HU179464B - Process for preparing antibiotic a-40104 - Google Patents

Process for preparing antibiotic a-40104 Download PDF

Info

Publication number
HU179464B
HU179464B HU78EI824A HUEI000824A HU179464B HU 179464 B HU179464 B HU 179464B HU 78EI824 A HU78EI824 A HU 78EI824A HU EI000824 A HUEI000824 A HU EI000824A HU 179464 B HU179464 B HU 179464B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibiotic
component
medium
dihydro
mixture
Prior art date
Application number
HU78EI824A
Other languages
English (en)
Inventor
Karl H Michel
Calvin E Higgens
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HU179464B publication Critical patent/HU179464B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás az A-40 104 A, B, C és D antibiotikumok és ezek keverékének előállítására.
Az A-40 104 antibiotikum-komplex A, B, C és D komponensekből áll. Az antibiotikum-komplexet a Clitopiluspsuedo-msitus mikroorganizmus süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülmények közötti tenyésztésével állítjuk elő. Az antibiotikum-komplex egyes összetevőit, az A, B és C komponenseket elkülönítettük. Az A-40 104 C komponens az ismert pleuromutilin antibiotikummal azonos. Az A-40 104 A és B komponensek a pleuromutilinnel rokon új antibiotikumok. Az A-40 104 A komponens a komplexben a legnagyobb mennyiségben van jelen, és ez a pleuromutilin D-xilóz-acetál-származéka. Az A-40 104 A és B komponensek,ezek 19,20-dihidro-származékai, ezek 2—6 szénatomos alkanoil-származékai és ez utóbbiak 19,20-dihidro-származékai Gram-pozitív és Gram-negatív festőd ésű baktériumok, anaerob baktériumok és Mycoplasma ellen hatékonyak.
A pleuromutilin antibiotikumot Kavanagh és munkatársai 1951-ben izolálták [Proc. Natl. Acad. Soc., 37, 570-574 (1951)]. A pleuromutilin szerkezetét később megállapították és az I képleten megadottnak találták.
A pleuromutilin alkalikus hidrolízisekor egy mutilin nevű vegyület keletkezik. A mutilin szerkezetét a II képleten mutatjuk be.
Nagyszámú pleuromutilin-származékot ismerünk: 572 894 számú svájci szabadalmi leírás (Derwent: 26 553X), 69(11 083 számú holland szabadalmi leírás (Derwent: 40 642), Knauseder és munkatársai, 3 716 579 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, Egger és munkatársai, 3 919 290 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, Brandl és munka5 társai, 3 949 079 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, Riedl, 3 979 423 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, Baughn és munkatársai, 3 987 194 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, Egger és és munkatársai, 4 032 530 számú 10 Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, Riedl, „Studies on Pleuromutilin and Somé of Its Derivatives”, J. Antibiotics, 29, 132-139, 1976, Egger és Renshagen, „Ne Pleuromutilin Derivatives with Enhanced Antimicrobial Activity, I. Synthesis”, J. Antibiotics, 29, 15 915-922, 1976, és „II. Structure-Activity Correlations”, ugyanott, 923—927, 1976, Knauseder és Brandl, „Pleuromutilins, Fermentation, Structure and Biosynthesis”, J. Antibiotics, 29, 125-135, 1976, Drews és munkatársai, „Antimicrobial Activities of 20 81 723 hfu, a New Pleuromutilin Derivative”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 7, 507-516, 1975.
Kutatásaink során két új, a pleuromutilin családba tartozó antibiotikumot fedeztünk fel. Ezenfelül új 25 módszert találtunk a pleuromutilin előállítására.
A találmány szerinti eljárással előállítjuk az A-40 104 A, B és D antibiotikum komponenseket, továbbá új eljárást ismertetünk az A-40 104 A, B, C és D antibiotikum komponensek előállítására. Ezen vegyü30 Jetek használható antibiotikum spektrummal rendel kéznek, a vegyületek nemcsak Gram-pozitív, Gram-negatív festödésű és anaerob baktériumok ellen hatnak, de gátolják a Mycoplasma nembe tartozó mikroorganizmusokat is. Ily módon új antibiotikumokat találtunk a szárnyasok, sertések és szarvasmarhák mycoplasmás megbetegedéseinek és a Treponema hyodysenteliae okozta sertés dizentéria kezelésére.
A találmány tárgya továbbá eljárás az A, B, D komponensekből és a pleuromutilinből álló A-40 104 antibiotikum-keverék előállítására, a találmány tárgya továbbá eljárás az A-40 104 A, az A-40 104 A 19,20-dihidro-származékának, az A-40 104 A tetra-(2—6 szénatomosj-alkanoil-származékainak és az utóbbiak 19,20-dihidro-származékának előállítására, a találmány tárgya továbbá eljárás az A—40 104 B, az A-40 104 B 19,20-dihidro-származékának, az A—40 104 B tri-(2 6 szénatomos)-alkanoil-származékainak és az utóbbi 19,20-dihidro-származékának előállítására, a találmány tárgya ezenkívül eljárás a pleuromutilin és az A-40 104 D komponens előállítására.
A találmány értelmében a fentiekben felsorolt vegyületek előállítására a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 vagy egy A-40 104 vegyületet termelő mikroorganizmust vagy mutánst felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztünk, míg jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel a táptalajban, ezt követően adott esetben az A-40 104 antibiotikum-keveréket elkülönítjük a táptalajból, majd adott esetben az antibiotikum-keverékből elkülönítjük az A-40 104 A komponenst, az A-40 104 D komponenst, a pleuromutilint vagy az A-40 104 D komponenst, majd adott esetben az A-40 104 A komponenst vagy az A-40 104 B komponenst hidrogénezzük, amiután 19,20-dihidro-A-40 104 A-t vagy 19,20-dihidro-A-40 104 B-t kapunk:
majd adott esetben az A-40 104 A, 19,20-dihidro-A-40 104 A, A-40 104 B vagy a 19,20-dihidroA-40 104 B komponenseket acilezzük, amiután megkapjuk az A-40 104 A vagy a 19,20-dihidro-A-40 104 A komponensek tetra-(2-6 szénatomos)-alkanoil-származékait, vagy az A-40 104 B vagy a
19.20- dihidro-A40 104 B komponensek tri-(2-6 szénatomosj-alkanoil-származékait.
A találmány értelmében a fenti vegyületeket a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmus tenyésztésével állítjuk elő.
A találmány antibiotikumok előállítására vonatkozik. Részletesebben, a találmány egy antibiotikum-komplex, az A—40 104 antibiotikum-komplex előállítására vonatkozik, amely legalább 4 komponensből, az A, B, C és D komponensekből áll. Az előállítást Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmussal végezzük. Az A-40 104 A és B komponensek új antibiotikumok.
A találmány oltalmi köréhez tartoznak az A-40 104 A és B komponensek 19,20-dihidro-származékai, az A—40 104 A és B komponensek 2—6 szénatomos alkanoil-származékai, továbbá ezen származékok
19.20- dihidro-származékai is.
Az A-40 104 A és B antibiotikumok szerkezetileg rokon vegyületek, ezek rokon vegyülete az A-40 104
C komponens is, amely az ismert pleuromutilin antibiotikummal azonos. A fermentáció során legalább 4 antibiotikum-komponens termelődik, ezek alkotják az A-40 104 antibiotikum-komplexet. A pleuromutilint és az A-40 104 A komponenst a szűrt fermentléből különítjük el előnyös extrakciós eljárással. Az A-4O 104 B komponens úgynevezett minor komponens, kromatográfiás módszerekkel különíthető el és izolálható. A másik minor komponens az A—40 104 D kromatográfiával különíthető el, jellemzésre elegendő mennyiségben azonban még nem izoláltuk.
