CH640265A5

CH640265A5 - Antibiotique et composition veterinaire.

Info

Publication number: CH640265A5
Application number: CH1249578A
Authority: CH
Inventors: Karl Heinz Michel; Calvin Eugene Higgens
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1977-12-08
Filing date: 1978-12-07
Publication date: 1983-12-30
Also published as: DK147659B; EP0002589A1; DK539178A; US4129721A; JPS5498701A; EP0002589B1; GB2009739B; AU4216378A; DE2861930D1; ES475853A1; PL211491A1; IE782420L; CS207693B2; IL56114A0; FI59420C; GR72460B; HU179464B; DD140477A5; FI59420B; LU80617A1

Description

Cette invention permet de disposer de nouveaux antibiotiques, les facteurs A et B de l'antibiotique A-40104, et d'un nouveau procédé de préparation des facteurs A, B et C de l'antibiotique A-40104. Ces facteurs ont un spectre antibiotique utilisable qui comprend non seulement un certain nombre de bactéries Gram positives et Gram négatives et de bactéries anaérobies, mais également les organismes Mycoplasma. On a trouvé de nouveaux agents pouvant servir potentiellement pour le traitement des maladies de la volaille, des porcs et du bétail dues aux organismes Mycoplasma, et pour le traitement de la dysenterie porcine due à Treponema hyodysenteriae.

Cette invention fournit un élément du groupe comprenant: un mélange antibiotique A-40104 comportant les facteurs A et B et la pleuromutiline; le facteur A de l'antibiotique A-40104, le facteur A de A-40104 19,20-dihydrogéné et les dérivés tétraalcanoyliques en C2-C6 du facteur A de A-40104 et du facteur A 19,20-dihydrogéné de A-40104, et le facteur B de l'antibiotique A-40104, le facteur B 19,20-dihydrogéné de A-40104 et les dérivés trialcanoyliques en C2-C6 du facteur B de A-40104 et du facteur B 19,20-dihydrogéné de A-40104.

On peut obtenir les nouveaux antibiotiques par un procédé qui consiste:

a) à cultiver Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179, ou un de ses mutants producteurs de A-40104, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobie en immersion, jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique;

b) à séparer éventuellement le mélange antibiotique A-40104 du milieu de culture;

c) éventuellement à isoler du mélange réactionnel le facteur A de l'antibiotique A-40104, le facteur B de l'antibiotique A-40104 ou la pleuromutiline;

d) à hydrogéner éventuellement le facteur A ou le facteur B de l'antibiotique A-40104 pour obtenir le facteur A ou le facteur B 19,20-dihydrogênés de A-40104;

e) à acyler éventuellement le facteur A, le facteur A 19,20-dihydrogéné, le facteur B ou le facteur B 19,20-dihydrogéné de l'antibiotique A-40104, pour obtenir les dérivés tétraalcanoyliques en C2-C6 du facteur A ou du facteur A 19,20-dihydrogéné, ou les dérivés trialcanoyliques en C2-C6 du facteur B ou du facteur B

19,20-dihydrogéné.

»

Cette invention fournit également une composition vétérinaire qui comporte un ingrédient inerte et, comme ingrédient actif, un élément du même groupe.

Les spectres d'absorption infrarouge des facteurs suivants de A-40104 (effectués en pastilles de KBr) sont donnés dans les dessins annexés:

Fig. 1 : facteur A de A-40104.

Fig. 2: facteur B de A-40104.

Cette invention concerne des antibiotiques. En particulier, elle concerne un antibiotique complexe, le complexe antibiotique A-40104, comprenant au moins trois facteurs distincts, les facteurs A, B et C. Les facteurs A et B de A-40104 sont de nouveaux antibiotiques et font partie de cette invention.

Les dérivés 19,20-dihydrogénés des facteurs A et B de A-40104 et les dérivés peralcanoyliques en C2-C6 des facteurs A et B de A-

40104 et de leurs dérivés 19,20-dihydrogénés font également partie de cette invention.

Les facteurs A et B de A-40104 sont apparentés, au point de vue structure, l'un à l'autre et au facteur C de A-40104 qui est l'antibiotique connu, la pleuromutiline. Au moins quatre facteurs antibiotiques sont produits simultanément pendant la fermentation pour donner le complexe antibiotique A-40104 de cette invention. La pleuromutiline et le facteur A de A-40104 peuvent être séparés du bouillon de fermentation filtré par des modes opératoires d'extraction appropriés. Le facteur B de A-40104, un facteur mineur, peut être séparé et isolé par des procédés chromatographiques. Un autre facteur mineur, le facteur D de A-40104, peut être séparé par Chromatographie mais n'a pas encore été isolé en quantité suffisante pour la caractérisation.

Les paragraphes suivants décrivent les propriétés physiques et spectrales des facteurs A et B de A-40104.

Facteur A de A-40104:

Le facteur A de A-40104 cristallise dans le chroloforme et a un point de fusion d'environ 117-120° C. Il a une formule empirique de C27H4.209, comme le montre l'analyse élémentaire, et un poids moléculaire de 510, comme le montre la spectrométrie de masse avec désorption de champ.

Le spectre d'absorption ultraviolet du facteur A de A-40104 dans le trifluoroéthanol présente un maximum d'absorption à 284 nm (s 32).

Le spectre de dichroïsme circulaire du facteur A de A-40104 dans le trifluoroéthanol présente les maxima suivants:

As = +2,84 à 200 nm,

As = +1,72 à 295 nm.

Le facteur A de A-40104 a le pouvoir rotatoire suivant: [a] jj = — 14°C (c 1,0, C2H50H).

Le titrage électrométrique du facteur A de A-40104 dans le dimé-thylformamide aqueux à 66% indique qu'il n'y a pas de groupements titrables.

