusement employée à une concentration d'environ 5 mg par centimètre cube, pour les solutions, et d'environ 5 mg par gramme, pour les poudres et les onguents. La paromomycine a l'avantage d'être relativement non toxique et d'être stable dans des conditions variables d'usage. Employée comme bactériostat, la paromomycine est appliquée directement au lieu d'infection, et d'autres applications peuvent être faites périodiquement, si cela est nécessaire. Si on le désire, la paromomycine peut être employée en combinaison avec d'autres agents bactériostatiques.
Les exemples suivants servent à illustrer l'invention.
Exemple 1: Douze litres d'un milieu nutritif ayant la composition suivante
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<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ...... <SEP> 0,5
<tb> Glycérine <SEP> .... <SEP> . <SEP> .................... <SEP> 0,5
<tb> Caséine, <SEP> hydrolysée <SEP> à <SEP> l'acide <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,3
<tb> Peptone............................ <SEP> 0,25
<tb> Levure <SEP> de <SEP> brasserie <SEP> ... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb> Substances <SEP> solides <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 0,25
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,25
<tb> Résidu <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> acétone-butanol <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,25
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> ...... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb> Eau, <SEP> ce <SEP> qu'il <SEP> faut <SEP> pour <SEP> faire <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 100,0
sont mis dans un récipient de fermentation de 30 litres, muni d'un appareillage en acier inoxydable comprenant un diffuseur, un propulseur, des chicanes et des tuyaux de prise d'échantillons, et le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant deux heures.
Le milieu est alors refroidi et inoculé avec 20 ml d'une suspension dans une solution stérile à 0,1% d'heptadécyl-sulfate de sodium, de spores de Strepto- myces rimosus, forme paromomycinus provenant de deux cultures de sporulation selon Moyer sur agar en pente.
Le mélange de culture inoculé est soumis à l'incubation à 26() C pendant soixante heures, au cours desquelles le mélange est agité à 200 t.p.rn. et de l'air stérile est fait passer dans le milieu par le diffuseur à raison de 12 litres à la minute.
Une partie du milieu de culture incubé résultant est employée pour l'inoculation de 16 litres d'un milieu nutritif de la composition suivante
EMI8.42
<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> ...... <SEP> . <SEP> ..... <SEP> 1,0
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ..... <SEP> 0,1
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ........ <SEP> .....
<SEP> 0,167
<tb> Résidu <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> 0,5
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> voulue <SEP> pour <SEP> faire <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100,0
Le pH de ce dernier milieu nutritif est ajusté à 7,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 10N, et le milieu est placé dans un récipient de fermentation de 30 litres, en verre, muni d'un diffuseur, d'un propulseur, de chicanes et d'un tuyau de prise d'échantillons. Le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant deux heures, laissé refroidir, puis inoculé avec 800 ml du milieu de culture obtenu comme décrit ci-dessus.
Le mélange de culture résultant est soumis à l'incubation à 26,1 C pendant nonante-quatre heures, pendant lesquelles le mélange est agité à 200 t.p.m. et que l'on fait passer de l'air stérile dans le milieu à l'aide du diffuseur, à raison de 16 litres par minute. Pendant l'incubation, on évite la formation de mousse par addition, selon besoin, d'axonge brute et d'huiles minérales contenant des mono- et di-glycérides.
A la fin de la période d'incubation, le milieu de culture de fermentation est ajusté à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique concentré, les substances solides présentes sont enlevées par filtration, et la masse sur le filtre est lavée avec de l'eau. Les eaux de lavage sont combinées avec le filtrat principal, le pH est ajusté à 7,0, et 15,5 litres de ce liquide de culture filtré sont introduits dans un échangeur en colonne (d. i. 38 mm), rempli de 380 ml d'une résine à acide carboxylique ayant été préalablement lavée successivement avec deux litres d'une solution aqueuse de 37,5 g d'hydroxyde de sodium puis avec deux litres d'eau.
La colonne contenant la paromo- mycine est lavée avec deux volumes d'eau, et est éluée avec de l'acide chlorhydrique 0,5 N. Les premiers 19,4 litres du percolat contiennent peu ou pas de paromomycine, et leur pH varie de 6 à 7,3. Quand le pH de l'éluat commence à tomber au-dessous de 6,0, on en recueille 2 litres.
Cette portion de deux litres est neutralisée à un pH 6 avec une solution d'hydroxyde de sodium 10 N et est filtrée. Le filtrat est concentré par évaporation dans le vide à un volume d'environ un litre.
On prépare une colonne d'adsorption en versant un mélange aqueux boueux de 65 g de charbon activé lavé à l'acide (produit marque Darco G-60) et 50 g de terre de diatomées dans une colonne de 38 mm, et on y ajoute 300 ml du filtrat concentré. La colonne est lavée avec 400 ml d'eau et éluée successivement avec 325 ml d'eau, 425 ml d'acétone aqueux à 1:
% et 400 ml d'acétone aqueux à 10 0/0. Les éluats d'eau et d'acétone sont concentrés et lyophilisés pour obtenir le chlorhydrate de paromomy- cine sous forme d'une poudre. Le produit est purifié en reprenant la poudre dans du méthanol, ajoutant un grand excès d'acétone à la solution, et récupérant par filtration le précipité qui se forme.
Le produit, le chlorhydrate de paromomycine a un pouvoir ro- tatoire [CC] 25 = -I- 56,50 (à 1% dans l'eau).
A l'analyse le chlorhydrate de paromomycine donne 35,71 % de carbone, 6,95 % d'hydrogène, 8,42 % d'azote et 21,5% de chlore.
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Pour obtenir la paromomycine à l'état de base libre, le chlorhydrate -est dissous dans l'eau pour for- mer une solution à 3 % ;
celle-ci est versée dans une colonne d'adsorption contenant une résine d'échange d'anions (produit marque Amberlite IR-45), ou de préférence IRA 411 ou IRA 400 à la forme hydroxyle, et la colonne est lavée avec une faible quantité d'eau.
Le percolat aqueux est concentré à siccité par lyophilisation, et le produit solide obtenu est purifié en le reprenant avec de l'éthanol obsolu bouillant, en refroidissant, et récupérant la paromo- mycine solide ; [a]25 = -I- 640 (à 1 % dans l'eau).
Par analyse, elle contient 45,17 % de carbone, 7,44'% d'hydrogène et 10,35'% d'azote. Exemple 2 Pour préparer un inoculum frais pour la produo- tion de paromomycine sur une large échelle décrite ci-après, 76 1 d'un milieu nutritif ayant la composition suivante
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<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> .... <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> - <SEP> . <SEP> - <SEP> - <SEP> .
<SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Résidu <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ... <SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> voulue <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 100,0
sont introduits dans un récipient de fermentation de l901. en acier inoxydable, et le pH est ajusté à 7,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 6 N. On stérilise le milieu par chauffage à 121 C pendant une heure.
Le milieu est alors refroidi et inoculé avec 40 ml d'une suspension de spores de Strepto- nzyces rimosus, forme paromomycinus dans une so- lution stérile d'heptadécylsulfate de sodium à 0,1 %, préparée de la manière décrite à l'exemple 1. Le milieu de culture est soumis à l'incubation à 260 C pendant soixante-quatre heures, durant lesquelles on lui fournit de l'air stérile à l'aide d'un diffuseur à raison de 9,8 pieds cubes par minute.