A következőkben ismertetjük az A-40 104 A és B komponensek fizikai és fizikai-kémiai tulajdonságait.
Az A-40 104 A komponens kloroformból kristályosítható, a kristályok 117 °C és 120 °C közötti hőmérsékleten olvadnak. Az A-40 104 A komponens tapasztalati képlete az elemanalízis alapján C27H4209. Molekulasúlya a deszorpciós tömegspektrometriás mérés szerint 510.
Az A-40 104 A antibiotikum trifluoretanolban vizsgált ultraibolya abszorpciós spektrumában a 284 nm-es hullámhosszon (e: 32) látható elnyelési maximum.
Az A-40 104 A komponens trifluoretanolban vizsgált cirkuláris diszkroizmus spektrumában a következő maximumok láthatók: Ae: +2;84,200 nm-en, Ae: +1,72,295 nm-en.
Az A-40 104 A komponens fajlagos forgatása: [cijf,5:-14° (konc.: l,0,etanol).
Az A-40 104 A komponens 66%-os vizes dimetilformamidban végzett elektrometrikus titrálása szerint a vegyületben titrálható csoport nincs.
Az A-40 104 A komponens káliumbromidban vizsgált infravörös abszorpciós spektrumában a legjelentősebb elnyelési maximumok a következő frekvenciákon (cm-1) figyelhetők meg: 3590, 3500, 3450 (széles), 3280 (széles), 2990, 2980, 2960, 2940, 2920, 2890, 2860, 1755, 1735, 1645, 1465, 1447, 1420, 1380, 1330, 1310, 1274, 1240, 1220, 1160, 1117, 1093, 1070, 1060,1040, 1014,984,955,940, 921, 905, 865, 760, 742, 698, 674, 603, 530 és 442.
Az A-40 104 A komponens alkoholokban mint például metanolban és etanolban oldódik, részlegesen oldódik kloroformban, vízben oldhatatlan.
Az A-40 104 A komponens fizikai és kémiai jellemzői alapján a pleuromutilin ú,D-xilo-piranozil-acetil-származékának látszik. A vegyület szerkezetét a III képletben adjuk meg.
Az A-40 104 B komponens fehér színű amorf anyag, amely az A-40 104 antibiotikum-komplexben minor komponensként fordul elő. Az A-40 104 antibiotikum-komplex teljes aktivitásának 0,01% és 0,1% közötti részét képviseli. Elektron tömegspektrometriás mérés szerint az A-40 104 B komponens molekulasúlya 394. A molekula-ionok és egyes fragmens-ionok vizsgálata szerint az A-40 104 B tapasztalati képlete: C22H34O6. A B komponens tömegspektrumban 318n/e-ná jelentkező csúcs (C2oH3003) azonos a pleuromutilin spektrumában 302 n/e-nél jelentkező csúccsal, ami azt jelenti, hogy a további oxigén-atom a B komponensben a vegyület magjában van, nem pedig az oldalláncban. A 164 n/e-nél jelentkező fragmens mind a B komponensben, mind a pleuronrutilinben megtalálható. A 245 n/e-nél jelentkező kis csúcs (CnHjsO) a pleuromutilin spektrumában
261 n/e-nél (Ci7H2SO2) jelentkezik a B komponens spektrumában. Az A-40 105 B komponens három olyan hidroxilcsoporttal rendelkezik, amely acilezhető. így például az A 40 104 B komponens piridinnel és ecetsavanhidriddel reagáltatva triacetil-származékot képez, amikor olyan vegyület keletkezik, amelynek tapasztalati képlete C28H40O9, molekulasúlya pedig 520. Ez azt jelzi, hogy az A-40 104 B komponensben a további oxigénatom hidroxilcsoportban helyezkedik el.
Az A-40 104 B komponens káliumbromidban vizsgált infravörös abszorpciós spektrumában a következő frekvenciákon (cm'1) jelentkezik jelentős elnyelési maximum: 3430 (széles), 2940, 2880, 1735, 1660, 1452, 1385, 1375, 1305, 1280, 1233, 1152, 1094, 1020,997,967,933,912,888, 752, és 660.
A fizikai és kémiai jellemzők alapján a A-40 104 B komponens a IV képletben megadott valószínű szerkezettel rendelkezik.
Az A-40 104 A és B komponensekben szerepel egy vinilcsoport, amely ismert módszerekkel redukálható, és amikor 19,20-dihidro-származékokat kapunk. Az A-40 104 A és B komponensek 19,20-dihidro-származékai szintén aktív baktériumellenes vegyületek és a találmány oltalmi köréhez tartoznak.
Az A-40 104 A és B komponensek, továbbá ezek
19,20-dihidro-származékai egyaránt tartalmaznak olyan hidroxilcsoportokat, amelyeket ismert módszerekkel acilezhetünk. Az A komponensben négy hidroxilcsoport, a B komponensben három hidroxilcsoport van. Az előállított acilezett származékok érthetően minden helyzetben azonos acilcsoportot tartalmaznak, azaz négyet az A és hármat a B komponensben. Az acilezett származékok szintén baktériumellenes vegyületek. Az A-40 104 A és B komponensek per-(2-6 szénatomosj-alkanoil-származékai, továbbá az A-40 104 A és B komponensek 19,20-dihidro-származékai az ismertetett vegyületek közül a legelőnyösebbek.
Az A-40 104 antibiotikum-komplex négy komponense kromatográfiás módszerrel· elkülöníthető és azonosítható- A komponenseket például vékony rétegkromatográfiával különítjük el, a kromatográfiát szilikagéllel (Merek, Darmstadt) végezzük, oldószerelegyként kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyét használjuk. Biológiai indikátorként Micrococcus luteus-t használunk. Abban az oldószer-elegyben az A-40 104 antibiotikum komplex A-D komponensei az 1. táblázatban megadott Rf-értékeket mutatják.
1.táblázat
A-40 104 komponens Rf-érték
A 0,21
B 0,36
C 0,52
D 0,67
Elkülöníthetjük a komponenseket papírkromatográfiával is, ebben az esetben Whatman No. 1. kezeletlen papírt használunk. Oldószerelegyként vízzel telített butanolt, indikátor mirkoorganizmusként Micro coccus luteus-t használunk. Ebben a rendszerben az A-40 104 A-D komponensek Rf-értékei a 2. táblázatban megadottak.
2. táblázat
A—40 104 komponens Rf-érték
A0,64
B0,51
C0,37
D0,31 j___________________________
Az alábbiakban ismertetjük az A-40 104 antibiotikumkomplex elkülönítését.
A találmány tárgyához tartozik az A-40 104 antibiotikum-komplex előállítása, ezen belül az A-40 104 A és B komponensek és az ismert pleuromutilin antibiotikum előállítása.
A találmány értelmében úgy járunk el, hogy egy Clitopilus pseudo-pinsitus basidiomiceta A-40 104 termelő törzset süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülmények között előnyös táptalajon addig tenyésztünk, mig a táptalajban antibiotikum halmozódik fel. Az antibiotikum-komplexet és a komplexet felépítő komponenseket ismert izolálási és tisztítási eljárások segítségével különítjük el.