Le spectre d'absorption infrarouge du facteur A de A-40104 en pastilles de KBr est représenté sur la fig. 1 des dessins annexés. Les maxima d'absorption les plus significatifs se trouvent aux fréquences suivantes (cm-1): 3590, 3500, 3450 (large), 3280 (large), 2990, 2980, 2960, 2940, 2920, 2890, 2860, 1755, 1735,1645, 1465, 1447, 1420, 1380,1330,1310,1274,1240,1220,1160,1117,1093,1070,1060, 1040, 1014, 984, 955, 940, 921, 905, 865, 760, 742, 698, 674, 603, 530 et 442.

Le facteur A de A-40104 est soluble dans les alcools comme le méthanol et l'éthanol, est partiellement soluble dans le chloroforme et est insoluble dans l'eau.

Le facteur A de A-40104 est le dérivé acêtal, ß, D-xylopyrano-sylique de la pleuromutiline, ayant la formule développée suivante:

,GH

H0\/\

T

V

Ç-COCH (

,CH

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

640 265

4

Facteur B de A-40104:

Le facteur B de A-40104 est un composé amorphe blanc qui constitue un facteur mineur dans le complexe antibiotique A-40104. Il représente en fait seulement 0,01 à 0,1% de l'activité du complexe antibiotique A-40104. Par spectrométrie de masse avec choc d'électrons, on a trouvé que le facteur B de A-40104 a un poids moléclaire de 394. L'étude des pics de l'ion moléculaire et de certains des ions fragmentaires indique que le facteur B de A-40104 a une formule empirique de C22^3i06- Un pic à m/e 318 (C2oH3003) dans le spectre de masse du facteur B est analogue à un pic à m/e 302 dans le spectre de la pleuromutiline, ce qui indique que l'oxygène additionnel du facteur B est sur le noyau plutôt que sur la chaîne latérale. Le fragment m/e 163 est commun au facteur B et à la pleuromutiline. Un petit pic à m/e 245 (C17H250) dans le spectre de la pleuromutiline est déplacé à m/e 261 (C17 H2502) dans le spectre du facteur B. Le facteur B de A-40104 a trois groupements hydroxyle pouvant subir une acylation. Par exemple, le facteur, le facteur B de A-40104 forme un dérivé triacétylé par traitement par la pyridine et l'anhydride acétique donnant un composé ayant la composition C28H4o09 (poids moléculaire 520), montrant que la fonction oxygénée supplémentaire du facteur B de A-40104 se trouve dans un groupement hydroxy.

Le spectre d'absorption infrarouge du facteur B de A-40104, effectué en pastilles de KBr, est représenté sur la fig. 2 des dessins annexés. Les maxima d'absorption les plus significatifs se trouvent aux fréquences suivantes (cm-1): 3430 (large), 2940, 2880,1735, 1660, 1452, 1385,1375,1305, 1280, 1233,1152, 1094,1020, 997, 967, 933, 912, 888, 752 et 660.

En se basant sur ses caractéristiques physico-chimiques, on pense que le facteur B de A-40104 a la formule approximative suivante:

0 II

Q-C-CH -CH

2

On peut séparer et identifier par des procédés chromatographi-ques les quatre facteurs du complexe A-40104. Par exemple, on peut séparer les facteurs par Chromatographie sur couche mince (CCM), en utilisant du gel de silice (Merck, Darmstadt), un système solvant 9:1 chloroforme :méthanol, et Micrococcus lut eus comme indicateur biologique. Les Rf approximatifs des facteurs A à D de A-40104 dans ce système sont donnés dans le tableau I.

Tableau I

Facteur de A-40104

Rf

A

0,21

B

0,36

C

0,52

D

0,67

25

On peut également séparer les facteurs par Chromatographie sur papier, en utilisant du papier non traité (Whatman N° 1), un système solvant d'eau saturée de butanol et Micrococcus luteus comme organisme de détection. Les Rf approximatifs des facteurs A à D de A-40104 dans ce système sont donnés dans le tableau II.

Tableau II

Facteur de A-40104

Rf

A

0,64

B

0,51

C

0,37

D

0,31

35

+CH

45

H3t

Comme on le verra, les deux facteurs A et B de A-40104 contiennent un groupement vinyle qui peut être réduit, par des modes opératoires classiques, pour obtenir les dérivés 19,20-dihydrogénés correspondants. Les dérivés 19,20-dihydrogénés des facteurs A et B sont également des agents antibactériens actifs et fonc partie de cette ss invention.

Les deux facteurs A et B et leurs dérivés 19,20-dihydrogénés contiennent des groupements hydroxyle qui sont susceptibles d'acyla-tion par des modes opératoires classiques (quatre groupements hydroxyle dans les composés du facteur A et trois groupements hydr- w oxyle dans les composés du facteur B). Il est entendu que les dérivés peracylés obtenus auront le même groupement acyle à chaque position à laquelle se fait l'acylation (c'est-à-dire quatre dans les composés du facteur A et trois dans les composés du facteur B). Ces dérivés peracylés sont également des agents antibactériens. Les dérivés per- 65 alcanoyliques en C2-C6 des facteurs A et B de A-40104 et des dérivés 19,20-dihydrogénés des facteurs A et B de A-40104 sont les composés préférés dans ce groupe.

Préparation du complexe antibiotique A-40104:

Cette invention concerne également un procédé de production du complexe antibiotique A-40104 et, ainsi, un procédé de production des facteurs A et B de A-40104 et de l'antibiotique connu, la pleuromutiline. Le procédé consiste à cultiver une souche productrice de A-40104 du basidiomycète Clitopilus pseudo-pinsitus dans des conditions aérobies, en immersion dans un milieu de culture approprié, jusqu'à production d'une activité antibiotique substantielle. On recueille le complexe antibiotique et les différents antibiotiques en utilisant divers modes opératoires d'isolement et de purification utilisés et connus dans la technique.