Pendant l'incubation, on ajoute un mélange stérilisé d'axongei brute et d'huiles minérales contenant des mono- et di-gly- cérides selon besoin pour éviter la formation de mousse.
La culture incubée ainsi obtenue est employée pour inoculer la culture principale, qui a été préparée de la manière suivante 435 1 d'un milieu ayant la composition suivante
EMI9.63
<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> ---- <SEP> l'o
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> ------ <SEP> l'o
<tb> Résidu <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .......
<SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,5
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> voulue <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 100,0
sont mis dans un récipient de fermentation de 7601 en acier inoxydable, et le pH est ajusté à 7,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 6 N. Le milieu est stérilisé par chauffage à 121o C pendant une heure, puis on le laisse refroidir.
Le milieu stérile est inoculé avec 381 de la culture préparée comme décrit ci-dessus et est soumis à l'incubation à 260 C pendant septante-deux heures, durant lesquelles on lui fournit de l'air stérile par un diffuseur à raison de 9411 par minute, et on l'agite avec un propulseur tournant à une vitesse de 230 t.p.m. Pour éviter une formation excessive de mousse pendant l'incubation, on ajoute selon besoin 8,1 litres d'un mélange stérile d'axonge brute et d'huiles minérales.
A la fin de la période d'incubation, le mélange de culture est amené à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique concentré ; on le filtre et la masse sur le filtre est lavée avec de l'eau. Le filtrat et les eaux de lavage combinés 5641 sont neutralisés et ajoutés à une colonne d'adsorption (d. i. 152 mm), garnie avec 13 litres d'une résine à acide carboxylique ( Amberlite IRC-50) qui a été préalablement neutralisée par percolation avec une solution de 1,265 g d'hydroxyde de sodium dans 60 litres d'eau.
La colonne qui contient la paromomycine, est lavée avec environ 40 litres d'eau, puis éluée avec de l'acide chlorhydrique 0,5 N. Lorsque le pH du liquide sortant de la colonne tombe au-dessous de 6, on recueille 88,5 litres de l'éluat, on les neutralise avec une solution d'hydroxyde de sodium 6 N, puis on concentre par évaporation dans le vide jusqu'à environ un dixième du volume.
Un quart de litre de l'éluat concentré est ajouté à une colonne d'adsorption préparée en mettant une boue aqueuse de 80 g de charbon activé (produit marque Darco G-60) et 60 g de terre de diatomées dans un tuyau de 38 mm ayant une capacité d'environ 360 ml. Le chlorhydrate de paromomycine contenu dans la colonne est retiré par élution avec 11/2 litre d'eau. L'éluat est concentré, congelé, et séché à l'état congelé sous un vide très poussé.
Le produit solide obtenu, le chlorhydrate de paromomy- cine, représente un rendement de 64'% de l'activité de la paromomycine, présente initialement dans le mélange de culture à la fin de la fermentation.
Pour transformer le chlorhydrate de paromomy- cine en le sulfate correspondant, on dissout 1 g de ce chlorhydrate dans. 25 ml de méthanol et on ajoute à la solution 4,5 ml d'une solution aqueuse molaire d'acide sulfurique. Le précipité qui se forme est isolé par filtration, et la masse sur le filtre est lavée avec du méthanol et séchée. Le produit résultant, le sulfate de paromomycine sous une forme contenant un ion chlorure, est dissous dans de l'eau et le pH de la solution est ajusté à 6,0 par mélange avec une quantité suffisante d'une résine d'échange d'anions à la forme hydroxyle.
La résine est enlevée par filtration et le filtrat est concentré par lyophilisation. La gomme résiduaire est convertie en un solide blanc par trituration avec de l'acétone. Le produit solide est
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isolé par filtration, lavé avec de l'acétone et séché. Le produit, sulfate de paromomycine, a un pouvoir rotatoire [a]15 de + 50,50 (à 1 A/o dans de l'eau).
Exemple 3: Pour préparer un inoculant frais pour la production de paromomycine sur une large échelle, comme cela est décrit ci-après, 12 litres d'un milieu nutritif de la composition suivante
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<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ....... <SEP> 2,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Résidu <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ... <SEP> .......... <SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> .............. <SEP> 0,5
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour <SEP> faire <SEP> ...... <SEP> 100,0
sont placés dans un récipient de fermentation de 30 litres à agitateur, et le pH est ajusté à 7,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 6 N.
Le milieu est stérilisé par chauffage à 12l C pendant deux heures, puis on le laisse refroidir et on l'inocule avec 20 ml d'une suspension de spores de Streptomyces rimosus, forme paromomycinus, dans une solution stérile d'heptadécyl-sulfate de sodium à 0,1'% préparée comme décrit à l'exemple 1.
Le mélange de culture est soumis à l'incubation à 260 C pendant 71 heures, durant lesquelles de l'air stérile est fourni par un diffuseur à raison de 12 litres à la minute, et le mélange est agité au moyen d'un propulseur tournant à raison de 200 t.p.m.
La culture incubée ainsi obtenue est employée pour inoculer la culture principale, préparée de la manière suivante 38 1 d'un milieu ayant la composition
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<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> ..... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Résidu <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ... <SEP> .......... <SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Eau <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour <SEP> faire <SEP> ...... <SEP> 100,0
sont préparés dans un récipient de fermentation en acier inoxydable de 1141, et le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant une heure. On laisse le milieu refroidir et on l'inocule avec 100 ml de l'inoculant frais, préparé comme indiqué ci-dessus. Le milieu inoculé est soumis à l'incubation, à 26ç) C pendant vingt-quatre heures, durant lesquelles de l'air stérile lui est fourni par un diffuseur à raison de 1821 par minute.
l1361 d'un milieu nutritif ayant la même composition que décrit ci-dessus, sont préparés et placés dans un récipient de fermentation de 19001, en acier inoxydable, et le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant 1 heure. On laisse refroidir le milieu stérile et on l'inocule avec 381 du mélange de culture obtenu par la fermentation précédente.
Le milieu inoculé est soumis à l'incubation à 26,1 C pendant vingt-trois heures, pendant lesquelles il est aéré par un diffuseur à raison de 12601 par minute, le mélange étant agité au moyen d'un propulseur tournant à raison de 84 t.p.m. Pendant cette incubation, pour éviter une formation excessive de mousse, on ajoute selon besoin 3,9 litres d'un mélange stérile d'axonge brute et d'huiles minérales contenant des mono- et di-glycérides.
On prépare 45401 d'un milieu de même composition que celui ci-dessus décrit, et présentant un pH de 7,5, et on les met dans un récipient de fermentation de 7600l, en acier inoxydable. Le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant 1 heure, puis laissé refroidir. Le milieu stérile (pH 6,65) est inoculé avec 7571 du milieu de culture décrit immédiatement ci-dessus, et il est soumis à l'incubation à 26,1 C pendant quarante-neuf heures. Pendant l'incubation, de l'air est fourni à raison de 33601 à la minute et le milieu est agité à l'aide d'un propulseur tournant à raison de 125 t.p.m.
Le milieu de culture (7760l contenant la paro- momycine à une concentration d'environ 0,2 mg/ml) est filtré, la masse sur le filtre est lavée avec de l'eau, et le filtrat et eaux de lavage combinés (90801) sont amenés à un pH de 7,2 et sont ajoutés à une colonne d'adsorption préparée en garnissant une colonne de 457 mm avec 184 litres d'une résine à acide carboxylique ( Amberlite IRC-50) et neutralisant la résine par percolation avec 6481 d'hydroxyde de sodium 0,6 N.
La colonne est alors lavée avec environ 12301 d'eau, et éluée avec 21201 d'acide chlorhydrique 0,5 N et 7951 d'acide chlorhydrique 0,6 N, des lavages à l'eau étant faits après chaque élution à l'acide, de façon à obtenir un volume total d'éluat de 36901.
Des éluats combinés provenant de plusieurs opérations semblables (volume total 30701) sont amenés à un pH de 9,5 avec de l'hydroxyde de sodium 6 N. On ajoute alors du charbon activé ( Darco G-60) à raison de 1,5'% poids/volume, et de la terre d'infusoires à raison de 1,0'0/() p/v, et agite le mélange pendant 1/2 heure. Puis le mélange est filtré dans un filtre-presse que l'on lave avec 37651 d'eau. La paro- momycine est éluée avec 928l d'acide sulfurique 0,05 N et 12651 d'acide sulfurique 0,1 N.
Les éluats d'acide sulfurique sont combinés et on les fait passer sur 453 kg d'une résine échangeuse d'anions ( Amberlite IR-45) à la forme hydroxyle. On détermine périodiquement le pH de l'éluat, et quand il tombe au-dessous de 9, la résine est régénérée. Le percolat contient la paromomycine à l'état de base libre.
Une portion de 6461 du percolat concentré, contenant 1,3 - 1,5 g de paromomycine, est amené à un pH de 7,3 avec de l'acide sulfurique 1 N, et on la fait passer à travers 5 ml d'une résine à acide carboxylique, à la forme ammonium. La résine est ensuite lavée avec de l'eau, et l'eau de lavage, qui contient
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une faible quantité de matière active, est rejetée. La paromomycine est éluée avec de l'hydroxyde d'ammonium 1 N, et l'éluat est séché à froid. Le rendement en le produit cherché, la paromomycine, est de 1,125 g.
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Process for preparing a novel antibiotic The invention relates to the preparation of a novel chemical compound having valuable antibiotic properties, and its salts. This new antibiotic will be referred to below as paroinomycin 5>.
Paromomycin is a white, amorphous and stable substance, very soluble in water, sparingly soluble in methanol and sparingly soluble in absolute ethanol. It is optically active and has a rotatory power [] D of approximately -; - 640 (at 1.% in water).
Paromomycin contains only the elements carbon, hydrogen, nitrogen and oxygen. She has the formula
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Paromomycin gives a positive ninhydrin test, an Elson-Morgan positive test for an amino sugar, a negative test for maltol after heating with an alkali, and a negative Sakaguchi test for the guanidines.
The infrared absorption spectrum of paromomycin by employing a mess of mineral oil formed by the pulverized substance and mineral oil, is characterized by absorption peaks at wavelengths of 2.93 and 6 , 25 microns. Fig. 1 shows the absorption spectrum of paromomycin in the infrared. Paromomycin forms addition salts with mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid and the like.
Paromomycin gives a hydrochloride having an optical rotation [a] D of about -I-56.5o (at 1% in water). Its pKa is equal to 6.3 and 8.35. This hydrochloride is more soluble in cold ethanol than in hot ethanol.
The infrared absorption spectrum of paromycin hydrochloride using a mineral oil mess is characterized by absorption peaks at wavelengths 6.23, 6.61, 6.66 , 8.72, 9.53 and 9.70 microns and an inflection. at 2.95 microns. Fig. 2 shows the infrared absorption spectrum of paromomycin hydrochloride.
Paromomycin forms a sulfate having an [a] D rotary power of about -I- 50.50 (at 1.5% in water). The infrared absorption spectrum of paromomycin sulfate using a mineral oil mess is characterized by pronounced absorption peaks at wavelengths of 6.17 and 6.55 microns, and an inflection at 3.1 microns.
Fig. 3 shows the infrared absorption spectrum of paromomycin sulfate.
Paromomycin is prepared, according to the invention, by inoculating a sterile aqueous nutrient medium having a pH between 6 and 8.5, and containing an assimilable carbon source and a nitrogen source and mineral substances, with Streptomyces rimosus, form paromomycinus, by incubating the inoculated medium at a temperature of 20 to 35o C aerobically, removing the solids present in the incubated medium and isolating the antibiotic produced from the solution thus obtained, in base form free or as an acid addition salt.
Streptomyces rimosus, paromomycinus form is a hitherto unknown microorganism, which is found in soils. It was isolated for the first time from a soil sample taken at Hacienda Tierra- dura, Miranda, Colombia, South America.
Cultures of this microorganism can be obtained by preparing a suspension in sterile water of a sample of the soil containing it, allowing the heavier particles to settle, spreading the resulting supernatant suspension of this soil in a series of dilutions on nutrient agar plates, incubating these plates at 24 - 280 C to produce growth of the microorganisms, and transplanting selected individual colonies resembling Streptomyces rimosus form paromomycinus onto fresh nutrient agar plates .
After repeated selections and transplants of uncontaminated and characteristic colonies on fresh plates of nutrient agar, thalli are obtained which constitute pure cultures of the microorganism sought.
Streptomyces rimosus, paromomycimis form has the following characters: when it has grown on glycerin-asparagine-agar medium, the lower mycelium is pale yellow to brown, and the aerial mycelium is white; when grown on a synthetic starch-agar medium, the lower mycelium is light brown and the aerial mycelium is white; on calcium malate-agar medium, the lower mycelium is light brown yellow and the aerial mycelium is white; on nutrient agar medium, the lower mycelium is light yellow orange brown with little or no aerial mycelium;
on glucose-tryptone-agar medium, the lower mycelium is light yellow to light brown, the aerial mycelium is white, and a faint brown coloration appears in the agar medium. Surface colonies are high, smooth, wrinkled or folded, and cracked in areas of thick growth; often the agar is also cracked. Seen under the microscope, the aerial hyphae are irregularly branched; the side branches are short and curved in spirals. Spirals are numerous on most media and are often found in dense groups. The distal parts of the aerial hyphae subdivide into chains of spores.
Streptomyces rimosus, paromomycinus form, liquefies gelatin with formation of little or no color in the medium and in general it does not peptonize sunflower milk. In synthetic agar medium (Pridham and Gottlieb, J.
Bact. 56, 108 (1948)), this organism uses many carbon sources, including adonite, cellobiose, dextrin, dextrose, d-galactose, glycerin, i-ino- site, lactose, levulose, maltose, d-mannite, d-mannose, melibiose, sorbite, starch and trehalose; it uses less readily l-arabinose, raffinose and xylose;
it does not use esculin, dulcite, inulin, melecitose, rhamnose, salicin and sucrose. This organism uses many sources of nitrogen, including dl-alanine, l-arginine, dl-aspartic acid, l-cystine, l-cystteine, 1-glutamic acid, glycyl -glycine, l-his- tidine, 1-leucine, l-lysine, l-phenylalanine, L-proline, dl-serine, dl-threonine,
dl-valine, ammonium sulfate and sodium nitrate; it uses less readily l-hydroxyproline, dl-isoleucine, dl-methionine, l-tryptophan, l-tyrosine, dl-norleucine, urea, and ammonium carbonate.
Morphologically, Streptomyces rimosus, paromomycinus form closely resembles Streptomyces rimosus (described by Sobin et al, to U.S. Patent 2516080 and kept under the designation
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<tb> Table <SEP> 1
<tb> Comparisons <SEP> of <SEP> stains <SEP> of <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus, <SEP> form <SEP> paromomycinus
<tb> and <SEP> of <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> NRRL <SEP> 2234,
<SEP> grown <SEP> on <SEP> various <SEP> media <SEP> to <SEP> agar
<tb> Medium <SEP> Part <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus
<tb> to <SEP> act <SEP> characteristic <SEP> form <SEP> paromomycinus <SEP> NRRL <SEP> 2234
<tb> Glycerin- <SEP> Mycelium <SEP> lower <SEP> Yellow <SEP> light <SEP> to <SEP> brown <SEP> light <SEP> Yellow <SEP> to <SEP> brown <SEP> light
<tb> Asparagine <SEP> Mycelium <SEP> aerial <SEP> White <SEP> White
<tb> Substratum <SEP> None <SEP> Slight <SEP> brown <SEP> light
<tb> Starch <SEP> Lower mycelium <SEP> <SEP> Light brown <SEP> <SEP> Light brown <SEP>
<tb> synthetic <SEP> Mycelium <SEP> aerial <SEP> White <SEP> (weakly <SEP> aerial)
<SEP> White
<tb> Substratum <SEP> None <SEP> None
<tb> Malate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> Mycelium <SEP> lower <SEP> Yellow <SEP> brown <SEP> Yellow <SEP> brown
<tb> Aerial <SEP> mycelium <SEP> White <SEP> White
<tb> Substratum <SEP> None <SEP> Slight <SEP> brown <SEP> light
<tb> Nutrient <SEP> medium <SEP> Lower mycelium <SEP> <SEP> Yellow <SEP> light <SEP> - <SEP> brown <SEP> orange <SEP> light <SEP> Yellow <SEP> brown <SEP > clear
<tb> Mycelium <SEP> aerial <SEP> Not <SEP> of <SEP> myc.
<SEP> aerial <SEP> White <SEP> (weakly <SEP> aerial)
<tb> Substratum <SEP> None <SEP> None
<tb> Glucose <SEP> Trepton <SEP> Lower mycelium <SEP> <SEP> Yellow <SEP> light <SEP> to <SEP> brown <SEP> light <SEP> Yellow <SEP> brown <SEP> to <SEP > brown <SEP> orange
<tb> Aerial <SEP> mycelium <SEP> White <SEP> White
<tb> Substratum <SEP> Slightly <SEP> brown <SEP> light <SEP> Brown <SEP> light
NRRL 2234 in the permanent culture collection of the Northern Utilization Research Branch in Peoria, Illinois). These two microorganisms show similar stains in their lower and aerial mycelia, as shown in Table 1.
S. rimosus is somewhat darker, and often stains more agar than does Streptomyces rimosus, form paromomycinus. In carbon utilization trials, Streptomyces rimosus, paromomycinus form and S. rimosus use the same carbon sources except l-arabinose, which Streptomyces rimosus, paromomycinus form uses only weakly while S. rimosus use it well (Table II).
Regarding nitrogen use, the two organisms are similar (Table III). Microscopically, Streptomyces rimosus, form paromomycinus closely resembles S. rimostrs. The two organisms form dense groups of spirals on agar and glycerin-asparagine, synthetic starch, calcium malate and glucose-tryptone media. On nutrient agar medium the two organisms form little aerial mycelium, and under a microscope their aerial filaments are mostly short and straight, with only incidental spirals.
With both organisms, the surface growth and the agar often merge at the places of thick development on various agar media.
From the fact that Streptomyces rimosus, paromomycinus form closely resembles S. rimosus, NRRL 2234, morphologically and in many respects physiologically, it is concluded that Streptomyces rimosus, paromomycinus form represents a new and distinct form of Streptomyces ri- mosus. A culture of Streptomyces rimosus, form paromomycinus is held in the Permanent Culture Collection of the Culture Office at Parke, Davis & Co., Detroit, Michigan, under No. 04998,
and the Culture Collection of the Fermentation Division, Northern Utilization Research Branch, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, under No. NRRL 2455.
For inoculation, spores or conidia of Streptomyces rimosus, paromomycinus form can be used. Aqueous suspensions thereof, containing a small proportion of soap or other wetting agent, can also be used. For large fermentations, it is preferable to use vigorous and young cultures of the microorganism.
As the source of carbohydrate assimilable in the aqueous nutrient medium, either pure carbohydrates or commercially available carbohydrate mixtures can be employed. As examples of such substances which are suitable for this purpose, there may be mentioned glucose, d-mannose, d-galactose, corn syrup, starch, soluble starch, malt liquors, molasses. , hydrolyzed starches, glycerin, etc.
The amount of carbohydrate present in the culture medium is not particularly critical; it can vary from 0.5 1 / o to 5 'o / o by weight of the total weight of said medium.
The source of nitrogen in the nutrient medium can be organic, inorganic, or mixed organic-inorganic. As examples of the various nitrogenous substances which may be employed in the nutrient medium, mention may be made of amino acids, peptones, hydrolyzed or non-hydrolyzed proteins, fishmeal, soybean meal, corn maceration liquor, extracts of meat,
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EMI4.1
<tb> Table <SEP> II
<tb> Comparison <SEP> of <SEP> <SEP> use of <SEP> carbon <SEP> by <SEP> the <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus, <SEP> form <SEP> paromomycinus,
<tb> and <SEP> the <SEP> S.
<SEP> rimosus <SEP> NRRL <SEP> 2234
<tb> Sources <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus
<tb> of <SEP> carbon <SEP> form <SEP> paromomycinus <SEP> NRRL2234
<tb> Monosaccharides
<tb> Pentoses
<tb> L-Arabinose <SEP> 0 <SEP> to <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Rhamnose <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> D-Xylose <SEP> 0 <SEP> to <SEP> + <SEP> 0 <SEP> to <SEP> -I-Hexoses
<tb> Dextrose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Galactose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Levulose <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> D-Mannose <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Disaccharides
<tb> Cellobiose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Lactose <SEP> ++ <SEP> to <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Maltose <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Melibiose <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> to <SEP> ++++
<tb> Sucrose <SEP> 0
<SEP> 0
<tb> Trehalose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Trisaccharides
<tb> Melecitosis <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Raffinose <SEP>. <SEP> + <SEP> to <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> to <SEP> + <SEP> +
<tb> Polysaccharides
<tb> Dextrin <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Inulin <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Starch <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Polyhydric <SEP> alcohols
<tb> Adonite <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Dulcite <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Glycerin <SEP> +++ <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> i-Inosite <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Mannite <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++++
<tb> D-Sorbite <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Miscellaneous
<tb> Aesculine <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Salicine <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 0 <SEP> = <SEP> not <SEP> of <SEP> growth
<tb> + <SEP> = <SEP>
weak <SEP> growth
<tb> + <SEP> + <SEP> = <SEP> growth <SEP> fairly <SEP> good
<tb> + <SEP> + <SEP> -I- <SEP> = <SEP> good <SEP> growth
<tb> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> = <SEP> very <SEP> good <SEP> growth.
<tb> Each <SEP> source <SEP> of <SEP> carbon <SEP> has <SEP> been <SEP> tried <SEP> at <SEP> a <SEP> concentration <SEP> of <SEP> 0.1 <SEP> / a <SEP> in <SEP> weight, <SEP> in <SEP> the <SEP> medium <SEP> synthetic <SEP> to <SEP> agar <SEP> described
<tb> by <SEP> Pridham <SEP> and <SEP> Gottlieb, <SEP> J. <SEP> Bact., <SEP> 56, <SEP> 108, <SEP> 1948.
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EMI5.1
Table l11 Comparison of nitrogen use by Streptomyces rimosus, form paromomycinus, and S.
rimosus, NRRL 2234 Streptomyces rimosus Streptomyces rimosus Sources of nitrogen * form paromomycinus NRRL 2234 Inorganic Sodium nitrate + + + + + + + + Ammonium sulfate + + + + + + + + Ammonium + + + + Organic Dl-Alanine + + + + + + + + L-Arginine + + + + + + + + dl-Aspartic acid + + + + + + + + L-Cystine + + + + + + + L-Cysteine + + + + + + + + 1-Glutamic acid + + + + + + + + Glycyl-glycine + + + + + + + + L-Histidine + + + + + + + L-Hydroxyproline + + Dl-Isoleucine + + + + L-Leucine + + + + + + + L-Lysine ++++ +++ Dl-Methionine + + + L-Phenylalanine + + + + + + + + L-Proline ++++ ++++ Dl-Serine + + + + + + + Dl-Threonine + + + + + + + + L-Tryptophan + + L-Tyrosine + + Dl-Norleucine + + + + + DL-Valine + + + + + + + + Urea + + + + @ 'k Each nitrogen source was tested at a concentration of 0,
01 M nitrogen equivalent in the synthetic agar medium described by Pridham and Gottlieb, J. Bact. 56, 108, 1948, modified by omitting ammonium sulfate and adding 1.0% by weight dextrose. peanut flour, inorganic nitrates, urea, ammonium salts, etc. Due to the crude nature of most readily available nitrogenous substances, the amount to be added to the nutrient medium varies somewhat with their degree of purity. It can be said, however, that in practice the nitrogenous substances should not exceed 6% by weight of the total weight of the fermentation medium.
It is necessary that there is a certain amount of mineral salts to obtain the best yields of paromomycin. In general, many of the raw materials such as corn maceration liquor, butanol-acetone fermentation residues, yeast preparations, soybean meal with oil, etc., contain sufficient amounts of inorganic salts. However, to ensure the presence of adequate amounts of the mineral components of the medium, it is generally advantageous to add small amounts of inorganic salts such as sodium chloride, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium acetate. sodium, etc.
The preferred concentration of inorganic salts is 0.1 to 1% of the nutrient medium. Cultivation of Streptomyces rimosus, paromomycinus form in the aqueous nutrient medium can be carried out in various ways. For example, the microorganism can be grown aerobically on the surface of the medium, or it can be cultivated below the surface of the medium, i.e. in the submerged state, provided that it simultaneously supplies oxygen.
The preferred procedure for producing paromomycin on a large scale involves the use of submerged or deep cultures of Streptomyces rimosus, paromomycinus form. In this way of carrying out the invention, a sterile aqueous nutrient medium is inoculated with Streptomyces rimosus, form paromomycinus and the medium is incubated with agitation and aeration at a temperature between 20 and 351 ° C.
preferably in the region of 23 - 300 C until a maximum concentration of paromomycin in the culture fluid has occurred. The time required for this maximum production of paromomycin varies with the size and type of apparatus employed. For example, for an industrial fermentation on a
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On a large scale, as performed in tank-type fermentation apparatus, maximum production of paromomycin is reached in about three to six days.
The incubation period can be limited to shorter times, but the yields are generally lower. Longer incubation periods do not appear to decrease the amount of paromomycin present in the culture fluid. When using secondary flasks for incubation, the time for maximum production may be a little longer than that required with large fermentation tanks.
Under submerged culture conditions, the microorganism grows as more or less separate particles, dispersed throughout the nutrient medium, contrasting with the more or less continuous film that forms on the surface of the medium in the surface culture method. . By virtue of this distribution of the organism in the mass of the medium, one can cultivate large volumes of the nutrient medium inoculated at one time in the large reservoirs or vats commonly employed in the fermentation industry.
Stationary tank fermenters, fitted with suitable agitation and aeration devices, as well as rotary drum fermenters, have been found particularly suitable for these purposes. However, for the preparation of smaller amounts of the antibiotic or cultures of the microorganism, the submerged culture method can be performed in small flasks or vessels which can be shaken or agitated by suitable mechanical means.
Agitation and aeration of the culture mixture can be accomplished in various ways. Agitation can be obtained by turbines, paddles, thrusters or any other mechanical agitation device, by overturning or shaking the fermentation vessel itself, by pumping devices, or even by the passage of air. through the middle.
Aeration can be carried out by injecting air into the fermentation medium through open pipes, through perforated pipes or porous diffusion means such as pieces of coal, carborundum, sintered glass, etc. ; it can also be accomplished by spraying, squirting or pouring the mixture into or through an atmosphere containing oxygen.
Production of paromomycin by surface culture involves inoculating a shallow layer, usually less than 2 cm, of a sterile aqueous nutrient medium with Streptomyces rimosus, form paromomycinus and subjecting the mixture to incubation in aerobic at a temperature of 20 to 350 C. It is generally necessary for the incubation period to be longer than in the deep incubation to obtain the maximum production of paromomycin. In general, this incubation period is ten to fifteen days.
When the incubation phase is completed, the mycelium is removed from the liquid, which contains the desired paromomycin, and the product is isolated from the culture liquid by the methods described below.
After completion of the fermentation phase of the process, the solid material present in the culture mixture is removed in any suitable manner, for example by filtration, centrifugation, etc., and the paromomycin is isolated from the remaining culture liquid. Isolation can be conveniently accomplished by ion exchange methods, preferably adsorption and elution of paromomycin using a cation exchanger in its salt form.
Paromomycin contained in the eluate can be isolated by concentration to dryness, or, if desired, it can be further purified, prior to isolation, by repeated adsorption and elution.
According to one of the preferred methods of isolating paromomycin from the culture mixture, the waste culture medium is subjected to adsorption and elution using a cation exchange resin in its form. salt, the eluate is concentrated, the concentrated eluate is adsorbed on activated charcoal, the paromomycin is extracted from the charcoal and the paromomycin is recovered from the extract in the free state or in the form of an addition salt with a mineral acid.
According to this method, the culture liquid obtained by removing the solid matter from the fermentation culture mixture is adjusted to a pH of approximately 6.8 to 7.5, and then passed through an adsorption column containing a carboxylic acid resin in salt form, such as the sodium, potassium or ammonium salt. The resin containing the adsorbed paromomycin is washed with water and then eluted with a dilute aqueous mineral acid such as hydrochloric acid, or a base such as ammonium hydroxide.