Az A-40 104 antibiotikumokat termelő törzset Hollandiából a Centraalbureau voor Schimmelculture (CBS) gyűjteményből kaptuk. A CBS-től kapott tenyészet (CBS 270,36) Octojuga pseudo-pinsita-nak bizonyult. A jelen szabadalmi leírásban a Clitopilus nevet használjuk, amely az Octojuga névvel szinonima. Ezen tenyészet antibiotikum termelő képessége nem volt ismeretes. Kiterjedt szűrővizsgálatokat követően felfedeztük, hogy képes az A-40 104 antibiotikumok termelésére.
Az A-40 104 A és B komponensek, továbbá a pleuromutilin termelésére használt Clitopilus pseudo-pinsitus törzset a Northern Marketing and Nutrition Research Division (U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61 604) törzsgyűjteményében letétbe helyeztük, ahol az NRRL 11 179 sorszámmal jelölték és ahonnan bárki elkérheti.
Mint ahogy más mikroorganizmusoknál is előfordul, az A-40 104 antibiotikumot termelő Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 törzs tulajdonságai változnak. Az NRRL 11 179 törzs mesterséges variánsait és mutánsait előállíthatjuk például különböző ismert mutagénekkel, mint például ultraibolya sugarakkal, röntgensugarakkal, nagyfrekvenciájú hullámokkal, radioaktív sugarakkal és vegyszerekkel. A találmány oltalmi köréhez tartoznak az összes természetes és mesterséges variánsok és mutánsok, amelyek a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmus meghatározó tulajdonságaival rendelkeznek.
A Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmus növesztéséhez használt táp'talajok sokfélék lehetnek. A termelés gazdaságossága, a legnagyobb termelés és a tennék könnyű izolálása érdekében azonban bizonyos táptalajokat előnyösen hasz3 nálhatunk. A nagyméretű fermentációkkor szénforrásként előnyösen például glükózt, tápióka dextrint, keményítőt és kukoricaolajat használunk, bár adhatunk a táptalajhoz glicerint, maltózt, fruktózt és hasonlókat is. Használhatjuk szénforrásként az olajsavat, laurilsavat és a lecitint is. Nitrogcnforrásként előnyösen szójabab lisztet, szójabab őrleményt, vagy szárított kulyaeledel és élesztő keverékét használjuk. Használhatunk nitrogénforrásként élesztőt, gyapotmaglisztet, mogyorólisztet, húspeptont és szárított kutyaeledelt is.Bár a növekedéshez essz antibiotikum termeléséhez a szervetlen sók jelenléte nem lényeges, adhatunk a táptalajhoz nátrium-, magnézium-, kalcium-, ammónium·, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrátés más ionokra disszociáló, oldódó sókat. így például, ha a táptalajt 0,05% magnéziumszulfáttal (7 H2O) és 0,2% kalciumkarbonáttal egészítjük ki, az antibiotikumtermelés nő.
Hozzáadhatjuk a táptalajhoz a növekedés és a mikroorganizmus fejlődését elősegítő nyomelemeket. Ezek a nyomelemek a mikroorganizmus növekedéséhez elegendő mennyiségben általában mint szenynyezö anyagok jelen vannak a táptalaj többi összetevőjében.
Abban az esetben is, ha a nagyméretű fermentáció során a táptalaj habzása nehézséget okoz, kismennyiségű (például literenként 0,2 mi) habzásgátlószert, például polipropilén-glikolt adunk a táptalajhoz. Nagymennyiségű A-40 104 antibiotikumok előállítására tankfermentorban süllyesztett, levegőztetett fermentációt végzünk. Kismennyiségű A-40 104 antibiotikumokat rázott lombikokban is előállíthatunk. Mivel az antibiotikum termelésben lagfázis figyelhető meg, ha a nagytérfogatú tankfermentort kismennyiségű tenyészettel oltjuk, előnyösen úgy járunk el, hogy nagymennyiségű és aktívan növekvő sejtet tartalmazó vegetatív inokulumot használunk az oltáskor. A vegetatív inokulum előállítására kismennyiségű táptalajt a mikroorganizmus micéliumdarabkáival oltunk, amelyet a mikroorganizmus friss és aktívan növekvő tenyészetéből nyerünk. Ezután a vegetatív inokulummal oltjuk a nagytérfogatú tankfermentorban levő táptalajt. A vegetatív inokulum elkészítéséhez használt táptalaj a főfermentációs táptalajjal azonos vagy attól különböző lehet.
Az A-40 104 antibiotikumokat termelő Clitopilus pseudo-pinsitus mikroorganizmus 20 °C és 33 °C közötti hőmérsékleten növekszik. Az A-40 104 antibiotikumok termelését előnyösen 30 °C hőmérsékleten végezzük.
Ahogy a levegőztetett és süllyesztett tenyésztésekkor szokásos, a kevert táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A mikroorganizmus megfelelő növekedéséhez megfelelő levegőztetés és kevertetés szükséges, olyan mértékben, hogy az oldott oxigén koncentrációja a lehetségesnek közel 80%-át érje el. Ha az oldott oxigén mennyisége alacsonyabb, úgy az A-40 104 A komponens és C komponens termelése csökken, a gyenge levegőztetés hatása különösen az A komponens termelésére nézve kedvezőtlen.
A fermentáció során először az A-40-104 C komponens jelenik meg, majd később az A-40 104 A. Az A-40 104 A komponens termelése szempontjából ezért körülbelül 12 napos fermentációs idő az előnyös. Ha a táptalajhoz kukoricaolajat adunk, úgy a C komponens átalakulása A komponenssé fokozódik. Az A-40 104 A komponens termelése szempontjából előnyös fermentációs körülmények között a termelt összantibiotikum 70% és 90% közötti mennyisége az A komponens.
A süllyesztett és levegőztetett fermentációs körülmények között termelt és az előzőekben ismertetett A-40-104 antibiotikumok elkülönítése a táptalajtól a fermentációs iparban ismert módszerekkel történik. A fermentáció során termelt antibiotikum nagy része a fermentlében található. Az A-40 104 antibiotikumok izolálására ezért kombinált módszereket, köztük szűrést, a szűrt fermentlé extrakcióját és adszorpciós kromatográfiai használunk. Különösen előnyös az az eljárás, amelynek során a szűrt tenyészlevet először toluollal, majd kloroformmal extraháljuk. Az A-40 104 C komponenst a toluolos extraktumból, az A-40 104 A komponenst pedig a kloroformos extraktumból izoláljuk. Az A-40 104 B minor komponenst az A-40 104 A komponens tisztítása közben adszorpciós kromatográfiával különítjük el.
A találmány szerinti eljárás másik előnyös kivitelezési változata szerint a táptalaj-komponenseket és a micéliumot magába foglaló szilárd halmazállapotú fermentációs maradékot használjuk az A—40 104 antibiotikumok kinyerésére extrakció és elkülönítés nélkül, előnyösen a víz eltávolítását követően. így például úgy járunk el, hogy az A-40 104 antibiotikumok fermentációs előállítása után fagyasztva szárítjuk a tenyészlevet és így közvetlenül keverjük a takarmány-premixbe.
A találmány szerinti eljárás egy következő előnyös kivitelezési változata szerint az A-40 104 antibiotikumok fermentációs előállítása után elkülönítjük a micéliumot, majd fagyasztva szárítjuk a szűrt tenyészlevet, és az így kapott A-40 104 antibiotikum-komplexet tartalmazó terméket közvetlenül a takarmány-premixhez keverjük.
Az A-40 104 antibiotikumok termelése, izolálása és az egyes antibiotikum-komponensek elkülönítése során a termelést és az elkülönítési folyamatot előnyösen kromatográfiás méréssel követjük. A mérést például szilikagél vékonyrétegkromatográfiával, oldószerelegyként kloroform és metanol 9 :1 arányú elegyét és bioindikátorként Micrococcus luteus mikroorganizmust használva végezzük.