La souche de Clitopilus pseudo-pinsitus qui est utilisable pour la production des antibiotiques de A-40104 a été obtenue au Centraal-bureau voor Schimmelcultures (CBS) des Pays-Bas. La culture CBS (CBS 270.36) a été classée comme Octojuga pseudo-pinsita. Le nom générique Clitopilus, qui est synonyme d'Octojuga, sera utilisé ici pour désigner l'organisme. L'aptitude de cette culture à produire des antibiotiques n'était pas connue. On a découvert cette aptitude à produire les antibiotiques A-40104 après un mode opératoire de sélection important.

La souche de Clitopilus pseudo-pinsitus qui est utilisable pour la production des facteurs A et B de A-40104 et de la pleuromutiline a été déposée à la Northern Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service Peoria, Illinois 61604, où elle est disponible sous le numéro NRRL 11179.

Comme c'est le cas avec d'autres organismes, les caractéristiques de la culture productrice de A-40104, Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179, sont sujettes à variations. Par exemple, l'on peut obtenir des variants et mutants artificiels de NRRL 11179, par traitement par divers mutagènes connus comme les rayons ultraviolets, les rayons X, les ondes de fréquence élevée, les rayons radioactifs et les produits chimiques. Tous les variants et mutants naturels et artificiels qui ont essentiellement les mêmes caractéristiques d'identifica-

5

640 265

tion que Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 et qui produisent les antibiotiques A-40104 peuvent être utilisés dans cette invention.

Le milieu de culture utilisé pour cultiver Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 peut être l'un quelconque d'un certain nombre de milieux. Pour des raisons d'économie de production, de rendement optimal et de facilité d'isolement du produit, on préfère cependant certains milieux de culture. Ainsi, par exemple, les sources de glucides préférés dans la fermentation à grande échelle sont le glucose, la dextrine de tapioca, l'amidon et l'huile de maïs, bien que l'on puisse également utiliser le glycérol, le maltose, le fructose, etc. L'oléate, le laurate et la lécithine sont d'autres sources utiles de carbone. Les sources d'azote préférées sont la farine de soja plus ou moins fine, ou une combinaison de levure et d'aliments secs pour chiens. D'autres sources d'azote acceptables comprennent la levure, la farine de coton, la farine d'arachide, la peptone de viande, et les aliments secs pour chiens. Bien que des sels minéraux nutritifs ne soient pas essentiels pour la croissance et la production d'antibiotiques, on peut ajouter des sels solubles pouvant donner des ions sodium, magnésium, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, sulfate, nitrate, etc. Par exemple, l'addition de 0,05% de MgS04 • 7H20 et de 0,2% de CaC03 au milieu améliore la production d'antibiotiques.

Les oligo-éléments essentiels nécessaires à la croissance et au développement de l'organisme doivent être inclus dans le milieu de culture. Ces oligo-éléments se trouvent souvent sous forme d'impuretés dans les autres constituants du milieu en quantité suffisante pour satisfaire les nécessités de croissance de l'organisme.

Il peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités (c'est-à-dire 0,2 ml/1) d'un agent antimoussant, comme le polypropylèneglycol, aux milieux de fermentation sur une grande échelle, si la formation de mousse pose des problèmes.

Pour la production de quantités substantielles des antibiotiques A-40104, on préfère la fermentation aérobie en immersion dans des réservoirs. On peut obtenir de petites quantités des antibiotiques A-40104 par culture sur flacons agités. En raison du temps de latence dans la production d'antibiotiques couramment associé à l'inoculation de grands réservoirs par de petites quantités de culture, il est préférable d'utiliser un inoculum végétatif qui contient de plus grandes quantités de cellules dans un état de croissance active. On prépare l'inoculum végétatif en inoculant un petit volume de milieu de culture avec des fragments mycéliens de l'organisme pour obtenir une culture fraîche en croissance active de l'organisme. Puis on transfère l'inoculum végétatif dans un réservoir plus grand. Le milieu utilisé pour la croissance de l'inoculum végétatif peut être le même que celui utilisé pour la fermentation sur une plus grande échelle, mais on peut également utiliser d'autres milieux.

Le Clitopilus pseudo-pinsitus producteur de A-40104 peut être cultivé à des températures comprises entre 20 et 33° C. La production optimale de A-40104 semble se produire à des températures d'environ 30° C.

Comme il est courant dans les procédés de culture aérobie en immersion, on insuffle de l'ar stérile dans le milieu de culture agité.

Pour une croissance efficace de l'organisme, il doit y avoir une aération et une agitation suffisantes pour maintenir un taux d'oxygène dissous aussi proche de 80% que possible. Des taux inférieurs d'oxygène dissous suppriment la production des facteurs A et C de A-40104, mais l'effet sur le facteur A est plus prononcé.

Au cours de la fermentation, le facteur C de A-40104 est produit d'abord et le facteur A de A-40104 apparaît ensuite. La période d'incubation préférée pour la production du facteur A de A-40104 est donc d'environ 12 d. L'addition d'huile de maïs au milieu améliore la transformation du facteur C en facteur A pendant la fermentation. Dans les conditions optimales pour la production du facteur A de A-40104, 70 à 90% de l'antibiotique produit sont le facteur A.

Après leur production dans des conditions de fermentation aérobies en immersion, on peut récupérer les antibiotiques de A-40104 précédemment décrits à partir du milieu de fermentation par des procédés utilisés dans le domaine de la fermentation. L'activité antibiotique produite pendant la fermentation se trouve essentiellement dans le bouillon. On effectue donc une récupération maximale des antibiotiques de A-40104 par une combinaison de méthodes comprenant la filtration, l'extraction du bouillon filtré et la Chromatographie d'absorption. Un procédé particulièrement préféré consiste à extraire le bouillon filtré d'abord avec du toluène puis avec du chloroforme. On isole le facteur C de A-40104 à partir de l'extrait tolué-nique, et on isole le facteur A de A-40104 à partir de l'extrait chloro-formique. On sépare le facteur B de A-40104, le facteur mineur, par Chromatographie d'absorption pendant la purification du facteur A de A-40104.