The eluate is concentrated, activated charcoal is mixed with it, and the charcoal containing paromamycin or its adsorbed salt is removed from the mixture; the paromomycin or the paromomycin salt is then eluted from this carbon with a suitable organic solvent, such as an aqueous or anhydrous lower aliphatic alcohol, or a ketone. Paromomycin or its salt can be isolated from this eluate by removing the solvent in vacuo or by precipitation.
In some cases, after elution of the paromomycin from the cation exchanger, it is desirable, especially if substantial amounts of inorganic salts are present, to raise the pH of the eluate by adding a base before l adsorption on activated carbon. In these cases, the eluate is adjusted to a pH of about 9 to 9.7, activated charcoal is mixed with this eluate, the charcoal containing the adsorbed paromomycin is removed from the mixture and washed with water, then the mixture. paromomycin is eluted with dilute mineral acid.
The paromomycin contained in the resulting eluate is conveniently isolated by passing the eluate through an exchanger containing an anion exchange resin in hydroxyl form, collecting and neutralizing the percolate, and treating this neutral percolate by exchange. with a cation exchange resin, in
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eluting with ammonium hydroxide and lyophilizing the eluate.
According to another preferred method for isolating paromomycin, the fermentation culture liquid is adsorbed and eluted as described above using a cation exchange resin, the pH of the resulting eluate is adjusted, if necessary, to about 4,5-7, and the eluate is passed through a column containing a mixture of approximately equal amounts of activated carbon and diatomaceous earth. The paromomycin salt which is retained by the column is eluted by washing with water.
Additional amounts of paromomycin remaining in the column after washing with water can be recovered by washing again with dilute aqueous organic solvents or with dilute aqueous mineral acid. The mineral acid salt of paromomycin can be removed from these washings by removing the solvent in vacuo, or by precipitation.
Paromomycin can be degraded by hydrolysis with a mineral acid such as hydrochloric acid to give a crystalline salt containing, on elemental analysis, 32 - 33% carbon, 7% hydrogen,
9 - 10% nitrogen and 23 - 24% chlorine. The products of such mineral acid hydrolysis have no appreciable antibacterial activity.
Paromomycin is strongly bacteriostatic active against a wide variety of pathogenic organisms. In particular, it is fully active in vitro against species of staphylococci which are resistant to oxytetracycline, erythromycin or carbomycin. Table IV shows the antibacterial spectrum of paromomycin used as sulfate, in vitro.
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Table! V Antibacterial spectrum of paromomycin sulphate l \ Minimum inhibitory concentration of paromomycin sulphate Culture in # tg / ml Clostridium. perfringens. . . . . . . . . . . 100.0 Coryn.ebacterium diphtheriae. . . . . . . .
0.39 Diplococcus pneumoniae. . . . . . . . . . 100.0 Micrococcus pyogenes var. aureus. . . . . . 0.78 Streptococcus pyogenes. . . . . . . . . . . 25.0 Streptococcus salivarius. . . . . . . . . . . 50.0 Aerobacter aerogenes. . . . . . . . . . . . 6.25 Brucella suis. . . . . . . . . . . . . . . . . 3.13 Escherichia coli. . . . . . . . . . . . . . . 12.5 Klebsiella pneumoniae. . . . . . . . . . . . 1.56 Neisseria catarrhalis. . . . . . . . . . . . . 0.78 Pasteurella multocida. . . . . . . . . . . . 6.25 Proteus vulgaris. . . . . . . . . . . . . . . 3.13 Pseudomonas aeruginosa. . . . . . . . . . - 50.0 Salmonella paratyphi. . . . . . . . . . . . 1.56 Salmonella schottmuelleri. . . . . . . . . . 12.5 Salmonella typhosa. . . . . . . . . . . . . 6.25 Shigella dysenteriae. . . . . . . . . . . . . 12.5 Shigella paradysenteriae. . . . . . . . . . . 12.5 Shigella sonnei. . .
. . . . . ,. . . . . . . 12.5 Vibrio comma. . . . . . . . . . . . . . . . 25.0 Mycobacterium phlei. . . . . . . . . . . . 0.19 Mycobacterium tuberculosis var. hominis. . 0.19 Determined by tests carried out twice on series of dilutions of broth. Purity estimated at 60-70 / a. Paromomycin is a useful agent for the prevention of possible infection by pathogenic microorganisms.
Paromomycin has important antiparasitic properties and is particularly useful in combating Endomoeba histolytica, the agent producing ameliasis. It is also useful for the treatment of local surface infections caused by various pathogenic microbes; it is particularly applicable to the treatment of infections caused by species of staphylococcus which are resistant to the various antibiotics commonly used, such as oxytetracycline, erythromycin, carbomycine, etc.
For these applications, paromomycin can be used as the free base or as a salt by addition of mineral acid such as hydrochloride, sulfate, etc. It can be applied in various suitable forms, for example as a powder mixed with an inert diluent such as talc, starch, etc., or as an ointment, containing an inert ointment base and a small proportion of
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paromomycin, or in a dilute aqueous solution containing, if desired, a compatible tension-active agent.
In these forms, paromomycin can be advantageously employed at a concentration of about 5 mg per cubic centimeter, for solutions, and about 5 mg per gram, for powders and ointments. Paromomycin has the advantage of being relatively non-toxic and of being stable under varying conditions of use. Used as a bacteriostat, paromomycin is applied directly to the site of infection, and other applications may be made periodically, if necessary. If desired, paromomycin can be used in combination with other bacteriostatic agents.
The following examples serve to illustrate the invention.
Example 1: Twelve liters of a nutrient medium having the following composition
EMI8.13
<tb> for <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydrate <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> ...... <SEP> 0.5
<tb> Glycerin <SEP> .... <SEP>. <SEP> .................... <SEP> 0.5
<tb> Casein, <SEP> hydrolyzed <SEP> to <SEP> acid <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.3
<tb> Peptone ............................ <SEP> 0.25
<tb> Yeast <SEP> from <SEP> brewery <SEP> ... <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.1
<tb> Solid <SEP> substances <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> maize <SEP> 0.25
<tb> <SEP> soy flour <SEP> <SEP> with <SEP> oil <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.25
<tb> Residue <SEP> from <SEP> fermentation <SEP> acetone-butanol <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.25
<tb> <SEP> sodium <SEP> chloride <SEP> ...... <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.5
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.1
<tb> Water, <SEP> this <SEP> that <SEP> must <SEP> for <SEP> to do <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 100.0
are placed in a 30 liter fermentation vessel, fitted with a stainless steel apparatus comprising a diffuser, a propellant, baffles and sample tubes, and the medium is sterilized by heating at 1210 C for two hours .
The medium is then cooled and inoculated with 20 ml of a suspension in a sterile 0.1% solution of sodium heptadecyl sulphate, of Streptomyces rimosus spores, paromomycinus form originating from two sporulation cultures according to Moyer on sloping agar.
The inoculated culture mixture is incubated at 26 () C for sixty hours, during which the mixture is stirred at 200 r.p.rn. and sterile air is passed through the diffuser through the medium at a rate of 12 liters per minute.