A következőkben az A-40 104 antibiotikumok aktivitását ismertetjük.
Az A-40 104 antibiotikum-komplex és az A-40 104 A és B komponensek bizonyos patogén mikroorganizmusok, különösen a Gram-pozitív festődésü baktériumok növekedését gátolja. Különösen előnyös baktériumellenes vegyület az A-40 104 A. Az A-40 104 A komponens legkisebb növekedésgátló koncentrációit kiválasztott baktériumokkal szemben meghatároztuk, a sztenderd agarhígításos vizsgálattal kapott eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg.
Jelentős tulajdonsága az A-40 104 antibiotikumoknak, hogy más antibiotikumokra rezisztens mikroorganizmusok növekedését gátolják. A 4. táblázatban összefoglaljuk a sztenderd papírkorong-lemez-méréssel az A-40 104 A és B komponensekkel kiválasztott mikroorganizmusokkal szemben kapott eredmé9
3.táblázat
Vizsgált mikroorganizmus Legkisebb növekedésgátló koncentráció (pg/ml) A-40 104 A
Staphylococcus aureus 3055 <0,5
Staphylococcus aureus 3074 <0,5
Streptococcus faecalis <0,5
Bordetella bronchiseptica <0,5
nyékét. Az aktivitást a gátlási zóna milliméterben mért nagyságával jellemezzük. A használt papírkorong átmérője 6,35 mm.
4.táblázat
Vizsgált mikroorganizmus Koncentráció pg/korong A gátlási zóna átmérője mm-ben
A-40 104 A komponens A-40 104 B komponens
Staphylococcus aureus 3055' 100 31,2 27,1
Staphylococcus aureus 30551 10 27,2 18,9
Staphylococcus aureus 30742 100 29,2 25,4
Staphylococcus aureus 30742 10 25,4 13,5
Staphylococcus aureus 31303 100 34,0 29,5
Staphylococcus aureus 31303 10 29,2 19,0
Streptococcus pyogenes4 100 27,0 23,0
Streptococcus pyogenes4 10 21,0 19,0
Streptococcus sp.99605 100 8,7 0
Streptococcus sp.99605 10 0 0
Diplococcus pneumoniae 100 20,0 17,0
Diplococcus pneumoniae 10 14,0 12,0
1 Penicillin G érzékeny 2 Penicillin G rezisztens 3 Methicillin rezisztens 4 A csoport s D csoport
Az 5. táblázatban megadjuk az in vitro gradiens agarhigításos módszerrel kapott vizsgálatok eredményeit, amely vizsgálatokban az A-40 104 A komponenst és az ampicillint hasonlítottuk össze.
5.táblázat
Vizsgált mikroorganizmus Legkisebb növekedésgátló koncentráció (pg/ml)
A-40 104 A komponens Ampicillin
Streptococcus pyogenes <0,01 <0,01
Streptococcus sp. X-66
(D csoport) 0,5 0,8
Streptococcus sp. 9960
(D csoport) 70 0,6
Neisseria gonorrhea 0,5 0,5
Neisseria gonorrhea Sand. 0,07 0,07
Neisseria gonorrhea Lind. 0,5 0,5
Hemophilus influenzáé Brun1 2 0,5
Hemophilus influenzáé Dick.1 2 0,5
Hemophilus influenzáé Laic.1 4 0,5
Hemophilus influenzáé 2512 0,7 70
Hemophilus influenzáé 2592 0,7 70
Hemophilus influenzáé 2602 0,7 70
1 Penicillin G érzékeny 2 Penicillin G rezisztens
Az A-40 104 A komponens és a 19,20-dihidro-A 40 104 A komponens (dihidro-A-40 104 A) in vivő baktériumellenes aktivitást mutat kísérletes baktérium fertőzésekkel szemben. A vizsgált vegyületeket két dózisban adtuk fertőzött egereknek és a megfigyelt aktivitást EDS0-értékben adjuk meg (EDS0: mg/kg-ban megadott hatásos dózis, amely a vizsgált állatok 50%-át védi, lásd Wick és munkatársai, J. Bacteriol, 81,233-235, 1961). A megfigyelt ED50-értékeket a 6. és 7. táblázatban adjuk meg.
Az A—40 104 antibiotikumok több anaerob baktérium növekedését is gátolják. A 8. táblázatban megadjuk a sztenderd agarhigításos módszerrel mért A -40 104 A komponens aktivitásokat.
A találmány szerinti A-40 104 antibiotikumok különösen előnyös tulajdonsága, hogy viszonylag nem toxikusak. így például az A-40 104 A komponens és ennek tetraacetil-származékának LDS0-értéke egerekben intraperitoneális injekcióval adva nagyobb, mint 300 mg/testsúlykilogramm.
A találmány szerinti A-40 104 antibiotikumok másik különösen fontos tulajdonsága, hogy Mycoplasma ellen hatékonyak. A Mycoplasma fajok patogének emberre és különböző állatokra. A Mycoplasma ellen aktív vegyületek különösen előnyösen használhatók fel a baromfiak, a sertések és a szarvasmarhák Mycoplasma okozta megbetegedéseinek megelőzésére.
A 9. táblázatban megadjuk az A-40 104 A komponens, a 19,20-dihidro-A-30 104 A komponens és az A-40 104 A komponens tetraacetil-származékának legkisebb növekedésgátló koncentrációit különböző Mycoplasma fajokkal szemben. A mérést in vitro végeztük folyékony halmazállapotú táptalajban, hígítási sorban.
19464
6.táblázat
Az Λ -40 104 A komponens aktivitása
Vizsgált mikroorganizmus Adagolás módja EDSo x2 Fertőzés mértéke
Staphylococcus aureus 3055 szubkután 15,7 1260 x LD5o (intraperitoneálisan)
Streptococcus pyogenes C203 szubkután 3,6 195 x LDS0 (intraperitoneálisan)
Streptococcus pneumoniae Park I szubkután 21,5 1280 x LD50 (intraperitoneálisan)
7. táblázat
A dihidro-A-40 104 A aktivitása
Vizsgált mikroorganizmus Adagolás módja ED50 x 2 Fertőzés mértéke
Staphylococcus aureus 3055 szubkután <4,4 69,5 x LD5 o (intraperitoneálisan)
Staphylococcus aureus 3055 orálisan 28 3400 x LD5 o (intraperitoneálisan)
Staphylococcus aureus 3055 orálisan 27 500 x LD50 (intraperitoneálisan)
Streptococcus pyogenes C203 szubkután 5,8 1690 x LD5 0 (intraperitoneálisan)
Streptococcus pneumoniae BI-343 szubkután 35 30 x LDS0 (intraperitoneálisan)
Streptococcus pneumoniae BI-492 szubkután 15,2 340 x LD5 o (intraperitoneálisan)
8. táblázat
Vizsgált mikroorganizmus i Legkisebb rövekedésgátló koncentráció (hg/ml)1
Actinomyces israelii <0,5
Clostridium perfringens 8
Clostridium septicum 8
Eubacterium aerofaciens 16
Peptococcus asaccharolyticus <0,5
Peptococcus prevoti <0,5
Peptostreptococcus anaerobius 2
Peptostreptococcus intermedius <0,5
Bacteroides fragilis 111 8
Bacteroides fragilis 1877 8
Bacteroides fragilis 1936B 8
Bacteroides thetaiotaomicron 2
Bacteroides melaninogenicus 1856/28 4
Bacteroides melaninogenicus 2736 4
Bacteroides vulgatis 4
Bacteroides corrodens 8
Fusobacterium symbiosum 4
Fusobacterium necrophorum <0,5
1A legkisebb növekedésgátló koncentrációt agarhigításos módszerrel határoztuk meg. Az eredményeket az inkubáció 24. órájában olvastuk le.