Ou bien, on peut utiliser les matières solides de la culture comprenant les constituants du milieu et le mycélium, sans extraction ou séparation mais de préférence après élimination de l'eau, comme source d'antibiotiques A-40104. Par exemple, après production de l'activité antibiotique A-40104, on peut sécher le milieu de culture par lyophilisation et le mélanger directement dans un prémélange alimentaire.

Dans un autre aspect, après production de l'activité de A-40104 dans le milieu de culture et séparation du mycélium, on peut lyophiliser le bouillon filtré pour obtenir le complexe antibiotique A-40104 sous une forme que l'on peut utiliser directement dans un prémélange alimentaire.

Pendant la production des antibiotiques A-40104 et l'isolement et la séparation des différents facteurs antibiotiques, il est préférable de contrôler les processus de production et de séparation par des modes opératoires chromatographiques. Par exemple, on préfère un système en CCM utilisant un système solvant CHC13 :CH3OH (9:1), du gel de silice comme absorbant, et Micrococcus luteus comme indicateur biologique.

Activité des antibiotiques A-40104:

Le complexe antibiotique A-40104 et les facteurs A et B de A-40104 séparément inhibent la croissance de certains organismes pathogènes, en particulier les bactéries Gram positives. Le facteur A de A-40104 est un agent antibactérien particulièrement utile. Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) auxquelles le facteur A-40104 inhibe des bactéries sélectionnées, comme déterminé par des essais classiques de dilution sur gélose, sont résumées dans le tableau III.

Tableau III

Organisme d'essai

Facteur A de A-40104

Staphylococcus aureus 3055

<0,5

Staphylococcus aureus 3074

<0,5

Streptococcus faecalis

<0,5

Bordetella bronchiseptica

<0,5

Dans un aspect important de cette activité, les antibiotiques A-40104 inhibent.la croissance d'organismes qui résistent aux autres antibiotiques. Dans le tableau IV, on résume l'activité des facteurs A et B de A-40104 vis-à-vis d'organismes représentatifs dans des essais disque-plaque classiques. L'activité est mesurée par le diamètre en millimètres de la zone d'inhibition observée; le diamètre du disque utilisé dans chaque cas est de 6,35 mm.

Tableau IV

Concen

Diamètre des zones

(mm)

Organisme d'essai tration

(Kg / disque)

Facteur A

de A-40104

Facteur B

de A-40104

Staphylococcus aureus 30551

100

31,2

27,1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

640 265

Tableau IV (suite)

Concen

Diamètre des zones (mm)

Organisme d'essai tration

(ng/

disque)

Facteur A

de A-40104

Facteur B

de A-40104

Staphylococcus aureus 30551

10

27,2

18,9

Staphylococcus aureus 30742

100

29,2

25,4

Staphylococcus aureus 30742

10

25,4

13,5

Staphylococcus aureus 31303

100

34,0

29,5

Staphylococcus aureus 3130 3

10

29,2

19,0

Streptococcus pyogenes 4

100

27,0

23,0

Streptococcus pyogenes 4

10

21,0

19,0

Streptococcus sp. 99605

100

8,7

0

Streptococcus sp. 99605

10

0

Diplococcus pneumoniae

100

20,0

17,0

Diplococcus pneumoniae

10

14,0

12,0

1 Sensible à la pénicilline G.

2 Résistant à la pénicilline G.

3 Résistant à la méthicilline.

4 Groupe A.

5 Groupe D.

Le tableau V montre que le facteur A de A-40104 se compare favorablement à l'ampicilline dans une série d'essais in vitro utilisant la méthode de dilution sur plaques de gélose avec gradient.

Tableau V

CIM (jxg/ml)

Organisme d'essai

Facteur A de A-40104

Ampicilline

Streptococcus pyogenes

<0,01

Streptococcus sp. X-66 (groupe D)

0,5

0,8

Streptococcus sp. 9960 (groupe D)

70

0,6

Neisseria gonorrhea

0,5

Neisseria gonorrhea Sand.

0,07

Neisseria gonorrhea Lind.

0,5

Hemophilus influenzae Brun1

2

0,5

Hemophilus influenzae Dick1

2

0,5

Hemophilus influenzae Laiv.1

4

0,5

Hemophilus influenzae 2512

0,7

70

Hemophilus influenzae 259 2

0,7

70

Hemophilus influenzae 2602

0,7

70

Le facteur A de A-40104 et le facteur A 19,20-dihydrogéné de A-40104 (dihydro-A-40104A) ont montré une activité antimicrobienne in vivo vis-à-vis d'infections bactériennes expérimentales. Quand on administre deux doses de ces composés à des souris atteintes d'infections types, on mesure l'activité observée sous forme d'une valeur DES0 [dose efficace en milligrammes par kilo pour protéger 50% des animaux d'essai; voir Warren Wiek et al., «J. Bacteriol» 81,233-235 (1961)]. Les DES0 observées pour ces composés sont données dans les tableaux VI et VII.

Tableau VI Activité du facteur A de A-40104

Organisme d'essai

Route

DES0 x 2

Dose infectante

Staphylococcus

aureus 3055

se

15,7

1260 x DL50 (ip)

Tableau VI (suite)

Organisme d'essai

Route

DES0 x 2

Dose infectante

Streptococcus

pyogenes C203

sc

3,6

195 x DLS0 (ip)

Streptococcus pneumo

niae Park I

sc

21,5

1280 x DLS0 (ip)

Tableau VII

Activité de dihydro-A-40104-A

Organisme d'essai

Route

DE50 x 2

Dose infectante

Staphylococcus

aureus 3055

sc

<4,4

69,5 x DL50 (ip)

Staphylococcus

aureus 3055

oral

28

3400 x DL50 (ip)

Staphylococcus

aureus 3055

oral

27

500 x DLS0 (ip)

Streptococcus

pyogenes C203

sc

5,8

1690 x DLS0 (ip)

Streptococcus pneumo

niae BI-343

sc

35

30 x DL50 (ip)

Streptococcus pneumo

niae BI-492

sc

15,2

340 x DL50 (ip)

Les antibiotiques A-40104 inhibent également la croissance de diverses bactéries anaérobies. Le tableau VIII résume l'activité du facteur A de A-40104, déterminée par l'essai classique de dilution sur gélose.