A portion of the resulting incubated culture medium is used for inoculation of 16 liters of a nutrient medium of the following composition
EMI8.42
<tb> for <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydrate <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.0
<tb> <SEP> soy flour <SEP> <SEP> with <SEP> oil <SEP> ...... <SEP>. <SEP> ..... <SEP> 1.0
<tb> <SEP> sodium <SEP> chloride <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> .. <SEP>. <SEP>. <SEP> .. <SEP> 0.5
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> ..... <SEP> 0.1
<tb> Ammonium <SEP> <SEP> ........ <SEP> .....
<SEP> 0.167
<tb> Stomach <SEP> residue <SEP> from <SEP> pig <SEP> extracted <SEP> to <SEP> salt <SEP> 0.5
<tb> Water, <SEP> quantity <SEP> desired <SEP> for <SEP> do <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 100.0
The pH of the latter nutrient medium is adjusted to 7.5 with a 10N sodium hydroxide solution, and the medium is placed in a 30-liter glass fermentation vessel, fitted with a diffuser, a propellant. , baffles and a sampling pipe. The medium is sterilized by heating at 1210 C for two hours, allowed to cool, then inoculated with 800 ml of the culture medium obtained as described above.
The resulting culture mixture is incubated at 26.1 C for ninety-four hours, during which the mixture is stirred at 200 r.p.m. and that sterile air is passed through the medium using the diffuser at a rate of 16 liters per minute. During incubation, the formation of foam is avoided by adding, as required, crude axonge and mineral oils containing mono- and diglycerides.
At the end of the incubation period, the fermentation culture medium is adjusted to pH 2 with concentrated hydrochloric acid, the solids present are removed by filtration, and the mass on the filter is washed with the water. The washing waters are combined with the main filtrate, the pH is adjusted to 7.0, and 15.5 liters of this filtered culture liquid are introduced into a column exchanger (38 mm diameter), filled with 380 ml of a carboxylic acid resin having been washed successively with two liters of an aqueous solution of 37.5 g of sodium hydroxide and then with two liters of water.
The column containing the paromomycin is washed with two volumes of water, and is eluted with 0.5 N hydrochloric acid. The first 19.4 liters of the percolate contain little or no paromomycin, and their pH varies from 6 to 7.3. When the pH of the eluate begins to drop below 6.0, 2 liters are collected.
This two-liter portion is neutralized to pH 6 with 10N sodium hydroxide solution and is filtered. The filtrate is concentrated by evaporation in vacuo to a volume of about one liter.
An adsorption column is prepared by pouring a muddy aqueous mixture of 65 g of activated charcoal washed with acid (Darco brand product G-60) and 50 g of diatomaceous earth into a 38 mm column, and added thereto. 300 ml of the concentrated filtrate. The column is washed with 400 ml of water and eluted successively with 325 ml of water, 425 ml of aqueous acetone at 1:
% and 400 ml of 10% aqueous acetone. The eluates of water and acetone are concentrated and lyophilized to obtain paromomycin hydrochloride in the form of a powder. The product is purified by taking up the powder in methanol, adding a large excess of acetone to the solution, and recovering by filtration the precipitate which forms.
The product, paromomycin hydrochloride, has a rotatory power [CC] 25 = -I-56.50 (at 1% in water).
On analysis, paromomycin hydrochloride gives 35.71% carbon, 6.95% hydrogen, 8.42% nitrogen and 21.5% chlorine.
<Desc / Clms Page number 9>
To obtain paromomycin in the free base state, the hydrochloride is dissolved in water to form a 3% solution;
this is poured into an adsorption column containing an anion exchange resin (product brand Amberlite IR-45), or preferably IRA 411 or IRA 400 in the hydroxyl form, and the column is washed with a low amount of water.
The aqueous percolate is concentrated to dryness by lyophilization, and the solid product obtained is purified by taking it up with obsolete boiling ethanol, while cooling, and recovering the solid paromomycin; [a] 25 = -I-640 (at 1% in water).
By analysis, it contains 45.17% carbon, 7.44% hydrogen and 10.35% nitrogen. Example 2 To prepare a fresh inoculum for the large scale production of paromomycin described below, 76 L of a nutrient medium having the following composition
EMI9.45
<tb> for <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydrate <SEP> .... <SEP>. <SEP> 1.0
<tb> <SEP> soy flour <SEP> <SEP> with <SEP> oil <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> - <SEP>. <SEP> - <SEP> - <SEP>.
<SEP>. <SEP> 1.0
<tb> Stomach <SEP> residue <SEP> from <SEP> pig <SEP> extracted <SEP> to <SEP> salt <SEP> 0.5
<tb> Ammonium <SEP> <SEP> ... <SEP> 0.167
<tb> <SEP> sodium <SEP> chloride <SEP> 0.5
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.5
<tb> Water, <SEP> quantity <SEP> wanted <SEP> for <SEP> do <SEP> 100.0
are introduced into a 1901 fermentation vessel. stainless steel, and the pH is adjusted to 7.5 with a 6N sodium hydroxide solution. The medium is sterilized by heating at 121 ° C. for one hour.
The medium is then cooled and inoculated with 40 ml of a suspension of Streptonzyces rimosus spores, paromomycinus form in a sterile solution of 0.1% sodium heptadecylsulphate, prepared as described in Example. 1. The culture medium is incubated at 260 ° C. for sixty-four hours, during which time it is supplied with sterile air using a diffuser at the rate of 9.8 cubic feet per minute.
During the incubation, a sterilized mixture of crude axongei and mineral oils containing mono- and diglycerides is added as needed to prevent foaming.
The incubated culture thus obtained is used to inoculate the main culture, which was prepared in the following manner 435 l of a medium having the following composition
EMI9.63
<tb> for <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydrate <SEP> ---- <SEP> o
<tb> <SEP> soy flour <SEP> <SEP> with <SEP> oil <SEP> ------ <SEP> o
<tb> Stomach <SEP> residue <SEP> from <SEP> pig <SEP> extracted <SEP> to <SEP> salt <SEP> 0.5
<tb> Ammonium <SEP> chloride <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.167
<tb> <SEP> sodium <SEP> chloride <SEP> .... <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> .......
<SEP> 0.5
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> 0.5
<tb> Water, <SEP> quantity <SEP> wanted <SEP> for <SEP> do <SEP> 100.0
are put into a 7601 stainless steel fermentation vessel, and the pH is adjusted to 7.5 with 6N sodium hydroxide solution. The medium is sterilized by heating at 121o C for one hour, then left cool.
The sterile medium is inoculated with 381 of the culture prepared as described above and is incubated at 260 C for seventy-two hours, during which it is supplied with sterile air by a diffuser at the rate of 9411 per. minute, and stirred with a propellant rotating at a speed of 230 rpm To avoid excessive foaming during incubation, 8.1 liters of a sterile mixture of crude axonge and mineral oils are added as needed.
At the end of the incubation period, the culture mixture is brought to a pH of 2 with concentrated hydrochloric acid; it is filtered and the mass on the filter is washed with water. The combined filtrate and washings 5641 are neutralized and added to an adsorption column (152 mm di), packed with 13 liters of a carboxylic acid resin (Amberlite IRC-50) which has been previously neutralized by percolation with a solution of 1.265 g of sodium hydroxide in 60 liters of water.
The column which contains the paromomycin is washed with approximately 40 liters of water and then eluted with 0.5N hydrochloric acid. When the pH of the liquid leaving the column falls below 6, 88 is collected, 5 liters of the eluate, neutralized with 6N sodium hydroxide solution, then concentrated by evaporation in vacuo to about one tenth of the volume.
A quarter of a liter of the concentrated eluate is added to an adsorption column prepared by putting an aqueous slurry of 80 g of activated charcoal (product brand Darco G-60) and 60 g of diatomaceous earth in a 38 mm pipe. having a capacity of about 360 ml. The paromomycin hydrochloride contained in the column is removed by elution with 11/2 liters of water. The eluate is concentrated, frozen, and dried in the frozen state under a very high vacuum.
The solid product obtained, paromomycin hydrochloride, represents a 64% yield of the activity of paromomycin, initially present in the culture mixture at the end of the fermentation.
To convert the paromomycin hydrochloride to the corresponding sulfate, 1 g of this hydrochloride is dissolved in. 25 ml of methanol and 4.5 ml of a molar aqueous solution of sulfuric acid are added to the solution. The precipitate which forms is isolated by filtration, and the mass on the filter is washed with methanol and dried. The resulting product, paromomycin sulfate in a form containing a chloride ion, is dissolved in water and the pH of the solution is adjusted to 6.0 by mixing with a sufficient amount of an exchange resin. anions in the hydroxyl form.
The resin is removed by filtration and the filtrate is concentrated by lyophilization. The residual gum is converted to a white solid by trituration with acetone. The solid product is
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isolated by filtration, washed with acetone and dried. The product, paromomycin sulfate, has an optical rotation [a] of + 50.50 (at 1 A / o in water).
Example 3: To prepare a fresh inoculant for the production of paromomycin on a large scale, as described below, 12 liters of a nutrient medium of the following composition
EMI10.9
<tb> for <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydrate <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> ....... <SEP> 2.0
<tb> <SEP> soy flour <SEP> <SEP> with <SEP> oil <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.0
<tb> Stomach <SEP> residue <SEP> from <SEP> pig <SEP> extracted <SEP> to <SEP> salt <SEP> 0.5
<tb> Ammonium <SEP> <SEP> ... <SEP> .......... <SEP> 0.167
<tb> <SEP> sodium <SEP> chloride <SEP> .... <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 0.5
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> .............. <SEP> 0.5
<tb> Water, <SEP> quantity <SEP> sufficient <SEP> for <SEP> to do <SEP> ...... <SEP> 100.0
are placed in a 30 liter stirred fermentation vessel, and the pH is adjusted to 7.5 with 6 N sodium hydroxide solution.
The medium is sterilized by heating at 12l C for two hours, then allowed to cool and inoculated with 20 ml of a suspension of Streptomyces rimosus spores, paromomycinus form, in a sterile solution of sodium heptadecyl sulfate. 0.1% prepared as described in Example 1.
The culture mixture is incubated at 260 C for 71 hours, during which sterile air is supplied by a diffuser at the rate of 12 liters per minute, and the mixture is stirred by means of a rotating propellant. at a rate of 200 rpm
The incubated culture thus obtained is used to inoculate the main culture, prepared in the following manner 38 1 of a medium having the composition
EMI10.27
<tb> for <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydrate <SEP> ..... <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 2.0
<tb> <SEP> soy flour <SEP> <SEP> with <SEP> oil <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.0
<tb> Stomach <SEP> residue <SEP> from <SEP> pig <SEP> extracted <SEP> to <SEP> salt <SEP> 0.5
<tb> Ammonium <SEP> <SEP> ... <SEP> .......... <SEP> 0.167
<tb> <SEP> sodium <SEP> chloride <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 0.5
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.5
<tb> Water <SEP> sufficient <SEP> quantity <SEP> for <SEP> to do <SEP> ...... <SEP> 100.0
are prepared in a 1141 stainless steel fermentation vessel, and the medium is sterilized by heating at 1210 C for one hour. The medium is allowed to cool and inoculated with 100 ml of the fresh inoculant, prepared as indicated above. The inoculated medium is subjected to incubation at 26 ° C. for twenty-four hours, during which sterile air is supplied to it by a diffuser at the rate of 1821 per minute.
1361 of a nutrient medium having the same composition as described above, are prepared and placed in a 19001 fermentation vessel, made of stainless steel, and the medium is sterilized by heating at 1210 C for 1 hour. The sterile medium is allowed to cool and inoculated with 381 of the culture mixture obtained by the previous fermentation.
The inoculated medium is subjected to incubation at 26.1 C for twenty-three hours, during which it is aerated by a diffuser at the rate of 12601 per minute, the mixture being stirred by means of a rotating propellant at a rate of 84 rpm During this incubation, to avoid excessive foaming, 3.9 liters of a sterile mixture of crude axonge and mineral oils containing mono- and diglycerides are added as needed.
45401 of a medium of the same composition as that described above, and having a pH of 7.5, are prepared and they are placed in a 7600l fermentation vessel, made of stainless steel. The medium is sterilized by heating at 1210 C for 1 hour, then allowed to cool. The sterile medium (pH 6.65) is inoculated with 7571 of the culture medium described immediately above, and it is incubated at 26.1 C for forty-nine hours. During incubation air is supplied at the rate of 33,601 per minute and the medium is stirred using a rotating propellant at a rate of 125 r.p.m.
The culture medium (7760l containing paromomycin at a concentration of about 0.2 mg / ml) is filtered, the mass on the filter is washed with water, and the combined filtrate and washings (90801 ) are brought to a pH of 7.2 and are added to an adsorption column prepared by packing a 457 mm column with 184 liters of a carboxylic acid resin (Amberlite IRC-50) and neutralizing the resin by percolation with 6481 sodium hydroxide 0.6 N.
The column is then washed with about 12,301 water, and eluted with 21,201 0.5 N hydrochloric acid and 7951 0.6 N hydrochloric acid, water washes being done after each acid elution. , so as to obtain a total eluate volume of 36901.
Combined eluates from several similar operations (total volume 30701) are brought to a pH of 9.5 with 6N sodium hydroxide. Activated carbon (Darco G-60) is then added at a rate of 1.5 % w / v, and diatomaceous earth at 1.0% / () w / v, and stir the mixture for 1/2 hour. Then the mixture is filtered through a filter press which is washed with 37651 of water. Paromomycin is eluted with 928l of 0.05N sulfuric acid and 12651 of 0.1N sulfuric acid.
The sulfuric acid eluates are combined and passed through 453 kg of an anion exchange resin (Amberlite IR-45) in the hydroxyl form. The pH of the eluate is periodically determined, and when it drops below 9, the resin is regenerated. The percolate contains paromomycin as a free base.
A 6461 portion of the concentrated percolate, containing 1.3 - 1.5 g of paromomycin, is brought to pH 7.3 with 1 N sulfuric acid, and passed through 5 ml of a carboxylic acid resin, in the ammonium form. The resin is then washed with water, and the washing water, which contains
<Desc / Clms Page number 11>
a small amount of active material is rejected. Paromomycin is eluted with 1N ammonium hydroxide, and the eluate is cold dried. The yield of the desired product, paromomycin, is 1.125 g.