9.táblázat
40 Vizsgált mikroorganizmus A-40 104 A komponens Dihidro-A-40 104 A Tetraacetil- A-40 104 A
Mycoplasma
gallisepticum Mycoplasma <0,78 0,195 12,5
45 synoviae Mycoplasma <0,78 0,195 50,0
hyorhinis Mycoplasma 1,56 0,195 25,0
50 hyopheumoniae 0,195 0,097 12,5
A találmány szerinti eljárással előállított A-40
104 antibiotikumokat előnyösen használhatjuk fel a 55 sertés dizentéria kezelésére, Brown és munkatársai a
041 175 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetik, hogy a pleuromutilin hatásos a sertés dizentéria kezelésekor. Úgy találtuk, hogy a találmány szerinti A—40 104 antibiotikumok szintén 60 aktívak a sertés dizentériát okozó Treponema hyodysenteriae-vel szemben. A vegyületek aktivitását in vitro méréssel határoztuk meg, oly módon, hogy 50, 5,0, 0,5 és 0,05 Mg/ml antibiotikumot adtunk 5% defibrinált borjúvért tartalmazó pepton-agar (trypticase) 65 lemezekhez. Az agar felületét ΙΟχ-en hígított Trepo néma hyodysenteriae szuszpenzió 0,1 ml-ével oltottuk. A lemezeket anaerob körülmények között inkubáltuk 4 napon át, majd meghatároztuk a hemolitikus treponema növekedését vagy a növekedés hiányát. A vizsgálat szerint az A-40 104 A komponens és a 5
19,20-dihidro-A40 104 A 50, 5,0 és 0,5 gg/ml agar koncentrációban gátolja a Treponema hyodysenteriae növekedését.
A sertés dizentéria kezelésekor az A-40 104 antibiotikumokat orálisan adjuk a fertőzött sertéseknek, 10 tabletta, kapszula, por alakú készítmény vagy hasonlók alakjában. Előállíthatunk semleges összetevőt és aktív összetevőként A-40 104 antibiotikumot tartalmazó állatorvosi készítményt. Az adagolást előnyösen úgy végezzük, hogy az A-40 104 antibiotikumot a 15 sertés takarmányában adagoljuk.
A találmány szerinti A-40 104 antibiotikumok további állatorvosi szempontból felhasználható tulajdonsága, hogy aktívak a Pasteurella fajokkal szemben. A Pasteurella multicoda például a szarvasmarhák, a 20 baromfiak és a sertések légúti fertőzéseinek okozója. A Pasteurella hemolytiea elsősorban felelős a szarvasmarhák légúti fertőzéseiért. Az A-40 104 A és ennek dihidro-származékának aktivitását Pasteurella mikroorganizmusokkal szemben in vitro méréssel határoz- 25 tűk meg. Az eredményeket a 10. táblázatban adjuk meg.
10.táblázat
Vizsgált A-40 104 Dihidro-
mikroorganizmus A komponens -A-40 104 A
Pasteurella
multicoda (borjú) 6,25 6,25
Pasteurella
multicoda (pulyka) 12,5 12,5
Pasteurella
hemolytiea 25,0 163
Érzékeny patogén mikroorganizmusokkal fertőzött ember kezelésére használható gyógyszerészeti 45 készítmény előállítására semleges összetevőt és A-40 104 antibiotikumot, mint aktív összetevőt keverünk.
A találmány szerinti A-40 104 antibiotikumok másik fontos tulajdonsága, hogy aktívak Spiroplasma 50 fajokkal szemben. A spiroplasma citri a citrusfajok megbetegedését, más Spiroplasma fajok, például a kukorica satnya növekedését okozzák. Az A-40 104 A komponens és ennek dihidro-származéka in vitro vizsgálatok szerint 0,01 rész/millió rész koncentrációban 55 gátolja a Spiroplasma citri növekedését.
Az A-40 104 antibiotikumok aktívak növényi patogénekkel szemben. Az A-40 104 A komponens levelekre permetezve vagy a talajba juttatva gátolja a lisztharmatot. Az A-40 104 A komponens 100 60 rész/millió rész mennyiségben a szántóföldbe juttatva gátolja a bab és az árpa lisztharmat okozta megbetegedését, ami a vegyület szisztémás aktivitására utal. Ezen antibiotikumok szisztémás aktivitását különösen előnyösen használhatjuk fel a növényi patogén 65 mikroorganizmusok vagy a Spiroplasma fajok gátlására.
A találmány szerinti eljárást a következőkben példákkal részletesen szemléltetjük.
1. példa
A. Az A-40 104 előállítása rázott tenyészetben
A Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 törzs érett agar tenyészetéről steril tű segítségével steril körülmények között az alábbi összetételű ferdeagart oltjuk:
szacharóz melasz kukoricalekvár malátaki vonat dikálium-hidrogén-foszfát enzimesen hidrolizált kazein3 mosott agar ionmentes víz g
g
6g g
2g g
g literre feltöltve aN-Z kazein, Humko Sheffield, Norwich, New York
A beoltott ferdeagart 30 °C hőmérsékleten 14 napon át inkubáljuk. Az érett agartenyészet körülbelül 5 cm2-es felszínéről steril tű segítségével lekaparjuk a micéliumot, és 50 ml, az alábbiakban megadott összetételű vegetatív táptalajt oltunk vele:
glükóz tápióka dextrin3 szója-hidrolizátum (por alakü)b ipari élesztőfrakció' csapvíz g
g lOg g
literre feltöltve.
A táptalaj pH-ja 5,3, amit 5N nátriumhidroxiddal 6,9-re állítunk be.
“Stabex 11, A.E. Staley, Decatur, 111. USA.
bHySoy T,Humko Sheffield, Norwich, New York. cAmber BYF 300, Amber Laboratories, Juneau,
Wisc., USA.
A beoltott vegetatív táptalajt 250 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban 25 °C hőmérsékleten 96 órán át percenként körülbelül 5 cm kitéréssel 250-et forduló rázóasztalon inkubáljuk.
Ezzel a vegetatív tenyészettel közvetlenül oltjuk a második vegetatív táptalajt. Előnyösen azonban későbbi használatra tároljuk a tenyészetet folyékony nitrogén feletti gázfázisban. Ilyen tárolásra a tenyészetet az alábbiak szerint kistérfogatú ampullákba osztjuk szét. Mindegyik ampullába 4 ml kinőtt vegetatív tenyészetet és 2 ml glicerin-laktóz oldatot teszünk. A glicerin-laktóz oldat összetétele a következő:
glicerin laktóz ionmentes víz
300 g
150 g literre feltöltve
Az így előállított szuszpenziókat folyékony nitrogén gázfázisában tartjuk.
19464
Az igy előállított 1 ml térfogatú tárolt szuszpenzióval 50 ml, az előzőekben megadott összetételű vegetatív táptalajt oltunk. A beoltott első vegetatív tenyészetet 250 ml térfogatú szélesszájú Erlenmeyer-lombikokban inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten 4 na- 5 pon át olyan rázóasztalon, amely körülbelül 5 cm átmérő mentén percenként 250-et fordul.