Tableau VIII

Organisme d'essai

CIM (|ig/ml)*

Actinomyces israelii

<0,5

Clostridium perfringens

8

Clostridium septicum

8

Eubacterium aerofaciens

16

Peptococcus asaccharolyticus

<0,5

Peptococcus prevoti

<0,5

Peptostreptococcus anaerobius

2

Peptostreptococcus intermedius

<0,5

Bacteroides fragilis 111

8

Bacteroides fragilis 1877

8

Bacteroides fragilis 1936B

8

Bacteroides thetaiotaomicron

2

Bacteroides melaninogenicus 1856/28

4

Bacteroides melaninogenicus 2736

4

Bacteroides vulgatis

4

Bacteroides corrodens

8

Fusobacterium symbiosum

4

Fusobacterium necrophorum

<0,5

* CIM déterminée par la méthode de dilution sur gélose. Les points finals sont lus après 24 h d'incubation.

Un avantage particulier des antibiotiques A-40104 est qu'ils sont relativement non toxiques. Par exemple, la DL5Ô du facteur A de A-40104 et du dérivé tétraacétylé du facteur A de A-40104, par injection intrapéritonéale chez les souris, est supérieure à 300 mg/kg.

L'activité vis-à-vis des organismes Mycoplasma est un aspect particulièrement important de l'activité antimicrobienne des antibiotiques de A-40104. Les espèces Mycoplasma sont pathogènes vis-

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

640 265

à-vis de l'homme et de divers animaux. On a particulièrement besoin des agents actifs vis-à-vis des Mycoplasma pour empêcher et traiter les maladies de type Mycoplasma chez la volaille, le porc et le bétail.

Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) du facteur A de A-40104, de son dérivé 19,20-dihydrogéné et du dérivé tétraacétylé vis-à-vis de diverses espèces de Mycoplasma, déterminées par des études de dilution de bouillon in vitro, sont résumées dans le tableau IX.

Tableau IX

Organisme d'essai

Facteur A de A-40104

Dihydro-A-40104A

Tétraacétyl-A-40104A

Mycoplasma galli-

septicum

<0,78

0,195

12,5

Mycoplasma syno-

viae

<0,78

0,195

50,0

Mycoplasma hyo-

rhinis

1,56

0,195

25,0

Mycoplasma hyo-

pneumoniae

0,195

0,097

12,5

Un aspect important de cette invention est l'utilisation des antibiotiques A-40104 dans le traitement de la dysenterie porcine. Comme décrit dans le brevet des E.U.A. N° 4041175, la pleuromutiline est efficace dans le traitement de la dysenterie porcine. On a découvert que les antibiotiques de A-40104 selon cette invention sont également actifs vis-à-vis de Treponema hyodysenteriae, l'organisme le plus souvent associé à la dysenterie porcine. On a déterminé l'activité en utilisant un essai in vitro qui consiste à incorporer le composé à des taux de 50, 5,0,0,5 et 0,05 ng/ml dans des plaques de trypticase-soja-gélose contenant 5% de sang de bœuf défibriné. On inocule la surface de la gélose avec 0,1 ml d'une dilution 10~' d'une suspension de T. hyodysenteriae. On fait incuber les plaques dans des conditions anaérobies pendant 4 d, puis on évalue la présence ou l'absence de croissance du tréponème hémolytique. Dans cet essai, le facteur A de A-40104 et son dérivé 19,20-dihydrogéné inhibent la croissance de T. hyodysenteriae aux concentrations de 50, 5,0 et 0,5 ng/ml.

Quand on les utilise dans le traitement de la dysenterie porcine, les antibiotiques de A-40104 peuvent être administrés à des porcs infectés, par voie orale sous forme de comprimés, de capsules, de poudres, etc. On peut préparer une composition vétérinaire d'un ingrédient inerte contenant comme agent actif un antibiotique A-40104. Un procédé d'administration préféré consiste cependant à incorporer l'antibiotique de A-40104 à l'aliment pour porc.

Un autre aspect vétérinaire de cette invention est l'activité des antibiotiques A-40104 vis-à-vis des espèces Pasteurella. P. multocida, par exemple, est un agent responsable des infections respiratoires chez le bétail, la volaille et les porcs. P. hemolytica est une cause importante de maladies respiratoires chez le bétail. L'activité du facteur A de A-40104 et de son dérivé dihydrogéné vis-à-vis de Pasteurella, déterminée par des essais classiques in vitro, est résumée dans le tableau X.

Tableau X CIM (ng/ml)

Organisme d'essai

Facteur A de A-40104

Dihydro-A-40104

Pasteurella multocida (bovins)

6,25

Pasteurella multocida (dindons)

12,5

Pasteurella hemolytica

25,0

16,5

On peut préparer une composition pharmaceutique contenant un ingrédient inerte et, comme ingrédient actif, un antibiotique A-40104,

pour l'administration à l'homme vis-à-vis d'organismes pathogènes sensibles. Un autre aspect important de cette invention est l'activité des antibiotiques A-40104 vis-à-vis des micro-organismes Spiro-plasma. Spiroplasma citri est l'agent responsable de la maladie portée par les citrus; un autre Spiroplasma nuit à la croissance du maïs. Dans des essais in vitro vis-à-vis de Spiroplasma citri, le facteur A de A-40104 et son dérivé dihydrogéné inhibent S. citri quand on les applique à des taux aussi faibles que 0,01 ppm.

