Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique L'invention a pour objet un procédé de prépa ration d'un nouvel antibiotique. Le nouvel antibio tique sera dénommé, dans la description qui suit, Amphotéricyne ; il s'agit d'un mélange qui peut être séparé en deux constituants, qui seront appelés Amphotéricyne A et Amphotéricyne B .
Selon l'invention, cet antibiotique est préparé en cultivant une espèce nouvelle de Streptomyces, la souche sp. 3694, ou un mutant de cette souche, dans un milieu nutritif aqueux comprenant une source de carbone et d'énergie assimilable et fermentescible et une source d'azote assimilable, en aérobie et en im mersion, jusqu'au moment où une activité fongicide substantielle est conférée à ce milieu et en isolant l'antibiotique du milieu.
<I>Le microorganisme</I> Le microorganisme utilisé pour la préparation d'Amphotéricyne est une espèce découverte récem ment de Streptomyces isolé d'un échantillon obtenu à Tembladora, sur la rivière Orinoco, en Amérique du Sud. Une culture de l'organisme vivant a été dé posée et constitue une partie de la collection de cul tures mères du Rutgers Institute of Microbiology (New Brunswick, New Jersey), où elle est disponi ble ; et elle a reçu le numéro 3694 dans la collection Waksman et est désignée ci-après sous le nom de Streptomyces sp. 3694.
L'invention est également exécutable avec des mutants de l'organisme particulier décrit ici, mutants qui peuvent être obtenus sous l'action d'agents dé terminant un changement, tels que des rayons X, des radiations ultraviolettes et des ypérites azotées. Le microorganisme, lorsqu'il est examiné par la méthode d'application par bande sur l'agar-agar de levure de bière, quant à son activité antibiotique vis- à-vis à la fois des bactéries et des champignons, ne détruit aucune des bactéries d'essai, mais détruit les champignons d'essai Saccharomyces cerevisiae, Rho- dotorula glutinis,
Candida albicans et Aspergillus piger.
Ci-après, est donnée une description des colo nies du microorganisme soumises à une incubation pendant des périodes différentes et sur des milieux différents <I>Plant de pommes de terre</I> Au bout de 15 jours, la culture s'étend, très lourde, humide, durcie, avec sensiblement la même couleur que les pommes de terre, des spores blancs couvrant la partie de la culture sur la portion in clinée.
<I>Lait de tournesol:</I> En 7 jours, le noyau de la culture à la surface est incolore. Le lait tourne au bleu pourpre, s'éclair cissant progressivement du sommet vers le fond et indiquant une protéolyse sans coagulation.
<I>Agar-agar</I> Czapek-Dox NaN03, 3 gm ; KH2P04, 1 gm ; KCl, 0,5 gin ; MgS04. 7H20, 0,5 gm ; FeS04. 7H20, 0,01 gm ; glu cose, 40 gm ; agar-agar, 15 gm ;eau distillée jusqu'à 1,000 ml.
Aucune croissance en 15 jours en dépit de deux inoculations ou ensemencements. <I>Plant</I> d'agar-agar <I>pourpre au glucose-milieu</I> nutritif- bromocrésol Extrait de boeuf, 3 gin ; peptone de protéine, 10 gin; glucose, 10 gin; NaCl, 5 gm ; agar-agar, 20 gin; pourpre de bromocrésol, 0,15 gin; eau distillée jusqu'à 1,000 ml. pH7.0.
Croissance modérément lourde en 51 jours, ri dée, brillante, asporogène. Le ridage sur tous les agar-agars est très caractéristique. Les rides sont pa rallèles, avec des dentelures en lignes droites dans la culture à angles droits les unes par rapport aux autres, donnant un aspect de mur de maçonnerie avec des rectangles de différentes dimensions. <I>Plant d'agar-agar</I> Sabouraud Glucose, 40 gin ; néopeptone, 10 gin ; agar-agar, 15 gin ; eau distillée 1,000 ml.
Au bout de 4 jours, la culture est jaune, tour nant au brun au bout de 7 jours et toute brune au bout de 15 jours. La culture est lourde, d'abord bril lante, puis tournant au mat, ridée avec un pigment brun diffusible visible au bout de 3 à 4 jours. <I>Plant d'agar-agar</I> glucose-asparagine Glucose, 10 gin ; K2HP04, 0,5 gin ; asparagine, 0,5 gin ; agar-agar, 15 gin ; eau distillée, 1,000 ml.
Au bout de 7 et 15 jours, la culture est modé rément lourde, non ridée, incolore, avec des spores blancs tournant au gris, et un pigment jaune diffu- sible tournant au brun. En plus, une matière insolu- ble dans l'eau et d'un jaune foncé est déposée sur les bords du plant d'agar-agar et à la base du plant. Cette matière est soluble dans le méthanol, le pro panol et la diméthylformamide.
Le microorganisme est caractérisé en outre par le fait que du sulfure d'hydrogène n'est pas produit, comme le montre l'essai avec du papier à l'acétate de plomb dans un milieu comprenant: peptone de protéose, 20 gin ; glucose, 1 gin ; Na2HP04 2 gin ; et eau distillée jusqu'à 1 litre. La culture se déve loppe sous forme d'une pellicule blanche asporogène. De plus, de la gélatine Difco est liquéfiée. La cul ture se développe sous forme d'un noyau légèrement brun et asporogène à la surface.
De plus, dans un bouillon de nitrate Difco, la culture se développe sous forme d'une pellicule légèrement brune et as- porogène. Le bouillon s'assombrit avec un pigment brun de diffusion. Le nitrate est fortement réduit en nitrite. De plus, de l'amidon est hydrolysé par la culture lorsque celle-ci se développe dans un milieu contenant de l'amidon.
Pour déterminer la teneur en carbone et en hy drogène de Streptomyces sp. 3694, des essais ont été effectués comme suit: . quatre séries de tubes d'agar- agar avec des sels minéraux sont préparées avec 1 mg par ml de ces quatre sources de nitrogène respecti vement: (NH4)2S04, NaN03, asparagine -et hydro- lysat de caséine. Dans chaque série, chaque tube est renforcé avec 10 mg par ml de l'une des seize sour ces possibles de carbone et d'énergie.
Celles-ci sont l'amidon, l'inuline, la dextrine, le raffinose, le mal tose, le lactose, le sucrose, le sorbose, le glucose, le dulcitol, l'inositol, le sorbitol, le mannitol, le xylose, l'arabinose et le glycérol.
L'agar-agar dans les tubes (10 ml) est enfermé et les plants sont traités avec une suspension de spo res de Streptomyces sp. 3694 dans de l'eau distillée. Au bout de 9 jours d'incubation, la culture a été examinée et les résultats indiquent que le microor ganisme est susceptible d'assimiler du carbone à par tir de l'amidon, de la dextrine, du maltose, du glu cose et du mannitol, quelle que soit la source de l'hydrogène. Avec les sources organiques d'azote, le lactose, le sucrose, l'inositol et le glycérol peuvent également être utilisés, bien qu'une culture avec ces sources de carbone puisse être plus légère qu'avec le glucose et ses polymères.
Des nitrates ne constituent des sources d'azote avec aucune des sources de car bone et d'énergie, tandis que l'asparagine et l'hydro- lysat de caséine peuvent servir de seules sources de carbone, d'azote et d'énergie. <I>L'antibiotique</I> Le Streptomyces sp. 3694 produit un mélange d'antibiotiques. Le mélange lui-même, aussi bien que les antibiotiques spécifiques isolés de ce même mé lange, présentent un spectre fongicide large, mais pas de propriétés bactéricides significatives.
Dans l'exécution du présent procédé, le Strepto myces sp. 3694 est cultivé d'ordinaire à une tempé rature de 230 C à 301, C, de préférence à environ 25o C.
Des sources appropriées de carbone sont: l'ami don, la dextrine, les sucres tels que maltose, lactose et glucose, le glycérol, etc. Des sources appropriées d'azote sont l'asparagine, l'hydrolisat de caséine, la farine de soja, de l'extrait de boeuf, de l'extrait de levure, etc. La fermentation est mise en aeuvre le plus souvent pendant environ 24 à 150 heures. A la fin de cette période de temps, une quantité substantielle d'Amphotéricyne a été formée (comme montré par des essais biologiques).
L'Amphotéricyne peut être séparée de la culture par l'un des trois moyens suivants 1. Le mycélium est séparé de tout le bouillon par filtration ou centrifugation, et l'Ampho- téricyne est extraite du mycélium après avoir abaissé le pH du mycélium d'environ 2 à 3 par traitement avec un acide.
L'extraction est effectuée avec un solvant approprié, tel qu'un alcanol inférieur (par exemple l'isopropanol, le n-propanol ou le n-butanol). L'évapora tion de l'alcanol provoque la précipitation de l'Amphotéricyne brute.
2. Tout le bouillon est alcalinisé à un pH d'en viron 11, et de préférence à un pH d'environ 12, au moyen d'une base telle que l'hydro xyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium. Le bouillon est ensuite agité et filtré, et le fil- trat est neutralisé à un pH d'environ 7 au moyen d'un acide tel qu'un acide minéral (par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide sulfuri que ou l'acide phosphorique) pour précipiter l'Amphotéricyne brute.
3. Le pH de tout le bouillon est réglé soit à une valeur d'environ 2 à 3 (par traitement avec un acide), soit à une valeur de 10 à 11 (par traitement avec une base), l'Amphotéricyne étant plus soluble à ces gammes de pH. Le bouillon est ensuite extrait avec un agent ap proprié d'extraction, tel que les alcanols men tionnés précédemment, puis est filtré et les phases sont séparées (si du n-butanol est uti lisé). L'Amphotéricyne brute est ensuite pré cipitée directement du filtrat par neutralisa tion à un pH d'environ 7 et par enlèvement d'une partie de l'agent d'extraction par dis tillation dans le vide.
Une purification ultérieure de l'Amphotéricyne brute isolée est le fractionnement en ses deux cons tituants, Amphotéricyne A et Amphotéricyne B. Ce fractionnement est mis en oeuvre par l'un ou l'autre des moyens ci-après 1.
Le précipité d'Amphotéricyne brute est traité en bouillie dans un alcool, tel qu'un alcanol inférieur (par exemple le méthanol, le h-pro- panol, l'isopropanol et le butanol) à un pH bas (obtenu en traitant la bouillie avec un acide tel qu'un acide minéral), et est filtré. La matière insoluble consiste principalement en Amphotéricyne B brute. Le filtrat est neu tralisé avec une base, telle que l'hydroxyde de sodium, pour provoquer la formation d'un précipité d'une matière cristallisée purifiée re présentant principalement l'Amphotéricyne A.