B. Tankfermentáció
Nagytérfogatú inokulum előállítására 10 ml fentiek szerint előállított vegetatív tenyészettel 400 ml második vegetatív táptalajt oltunk, amelynek összetétele az első vegetatív táptalaj összetételével azonos. Ezt a második vegetatív tenyészetet 2 liter térfogatú 15 szélesszájú Erlenmeyer-lombikokban 25 °C hőmérsékleten 48 órán át inkubáljuk olyan rázóasztalon, amely körülbelül 5 cm-es kitéréssel percenként 250-et fordul.
A fentiek szerint előállított kinőtt második vegeta- 20
tiv tenyészet 800 ml-ével 100 liter alábbi összetételű
steril táptalajt oltunk:
glükóz 1,5% '
glicerin 0,5% 25
tápióka dextrin 3%
szárított kutyaeledel3 2,5%
élesztőkivonat 0,5%
káliumklorid 0,1%
niagnéziumszulfát x 7H2O 0,05% 30
vas(ll)-szulfát x 7H2O 0,01%
mangán-klorid x 4H2O 0,005%
cink-szulfát x 7H2O 0,005%
kalcium-karbonát 0,01%
ionmentes víz. 35
A táptalaj pH-ját 4N hidrogénkloriddal 5,0-re állítjuk be.
3Purina Dog Cow, Raispon Purina Co., St. Louis, Mo.,
188. 40
A beoltott termelő táptalajt 165 literes fermentorban 30 °C hőmérsékleten 12 napon át fermentáljuk. A tenyészeten annyi steril levegőt vezetünk át, hogy az oldott oxigén koncentrációja a maximum 45 80%-át érje el.
2. példa
Az 1. példa szerinti fermentációt végezzük el, vegetatív táptalajként azonban az alábbi összetételű táptalajt használjuk:
dextróz 9,5% galaktóz ^,5% glicerin 9,5% oltható keményítő 0.5% élesztőkivonat 0,2% szárított kutyaeledel3 0,5% szójababolaj 0,2% kukoricaolaj 0,2% kálium-dihidrogén-foszfát 0,3% magnézium-szulfát x 7HjO 0,05% vas(II)-szulfát x 7H2O 0,01%
CaCO3 kalcium-karbonát 0,1% mangán-klorid x 4H2 O 0,005% cink-szulfát x 7H2O 0,005% ionmentes víz 3Purina Dog Cow.
A táptalaj pH-ja 5,7, amit 4N hidrogénkloriddal 5,0-re állítunk be.
3. példa
Az 1. példában megadottak szerint fermentálunk.
főfermentációs táptalajként azonban az alábbi összetételű táptalajt használjuk:
glükóz 5,0%
szójababdara 0,75%
magnézium-szulfát x 7H2 O 0,1%
kalcium-karbonát 0,2%
ionmentes víz.
A táptalaj pH-ja 7,4, amit 4N hidrogénkloriddal 6,5-re állítunk be.
4. példa
Az A-40 104 A és C komponensek elkülönítése
5450 liter, a 3. példában megadottak szerint előállított teljes fermentlevet szűrési segédanyag jelenlétében (Hyflo Super-cel, diatomaföld, Johns-Manvilié Probicts Corp., USA) szűrünk, szűrletként 3640 liter oldatot kapunk. Ionmentes vízzel mossuk a szűrési maradékként kapott micéliumot, amikor további 1820 liter szűrletet kapunk. Az 5460 liter térfogatú egyesített szűrletet a szűrlet pH-ján 0,5 térfogat toluollal egy órán át extraháljuk, ami után 2500 liter toluolos extraktumot kapunk. Ez a toluolos extraktum elsősorban az A-40 104 C komponenst fpleuromutilin) tartalmazza. Körülbelül 23 literre töményítjük a toluolos extraktumot. Ekkor 1943 g A-40 104 C komponens kristályosodik ki, amit szűréssel elkülönítünk. 8 liter térfogatra töményítjük az anyalúgot. Ebből további 282 g C komponens különül el. Ismét sűrítjük az anyalúgot, a 6 liternyi sűrítményből 4 °C-ra való hűtést és 72 órán át történő tárolást követően további 158 g C komponens különül el. Az ezután megmaradó anyalúgot viszkózus olajos desztillációs maradékig sűrítjük, amit 6 liter dietiléterben oldunk. Az oldatot 72 órán át 4 °C hőmérsékleten tartjuk, ami után további 112 g A-40 104 C komponenshez jutunk.
A toluolos extrakció után visszamaradt vizes oldatot 0,5 térfogat kloroformmal extraháljuk egy órán át. Az elkülönített kloroformos oldatot körülbelül 10 Éterre sűrítjük, és 72 órán át 4 °C hőmérsékleten tartjuk. Az oldatból kivált kristályokat szűréssel elkülönítjük és szárítjuk, ami után 588 g A-40 104 A komponenst kapunk.
5. példa
Az A-40 104 antibiotikum-komplex és a
B komponens elkülönítése
214 liter az 1. példában megadottak szerint előállíott teljes tenyészlevet szűrési segédanyag jelenlétben szűrünk, amikor 119 liter szürletet kapunk. A jzűrési maradékként kapott micéliumot vízzel mossuk, majd az így kapott 80 liter szűrletet egyesítjük az eredeti szűrlettel. A 199 liter térfogatú egyesített szűrletet a szűrlet pH-ján 80-80 liter etilacetáttal extraháljuk. Egyesítjük az etilacetátos extraktumokat, és csökkentett nyomáson körülbelül 2 liter térfogatra töményítjük. Az aktív antibiotikum-komplex kicsapására körülbelül 20 liter hexánt adunk az oldathoz. Szűréssel elkülönítjük a kivált antibiotikum-komplexet, majd körülbelül 300 ml etilacetátban újra feloldjuk, és hexánnal újra kicsapjuk. Hexánnal mossuk az elkülönített csapadékot, majd szárijuk, ami után A, B és C komponenseket tartalmazó 27,3 g A-40 104 antibiotikum-komplexet kapunk.
g így előállított komplexet 40 ml kloroformban oldunk. Szűrjük a kloroformos oldatot, a szűrletet nyitott 5,6x28 cm átmérőjű üvegoszlopban szilikagélen (Woelm) kromatografáljuk. Az eredetileg kloroformmal töltött oszlopot percenként 2 ml sebességgel kloroformmal eluáljuk, miközben 20 ml térfogatú frakciókat különítünk el. A 7. frakció után kloroform cs metanol 95 : 5 arányú elegyével folytatjuk az eluálást, a 28. frakció elkülönítése után az eluálást kloroform és metanol 9 :1 arányú elegy ével folytatjuk. A 72—120. frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor 4 g súlyú száraz, por alakú terméket kapunk.
Üjabb tenyészlevet dolgozunk fel a fentiekben megadottak szerint, amikor 6 g száraz, por alakú termékhez jutunk. Egyesítjük a két terméket, a 10 g összsúlyú mintát 100 ml kloroformhoz adjuk. A kloroformban nem oldódó anyagot szűréssel elkülönítjük, ily módon 1,6 g A-40 104 A komponenst kapunk. A szűrletet nyitott üvegoszlopon 5,8 x 48 cm) szilikagélen (Woelm) kromatografáljuk. A kloroformmal készült oszlopot kloroformmal mossuk, az eluálást kloroform és metanol 97,5 : 2,5 arányú elegyével végezzük. Az eluálás sebessége 4 ml/perc, az elkülönített frakciók térfogata 20 ml. A 156-190. frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A desztillációs maradékot kevés kloroformban oldjuk, az oldathoz hexánt adunk a termék kicsapására. Szűréssel elkülönítjük a csapadékot, amikor szárítást követően 99 mg A-40 104 B komponenst kapunk.