Les antibiotiques de A-40104 sont également actifs vis-à-vis des agents phytopathogènes. Par exemple, quand on les applique sous la forme d'une pulvérisation sur les feuilles ou d'un arrosage du sol, le facteur A de A-40104 est actif vis-à-vis de l'oïdium poudreux. Dans des essais sur des plants de haricots et d'avoine, on peut lutter contre l'oïdium poudreux avec un arrosage du sol du facteur A de A-40104 à un taux de 100 ppm, ce qui indique que ces composés ont une activité systémique. L'activité systémique de ces antibiotiques est particulièrement avantageuse dans la lutte contre les agents phytopathogènes ou les organismes Spiroplasma.

Pour illustrer plus complètement le fonctionnement de cette invention, on donne les exemples suivants.

Exemple 1 :

A. Fermentation en flacon agité de A-40104

On gratte avec un instrument stérile une culture à maturité sur plaque inclinée de gélose de Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179, et on la transfère de façon aseptique sur une plaque inclinée de gélose ayant la composition suivante:

Ingrédient

Quantité (g)

Saccharose

25

Mélasse noire

36

Liqueur de macération de maïs

6

Extrait de malt

10

k2hpo4

2

Caséine hydrolysée par voie enzymatique*

10

Gélose lavée

25

Eau désionisée q.s.p. 11

* N-Z Case, Humko Sheffield, Norwich, N.Y., U.S.A.

On fait incuber la culture inoculée à environ 30° C pendant environ 14 d. On gratte avec un instrument stérile la culture inclinée arrivée à maturité, et on utilise les mycéliums macérés provenant d'environ 5 cm2 de surface pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante:

Ingrédient

Quantité (g)

Glucose

10

Dextrine de tapioca*

10

Poudre d'hydrolysat de soja**

10

Fraction de levure de brasserie***

5

Eau du robinet q.s.p. 11

pH du milieu environ 3,5; ajuster à pH 6,9

avec NaOH 5N

* Stadex 11, A.E. Staley, Decatur, 111., U.S.A.

** HySoy T, Humko Sheffield, Norwich, N.Y., U.S.A. *** Amber BYF 300, Amber Laboratories, Juneau, Wisc., U.S.A.

On fait incuber le milieu végétatif inoculé dans un flacon Erlen-meyer de 250 ml, à environ 25° C, pendant 96 h, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tr/min.

5

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15

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640 265

8

On peut utiliser ce milieu végétatif incubé directement pour inoculer le milieu végétatif de second stade. Ou bien, et de préférence, on peut le conserver pour un usage ultérieur en maintenant la culture dans la phase vapeur d'azote liquide. On prépare la culture pour une telle conservation dans de nombreuses petites ampoules comme suit: dans chaque ampoule, on place 4 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol/lactose ayant la composition suivante:

Ingrédient

Quantité (g)

Glycérol Lactose

Eau désionisée q.s.p. 11

300 150

On conserve les suspensions ainsi préparées dans la phase vapeur de l'azote liquide.

On utilise une suspension conservée (1 ml) ainsi préparée pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif de premier stade ayant la même composition que celle décrite précédemment pour le milieu végétatif. On fait incuber le milieu végétatif de premier stade inoculé dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à large col, à 25° C, pendant environ 4 d, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tr/ min.

B. Fermentation en réservoir

Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml du milieu végétatif de premier stade incubé décrit précédemment pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif de second stade ayant la même composition que celle du milieu végétatif. On fait incuber le milieu de second stade dans un Erlenmeyer à large col de 21, à 25° C, pendant environ 48 h, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tr/min.

On utilise le milieu végétatif de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit précédemment, pour inoculer 100 1 d'un milieu de production stérile ayant la composition suivante:

Ingrédient

Quantité (g/1)

Glucose

15

Glycérol

5

Dextrine de tapioca

30

Aliment sec pour chien*

25

Extrait de levure

5

KCl

1

MgS04 • 7H20

0,5

FeS04 • 7H20

0,1

MnCl2 • 4H20

0,05

ZnS04 • 7H20

0,05

CaC03

0,1

Eau désionisée q.s.p. 11

pH ajusté à 5,0 avec HCl 4N

* Purina Dog Chow, Ralston Purina Co., St Louis, U.S.A. (Mo 63188).

On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 1651, à une température d'environ 30° C, pendant environ 12 d. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile en maintenant un taux d'oxygène dissous d'environ 80%.

Exemple 2:

On effectue la fermentation comme dans l'exemple 1 mais en utilisant un milieu végétatif ayant la composition suivante:

Ingrédient

Quantité (g/1)

Dextrose

5

Galactose

5

Glycérol

5

Amidon soluble

5

Extrait de levure

2

Aliment sec pour chien*

5

Huile de soja

2

Hule de maïs

2

kh2po4

3

MgS04 • 7H20

0,5

FeS04 • 7H20

0,1

CaC03

1,0

MgCl2 • 4H20

0,05

ZnS04 • 7H20

0,05

Eau désionisée q.s.p. 11

pH du milieu environ 5,7, ajusté à 5,0 avec

HC14N

* Purina Dog Chow.

Exemple 3:

On effectue la fermentation en utilisant le procédé de l'exemple 1, mais en utilisant le milieu de fermentation ayant la composition suivante:

Ingrédient

Quantité (g/1)

Glucose

50

Gruau de soja

7,5

MgS04 • 7H20

1,0

CaC03

2,0

Eau désionisée q.s.p. 11

pH d'environ 7,4, ajusté à pH 6,5 avec

HC14N

Exemple 4:

Isolement des facteurs A et C de A-40104

On filtre le bouillon de fermentation entier (45401) obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 3, en utilisant un adjuvant de filtration (Hyflo Super-cel, une terre de diatomées, Johns-Manville Products Corp.) et l'on obtient 36401 de filtrat. On lave le gâteau mycélien avec de l'eau désionisée et on obtient 18201 supplémentaires de filtrat. On extrait les filtrats réunis (54601) au pH du bouillon avec du toluène ( 'A volume) pendant 1 h, et l'on obtient 25001 d'extrait de toluène. Cet extrait toluénique contient essentiellement le facteur C de A-40104 (pleuromutiline). On concentre l'extrait toluénique jusqu'à un volume d'environ 23 1. Une première récolte du facteur C de A-40104 (1943 g) cristallise et on la recueille par filtration. On concentre la liqueur mère jusqu'à un volume d'environ 8 1. On sépare une seconde récolte de facteur C (282 g). On concentre à nouveau la liqueur mère jusqu'à un volume d'environ 61, en refroidissant à environ 4°C pendant 72 h, et l'on obtient 158 g supplémentaires de facteur C. On concentre jusqu'à une huile visqueuse la liqueur mère provenant de cette troisième récolte; on dissout cette huile dans 61 d'éther diéthylique; on refroidit la solution à 4°C pendant 72 h, et l'on obtient 112 g d'une quatrième récolte du facteur C de A-40104.

On extrait ensuite la solution aqueuse restant après l'extraction toluénique avec 'A volume de chloroforme pendant 1 h. On concentre l'extrait chloroformique obtenu jusqu'à un volume d'environ 101, et on refroidit à 4° C pendant 72 h. On sépare par filtration les

5

10

15

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35

40

45

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55

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65

cristaux qui se forment et on les sèche, ce qui donne 588 g du facteur Ade A-40104.

Exemple 5:

Isolement du complexe A-40104 et du facteur B

On filtre le bouillon de fermentation entier (2141) obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 1 en utilisant un adjuvant de filtration, et l'on obtient 119 1 de filtrat. On lave le gâteau mycélien avec de l'eau et l'on obtient 80 1 supplémentaires de filtrat. On extrait les filtrats réunis (1991) deux fois au pH du bouillon avec de l'acétate d'éthyle (801 à chaque fois). On concentre les extraits réunis d'acétate d'éthyle sous vide jusqu'à un volume d'environ 21. On ajoute 201 d'hexane pour précipiter le complexe actif. On sépare par filtration le complexe antibiotique qui a précipité, puis on le redissout dans environ 300 ml d'acétate d'éthyle et on le précipite à nouveau avec de l'hexane. On lave le précipité avec de l'hexane et on le sèche, ce qui donne 27,3 g du complexe antibiotique A-40104 (contenant les facteurs A, B et C).

On dissout une portion (5 g) de ce complexe dans 40 ml de chloroforme. On filtre la solution chloroformique et on Chromatographie le filtrat sur une colonne en verre ouverte (5,6 x 28 cm) sur gel de silice (Woelm). On garnit la colonne avec une suspension de gel de silice dans du chloroforme et on l'élue avec du chloroforme à un débit de 2 ml/min, en recueillant des fractions ayant un volume de 20 ml. A la fraction N° 7, on change le solvant d'élution et l'on utilise un mélange 95:5 de chloroforme et de méthanol; à la fraction N° 28, on change à nouveau le solvant et l'on utilise un mélange 9:1 de chloroforme et de méthanol. On réunit les fractions 72 à 120 et on les évapore sous vide, et l'on obtient 4 g d'une poudre sèche.

On traite du bouillon de fermentation supplémentaire de la même manière et l'on obtient encore 6 g de cette substance. On ajoute 100 ml de chloroforme aux échantillons réunis (10 g); la substance insoluble dans le chloroforme (1,6 g du facteur A de A-40104) est séparée par filtration. On Chromatographie le filtrat sur une colonne de verre ouverte (5,8 x 48 cm) sur gel de silice (Woelm). On garnit la colonne et on la lave avec du chloroforme, puis on l'élue avec un mélange 97,5:2,5 de chloroforme et de méthanol, en recueillant des fractions ayant un volume de 20 ml à un débit de 4 ml/min. On réunit les fractions Nos 156 à 190 et on les évapore à siccité sous vide. On dissout le résidu dans un petit volume de chloroforme; on ajoute de l'hexane à cette solution pour précipiter le produit. On sépare le précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 99 mg du facteur B de A-40104.

Exemple 6:

Préparation du facteur A 19,20-dihydrogéné de A-40104

On dissout 10,15 g (0,0199 mol) du facteur A de l'antibiotique A-40104 dans 188 ml de tétrahydrofuranne, et on ajoute 2,5 g de 5%

640 265

de Pd/C. On hydrogène le mélange réactionnel pendant 4 h à la température ambiante, puis on le filtre sur un entonnoir en verre fritté avec une couche de célite. On évapore le filtrat sous vide à siccité. On cristallise le résidu dans un mélange 2:1 d'acétate d'éthyle et de méthanol, ce qui donne 7,0447 g (0,01375 mol, rendement de 69%) du facteur A 19,20-dihydrogéné de A-40104.

Exemple 7:

Préparation du facteur B 19,20-dihydrogéné de A-40104

On hydrogène le facteur B de A-40104, en utilisant les conditions décrites dans l'exemple 6, pour obtenir le facteur B 19,20-dihydrogéné de A-40104.

Exemple 8:

Préparation du facteur A tétraacétylé de A-40104

On dissout 2 g du facteur A de A-40104 dans 5 ml de pyridine sèche et on ajoute 5 ml d'anhydride acétique. On laisse la solution limpide résultante reposer à la température ambiante pendant 120 h. Puis on ajoute la solution à 20 ml d'éthanol; on évapore la solution résultante sous vide jusqu'à ce que l'on ait éliminé les traces de pyridine et d'acide acétique, et l'on obtient 2,1 g du dérivé tétraacétylé du facteur A de A-40104. [a]2D5 -22,2°C (c 1,0, C2H5OH); formule empirique C3sH5o013 et poids moléculaire de 678,325 par spectro-métrie de masse avec correspondance des pics.

Analyse pour C35HS0O13:

Calculé: C 62,00 H 7,40 0 30,60%

Trouvé: C 62,06 H 7,32 0 30,19%

Exemples 9-14:

On prépare le dérivé triacétylé du facteur B de A-40104 à partir du facteur B de A-40104, en utilisant un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple 8.

On prépare le dérivé tétraacétylé du facteur A 19,20-dihydrogéné en faisant réagir le facteur A 19,20-dihydrogéné de la manière décrite dans l'exemple 8.

On prépare le dérivé triacétylé du facteur B 19,20-dihydrogéné en faisant réagir le facteur B 19,20-dihydrogéné selon le procédé de l'exemple 8.

On prépare le dérivé tétra-(n-butyrylé) du facteur A de A-40104 en faisant réagir le facteur A de A-40104 avec l'anhydride n-butyrique selon le mode opératoire de l'exemple 8.

On prépare le dérivé tripropionylé du facteur B de A-40104 en faisant réagir le facteur B de A-40104 avec l'anhydride propionique selon le mode opératoire de l'exemple 8.

On prépare le dérivé tétra-(n-valérylé) du facteur A 19,20-dihydrogéné en faisant réagir le facteur A 19,20-dihydrogéné avec l'anhydride valérique selon le mode opératoire de l'exemple 8.

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

R

2 feuilles dessins

Claims

640 265

2

REVENDICATIONS

1. Antibiotique, comprenant un des éléments suivants: — le mélange antibiotique A-40104 comprenant le facteur A de cet antibiotique qui est le dérivé acétal ß,D-xylopyranosyle de la pleuromutiline de formule:

OH

(I)

Ob le facteur B de cet antibiotique qui est une substance amorphe blanche ayant les propriétés suivantes:

a) un poids moléculaire de 394 déterminé par spectrométrie de masse avec choc d'électrons;

b) une formule empirique d'environ C22H3406;

c) un spectre d'absorption infrarouge, effectué en pastilles de KBr, avec des maxima d'absorption significatifs aux fréquences suivantes (cm-1): 3430 (large), 2940,1735,1660, 1452, 1385,1375, 1305, 1280, 1233, 1152, 1094, 1020, 997, 967, 933, 912, 888, 752 et 660, et d) trois groupements hydroxy susceptibles d'acylation,

et le facteur C qui est la pleuromutiline de formule (II):

COCHzOH

facteur B, et le dérivé trialcanoylique en C2-C6 du facteur B 19,20-dihydrogéné.
2. Antibiotique selon la revendication 1, constitué par le mélange antibiotique A-40104 comprenant le facteur A de l'antibio-

5 tique A-40104, le facteur B de l'antibiotique A-40104 et la pleuromutiline.
3. Antibiotique selon la revendication 1, constitué par un élément choisi parmi 1) le facteur A de l'antibiotique A-40104, 2) le dérivé 19,20-dihydrogéné du facteur A de A-40104, et 3) les dérivés io tétraalcanoyliques en C2-C6 du facteur A de A-40104 et du facteur A 19,20-dihydrogéné de A-40104.
4. Antibiotique selon la revendication 1, constitué par un composé choisi parmi 1) le facteur B de l'antibiotique A-40104, 2) le dérivé 19,20-dihydrogéné du facteur B de A-40104, et 3) les dérivés

15 trialcanoyliques en C2-C6 du facteur B de A-40104 et du facteur B 19,20-dihydrogéné de A-40104.
5. Composition vétérinaire, caractérisée par un ingrédient inerte et, comme ingrédient actif, par un élément du groupe des antibiotiques décrits dans l'une des revendications 1 à 4.

20

25 L'antibiotique pleuromutiline a été isolé en 1951 par Kavanagh et al. [«Proc. Nati. Acad. Soc.» 37, 570-574 (1951)]. Il a été montré par la suite que la formule développée de la pleuromutiline est:

O-COCH2CH

35

(II)

L'hydrolyse alcaline de la pleuromutiline donne un composé qui est appelé mutiline. La mutiline a la formule développée suivante:

(II)

50

i: :i '1

• • 7 •

60

1 7

— le facteur A de l'antibiotique A-40104, le facteur A de cet antibiotique 19,20-dihydrogéné, le dérivé tétraalcanoylique en C2-C6 du facteur A, et le dérivé tétraalcanoylique en C2-C6 du facteur A

19,20-dihydrogéné;

— le facteur B de l'antibiotique A-40104, le facteur B de cet antibiotique 19,20-dihydrogéné, le dérivé trialcanoylique en C2-C6 du

65 Un grand nombre de dérivés de pleuromutiline ont été préparés : brevet suisse N° 572894 (Derwent N° 26553X); brevet néerlandais N° 6911083 (Derwent N° 40642); brevets américains Nos 3716579, 3919290, 3949079, 3979423, 3987194 et 4032530; If. Riedl, «Studies

3

640 265

on Pleuromutilin and Some of Its Derivatives», «J. Antibiotics» 29, 132-139 (1976); H. Egger and H. Reinshagen «New Pleuromutilin Derivatives with Enhanced Antimicrobial Activity. I. Synthesis, «J. Antibiotics» 29, 915-922 (1976) et «II. Structure-Activity Corrélations», ibid., 923-927 (1976); F. Knauseder et E. Brandi, «Pleuro-mutilins: Fermentation, Structure and Bio-synthesis», «J. Antibiotics» 29, 125-131 (1976); J. Drews et al., «Antimicrobial Activities of 81.723 hfu, a New Pleuromutilin Derivative», «Antimicrob. Agents and Chemotherapy» 7, 507-516 (1975).

La titulaire a découvert deux antibiotiques qui sont de nouveaux éléments de la famille de la pleuromutiline parmi les antibiotiques.