2. Le précipité d'Amphotéricyne brute est traité en bouillie dans un solvant, tel qu'une di- (alcoyle inférieur) amide d'acide alcandïque inférieur (par exemple la diméthylformamide, la diméthylacétamide ou la diéthylforma- mide), et est filtré. La matière insoluble con siste principalement en Amphotéricyne B brute.
En traitant la solution d'amide avec un mélange d'eau et d'un solvant polaire or ganique, tel qu'un alcool aqueux (par exem ple une solution de méthanol et d'eau) ou une cétone aqueuse (par exemple une solu tion d'acétone et d'eau), on obtient un pré cipité cristallisé comprenant principalement l'Amphotéricyne A.
Les Amphotéricynes A et B sont des substances amphotériques qui forment aisément des sels avec à la fois des bases et des acides. Ainsi, en traitant l'Amphotéricyne avec une base inorganique, telle qu'une base d'un métal alcalin (par exemple l'hy droxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium) ou une base d'un métal alcalino-terreux, le sel du métal correspondant est formé. En traitant l'Amphotéricyne avec un sel d'un métal alcalino-terreux (par exemple le chlorure de calcium ou le chlorure de magnésium) dans un alcool tel que le méthanol, des complexes sont formés.
En faisant réagir l'Amphotéricyne avec un hydroxyle d'ammonium ou une base azotée or ganique, le sel correspondant d'ammonium ou d7ami- ne est formé.
Chacune des Amphotéricynes réagit de plus avec des acides à la fois minéraux et organiques pour for mer le sel de l'acide correspondant. Ainsi, l'Ampho- téricyne peut être traitée par des acides minéraux, tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique, pour former le sel correspon dant ; ou encore elle peut être traitée par des acides organiques, tels que l'acide acétique, l'acide citrique ou l'acide tartrique, pour former les sels des acides correspondants.
Les exemples ci-après illustrent l'invention. <I>Exemple 1</I> <I>Fermentation du Streptomyces</I> sp. <I>3694</I> Une charge de 12 litres de Streptomyces sp. 3694 est mise à fermenter dans le milieu d'ensemencement, pendant une durée et dans des conditions indiquées ci-après <I>Préparation</I> <I>A. Première phase</I> Source d'ensemencement - culture de Strepto myces sp. 3694, développée sur des plants d'agar- agar Gould.
Milieu - 3:% d'agent nutritif de Staley 4S 2 % de glucose 0,0005 0/<B>0</B> COC12. 6H20 0,1 % CaCO3 pH réglé à 7,0 - 7,2 Stérilisation pendant 30 minutes à 1210 C. Volume - 100 ml dans un ballon de 500 ml. Température - 250 C.
Durée d'ensemencement - 72 heures sur un agita teur alternatif (170 cycles par minute). <I>B. Seconde phase</I> Source d'ensemencement - 10 % de la première phase.
Milieu - le même que dans la première phase Stérilisation - 40 minutes à 121 C.
Volume - 480 ml dans un ballon de 2000 ml. Température - 250 C Durée d'ensemencement - 48 heures sur un. agita teur alternatif (120 cycles par minute). <I>Conditions de fermentation</I> Milieu - 3 '% d'agent nutritif de Staley 4S 2 % de glucose 0,25 0/<B>0</B> de CaC03 0,1 % NaCl 0,0005 0/<B>0</B> COC12 Stérilisation - 15 minutes à 1210 C.
Température - 25o C. Puissance dépensée pour l'agitation - 0,2 CV/4541. Aération - courant d'air avec une vitesse linéaire de 60 cm/min.
Cycle de fermentation - 144 heures.
Anti-mousse - Huile de combustion de première qualité (environ 0,5 % de la charge). Importance de l'ensemencement - 480 ml de la se conde phase du ballon (4 fl/o).
Volume - 12.000 ml.
Les résultats de la fermentation sont donnés dans le tableau ci-après (eu égard à deux charges)
EMI0004.0004
Charge <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> Durée <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> S.Cerevisiae <SEP> Essai <SEP> sur <SEP> S.Cerevisiae
<tb> de <SEP> fermentation, <SEP> Unités <SEP> <B>dé</B> <SEP> dilution/ml <SEP> pH <SEP> Unités <SEP> de <SEP> dilution/ml <SEP> pH
<tb> heures <SEP> Extrait* <SEP> Bouillon* <SEP> Extrait <SEP> Bouillon
<tb> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 6,5 <SEP> - <SEP> - <SEP> 6,6
<tb> 25 <SEP> 1600 <SEP> 120 <SEP> 7,2 <SEP> 640 <SEP> 120 <SEP> 7,2
<tb> 49 <SEP> 1600 <SEP> 120 <SEP> 7,0 <SEP> 120 <SEP> 120 <SEP> 7,1
<tb> 73 <SEP> 8000 <SEP> 180 <SEP> 7,1 <SEP> 12,000 <SEP> 80 <SEP> 7,3
<tb> 97 <SEP> 4000 <SEP> 80 <SEP> 7,0 <SEP> 3,000 <SEP> 120 <SEP> 7,1
<tb> 121 <SEP> 3000 <SEP> 40 <SEP> 6,9 <SEP> 4,000 <SEP> 120 <SEP> 7,
9
<tb> 144 <SEP> 9706 <SEP> 2560 <SEP> 7,2 <SEP> 40 <SEP> 80 <SEP> 8,1
<tb> Des <SEP> échantillons <SEP> ont <SEP> été <SEP> centrifugés <SEP> (les <SEP> essais <SEP> portant <SEP> sur <SEP> le <SEP> milieu <SEP> surnageant <SEP> étant <SEP> classés <SEP> sous <SEP> <SEP> bouillon <SEP> ), <SEP> et
<tb> le <SEP> centrifugat <SEP> extrait <SEP> avec <SEP> un <SEP> volume <SEP> de <SEP> butanol <SEP> égal <SEP> à <SEP> l'échantillon <SEP> original <SEP> (les <SEP> essais <SEP> portant <SEP> sur <SEP> cet <SEP> extrait <SEP> étant
<tb> classés <SEP> sous <SEP> <SEP> extrait <SEP> ). <SEP> Les <SEP> unités <SEP> de <SEP> dilution/ml <SEP> sont <SEP> l'inverse <SEP> du <SEP> nombre <SEP> minimum <SEP> de <SEP> ml <SEP> d'échantillon <SEP> encore <SEP> actif
<tb> en <SEP> dilution <SEP> dans <SEP> un <SEP> ml.
<I>Exemple 2</I> <I>Fermentation de Streptomyces</I> sp. <I>3694</I> Un ensemencement approprié, préparé suivant la manière décrite dans l'exemple 1, est introduit dans un milieu de fermentation contenant Farine de soja<B>.......... 10</B> gin Pommes de terre pulvérisées 10 gin Dextrose<B>.............. 10</B> gin CoC12. 6H20 <B>..........</B> 10 ml d'une solution à 0,05 fl/o CaCO3 ................
lgm Eau distillée <B>............</B> 1 litre Le milieu est stérilisé dans un autoclave à 121O C pendant 20 minutes préalablement à l'introduction de l'ensemencement. Au bout de quatre jours, des essais ont été effectués vis-à-vis de Saccharomyces cerevisiae avec une partie du bouillon qui a été lyo philisée et reconstituée avec de l'eau jusqu'à environ 2 fois 1/s la concentration originale et avec l'extrait à l'alcool butylique des cellules lavées, reconstituées jusqu'au volume de l'échantillon original,
ces essais ont donné les résultats ci-après
EMI0004.0021
Essai <SEP> sur <SEP> S.Cerevisiae
<tb> Unités <SEP> de <SEP> dilution/ml
<tb> Bouillon <SEP> .............. <SEP> 5000
<tb> Extrait <SEP> des <SEP> cellules <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5000 Ensuite de ces essais, la fermentation est pour suivie pendant 5 jours.
L'Amphotéricyne peut être extraite de l'une ou l'autre des manières indiquées ci-après <I>Extraction à</I> l'isopropanol <I>de tout le bouillon</I> L'extraction de l'Amphotéricyne à partir de tout le bouillon de l'exemple 1 est mise en aeuvre en ajoutant 80 à 170 fl/o du volume du bouillon en iso- propanol et en réglant à un pH de 2,0 avec de l'acide sulfurique. Après agitation pendant environ 1/2 heure, le mélange est filtré, de préférence en utilisant l'aide d'un filtre.
Le pH du filtrat est réajusté à environ 7 avec de l'hydroxyde de sodium et l'isopropanol est éliminé par distillation dans le vide à une tempéra ture non supérieure à 350 C. Le mélange est ensuite laissé dans une chambre froide pendant la nuit, le précipité qui se forme est éliminé par filtration, lavé avec de l'acétone et séché dans le vide. Un mélange d'Amphotéricyne A et d'Amphotéricyne B est obtenu avec un rendement d'environ 40 0/0.
Les essais sur le mélange ont donné environ 1500-2500 ud/mg (Saccharomyces cerevisiae) ; ud/mg (unités de dilu- tion/mg) désigne l'inverse du nombre minimum de mg du mélange qui est encore actif en dilution dans un ml.
Extraction <I>au</I> butanol <I>de tout le bouillon</I> A 9,4 litres du milieu de culture, titrant 3000 ud/ ml, on ajoute un quart de son volume de butanol. Le pH est abaissé à 2.0 avec de l'acide sulfurique et le mélange est bien agité pendant 1/2 heure. Le produit marque Hyflo (5 % P/v) ou tout autre adjuvant de filtrant est alors ajouté et le mélange est filtré. Le filtrat est placé dans un entonnoir de séparation et la couche de butanol est séparée et re tenue.
La solution de butanol est alors distillée jus qu'à 1/s de son volume original sous vide à une tem pérature non supérieure à 35c, C. Il se forme un pré cipité qui est éliminé par filtration, qui est bien lavé avec de l'acétone et qui est séché dans le vide.
Le produit, qui est obtenu avec un rendement d'environ 22 %, est un mélange d'Amphotérieyne A et d'Am- photéricyne B et des essais sont effectués avec envi- ron <B>1600</B> ud/mg vis-à-vis du Saccharomyces cerevi- siae et avec environ 960 ud/mg vis-à-vis du Candida albicans.
<I>Extraction</I> d'Amphotéricyne <I>du mycélium</I> 1 litre du milieu de culture contenant de l'Am- photéricyne est centrifugé pour séparer le filtrat et le mycélium. Le gâteau humide de mycélium est agité avec 200 ml de n-propanol, est réglé à un pH de 2,0 à 3,0 avec de l'acide sulfurique et est laissé dans une chambre froide pendant la nuit.
Le propanol est séparé par centrifugation et le gâteau mycélial est extrait trois nouvelles fois avec 100 ml de portions de n-propanol. Les extraits combinés de propanol sont concentrés dans le vide sous un faible volume d'environ 130 ml, volume pour lequel se forme un précipité. Ce précipité est éliminé par centrifugation et est séché dans le vide.
On récupère environ 1.114 gm, avec une puissance d'environ 1176 ud/mg vis-à- vis du Candida. 820 mg de ce produit solide est fi nement pulvérisé et est dissous par chauffage dans un mélange de 80 ml de n-butanol et de 16 ml de méthanol, alors que 80 ml d'eau sont ajoutés pro gressivement. A cette solution, sont ajoutés 48 ml d'hexane, et le mélange est agité, puis est laissé re poser à la température ambiante pendant la nuit.
Une fraction de cristaux jaune pâle d'Amphotéricyne est formée ; elle est filtrée et séchée dans un dessicca- teur. D'autres fractions d'une matière moins pure peuvent être obtenues par concentration des liqueurs mères dans le vide.
<I>Extraction de tout le</I> bouillon <I>rendu basique</I> A un échantillon de 500 ml du milieu de cul ture contenant l'Amphotéricyne et titrant à l'essai <B>11000</B> ud./ml vis-à-vis du Saccharomyces cerevisiae, est ajouté un volume égal d'alcool isopropylique. Le pH de ce mélange est alors élevé à 10,
5 en utilisant de l'hydroxyde de sodium à 20 %. Ce mélange est ensuite agité pendant 1/2 heure, on ajoute 2'% de Hyflo (P/v),
et le mélange est filtré. Le pH du filtrat est abaissé à 7 en utilisant 20 '% d'acide sul- furique et l'alcool isopropylique est éliminé dans le vide à une température non supérieure à 350 C. Après avoir laissé reposer pendant une nuit, le pré cipité est éliminé par filtration, est lavé à l'eau puis à l'acétone et est séché dans le vide.
Le rendement s'élève à environ 1.22 g (77 0/0) d'un mélange d'Am- photéricyne A et d'Amphotéricyne B, dont l'essai donne environ 3400 ud/mg (Saccharomyces cere- visiae).
Les mélanges d'Amphotéricyne peuvent être frac tionnés en leurs constituants, Amphotéricyne A et Amphotéricyne B, comme indiqué ci-après <I>Cristallisation utilisant de</I> l'alcool L'Amphotéricyne obtenue ci-dessus est mélangée,
de façon à former une bouillie avec de l'alcool iso- propylique aqueux à 70 % à une concentration cor- respondant à une activité de 32 000-35 000 ud/ml contre Candida albicans, tout en agitant ; le pH est abaissé à 2 avec de l'acide chlorhydrique. La matière insoluble (Amphotéricyne B brute) est éliminée par filtration et le pH du filtrat est élevé à environ 7,5.
Après avoir laissé reposer pendant une nuit, le pré cipité cristallisé, consistant principalement en Am- photéricyne A purifiée, est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et séché dans le vide. Le rendement d'Amphotéricyne A est d'environ 50 % basé sur l'ac- tivité biologique.
<I>Cristallisation utilisant la</I> diméthylformamide L'Amphotéricyne est mélangée de façon à former une bouillie avec de la diméthylformamide (1 g/ 20 ml). Tout en agitant, le pH est abaissé à 7, en utilisant de l'acide chlorhydrique concentré.
Après agitation pendant 1/2 heure, le produit Hyflo (1 % P/v) est ajouté et le mélange est filtré. Au fil- trat, est ajouté un volume de méthanol, suivi par la lente addition d'un volume d'eau.
(Bien qu'une solution de méthanol et d'eau soit préférée, l'étha nol, l'acétone ou le dioxane dans l'eau exercent éga lement une action efficace). On laisse alors le mé lange reposer pendant la nuit avec le pH résultant de 4,5. Le précipité ainsi formé est éliminé par fil tration, est lavé à l'acétone et est séché.
Il est com- posé de 85-90 % d'Amphotéricyne B, de 5-10 % d'Amphotéricyne A et d'une faible quantité d'impu retés.
Le pH de la liqueur mère résultante d'où l'Amphotéricyne B a été isolée est ensuite élevé à 8 par addition d'hydroxyde de sodium, et on ajoute encore 3 volumes d'eau. Après avoir laissé reposer pendant la nuit, le précipité est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché.
Ce précipité est composé de 80-85 % d'Amphotéricyne A, de 5- 10 % d'Amphotéricyne B et d'une faible quantité d'impuretés.
La récupération de toute l'activité s'élève à 90-95 La fraction contenant en prédominance l'Ampho- téricyne B peut être encore purifiée en en faisant une bouillie avec de l'isopropanol aqueux à 70 %, à une concentration de 1 g par 100 ml à un pH 2 pendant 1/2 heure. Le mélange est ensuite filtré, le filtrat est chauffé à 450 C et le pH est élevé lentement à 5 avec de l'hydroxyde de sodium.
On laisse ensuite le mélange refroidir lentement à la température am biante et reposer pendant la nuit. Le produit cris tallisé (rendement d'environ 50 '0 /0) est ensuite éli miné par filtration, est lavé à l'acétone et est séché. Il représente essentiellement l'Amphotéricyne B pure.
La fraction contenant en prédominance l'Ampho- téricyne A peut être à nouveau purifiée en formant une bouillie dans la diméthylformamide à une concentration de 1 g par 20 ml, en agitant pendant 1 heure,
en éliminant par filtration les matières insolubles et en ajoutant le filtrat lentement à un volume égal de méthanol aqueux à 50 %. Le préci- pité cristallisé est éliminé par filtration après avoir reposé pendant la nuit, est lavé à l'acétone et est séché.
L'Amphotéricyne A sensiblement pure est obtenue ainsi avec un rendement de 70-80% approximativement.
Des sels et des complexes d'Amphotéricyne peuvent être préparés suivant les indications données ci-après <I>Préparation de sels de métaux alcalins</I> d'Amphotéricyne L'Amphotéricyne, soit en un mélange brut, soit sous la forme de cristaux purifiés d'Amphotéricyne A ou B, forme aisément des sels et le mode opératoire suivant est également efficace pour former soit le sel de sodium ou de potassium du mélange,
soit les sels des constituants purifiés A ou B L'Amphotéricyne A cristallisée est mise en sus pension dans une quantité de méthanol telle que la concentration de l'antibiotique soit d'environ 250 000 u/ml (Saccharomyces cerevisiae). 2 équivalents d'hy droxyde de sodium méthanolique 1N sont ajoutés et le mélange est agité pendant 15 minutes pour assurer une solubilisation complète de l'antibiotique. La solution est filtrée et 10 volumes d'acétone sont ajoutés au filtrat.
Un précipité de sel de sodium est ainsi formé, est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché dans un dessiccateur. Le rendement du sel de sodium est d'environ 90 % de l'Amphotéricyne originale basée sur son activité biologique (in vitro).
Le sel de sodium présente dans l'eau une solu bilité plus grande (50-60 mg/ml) que l'Amphotéri- cyne A cristallisée originale. Il présente également une bonne solubilité dans le méthanol et la diméthyl- formamide. Il est quelque peu soluble dans l'éthanol et l'isopropanol, mais insoluble dans l'éther, l'acé tone, le butanol, le chloroforme, le benzène, l'hexane et le dioxane.
<I>Préparation du complexe de chlorure de calcium</I> Un complexe de chlorure de calcium d'Ampho- téricyne peut être préparé en dissolvant l'Amphoté- ricyne cristallisée soit A, soit B (ou un mélange des deux) dans 1:
% de chlorure de calcium méthanoli- que (1 gin/20 ml), en éliminant par filtration toute matière insoluble et en ajoutant 5 volumes d'acétone au filtrat. Le précipité est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché dans le vide. La solubilité du complexe de chlorure de calcium dans des solvants organiques est analogue à celle des sels métalliques.
Cependant, dans l'eau, le complexe s'hydrolyse et sa solubilité est celle de l'Amphoté- ricyne originale. <I>Préparation d'un sel d'acide</I> L'Amphotéricyne A ou B cristallisée (ou un mélange des deux) est dissoute dans la diméthylfor- mamide (1 g/25 ml), et un équivalent d'acide chlor hydrique concentré y est ajouté. Le mélange est filtré et 10 volumes d'acétone sont ajoutés au filtrat neutre. Le précipité ainsi formé est éliminé par filtration, est lavé à l'acétone et est séché dans un dessiccateur dans le vide.
Le produit, qui est obtenu avec un rendement d'environ 90 '%, contient un équivalent d'acide et présente in vitro une activité biologique équivalente à celle de l'Amphotéricyne cristallisée. Il est quelque peu plus soluble dans l'eau et bien plus soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol et le butanol que ne l'est l'Amphoté- ricyne cristallisée.
Cependant, le sel d'acide est insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther, le benzène, l'acétate d'éthyle et l'hexane.
Le sultafe a été préparé de la même manière en substituant un équivalent d'acide sulfurique à l'acide chlorhydrique. Il présente des propriétés analbgues à celles de l'hydrochlorure. <I>Propriétés chimiques et physiques de</I> l'Amphotéricyne L'Amphotéricyne A cristallisée présente les caractéristiques physiques et chimiques suivantes Point de fusion Fonce à 180-185C, brunit et se contracte à 198-2000 C, fond avec décomposition à environ 2100 C.
Analyse élémentaire C - 59,28 0/0 H - 8,43,% N - 1,81 % O - 30,48 % (par différence) Aucun autre élément présent.
Pas de groupes méthoxy ou acétyle. Pouvoir rotatoire spécifique [a]D C -I-- 163o (pyridine) ; -f- 93o (acide acé tique) ; -I- 1361, (diméthylformamide) ; -f- 28,, (0,1N HCl dans le méthanol).
Solubilité Bonne solubilité dans l'acide acétique glacial et la diméthylformamide. Soluble jusqu'à la proportion d'environ 1 mg/ml dans le méthanol, l'alcool isopro- pylique aqueux et le butanol humide, bien plus soluble dans ces solvants lorsqu'il est acidifié ou fortement alcalinisé. (Par exemple dans une solution d'alcool isopropylique à 50 0/0, la solubilité de l'Amphotéricyne A est, comme indiqué, approxima tivement 1 mg/ml à un pH entre 3 et 8 ; à un pH de 2,9 et 10, cependant, la solubilité est 3 mg/ml, alors qu'à un pH 11, la solubilité est augmentée jusqu'à 8-10 mg/ml).
L'antibiotique est insoluble dans l'eau à un pH neutre ou acide dans les conditions ordinaires, mais est soluble à un pH 10 et au-dessus. Cependant, dans des solutions diluées, l'antibiotique peut être dissous dans une solution aqueuse neutre en augmentant le pH d'une suspension de la matière à 11, comme, par exemple, avec de l'hydroxyde de sodium. La solution ainsi formée peut être neutralisée avec un acide sans que se produise une précipitation quelconque.
L'Amphotéricyne A est insoluble dans l'éther, le dioxane, l'acétate d'éthyle, l'acétate d'amyle, le chloroforme, le benzène, l'acétone, l'hexane, l'éthanol absolu, l'isopropanol ou le butanol.
Spectre d'ultraviolet Les maxima d'absorption dans l'ultraviolet de l'Amphotéricyne A cristallisée dans le méthanol sont:
EMI0007.0007
Certains maxima d'absorption dans la région 362 405 peuvent être dus à la présence d'un peu d'Am- photéricyne B.
Spectre d'infrarouge Le spectre d'absorption dans l'infrarouge de l'Amphotéricyne A en suspension dans le milieu Nujol montre des pointes (et des paliers indiqués par sh pour les fréquences et longueurs d'ondes sui vantes
EMI0007.0013
Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde <SEP> Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde
<tb> (cm-1) <SEP> (R) <SEP> (cm-1)
<tb> 3333 <SEP> 3,00 <SEP> 1129 <SEP> 8,86
<tb> 1695 <SEP> 5,90 <SEP> 1105 <SEP> 9,05
<tb> 1656 <SEP> 6,04 <SEP> 1066 <SEP> 9,38
<tb> 1623 <SEP> 6,16 <SEP> sh <SEP> 1035 <SEP> 9,66
<tb> 1567 <SEP> 6,38 <SEP> sh <SEP> 1008 <SEP> 9,92
<tb> 1546 <SEP> 6,47 <SEP> 992 <SEP> 10,08
<tb> 1425 <SEP> 7,02 <SEP> sh <SEP> 977 <SEP> 10,24 <SEP> sh
<tb> 1403 <SEP> 7,13 <SEP> 949 <SEP> 10,54
<tb> 1374 <SEP> 7,
28 <SEP> sh <SEP> 912 <SEP> 10,96
<tb> 1323 <SEP> 7,56 <SEP> 893 <SEP> 11,20
<tb> 1276 <SEP> 7,84 <SEP> sh <SEP> 877 <SEP> 11,40
<tb> 1232 <SEP> 8,12 <SEP> 850 <SEP> 11,76
<tb> 1201 <SEP> 8,32 <SEP> sh <SEP> 836 <SEP> 11,96
<tb> 1183 <SEP> 8,45 <SEP> 810 <SEP> 12,34
<tb> 1159 <SEP> 8,63 <SEP> 794 <SEP> 12,60
<tb> 760 <SEP> 13,16 Equivalent neutre de l'Amphotéricyne A cristallisée 929 en titrant comme une base 989 en titrant comme un acide Stabilité du pH Stable pour tous les pH entre 3 et 11 pour au moins une durée allant jusqu'à 24 heures. A un pH aussi bas que 2, l'Amphotéricyne A est stable pour une durée de 3 heures avec seulement une faible quantité de décomposition qui se produit.
Stabilité thermique Stable jusqu'à environ 700 C, dans une solution neutre d'isopropanol à 50 '%.
Essais chimiques Fournit une couleur jaune avec du chlorure ferrique.
L'Amphotéricyne B cristallisée présente les carac téristiques physiques et chimiques suivantes Point de fusion Aucun point de fusion distinct ; fonce et car bonise.
Analyse élémentaire C = 56,70 % H = 7,72 % N = 1,87% O = 33,711% Aucun autre élément présent.
Ni groupes méthoxy ni groupes acétyle. Pouvoir rotatoire spécifique [-a]D C -I- 2380 (diméthylformamide) ; -52,20 (0,1N HCl dans le méthanol).
Solubilité Bonne solubilité dans la dimétyhylformamide et dans l'acide acétique glacial. Soluble jusqu'à la proportion de 0,5 mg/1 dans le méthanol, l'alcool isopropylique aqueux et le butanol humide, et beau coup plus soluble dans ces solvants lorsqu'elle est acidifiée ou fortement alcalinisée.
Spectre d'ultraviolet Les maxima d'absorption dans l'ultraviolet de l'Amphotéricyne B cristallisée dans le méthanol sont:
EMI0007.0049
Spectre d'infrarouge Le spectre d'absorption dans l'infrarouge de l'Amphotéricyne B en suspension dans le milieu Nujol montre des pointes (et des paliers indiqués par sh ) pour les fréquences et longueurs d'ondes suivantes
EMI0008.0003
Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde <SEP> Fréquence <SEP> Longueur <SEP> d'onde
<tb> (cm-1) <SEP> W <SEP> (cm-1)
<tb> 3333 <SEP> 3,00 <SEP> 1042 <SEP> 9,60
<tb> 1709 <SEP> 5,85 <SEP> 1008 <SEP> 9,92
<tb> 1577 <SEP> 6,34 <SEP> 981 <SEP> 10,19
<tb> 1401 <SEP> 7,14 <SEP> 965 <SEP> 10,
36 <SEP> sh
<tb> 1374 <SEP> 7,28 <SEP> 903 <SEP> 11,08
<tb> 1323 <SEP> 7,56 <SEP> sh <SEP> 886 <SEP> 11,29
<tb> 1266 <SEP> 7,90 <SEP> 852 <SEP> 11,74
<tb> 1232 <SEP> 8,12 <SEP> 812 <SEP> 12,32 <SEP> sh
<tb> 1192 <SEP> 8,39 <SEP> 794 <SEP> 12,60
<tb> 1174 <SEP> 8,52 <SEP> 758 <SEP> 13,20
<tb> 1134 <SEP> 8,82
<tb> 1106 <SEP> 9,04
<tb> 1068 <SEP> 9,36 Equivalent neutre de l'Amphotéricyne B cristallisée 760 en titrant comme une base.
La stabilité du pH et la stabilité thermique de l'Amphotéricyne B sont analogues aux stabilités cor respondantes de l'Amphotéricyne A.
<I>Propriétés biologiques des</I> Amphotéricynes L'Amphotéricyne, à l'état de mélange et à l'état d'Amphotéricyne A et d'Amphotéricyne B purifiées, présente un large spectre fongicide, comme indiqué par le tableau suivant Le tableau ci-dessous ne représente pas une indi cation exacte de l'activité de l'Amphotéricyne B, puisque cet antibiotique est extrêmement insoluble et que, par suite,
son efficacité dans le milieu agar- agar utilisé pour déterminer le spectre fongicide ci- dessus est grandement diminuée.
Ainsi, dans les essais de tubes dans le bouillon, lorsque l'Ampho- téricyne B est comparée aux Amphotéricynes mélan gées en ce qui concerne l'efficacité vis-à-vis de Candida albicans et Saccharomyces cerevisiae, il a été déterminé que l'Amphotéricyne B était respecti vement 8,10 et 6,17 fois plus efficace que ne le sont les Amphotéricynes mélangées.
L'Amphotéricyne, soit en mélange, soit indivi duellement, est utile pour combattre les champignons pathogènes qui provoquent la dermatomycose et des mycoses généralisées. Spécifiquement elle est effi ciente dans le traitement du pied d'athlète , de la coccidioidomycose, des moniliases, de la blastomy- cose, etc.
Ainsi, pour la prophylaxie et la thérapeu tique dans une infection moniliale et d'autres cham pignons, l'Amphotéricyne peut être administrée à des personnes humaines par voie buccale sous forme de tablettes contenant 1/2 à 1 gm de l'antibiotique ; et elle peut être ainsi utilisée en combinaison avec des antibiotiques bactéricides à large spectre, tels que l'oxytétracycline, la chlorotétracycline ou la tétracy cline, à la place de la nystatine pour inhiber le développement des champignons résultant.
EMI0008.0039
Amphotéricynes <SEP> Amphotéricyne <SEP> Amphotéricyne
<tb> mélangées <SEP> A <SEP> B
<tb> <U>CIM <SEP> <B>*</B></U> <SEP> y/ml <SEP> CIM <SEP> <B><U>'Y/MI</U></B> <SEP> C<U>IM <SEP> <B>7/mi</B></U>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> <B>................</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> 25
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> <B>....................</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> <B>.........</B> <SEP> . <SEP> <B>..............</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> notatum <SEP> <B>....................</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Ceratostomella <SEP> Ulmi <SEP> <B>................</B> <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> 1,6 <SEP> 1,6 <SEP> 3,1
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> ......................
<SEP> 1,6 <SEP> 1,6 <SEP> 6,3
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> 9533 <SEP> <B>........</B> <SEP> 1,6 <SEP> 1,6 <SEP> 12,5
<tb> Microsporum <SEP> audouini <SEP> <B>..................</B> <SEP> 12,5 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Microsporum <SEP> canis <SEP> <B>......................</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Botrytis <SEP> tulipae <SEP> <B>........................</B> <SEP> 6,3 <SEP> 6,3 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Rhodotorula <SEP> glutinis <SEP> <B>....................</B> <SEP> 3,1 <SEP> 3,1 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Fusarium <SEP> bulbigenium <SEP> <B>..................</B> <SEP> 6,3 <SEP> 6,3 <SEP> > <SEP> 100
<tb> CIM <SEP> désigne <SEP> la <SEP> concentration <SEP> inhibitrice <SEP> minimum.
<I>Comparaison de</I> l'Amphotéricyne <I>avec d'autres</I> <I>antibiotiques</I> Etant donné que l'Amphotéricyne manifeste cer taines caractéristiques analogues à celles d'autres antibiotiques, des essais physiques et biologiques comparatifs ont été effectués pour établir qu'il s'agit de nouveaux antibiotiques, non préparés ni décrits précédemment.
L'Amphotéricyne présente une gamme élevée d'activité si on la compare à la nystatine et à la rimocidine. Une comparaison d'un mélange purifié d'Amphotéricynes A et B avec une charge purifiée de nystatine vis-à-vis de deux organismes-témoins donne le résultat suivant
EMI0008.0048
Rapport <SEP> d'activité
<tb> Organisme-témoin <SEP> Amphotéricyne/nystatine
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> . <SEP> .
<SEP> 2,86
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> <B>........</B> <SEP> 5,62 Comme la rimocidine présente un spectre fon gicide analogue à celui de la nystatine et de l'Am- photéricyne, elle a été essayée sous la forme de son sulfate à côté de l'Amphotéricyne et de la nystatine vis-à-vis de S. cerevisiae. Elle est moins active que la nystatine ou l'Amphotéricyne sur la base du poids, comme l'indique le tableau suivant
EMI0009.0003
CIM <SEP> vis-à-vis <SEP> de <SEP> S. <SEP> cerevisiae
<tb> y/ml
<tb> Nystatine <SEP> <B>..........</B> <SEP> 0,512 <SEP> (8 <SEP> essais)
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> rimocidine <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,915 <SEP> (9 <SEP> essais)
<tb> Amphotéricynes <SEP> .... <SEP> 0,160 <SEP> (10 <SEP> essais) Ces résultats montrent les propriétés supérieures de l'Amphotéricyne par comparaison avec la nysta- tine et la rimocidine vis-à-vis de Saccharomyces cerevisiae et Candida albicans.
En dehors des différences biologiques précitées, l'Amphotéricyne diffère physiquement de la nysta- tine, de la rimocidine et de l'ascosine, comme indiqué par les comparaisons suivantes du pouvoir rotatoire spécifique <I>Pouvoir rotatoire spécifique de</I> l'Amphotéricyne <I>A,</I> <I>de</I> l'Amphotéricyne <I>B, de la nystatine, de la</I> rimocidine <I>et de</I> l'ascosine [ajD C
EMI0009.0022
Solvant <SEP> Diméthyl- <SEP> 0,
1N <SEP> HCl
<tb> Antibiotique <SEP> Pyridine <SEP> Acide <SEP> acétique <SEP> formamide <SEP> dans <SEP> le <SEP> méthanol
<tb> Amphotéricyne <SEP> A <SEP> <B>..............</B> <SEP> -I- <SEP> 163o <SEP> +93o <SEP> -I- <SEP> 136o <SEP> +28o
<tb> Amphotéricyne <SEP> B <SEP> <B>.............. <SEP> +2380</B> <SEP> -52,20
<tb> Nystatine <SEP> .................... <SEP> -I- <SEP> 110 <SEP> - <SEP> 70 <SEP> -I- <SEP> 6,5o <SEP> - <SEP> 3,50
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> rimocidine <SEP> <B>.....</B> <SEP> . <SEP> <B>....</B> <SEP> +102o <SEP> +67o
<tb> Ascosine <SEP> (50 <SEP> % <SEP> NaHC03 <SEP> en <SEP> poids) <SEP> -f- <SEP> 12,2o <SEP> -130 Les données de ce tableau peuvent être mises en parallèle avec les données d'absorption dans l'ultra violet pour les deux Amphotéricynes ;
il est évident que l'Amphotéricyne A, bien qu'elle ait un spectre d'ultraviolet qui est analogue à celui rapporté pour la nystatine et la rimocidine, s'en différencie par les pouvoirs rotatoires spécifiques respectifs ; et, de même, bien que l'Amphotéricyne B ait un spectre d'ultraviolet qui est très semblable à celui de l'asco- sine, les deux produits se distinguent par les différen ces dans leurs pouvoirs rotatoires spécifiques res pectifs.
La conclusion à tirer de ces comparaisons réside donc dans le fait que l'Amphotéricyne diffère de la nystatine, de la rimocidine ou de l'ascosine à la fois dans ses effets biologiques et dans ses caractéristiques physiques.
Method for preparing a new antibiotic The subject of the invention is a method for preparing a new antibiotic. The new antibiotic will be called, in the description which follows, Amphotericyne; it is a mixture which can be separated into two constituents, which will be called Amphotericyne A and Amphotéricyne B.
According to the invention, this antibiotic is prepared by cultivating a new species of Streptomyces, the strain sp. 3694, or a mutant of this strain, in an aqueous nutrient medium comprising a source of assimilable and fermentable carbon and energy and a source of assimilable nitrogen, aerobically and in immersion, until such time as substantial fungicidal activity is conferred on this medium and isolating the antibiotic from the medium.
<I> The microorganism </I> The microorganism used for the preparation of Amphotericyne is a recently discovered species of Streptomyces isolated from a sample obtained at Tembladora, on the Orinoco river, in South America. A culture of the living organism has been deposited and forms part of the collection of mother cultures at the Rutgers Institute of Microbiology (New Brunswick, New Jersey), where it is available; and it has been given number 3694 in the Waksman collection and is hereinafter referred to as Streptomyces sp. 3694.
The invention is also operable with mutants of the particular organism described herein, mutants which can be obtained by the action of change-determining agents, such as x-rays, ultraviolet radiation and nitrogenous yperites. The microorganism, when examined by the method of band application on brewer's yeast agar agar, for its antibiotic activity against both bacteria and fungi, does not destroy any of the test bacteria, but destroys the test fungi Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutinis,
Candida albicans and Aspergillus piger.
Hereinafter, a description is given of the colonies of the microorganism subjected to incubation for different periods and on different media <I> Potato plant </I> After 15 days, the culture expands, very heavy, moist, hardened, with about the same color as potatoes, white spores covering part of the crop on the sloping portion.
<I> Sunflower milk: </I> In 7 days, the nucleus of the culture on the surface is colorless. The milk turns purple-blue, lightening gradually from top to bottom, indicating proteolysis without coagulation.
<I> Agar-agar </I> Czapek-Dox NaN03, 3 gm; KH2PO4, 1 gm; KCl, 0.5 gin; MgS04. 7H20, 0.5gm; FeS04. 7H20, 0.01 gm; glue cose, 40 gm; agar-agar, 15 gm; distilled water up to 1,000 ml.
No growth in 15 days despite two inoculations or inoculations. <I> Plant </I> purple agar-agar with glucose-medium </I> nutrient-bromocresol Beef extract, 3 gin; protein peptone, 10 µl; glucose, 10 gin; NaCl, 5 gm; agar-agar, 20 gin; bromocresol purple, 0.15 gin; distilled water up to 1,000 ml. pH7.0.
Moderately heavy growth in 51 days, smooth, shiny, asporogenic. The wrinkling on all agar-agars is very characteristic. The wrinkles are parallel, with serrations in straight lines in the crop at right angles to each other, giving the appearance of a masonry wall with rectangles of varying sizes. <I> Agar-agar plant </I> Sabouraud Glucose, 40 gin; neopeptone, 10 gn; agar-agar, 15 gin; distilled water 1,000 ml.
After 4 days, the culture is yellow, turning brown after 7 days and all brown after 15 days. The culture is heavy, first shiny, then turning dull, wrinkled with a diffusible brown pigment visible after 3 to 4 days. <I> Glucose-asparagine agar-agar plant </I> Glucose, 10 gin; K2HPO4, 0.5 gin; asparagine, 0.5 gin; agar-agar, 15 gin; distilled water, 1,000 ml.
After 7 and 15 days, the culture is moderately heavy, non-wrinkled, colorless, with white spores turning gray, and a diffuse yellow pigment turning brown. In addition, a water insoluble, dark yellow material is deposited on the edges of the agar plant and at the base of the plant. This material is soluble in methanol, pro panol and dimethylformamide.
The microorganism is further characterized in that hydrogen sulfide is not produced, as shown by testing with lead acetate paper in a medium comprising: proteose peptone, 20 µm; glucose, 1 gin; 2 gn Na2HPO4; and distilled water up to 1 liter. The culture develops as an asporogenic white film. In addition, Difco gelatin is liquefied. The culture develops as a light brown nucleus which is asporogenous on the surface.
In addition, in Difco nitrate broth, the culture grows as a slightly brown, porogenic film. The broth darkens with a diffusing brown pigment. Nitrate is greatly reduced to nitrite. In addition, starch is hydrolyzed by the culture when it grows in a medium containing starch.
To determine the carbon and hydrogen content of Streptomyces sp. 3694, tests were carried out as follows:. four sets of agar tubes with inorganic salts are prepared with 1 mg per ml of these four nitrogen sources, respectively: (NH4) 2SO4, NaNO3, asparagine and casein hydrolyzate. In each series, each tube is reinforced with 10 mg per ml of one of the sixteen possible sources of carbon and energy.
These are starch, inulin, dextrin, raffinose, mal tose, lactose, sucrose, sorbose, glucose, dulcitol, inositol, sorbitol, mannitol, xylose, arabinose and glycerol.
The agar in the tubes (10 ml) is enclosed and the plants are treated with a suspension of Streptomyces sp. 3694 in distilled water. After 9 days of incubation, the culture was examined and the results indicate that the microorganism is capable of assimilating carbon from starch, dextrin, maltose, glucose and mannitol. , regardless of the source of the hydrogen. Along with organic sources of nitrogen, lactose, sucrose, inositol, and glycerol can also be used, although cultivation with these carbon sources may be lighter than with glucose and its polymers.
Nitrates are not sources of nitrogen along with any of the carbon and energy sources, while asparagine and casein hydrolyzate can serve as the sole sources of carbon, nitrogen and energy. <I> The antibiotic </I> Streptomyces sp. 3694 produces a mixture of antibiotics. The mixture itself, as well as the specific antibiotics isolated from the same mixture, exhibit a broad fungicidal spectrum, but no significant bactericidal properties.
In carrying out the present method, Strepto myces sp. 3694 is usually grown at a temperature of 230 ° C to 301 ° C, preferably about 25 ° C.
Suitable sources of carbon are: friend, dextrin, sugars such as maltose, lactose and glucose, glycerol, etc. Suitable sources of nitrogen are asparagine, casein hydrolyzate, soybean meal, beef extract, yeast extract, etc. Fermentation is carried out most often for about 24 to 150 hours. At the end of this time period, a substantial amount of Amphotericyne had been formed (as shown by bioassays).
Amphotericyne can be separated from the culture by any of the following three means 1. The mycelium is separated from all the broth by filtration or centrifugation, and Amphoteryne is extracted from the mycelium after lowering the pH of the mycelium. about 2 to 3 per treatment with an acid.
The extraction is carried out with a suitable solvent, such as a lower alkanol (eg isopropanol, n-propanol or n-butanol). Evaporation of the alkanol causes precipitation of crude Amphotericyne.
2. All broth is alkalized to a pH of about 11, and preferably a pH of about 12, using a base such as sodium hydroxide or potassium hydroxide. The broth is then stirred and filtered, and the filtrate is neutralized to a pH of about 7 by means of an acid such as a mineral acid (for example hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid) to precipitate crude Amphotericyne.
3. The pH of all the broth is adjusted either to a value of about 2 to 3 (by treatment with an acid) or to a value of 10 to 11 (by treatment with a base), Amphotericine being more soluble. at these pH ranges. The broth is then extracted with a suitable extracting agent, such as the alkanols mentioned above, then is filtered and the phases are separated (if n-butanol is used). The crude Amphotericyne is then precipitated directly from the filtrate by neutralization to a pH of about 7 and by removing part of the extractant by vacuum distillation.
A subsequent purification of the crude Amphotericyne isolated is the fractionation into its two constituents, Amphotericyne A and Amphotericyne B. This fractionation is carried out by one or the other of the means below 1.
The precipitate of crude Amphotericyne is slurried in an alcohol, such as a lower alkanol (e.g. methanol, h-propanol, isopropanol and butanol) at low pH (obtained by treating the slurry with an acid such as a mineral acid), and is filtered. The insoluble matter consists mainly of crude Amphotericyne B. The filtrate is neutralized with a base, such as sodium hydroxide, to cause the formation of a precipitate of purified crystalline material predominantly exhibiting Amphotericyne A.
2. The precipitate of crude Amphotericyne is slurried in a solvent, such as a lower alkandic acid di- (lower alkyl) amide (eg, dimethylformamide, dimethylacetamide or diethylformamide), and is filtered. . The insoluble matter consists mainly of crude Amphotericyne B.
By treating the amide solution with a mixture of water and an organic polar solvent, such as an aqueous alcohol (eg, a solution of methanol and water) or an aqueous ketone (eg, a solu acetone and water), a crystalline precipitate is obtained comprising mainly Amphotericyne A.
Amphotericines A and B are amphoteric substances which readily form salts with both bases and acids. Thus, by treating Amphotericyne with an inorganic base, such as a base of an alkali metal (eg sodium hydroxide or potassium hydroxide) or a base of an alkaline earth metal, the corresponding metal salt is formed. By treating Amphotericyne with a salt of an alkaline earth metal (eg, calcium chloride or magnesium chloride) in an alcohol such as methanol, complexes are formed.
By reacting Amphotericyne with an ammonium hydroxyl or an organic nitrogenous base, the corresponding ammonium or amine salt is formed.
Each of the Amphotericynes further reacts with both mineral and organic acids to form the corresponding acid salt. Thus, Amphotericyne can be treated with mineral acids, such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid, to form the corresponding salt; or it can be treated with organic acids, such as acetic acid, citric acid or tartaric acid, to form the salts of the corresponding acids.
The examples below illustrate the invention. <I> Example 1 </I> <I> Fermentation of Streptomyces </I> sp. <I> 3694 </I> A 12 liter load of Streptomyces sp. 3694 is left to ferment in the sowing medium, for a period and under the conditions indicated below <I> Preparation </I> <I> A. First phase </I> Seeding source - culture of Strepto myces sp. 3694, developed on Gould agar plants.
Medium - 3:% Staley 4S nutrient 2% glucose 0.0005 0 / <B> 0 </B> COC12. 6H20 0.1% CaCO3 pH adjusted to 7.0 - 7.2 Sterilization for 30 minutes at 1210 C. Volume - 100 ml in a 500 ml flask. Temperature - 250 C.
Seeding time - 72 hours on a reciprocating agitator (170 cycles per minute). <I> B. Second phase </I> Seed source - 10% of the first phase.
Medium - the same as in the first phase Sterilization - 40 minutes at 121 C.
Volume - 480 ml in a 2000 ml flask. Temperature - 250 C Seeding time - 48 hours on one. reciprocating agitator (120 cycles per minute). <I> Fermentation conditions </I> Medium - 3 '% Staley 4S nutrient 2% glucose 0.25 0 / <B> 0 </B> CaC03 0.1% NaCl 0.0005 0 / <B> 0 </B> COC12 Sterilization - 15 minutes at 1210 C.
Temperature - 25o C. Power expended for stirring - 0.2 CV / 4541. Aeration - air current with a linear speed of 60 cm / min.
Fermentation cycle - 144 hours.
Defoamer - Premium combustion oil (approximately 0.5% of the load). Importance of inoculation - 480 ml of the second phase of the flask (4 fl / o).
Volume - 12,000 ml.
The results of the fermentation are given in the table below (with regard to two charges)
EMI0004.0004
Load <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> Duration <SEP> Test <SEP> on <SEP> S.Cerevisiae <SEP> Test <SEP> on <SEP> S.Cerevisiae
<tb> of <SEP> fermentation, <SEP> Units <SEP> <B> de </B> <SEP> dilution / ml <SEP> pH <SEP> Units <SEP> of <SEP> dilution / ml <SEP > pH
<tb> hours <SEP> Extract * <SEP> Broth * <SEP> Extract <SEP> Broth
<tb> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 6.5 <SEP> - <SEP> - <SEP> 6.6
<tb> 25 <SEP> 1600 <SEP> 120 <SEP> 7,2 <SEP> 640 <SEP> 120 <SEP> 7,2
<tb> 49 <SEP> 1600 <SEP> 120 <SEP> 7,0 <SEP> 120 <SEP> 120 <SEP> 7.1
<tb> 73 <SEP> 8000 <SEP> 180 <SEP> 7.1 <SEP> 12,000 <SEP> 80 <SEP> 7.3
<tb> 97 <SEP> 4000 <SEP> 80 <SEP> 7,0 <SEP> 3,000 <SEP> 120 <SEP> 7.1
<tb> 121 <SEP> 3000 <SEP> 40 <SEP> 6.9 <SEP> 4,000 <SEP> 120 <SEP> 7,
9
<tb> 144 <SEP> 9706 <SEP> 2560 <SEP> 7,2 <SEP> 40 <SEP> 80 <SEP> 8,1
<tb> <SEP> samples <SEP> were <SEP> centrifuged <SEP> (the <SEP> assays <SEP> carrying <SEP> on <SEP> the <SEP> medium <SEP> supernatant < SEP> being <SEP> classified <SEP> under <SEP> <SEP> broth <SEP>), <SEP> and
<tb> the <SEP> centrifugate <SEP> extracts <SEP> with <SEP> a <SEP> volume <SEP> of <SEP> butanol <SEP> equal <SEP> to <SEP> the original <SEP> sample <SEP> (the <SEP> tests <SEP> carrying <SEP> on <SEP> this <SEP> extract <SEP> being
<tb> classified <SEP> under <SEP> <SEP> extract <SEP>). <SEP> The <SEP> units <SEP> of <SEP> dilution / ml <SEP> are <SEP> the inverse <SEP> of <SEP> number <SEP> minimum <SEP> of <SEP> ml <SEP > sample <SEP> still <SEP> active
<tb> in <SEP> dilution <SEP> in <SEP> a <SEP> ml.
<I> Example 2 </I> <I> Fermentation of Streptomyces </I> sp. <I> 3694 </I> A suitable inoculation, prepared according to the manner described in Example 1, is introduced into a fermentation medium containing Soy flour <B> .......... 10 </ B> gin Potato powder 10 gin Dextrose <B> .............. 10 </B> gin CoC12. 6H20 <B> .......... </B> 10 ml of a 0.05 fl / o CaCO3 solution ................
lgm Distilled water <B> ............ </B> 1 liter The medium is sterilized in an autoclave at 121O C for 20 minutes prior to the introduction of the inoculation. After four days, tests were carried out for Saccharomyces cerevisiae with part of the broth which was lyophilized and reconstituted with water to about 2 times 1 / s the original concentration and with butyl alcohol extract of washed cells reconstituted up to the volume of the original sample,
these tests gave the following results
EMI0004.0021
<SEP> test on <SEP> S. Cerevisiae
<tb> <SEP> units of <SEP> dilution / ml
<tb> Broth <SEP> .............. <SEP> 5000
<tb> Extract <SEP> from <SEP> cells <SEP> <B> ... </B> <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 5000 After these tests, the fermentation is followed for 5 days.
Amphotericyne can be extracted in either of the following ways <I> Extraction with </I> isopropanol <I> from all the broth </I> Extraction of Amphotéricyne From all the broth of Example 1 is carried out by adding 80 to 170 fl / o of the volume of the broth in isopropanol and adjusting to a pH of 2.0 with sulfuric acid. After stirring for about 1/2 hour, the mixture is filtered, preferably using the aid of a filter.
The pH of the filtrate is readjusted to about 7 with sodium hydroxide and the isopropanol is removed by vacuum distillation at a temperature not higher than 350 C. The mixture is then left in a cold room overnight, the precipitate which forms is removed by filtration, washed with acetone and dried in vacuo. A mixture of Amphotéricyne A and Amphotéricyne B is obtained with a yield of approximately 40%.
Tests on the mixture gave about 1500-2500 ud / mg (Saccharomyces cerevisiae); ud / mg (dilution units / mg) denotes the reciprocal of the minimum number of mg of the mixture which is still active when diluted in one ml.
Extraction <I> with </I> butanol <I> of all the broth </I> To 9.4 liters of the culture medium, titrating 3000 ud / ml, one adds a quarter of its volume of butanol. The pH is lowered to 2.0 with sulfuric acid and the mixture is stirred well for 1/2 hour. The Hyflo brand product (5% w / v) or any other filter aid is then added and the mixture is filtered. The filtrate is placed in a separatory funnel and the butanol layer is separated and retained.
The butanol solution is then distilled to 1 / s of its original volume under vacuum at a temperature not higher than 35 ° C. A precipitate forms which is removed by filtration, which is washed well with water. acetone and which is vacuum dried.
The product, which is obtained with a yield of approximately 22%, is a mixture of Amphotérieyne A and Am- photéricyne B and tests are carried out with approximately <B> 1600 </B> ud / mg vis vis-à-vis Saccharomyces cerevisiae and with approximately 960 ud / mg vis-à-vis Candida albicans.
<I> Extraction </I> of Amphotericyne <I> from the mycelium </I> 1 liter of the culture medium containing Am- photeryne is centrifuged to separate the filtrate and the mycelium. The wet mycelium cake is stirred with 200 ml of n-propanol, adjusted to pH 2.0 to 3.0 with sulfuric acid and left in a cold room overnight.
The propanol is separated by centrifugation and the mycelial cake is extracted three more times with 100 ml of portions of n-propanol. The combined propanol extracts are concentrated in vacuo to a small volume of about 130 ml, at which volume a precipitate forms. This precipitate is removed by centrifugation and is dried in vacuum.
About 1.114 gm are recovered, with a potency of about 1176 ud / mg against Candida. 820 mg of this solid product is finely pulverized and is dissolved by heating in a mixture of 80 ml of n-butanol and 16 ml of methanol, while 80 ml of water are gradually added. To this solution are added 48 ml of hexane, and the mixture is stirred, then is left to stand at room temperature overnight.
A fraction of pale yellow Amphotericyne crystals is formed; it is filtered and dried in a desiccator. Other fractions of less pure material can be obtained by concentrating the mother liquors in vacuum.
<I> Extraction of all the </I> broth <I> made basic </I> To a sample of 500 ml of the culture medium containing Amphotericyne and assaying <B> 11000 </B> ud./ml vis-à-vis Saccharomyces cerevisiae, is added an equal volume of isopropyl alcohol. The pH of this mixture is then raised to 10,
5 using 20% sodium hydroxide. This mixture is then stirred for 1/2 hour, 2% Hyflo (w / v) is added,
and the mixture is filtered. The pH of the filtrate is lowered to 7 using 20% sulfuric acid and the isopropyl alcohol is removed in vacuo at a temperature not higher than 350 C. After allowing to stand overnight, the precipitate is removed. removed by filtration, washed with water and then with acetone and dried in vacuo.
The yield amounts to about 1.22 g (77%) of a mixture of Am- photeryne A and Amphotericyne B, the test of which gives about 3400 µd / mg (Saccharomyces cerevisiae).
Mixtures of Amphotericyne can be fractionated into their constituents, Amphotericyne A and Amphotericyne B, as indicated below <I> Crystallization using </I> alcohol The Amphotericyn obtained above is mixed,
so as to form a slurry with 70% aqueous isopropyl alcohol at a concentration corresponding to an activity of 32,000-35,000 ud / ml against Candida albicans, while stirring; the pH is lowered to 2 with hydrochloric acid. Insoluble material (crude Amphotericyne B) is removed by filtration and the pH of the filtrate is raised to about 7.5.
After allowing to stand overnight, the crystallized precipitate, consisting mainly of purified Am-photeryne A, is filtered off, washed with acetone and dried in vacuo. The yield of Amphotericyne A is about 50% based on biological activity.
<I> Crystallization using </I> dimethylformamide Amphotericyne is mixed so as to form a slurry with dimethylformamide (1 g / 20 ml). While stirring, the pH is lowered to 7, using concentrated hydrochloric acid.
After stirring for 1/2 hour, the Hyflo product (1% w / v) is added and the mixture is filtered. To the filtrate is added one volume of methanol, followed by the slow addition of one volume of water.
(Although a solution of methanol and water is preferred, ethanol, acetone or dioxane in water also work effectively). The mixture is then allowed to stand overnight with the resulting pH of 4.5. The precipitate thus formed is removed by filtration, is washed with acetone and is dried.
It is made up of 85-90% Amphotericyne B, 5-10% Amphotericyne A and a small amount of impurities.
The pH of the resulting mother liquor from which Amphotericyne B has been isolated is then raised to 8 by addition of sodium hydroxide, and a further 3 volumes of water are added. After leaving to stand overnight, the precipitate is removed by filtration, is washed with acetone and is dried.
This precipitate is composed of 80-85% of Amphotericyne A, 5-10% of Amphotericyne B and a small amount of impurities.
The recovery of all activity is 90-95 The fraction containing predominantly Amphoteryne B can be further purified by slurrying it with 70% aqueous isopropanol at a concentration of 1 g per 100 ml at pH 2 for 1/2 hour. The mixture is then filtered, the filtrate is heated to 450 ° C. and the pH is slowly raised to 5 with sodium hydroxide.
The mixture is then allowed to cool slowly to room temperature and stand overnight. The cris tallized product (yield of about 50%) is then removed by filtration, washed with acetone and dried. It essentially represents pure Amphotéricyne B.
The fraction containing predominantly Amphotericyne A can be further purified by forming a slurry in dimethylformamide at a concentration of 1 g per 20 ml, stirring for 1 hour,
filtering off insolubles and adding the filtrate slowly to an equal volume of 50% aqueous methanol. The crystallized precipitate is removed by filtration after standing overnight, washed with acetone and dried.
Substantially pure Amphotericyne A is thus obtained with a yield of approximately 70-80%.
Salts and complexes of Amphotericyne can be prepared according to the directions given below <I> Preparation of alkali metal salts </I> of Amphotericyne Amphotericyne, either as a crude mixture or in the form of crystals purified from Amphotericyne A or B, readily forms salts and the following procedure is also effective to form either the sodium or potassium salt of the mixture,
either the salts of the purified constituents A or B The crystallized Amphotericyne A is suspended in a quantity of methanol such that the concentration of the antibiotic is approximately 250,000 u / ml (Saccharomyces cerevisiae). 2 equivalents of 1N methanolic sodium hydroxide are added and the mixture is stirred for 15 minutes to ensure complete solubilization of the antibiotic. The solution is filtered and 10 volumes of acetone are added to the filtrate.
A precipitate of sodium salt is thus formed, is removed by filtration, is washed with acetone and is dried in a desiccator. The yield of the sodium salt is approximately 90% of the original Amphotericyne based on its biological activity (in vitro).
The sodium salt has a greater solubility in water (50-60 mg / ml) than the original crystallized Amphotericin A. It also exhibits good solubility in methanol and dimethylformamide. It is somewhat soluble in ethanol and isopropanol, but insoluble in ether, acetone, butanol, chloroform, benzene, hexane and dioxane.
<I> Preparation of Calcium Chloride Complex </I> An Amphoteryne calcium chloride complex can be prepared by dissolving crystallized Amphotericyne either A or B (or a mixture of both) in 1 :
% methanolic calcium chloride (1 gin / 20 ml), filtering off any insoluble material and adding 5 volumes of acetone to the filtrate. The precipitate is removed by filtration, is washed with acetone and is dried in vacuo. The solubility of the calcium chloride complex in organic solvents is similar to that of metal salts.
However, in water the complex hydrolyzes and its solubility is that of the original Amphotericyne. <I> Preparation of an acid salt </I> Crystallized Amphotericyne A or B (or a mixture of both) is dissolved in dimethylformamide (1 g / 25 ml), and one equivalent of acid concentrated hydrochloric acid is added to it. The mixture is filtered and 10 volumes of acetone are added to the neutral filtrate. The precipitate thus formed is removed by filtration, is washed with acetone and is dried in a desiccator under vacuum.
The product, which is obtained with a yield of about 90%, contains an acid equivalent and exhibits in vitro a biological activity equivalent to that of crystallized Amphotericyn. It is somewhat more soluble in water and much more soluble in methanol, ethanol, isopropanol and butanol than is crystallized Amphotericyne.
However, the acid salt is insoluble in acetone, chloroform, ether, benzene, ethyl acetate and hexane.
The sultafe was prepared in the same way by substituting one equivalent of sulfuric acid for hydrochloric acid. It has properties analbgues to those of hydrochloride. <I> Chemical and physical properties of </I> Amphotericyne Crystallized Amphotericyne A has the following physical and chemical characteristics Melting point Darkens at 180-185C, browns and contracts at 198-2000 C, melts with decomposition at about 2100 C.
Elemental analysis C - 59.28 0/0 H - 8.43,% N - 1.81% O - 30.48% (by difference) No other element present.
No methoxy or acetyl groups. Specific optical rotation [a] D C -I-- 163o (pyridine); -f-93o (acetic acid); -I-1361, (dimethylformamide); -f- 28 ,, (0.1N HCl in methanol).
Solubility Good solubility in glacial acetic acid and dimethylformamide. Soluble up to the proportion of about 1 mg / ml in methanol, aqueous isopropyl alcohol and wet butanol, much more soluble in these solvents when acidified or strongly alkalized. (For example in a 50% isopropyl alcohol solution, the solubility of Amphotericyne A is, as indicated, approximately 1 mg / ml at a pH between 3 and 8; at a pH of 2.9 and 10, however, the solubility is 3 mg / ml, while at pH 11 the solubility is increased to 8-10 mg / ml).
The antibiotic is insoluble in water at neutral or acidic pH under ordinary conditions, but is soluble at pH 10 and above. However, in dilute solutions the antibiotic can be dissolved in a neutral aqueous solution by increasing the pH of a suspension of the material to 11, such as, for example, with sodium hydroxide. The solution thus formed can be neutralized with an acid without any precipitation occurring.
Amphotericyne A is insoluble in ether, dioxane, ethyl acetate, amyl acetate, chloroform, benzene, acetone, hexane, absolute ethanol, isopropanol or butanol.
Ultraviolet spectrum The ultraviolet absorption maxima of Amphotericyne A crystallized in methanol are:
EMI0007.0007
Some absorption maxima in the 362 405 region may be due to the presence of some Am- photeryne B.
Infrared spectrum The infrared absorption spectrum of Amphotericyne A in suspension in Nujol medium shows peaks (and steps indicated by sh for the following frequencies and wavelengths
EMI0007.0013
Frequency <SEP> Wave <SEP> length <SEP> Frequency <SEP> Wave <SEP> length
<tb> (cm-1) <SEP> (R) <SEP> (cm-1)
<tb> 3333 <SEP> 3.00 <SEP> 1129 <SEP> 8.86
<tb> 1695 <SEP> 5.90 <SEP> 1105 <SEP> 9.05
<tb> 1656 <SEP> 6.04 <SEP> 1066 <SEP> 9.38
<tb> 1623 <SEP> 6.16 <SEP> sh <SEP> 1035 <SEP> 9.66
<tb> 1567 <SEP> 6.38 <SEP> sh <SEP> 1008 <SEP> 9.92
<tb> 1546 <SEP> 6.47 <SEP> 992 <SEP> 10.08
<tb> 1425 <SEP> 7.02 <SEP> sh <SEP> 977 <SEP> 10.24 <SEP> sh
<tb> 1403 <SEP> 7.13 <SEP> 949 <SEP> 10.54
<tb> 1374 <SEP> 7,
28 <SEP> sh <SEP> 912 <SEP> 10.96
<tb> 1323 <SEP> 7.56 <SEP> 893 <SEP> 11.20
<tb> 1276 <SEP> 7.84 <SEP> sh <SEP> 877 <SEP> 11.40
<tb> 1232 <SEP> 8.12 <SEP> 850 <SEP> 11.76
<tb> 1201 <SEP> 8.32 <SEP> sh <SEP> 836 <SEP> 11.96
<tb> 1183 <SEP> 8.45 <SEP> 810 <SEP> 12.34
<tb> 1159 <SEP> 8.63 <SEP> 794 <SEP> 12.60
<tb> 760 <SEP> 13.16 Neutral equivalent of Amphotericyne A crystallized 929 by titrating as a base 989 by titrating as an acid pH stability Stable for all pH between 3 and 11 for at least a period of time up to at 24 hours. At a pH as low as 2, Amphotericyne A is stable for 3 hours with only a small amount of decomposition occurring.
Thermal stability Stable up to about 700 C, in a neutral 50% isopropanol solution.
Chemical Tests Provides a yellow color with ferric chloride.
Crystallized Amphotericyne B has the following physical and chemical characteristics Melting point No distinct melting point; go for it and because good luck
Elemental analysis C = 56.70% H = 7.72% N = 1.87% O = 33.711% No other element present.
Neither methoxy groups nor acetyl groups. Specific optical rotation [-a] D C -I- 2380 (dimethylformamide); -52.20 (0.1N HCl in methanol).
Solubility Good solubility in dimethylformamide and in glacial acetic acid. Soluble up to the proportion of 0.5 mg / l in methanol, aqueous isopropyl alcohol and wet butanol, and much more soluble in these solvents when acidified or strongly alkalized.
Ultraviolet spectrum The ultraviolet absorption maxima of Amphotericyne B crystallized in methanol are:
EMI0007.0049
Infrared spectrum The infrared absorption spectrum of Amphotericyne B suspended in the Nujol medium shows peaks (and steps indicated by sh) for the following frequencies and wavelengths
EMI0008.0003
Frequency <SEP> Wave <SEP> length <SEP> Frequency <SEP> Wave <SEP> length
<tb> (cm-1) <SEP> W <SEP> (cm-1)
<tb> 3333 <SEP> 3.00 <SEP> 1042 <SEP> 9.60
<tb> 1709 <SEP> 5.85 <SEP> 1008 <SEP> 9.92
<tb> 1577 <SEP> 6.34 <SEP> 981 <SEP> 10.19
<tb> 1401 <SEP> 7.14 <SEP> 965 <SEP> 10,
36 <SEP> sh
<tb> 1374 <SEP> 7.28 <SEP> 903 <SEP> 11.08
<tb> 1323 <SEP> 7.56 <SEP> sh <SEP> 886 <SEP> 11.29
<tb> 1266 <SEP> 7.90 <SEP> 852 <SEP> 11.74
<tb> 1232 <SEP> 8.12 <SEP> 812 <SEP> 12.32 <SEP> sh
<tb> 1192 <SEP> 8.39 <SEP> 794 <SEP> 12.60
<tb> 1174 <SEP> 8.52 <SEP> 758 <SEP> 13.20
<tb> 1134 <SEP> 8.82
<tb> 1106 <SEP> 9.04
<tb> 1068 <SEP> 9.36 Neutral equivalent of crystallized Amphotericyne B 760 titrating as a base.
The pH stability and thermal stability of Amphotericyne B are analogous to the corresponding stabilities of Amphotericyn A.
<I> Biological properties of </I> Amphotericynes Amphotericyne, in the state of mixture and in the state of purified Amphotericyne A and Amphotericyne B, exhibits a broad fungicidal spectrum, as indicated by the following table. The table below does not represent an exact indication of the activity of Amphotericyne B, since this antibiotic is extremely insoluble and therefore,
its effectiveness in the agar-agar medium used to determine the above fungicidal spectrum is greatly reduced.
Thus, in the broth tube tests, when Amphoteryne B is compared with mixed Amphotericynes for efficacy against Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae, it was determined that the Amphotericyne B was respectively 8.10 and 6.17 times more effective than mixed Amphotericines.
Amphotericyne, either as a mixture or individually, is useful for combating pathogenic fungi which cause dermatomycosis and generalized mycosis. Specifically it is effective in the treatment of athlete's foot, coccidioidomycosis, moniliasis, blastomycosis, etc.
Thus, for prophylaxis and tick therapy in monilial infection and other fungi, Amphotericyne can be administered to humans orally in the form of tablets containing 1/2 to 1 gm of the antibiotic; and thus can be used in combination with broad spectrum bactericidal antibiotics, such as oxytetracycline, chlorotetracycline or tetracycline, in place of nystatin to inhibit the development of the resulting fungi.
EMI0008.0039
Amphotericynes <SEP> Amphotericyne <SEP> Amphotericyne
<tb> mixed <SEP> A <SEP> B
<tb> <U> CIM <SEP> <B>*</B> </U> <SEP> y / ml <SEP> CIM <SEP> <B> <U> 'Y / MI </U> < / B> <SEP> C <U> IM <SEP> <B>7/mi</B> </U>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> <B> ................ </B> <SEP> 3.1 <SEP> 3.1 <SEP> 25
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> <B> .................... </B> <SEP> 3.1 <SEP> 3.1 <SEP>> <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> <B> ......... </B> <SEP>. <SEP> <B> .............. </B> <SEP> 3.1 <SEP> 3.1 <SEP>> <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> notatum <SEP> <B> .................... </B> <SEP> 3.1 <SEP> 3.1 <SEP>> <SEP> 100
<tb> Ceratostomella <SEP> Ulmi <SEP> <B> ................ </B> <SEP>. <SEP> <B> ... </B> <SEP> 1.6 <SEP> 1.6 <SEP> 3.1
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> ......................
<SEP> 1.6 <SEP> 1.6 <SEP> 6.3
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> 9533 <SEP> <B> ........ </B> <SEP> 1.6 <SEP> 1.6 <SEP> 12.5
<tb> Microsporum <SEP> audouini <SEP> <B> .................. </B> <SEP> 12.5 <SEP> 3.1 <SEP >> <SEP> 100
<tb> Microsporum <SEP> canis <SEP> <B> ...................... </B> <SEP> 3.1 <SEP> 3 , 1 <SEP>> <SEP> 100
<tb> Botrytis <SEP> tulipae <SEP> <B> ........................ </B> <SEP> 6.3 <SEP > 6.3 <SEP>> <SEP> 100
<tb> Rhodotorula <SEP> glutinis <SEP> <B> .................... </B> <SEP> 3.1 <SEP> 3.1 <SEP>> <SEP> 100
<tb> Fusarium <SEP> bulbigenium <SEP> <B> .................. </B> <SEP> 6.3 <SEP> 6.3 <SEP >> <SEP> 100
<tb> CIM <SEP> designates <SEP> the minimum <SEP> inhibitory <SEP> concentration <SEP>.
<I> Comparison of </I> Amphotericyne <I> with other </I> <I> antibiotics </I> Since Amphotericyn exhibits certain characteristics similar to those of other antibiotics, Comparative physical and biological tests were carried out to establish that these are new antibiotics, not prepared nor described previously.
Amphotericyne exhibits a high range of activity compared to nystatin and rimocidin. A comparison of a purified mixture of Amphotericynes A and B with a purified load of nystatin vis-à-vis two control organisms gives the following result
EMI0008.0048
Activity report <SEP>
<tb> Control organism <SEP> Amphotericyne / nystatin
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP>. <SEP>.
<SEP> 2.86
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> <B> ........ </B> <SEP> 5.62 As rimocidin exhibits a fungicidal spectrum similar to that of nystatin and Am- photericyne, it has been tested in the form of its sulfate alongside Amphotericyne and nystatin against S. cerevisiae. It is less active than nystatin or Amphotericyne on a weight basis, as shown in the following table
EMI0009.0003
CIM <SEP> vis-à-vis <SEP> of <SEP> S. <SEP> cerevisiae
<tb> y / ml
<tb> Nystatin <SEP> <B> .......... </B> <SEP> 0.512 <SEP> (8 <SEP> trials)
<tb> Sulfate <SEP> of <SEP> rimocidin <SEP>. <SEP>.
<SEP> 0.915 <SEP> (9 <SEP> tries)
<tb> Amphotericynes <SEP> .... <SEP> 0.160 <SEP> (10 <SEP> trials) These results show the superior properties of Amphotericyne in comparison with nystatin and rimocidin with respect to of Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.
Apart from the aforementioned biological differences, Amphotericyne differs physically from nystatine, rimocidin and ascosin, as indicated by the following comparisons of the specific optical rotation <I> Specific optical rotation of </I> the Amphotericine <I> A, </I> <I> </I> Amphotericine <I> B, nystatin, </I> rimocidin <I> and </I> ascosin [ ajD C
EMI0009.0022
Solvent <SEP> Dimethyl- <SEP> 0,
1N <SEP> HCl
<tb> Antibiotic <SEP> Pyridine <SEP> Acetic acid <SEP> <SEP> formamide <SEP> in <SEP> the <SEP> methanol
<tb> Amphotericyne <SEP> A <SEP> <B> .............. </B> <SEP> -I- <SEP> 163o <SEP> + 93o <SEP> -I- <SEP> 136o <SEP> + 28o
<tb> Amphotericyne <SEP> B <SEP> <B> .............. <SEP> +2380 </B> <SEP> -52.20
<tb> Nystatin <SEP> .................... <SEP> -I- <SEP> 110 <SEP> - <SEP> 70 <SEP> -I - <SEP> 6.5o <SEP> - <SEP> 3.50
<tb> <SEP> rimocidin <SEP> <B> ..... </B> <SEP> sulphate. <SEP> <B> .... </B> <SEP> + 102o <SEP> + 67o
<tb> Ascosine <SEP> (50 <SEP>% <SEP> NaHC03 <SEP> in <SEP> weight) <SEP> -f- <SEP> 12.2o <SEP> -130 The data in this table can be compared with the absorption data in the ultra violet for the two Amphotericynes;
it is evident that Amphotericyne A, although it has an ultraviolet spectrum which is analogous to that reported for nystatin and rimocidin, differs from it by the respective specific rotatory powers; and, likewise, although Amphotericyne B has an ultraviolet spectrum which is very similar to that of ascosin, the two products are distinguished by the differences in their respective specific rotational powers.
The conclusion to be drawn from these comparisons therefore lies in the fact that Amphotericyne differs from nystatin, rimocidin or ascosin both in its biological effects and in its physical characteristics.