6. példa
A 19,20-dihidro-A-40 104 A komponens előállítása
10,15 g (0,0199 M) A-40 104 A komponenst 188 ml tetrahidrofuránban oldunk. Az oldathoz 2,5 g 5% palládiumot tartalmazó szénporos katalizátort adunk. 4 órán át szobahőmérsékleten hidrogénezzük a reakcióelegyet, ezt követően celite rétegen át üvegszűrőn szűrjük. Csökkentett nyomáson desztilláljuk a szűrletet. A száraz desztillációs maradékot etilacetát és metanol 2 : 1 arányú elegyéből kikristályosítva 7,0447 g (0,01375 M) 19,20-dihiro-A-40 104 A komponenst kapunk, kitermelés: 69%.
7. példa
A l9,20-dihidro-A-40 104 B komponens előállítása
A 6. példában megadottak szerint eljárva az A-40
104 B komponenst hidrogénezzük, ami után 19,20-dihidro-A-40 104 B-t kapunk.
8. példa
A tetraacetil-A-40 104 A komponens előállítása g A40 104 A komponenst 5 ml vízmentes piridinben oldunk. Az oldathoz 5 ml ecetsavanhidridet adunk. 120 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni az igy kapott átlátszó oldatot. Ezután 20 ml metanolhoz öntjük a reakcióelegyet, majd csökkentett nyomáson addig desztilláljuk, mig a piridin és az ecetsav nyomai is eltávoznak. Desztillációs maradékként 2,1 g A 40 104 A-tetraacetil-származékot kapunk.
Az előállított vegyület forgatása: [o]jj5: -22,2° (konc.: 1,0, etanolban).
Az előállított vegyület tapasztalati képlete C3sHsoO13, molekulasúlya tömegspektrometriás mérés szerint 678,325.
Elemanalízis képletre C3SHS0O13
számított: C O 62,00%, 30,60%, Η = 7,40%,
mért: C 62,06%, H = 7,32%,
O 30,19%.
Szabadalmi igénypontok:

Claims (12)

1. Eljárás az A, B, D komponensekből és pleuromutilinből álló A-40 104 antibiotikum-keverék, az A-40 104 A komponens, a 19,20-dihidro-A-40 104 A, az A—40 104 A komponens és a 19,20-dihidro-A-40 104 A tetra-(2-6 szénatomos)-alkanoil-származékainak, az A-40 104 B komponens, a 19,20-dihidro-A-40 104 B, az A-40 104 B komponens és a
19,20-dihidro-A-40 104 B tri-(2-6 szénatomos)-alkanoil-származékainak, a pleuromutilin, továbbá az A-40 104 D antibiotikum előállítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmust, vagy ennek egy A-40 140 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között tenyésztjük, majd elkülönítjük az A-40 104 antibiotikum-keveréket a táptalajból, és kívánt esetben elkülönítjük az A-40 104 A komponenst, az A-40 104 B komponenst, a pleuromutiIjrt vagy az A-40 104 D komponenst az antibiotikum-keverékből, és kívánt esetben a 19,20-dihidro-A-40 104 A, illetve a 19,20-dihidro-A40 104 B előállítására hidrogé9 nézzük az A-40 104 A komponenst, illetve az A-40
104 B komponenst, és kívánt esetben acilezzük az A-40 104 A komponenst, a 19,20-dihidro-A-40 104 A-t, az A-40 104 B komponenst vagy a 19,20-dihidro-A40 104 B-t, amikor megkapjuk az A-40 104 A komponens vagy a
19,20-dihidro-A-40 104 A tetra-(2-6 szénatomos)-alkanoil-származékait, illetve az A-40 104 B komponens, vagy a 19,20-dihidro-AAO 104 B tri-(2—6 szénatomos)-alkanoil-származékait.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja az A, B, D komponensekből és pleuromutilinből álló A—40 104 antibiotikum-keverék előállítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmust vagy ennek egy A-40 104 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények kozott addig tenyésztjük, míg jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel a táptalajban, majd szűréssel elkülönítjük a táptalajból az A-40 104 antibiotikum-keveréket.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, az A-40 104 A komponens előállítására, azzal jellemezve, hogy
A clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmust, vagy ennek egy A—40 104 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel, majd szűréssel elkülönítjük az A-40 104 antibiotikum-keveréket a táptalajból, majd az A-40 104 A antibiotikum-keveréket toluollal, majd kloroformmal extraháljuk, és a kloroformos extraktumból kinyerjük az A-40 104 A komponenst.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, az A-40 104 B komponens előállítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmust, vagy ennek egy A-40 104 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel, majd szűréssel elkülönítjük a táptalajból az A-40 104 antibiotikum-keveréket, és az A-40 104 antibiotikum-keverék etilacetátos extraktumának kloroformos oldatából kromatográfiásan elkülönítjük az A-40 104 B komponenst.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja pleuromutilin előállítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmust, vagy ennek egy A-40 104 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel, majd szűréssel elkülönítjük az A—40 104 antibiotikum-keveréket a táptalajból, az A-40 104 antibiotikum-keveréket toluollal extraháljuk, a bekoncentrált toluolos extraktumot lehűtjük, és a pleuromutilint szűréssel elkülönítjük.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja az A-40 104 D komponens előállítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmust, vagy ennek egy A-40 104 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel, majd az A—40 104 antibiotikum-keveréket szűréssel elkülönítjük a táptalajból, és az A-40 104 D antibiotikum-komponenst szilikagélen végzett vékonyréteg-kromatográfiával, kloroform-metanol (9 : 1) rendszerben elkülönítjük az antibiotikum-keverékből.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, 19,20-dihidro-A-40 104 A antibiotikum előállítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitum NRRL 11 179 mikroorganizmust, vagy ennek egy A-40 104 antibiotikumot termelő mutánsát szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sódat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel.
majd szűréssel elkülönítjük az A-40 104 antibiotikum-keveréket a táptalajból, majd az A-40 104 antibiotikum-keveréket toluollal, majd kloroformmal extraháljuk, és a kloroformos extraktumból elkülönítjük az A-40 104 A komponenst, és
5%-os palládium-szén katalizátorral, szobahőmérsékleten hidrogénezzük az A-4O 104 A antibiotikum-komponenst.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja az A-40 104 A komponens tetra-(2- 6 szénatomos)-alkanoil-származékainak előállítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmust vagy ennek egy A—40 104 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénfonást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel,
1/9464 majd szűréssel elkülönítjük az A-40 104 antibiotikum-keveréket a táptalajból, majd az A-40 104 antibiotikum-keveréket toluollal, majd kloroformmal extraháljuk, és a kloroformos extraktumból elkülönítjük az A-40 104 A komponenst, és valamely alkánkarbonsav-anhidriddel acilezzük az A-40 104 A antibiotikum komponenst.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, a 19,20-dihidro-A-40 104 A tetra-(2-6 szénatomosj-alkanoil-származékainak előlllítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmus, vagy ennek egy A-40 104 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel, majd szűréssel elkülönítjük az A-40 104 antibiotikum-keveréket a táptalajból, majd az A-40 104 antibiotikum-keveréket toluollal, majd kloroformmal extraháljuk, és a kloroformos extraktumból elkülönítjük az A-40 104 komponenst, majd 5%-os palládium-szén katalizátorral, szobahőmérsékleten hidrogénezzük az A-40 104 A komponenst, és valamely alkánkarbonsav-anhidriddel acilezzük a
19,20-dihidro-A40 104 A-t.
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, a 19,20-dihidro-A-40 104 B előállítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmust, vagy ennek egy A-40 104 antibiotikumot termelő mutánsát szénhidrogénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, sülylyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel, majd szűréssel elkülönítjük az A-40 104 antibiotikum-keveréket a táptalajból, majd az A-40 104 antibiotikum keverék etilacetátos extraktumának kloroformos oldatából kromatográfiával elkülönítjük az A-40 104 B komponenst, és
5%-os palládium-szén katalizátorral, szobahőmérsékleten hidrogénezzük az A-40 104 B antibiotikum komponenst.
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, az A-40 104 B komponens tri-(2-6 szénatomosj-alkanoil-származékainak előállítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmust, vagy ennek egy A-40 104 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel, majd szűréssel elkülönítjük az A-40 104 antibiotikum-keveréket a táptalajból, majd az A-40 104 antibiotikum-keverék etilacetátos extraktumának kloroformos oldatából kromatográfiával elkülönítjük az A-40 104 B komponenst, és valamely alkánkarbonsav-anhidriddel acilezzük az A-40 104 B antibiotikum-komponenst.
12. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, a 19,20-dihidro-A-40 104 B tri-(2-6 szénatomosj-alkanoil-származékainak előállítására, azzal jellemezve, hogy a Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 mikroorganizmus, vagy ennek egy A-40 104 antibiotikumot termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénfonást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel, majd szűréssel elkülönítjük az A-40 104 antibiotikum-keveréket a táptalajból, majd az A-40 104 antibiotikum-keverék etilacetátos extraktumának kloroformos oldatából elkülönítjük az A—40 104 komponenst, majd 5%-os palládium-szén katalizátorral, szobahőmérsékleten hidrogénezzük az A-40 104 B komponenst, és valamely alkánkarbonsav-anhidriddel acilezzük a
19,20-dihidro-A40 104 B-t.
2 ábraoldal
A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója
83.4141 - Zrínyi Nyomda, Budapest
179464 Nemzetközi osztályozás: C 12 P 19/62, C 07 H 17/08
2/1
HU78EI824A 1977-12-08 1978-12-07 Process for preparing antibiotic a-40104 HU179464B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US05/858,505 US4129721A (en) 1977-12-08 1977-12-08 A-40104 antibiotics and process for production thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU179464B true HU179464B (en) 1982-10-28

Family

ID=25328466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU78EI824A HU179464B (en) 1977-12-08 1978-12-07 Process for preparing antibiotic a-40104

Country Status (28)

Country Link
US (1) US4129721A (hu)
EP (1) EP0002589B1 (hu)
JP (1) JPS5498701A (hu)
AR (1) AR224355A1 (hu)
AT (1) AT362060B (hu)
AU (1) AU4216378A (hu)
BE (1) BE872488A (hu)
CA (1) CA1135641A (hu)
CH (2) CH640265A5 (hu)
CS (1) CS207693B2 (hu)
DD (1) DD140477A5 (hu)
DE (1) DE2861930D1 (hu)
DK (1) DK147659C (hu)
ES (1) ES475853A1 (hu)
FI (1) FI59420C (hu)
FR (1) FR2411204A1 (hu)
GB (1) GB2009739B (hu)
GR (1) GR72460B (hu)
HU (1) HU179464B (hu)
IE (1) IE47532B1 (hu)
IL (1) IL56114A0 (hu)
IT (1) IT1100672B (hu)
LU (1) LU80617A1 (hu)
NZ (1) NZ189081A (hu)
PH (1) PH14843A (hu)
PL (1) PL211491A1 (hu)
PT (1) PT68858A (hu)
ZA (1) ZA786871B (hu)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4518691A (en) * 1982-07-14 1985-05-21 Repligen Corporation In vitro enzymatic process for preparing glucuronides of ester-containing anticholinergics
AT400674B (de) * 1991-07-24 1996-02-26 Biochemie Gmbh Pharmazeutische pleuromutilin-zubereitung
GB0218578D0 (en) * 2002-08-09 2002-09-18 Glaxo Group Ltd Novel method
TWI762573B (zh) 2017-02-10 2022-05-01 奧地利商納畢瓦治療有限責任公司 截短側耳素之純化

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3949079A (en) * 1964-04-17 1976-04-06 Biochemie Ges.M.B.H. Antibiotic derivatives
DE1249657B (hu) * 1964-04-17

Also Published As

Publication number Publication date
LU80617A1 (fr) 1979-05-16
IE782420L (en) 1979-06-08
JPS5498701A (en) 1979-08-03
IT7830656A0 (it) 1978-12-06
FI783708A (fi) 1979-06-09
PL211491A1 (hu) 1980-02-25
FR2411204A1 (fr) 1979-07-06
IT1100672B (it) 1985-09-28
IL56114A0 (en) 1979-03-12
CS207693B2 (en) 1981-08-31
CH640265A5 (fr) 1983-12-30
US4129721A (en) 1978-12-12
BE872488A (fr) 1979-06-05
DK539178A (da) 1979-07-03
FI59420B (fi) 1981-04-30
AU4216378A (en) 1979-06-14
DD140477A5 (de) 1980-03-05
DK147659B (da) 1984-11-05
ATA871478A (de) 1980-09-15
PT68858A (en) 1979-01-01
NZ189081A (en) 1982-03-23
GB2009739B (en) 1982-06-30
AR224355A1 (es) 1981-11-30
FR2411204B1 (hu) 1981-06-26
DK147659C (da) 1985-04-29
FI59420C (fi) 1981-08-10
IE47532B1 (en) 1984-04-18
AT362060B (de) 1981-04-27
EP0002589A1 (en) 1979-06-27
GB2009739A (en) 1979-06-20
DE2861930D1 (en) 1982-08-19
ES475853A1 (es) 1980-05-16
PH14843A (en) 1981-12-16
ZA786871B (en) 1980-08-27
GR72460B (hu) 1983-11-09
CH643298A5 (fr) 1984-05-30
EP0002589B1 (en) 1982-06-30
CA1135641A (en) 1982-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DD159644A5 (de) Verfahren zur herstellung von makroliden
US4161523A (en) Rosamicin esters, acid addition salts and methods for production thereof
IE46719B1 (en) Thienamycin derivatives
KR850001666B1 (ko) 마크로라이드 항생물질의 제조방법
US4359583A (en) Antibiotics TM-531 B and TM-531 C
US4247542A (en) A-40104 Antibiotics and process for production thereof
US3843784A (en) Antibiotics a201a and a201b and process for the production thereof
US4291021A (en) Novel macrolide antibiotics and preparation thereof
HU179464B (en) Process for preparing antibiotic a-40104
US4234690A (en) Method for producing rosaramicin (rosamicin)
CA1158579A (en) Antibiotic ar-5 complex, derivatives thereof and methods for production thereof
KR860001997B1 (ko) 데(미시노실옥시)틸로신 유도체의 제조방법
US4431809A (en) Antibiotic A-33853 derivatives
US4393056A (en) Antibiotics tetronolide compounds and process for production thereof
US3207750A (en) Derivatives of decoyinine
US4003902A (en) Naphthyridinomycin antibiotics
KR840001193B1 (ko) 마크로라이드 항생물질의 제조방법
KR820002138B1 (ko) A-40104 항생물질의 제조방법
JPH0150398B2 (hu)
AU609172B2 (en) Antibiotic a80577 and process for its production
US4876273A (en) Antibotic A80577 and process for its production
KR970001001B1 (ko) I-디옥시만노딜리마이신의 제법
JPS6317834B2 (hu)
KR790001594B1 (ko) 16원환(員環)마크로라이드계 항생물질의 아실화유도체의 제조방법
JPS6130558B2 (hu)

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee