DK147659B

DK147659B - Fremgangsmaade til fremstilling af en antibiotisk blanding benaevnt a-40104 eller dens komponenter a-40104 a, b og d og pleuromutilin eller dihydro- eller alkanoyl-derivater heraf

Info

Publication number: DK147659B
Application number: DK539178AA
Authority: DK
Inventors: Karl Heinz Michel; Calvin Eugene Higgens
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1977-12-08
Filing date: 1978-11-30
Publication date: 1984-11-05
Also published as: BE872488A; ATA871478A; GB2009739B; DE2861930D1; FR2411204A1; DK147659C; LU80617A1; FI783708A; IE47532B1; FI59420B; PL211491A1; PH14843A; CH640265A5; GR72460B; EP0002589B1; IT7830656A0; IL56114A0; PT68858A; DK539178A; CH643298A5

Description

i 147659

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en antibiotisk blanding benævnt A-40104, dens komponenter A-40104 faktor A, B og D samt pleuromu-tilin (A-40104 faktor C) eller 19,20-dihydro- eller tetra-5 (C2~Cg)-alkanoyl-derivater af A-40104 faktor A eller 19,20-dihydro- eller tri(C2“Cg)-alkanoyl-derivater af A-40104 faktor B, hvor A-40104 faktor A er D-xylose-acetal-deriva-tet af pleuromutilin, og A-40104 faktor A og faktor B er hidtil ukendte antibiotika, som i lighed med de øvrige forbin-10 delser, der opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er virksomme overfor gram-positive og gram-negative bakterier, anaerobe bakterier og Mycoplasma.

Antibiotiket pleuromutilin blev isoleret i 1951 af Kavanagh et al. [Proc. Natl. Acad. Soc. 37, 570-574 (1951)J.

15 Strukturen af pleuromutilin viste sig senere at vare

(jJ-COCHsOH

« /V

/3\ x\ /·'" '=? *Z 4» 6» v—J r \·/ ?\—· « X *ia

12__ii X

,/ "X

Basisk hydrolyse af pleuromutilin giver en forbindelse, der kendes under betegnelsen mutilin. Denne har følgende struktur: 2 147669

.. X

11 \/i4\ • /V \.

"VΛ1 /" \η

Der er blevet fremstillet et stort antal pleuromutilin derivater [Schweizisk patentskrift nr. 572 894 (Derwert No. 26553X); hollandsk patentskrift nr. 69 11083 (Derwert No. 40 642); Knauseder et al., U.S.A. patentskrift nr.

5 3.716.579; Egger et al., U.S.A. patentskrift nr. 3.919.290;

Brandl et al., U.S.A. patentskrift nr. 3.949.079; Riedl, U.S.A. patentskrift nr. 3.979.423, Baughn et al., U.S.A. patentskrift nr. 3.987.194; Egger et al., U.S.A. patentskrift nr. 4.032.530; K. Riedl, "Studies on Pleuromutilin 10 and Some of Its Derivatives", J. Antibiotics 29^, 132-139 (1976); H. Egger og H. Reinshagen, "New Pleuromutilin Derviatives with Enhanced Antimicrobial Activity. I.

Synthesis", J. Antibiotics 29_, 915-922 (1976) og "II. Structure-Activity Correlations", ibid., 923-927 (1976); 15 F. Knauseder og E. Brandl, "Pleuromutilins: Fermentation,

Structure and Biosynthesis", J. Antibiotics 29, 125-131 (1976); J. Drews et al., "Antimicrobial Activities of 81.723 hfu, a New Pleuromutilin Derivative", Antimicrob.

Agents and Chemotherapy T_, 507-516 (1975)].

20 Det har nu vist sig, at mikroorganismen Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 ved dyrkning danner en antibiotisk blanding benævnt A-40104 indeholdende de hidtil ukendte antibiotiske forbindelser A-40104 faktor A, B og D samt pleuromutilin. Disse faktorer har et nyttigt antibiotisk 147659 3 spektrum, som ikke blot omfatter et antal gram-positive og gram-negative bakterier og anaerobe bakterier, men også mycoplasma-organismer, hvorfor de har potentiel anvendelse til behandling af mycoplasma-fremkaldte sygdomme 5 hos fjerkræ, svin og kvæg og til behandling af svinedysen-teri, der fremkaldes af Treponema hyodysenteriae. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

10 På de medfølgende tegninger ses IR-absorptionsspektrene af A-40104 faktor A og faktor B. Fig. 1 viser spektret af A-40104 faktor A, og fig. 2 viser spektret af A-40104 faktor B.

I det følgende beskrives de fysiske og spektrale egenskaber 15 af A-40104 faktor A og B.

A-40104 faktor A

A-40104 faktor A udkrystalliserer fra chloroform og har et smeltepunkt på omkring 117-120°C. Forbindelsen har den empiriske formel C27H42®9' som kestemt ved grundstof-20 analyse, og en molekylvægt på 510 bestemt ved massespek- troskopi. Det ultraviolette absorptionsspektrum af A-40104 faktor A i trifluorethanol udviser et absorptionsmaksimum ved 284 nm (£ 32). Cirkulardicroisme-spektret af A-40104 faktor A i trifluorethanol udviser følgende maksima: 25 Δε, = +2,84 ved 200 nm Δε. = +1,72 ved 295 nm.

A-40104 faktor A har følgende specifikke rotation: -14° (£ 1,0; C2H50H).

Elektrometrisk titrering af A-40104 faktor A i 66 procent 30 vandig dimethylformamid viser, at der ikke er nogen titrer-bare grupper til stede.

147659 4

Det infrarøde absorptionsspektrum af A-40104 faktor A i fast kaliumbromid er vist på fig. 1. De mest signifikante absorp -tionsmaksima optræder ved følgende frekvenser (cm-1·): 3590, 3500, 3450 (bredt), 3280 (bredt), 2990, 2980, 5 2960, 2940, 2920, 2890, 2860, 1755, 1735, 1645, 1465, 1447, 1420, 1380, 1330, 1310, 1274, 1240, 1220, 1160, 1117, 1093, 1070, 1060, 1040, 1014, 984, 955 , 940, 921, 905, 865, 760, 742, 698, 674, 603, 530 og 442.

Forbindelsen A-40104 faktor A er opløselig i alkoholer såsom 10 methanol og ethanol, delvis opløselig i chloroform og uopløselig i vand.

På basis af de fysiske og kemiske karakteristika må det formodes, at A-40104 faktor A er β,D-xylopyranosylacetal-derivatet af pleutomutilin med følgende struktur: Γ

K°\ / \ /0H

\/'

0-COCHO

S ch\/\ / \/CHs " ]_I I 0 V /v^ ohs Ih 15 A-40104 faktor B er en hvid amorf forbindelse, som optræder som en mindre betydende faktor i den antibiotiske blanding ο 147659 5 Α-40104. Forbindelsen repræsenterer kun mellem 0,01 og 0,1 procent af aktiviteten af den antibiotiske blanding A-40104. Ved massespektroskopi har det vist sig, at A-40104 faktor B har molekylvægten 394. Ved at sammenlig-5 ne placeringen i massespektret af molekularionen og nogle af de ladede fragmenter har man fundet, at A-40104 faktor B har den empiriske formel · 211 ΐορ ved m/e 318 ^C20H30°3^ 1 massesPektret af faktor B er analog med en top ved m/e 302 i spektret for pleuromutilin, hvilket vi-10 ser, at det overskydende oxygen i faktor B befinder sig på kernen og ikke på sidekæden. Et fragment ved m/e 163 er fælles for både faktor A og pleuromutilin. En lille top ved m/e 245 (C^EL^O) i spektret for pleuromutilin forskydes til m/e 261 (°2^ i spektret for faktor B. A-40104 15 faktor B har tre hydroxylgrupper, som kan undergå acylering.

' For eksempel .danner A-40104 faktor B et triacetylderivat ved behandling med pyridin og eddikesyreanhydrid, hvilket giver en forbindelse med sammensætningen ^28^40^9 (molekylvægt 520), som viser, at den ekstra oxygen-funktion 20 i A-40104 faktor B findes i en hydroxylgruppe.

Det infrarøde absorbtionsspektrum af A-40104 faktor B i fast kaliumbromid ses på fig. 2. De mest signifikante absorptionsmaksima viser sig ved følgende frekvenser (cm"1): 3430 (bredt), 2940, 2880, 1735, 1660, 1452, 25 1385, 1375, 1305, 1280, 1233, 1152, 1094, 1020, 997, 967, 933, 912, 888, 752 og 660.

På basis af de fysiske og kemiske karakteristika må A-40104 faktor B formodes at have den følgende tilnærmede struktur: 147659 6 .η

U

ιι

Q-C-CH -OH

... \... ,f__-

9 "l/X

. /*\ / \ /CH3 (--+0H

I—L/I

Hal fc

Som det fremgår, indeholder både faktor A og faktor B en vinylgruppe, som kan reduceres ved velkendte processer, hvorved opnås de tilsvarende 19,20-dihydroderivater. Disse derivater af faktor A og faktor B er ligeledes antibak-5 terielle forbindelser.

Både A-40104 faktor A og A-40104 faktor B indeholder hydroxylgrupper, som kan acyleres ved kendte metoder (fire hydroxylgrupper i faktor A-forbindelsen og tre hydroxylgrupper i faktor B-forbindelsen). Det vil forstås, 10 at de opnåede peracylerede derivater vil have den samme (C2~Cg)-alkanoylgruppe i alle stillinger, hvor der kan foregå acylering (d.v.s. fire grupper i faktor A-forbindelsen og tre grupper i faktor B-forbindelsen). Disse peracylerede derivater er ligeledes antibakterielt virksomme.

15 De fire individuelle faktorer af A-40104-komplekset kan adskilles og identificeres ved chromatografiske metoder.

F.eks. kan faktorerne adskilles ved tyndtlagschromatogra-fi (TLC) på silicagel (Merck Darmstadt) ved anvendelse af et opløsningsmiddel-system bestående af chloroform og me-20 thanol (9:1) og Micrococcus luteus som bioindikator. De omtrentlige R^-værdier af A-40104 faktor A-D i dette system er vist i tabel I.

147659 7

TABEL I

A-40104 faktor R^-værdi A 0,21 B 0,36 5 C (pleuromutilin) 0,52 D 0,67

Faktorerne kan også adskilles ved papirchromatografi ved anvendelse af ubehandlet papir (Whatman Nr. l), et opløsningsmiddel-system bestående af vand mættet med butanol 10 samt Micrococcus luteus som detektionsorganisme. De omtrentlige Rf-værdier af A-40104 faktor A-D i dette system er anført i tabel II.

TABEL II

A-40104 faktor R^-værdi 15 A 0,64 B 0,51 C (pleuromutilin) 0,37 D 0,31

Fremstilling af det antibiotiske kompleks A-40104 20 Den stamme af Clitopilus pseudo-pinsitus, der er anvende lig til fremstilling af de omhandlede A-40104-antibiotika, er fremskaffet fra Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) i Holland. CBS-kulturen (CBS 270.36) blev klassificeret som Octojuga pseudo-pinsita. Det generiske navn 25 Clitopilus, som er synonymt med Octojuga, anvendes i denne beskrivelse til betegnelse af mikroorganismen. Denne kulturs evne til at producere antibiotika var ikke tidligere 147659 8 kendt. Dens evne til at producere A-40104-antibiotika blev påvist efter en ekstensiv sorterings-procedure.

En kultur af Clitopilus pseudo-pinsitus-stammen, der er anvendelig til fremstilling af A-40104 faktor A, B og D 5 samt pleuromutilin, opbevares hos Northern Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Department of Agricul-ture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, og indgår i den faste samling af kulturer, hvorfra den er kommercielt tilgængelig under nummeret NRRL 11179.

som det er tilfældet med andre mikroorganismer, kan også de karakteristiske træk ved den A-40104-producerende kultur Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 undertiden variere. F.eks. kan man fremstille kunstige varianter og mutanter af stammen NRRL 11179 ved at behandle denne med for-15 skellige kendte mutagener såsom ultraviolet stråling, røntgenstråling, højfrekvente bølger, radioaktive bølger og kemikalier. Alle naturligt forekommende og kunstige varianter og mutanter, som i det væsentlige har samme identificerende karakteristika som Clitopilus pseudo-pinsi-20 tus NRRL 11179, og som producerer A-40104-antibiotika, kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Dyrkningsmediet, der benyttes til dyrkning af Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179, kan udvælges blandt en række forskellige medier. Af hensyn til en økonomisk produktion, 25 et optimalt udbytte og en bekvem isolation af produkterne er der imidlertid visse dyrkningsmedier, der er særligt foretrukne, Således foretrækker man f.eks. at anvende gluco-se, tapioka-dextrin, stivelse og majsolie som carbonhydrat-kilde ved fermentering i stor målestok, selv om også glyce-30 rol, maltose, fructose og lignende kan anvendes. Andre . nyttige carbonkiler omfatter oleater, laurater og lecithin. Foretrukne nitrogenkilder omfatter soyabønnemel, formalede soyabønner eller en kombination af gær og tørt hundefoder.

147659 9

Andre acceptable nitrogenkilder omfatter gær, bomuldsfrømel, jordnøddemel og tørt hundefoder. Selv om nærende uorganiske salte ikke er væsentlige for dyrkningen og den antibiotiske produktion, kan man tilsætte opløselige salte, 5 der f.eks. kan danne natrium-, magnesium-, calcium-, ammonium-, chlorid-, carbonat-, sulfat- eller nitrationer. Eksempelvis vil en tilsætning af 0,05% MgSO^^HgO og 0,2% CaCO^ til mediet forøge den antibiotiske produktion.

Nødvendige sporelementer til dyrkning og udvikling af or-10 ganismen bør være til stede i dyrkningsmediet. Sådanne sporelementer optræder ofte som urenheder i andre bestanddele af mediet i mængder, der er tilstrækkeligt store til at imødekomme mikroorganismens krav.

Det kan være nødvendigt at sætte små mængder (af størrel-15 sesordenen 0,2 ml pr. 1) af et anti-skummiddel, såsom po- lypropylenglycol, til mediet ved fermentering i stor målestok, hvor skumning kan være et problem.

Ved fremstilling af større mængder A-40104-antibiotika foretrækkes neddykket aerob fermentering i tanké. Mindre 20 mængder A-40104-antibiotika kan opnås ved dyrkning i ryste flasker. På grund af den tidsforsinkelse i den antibiotiske produktion, der normalt er forbundet med podning af store tanke med små mængder af kulturen, foretrækkes det at anvende et vegetativt podestof, der indeholder større mæng-25 der celler i en tilstand af aktiv vækst. Det vegetative podestof fremstilles ved at pode et lille volumen af dyrkningsmediet med myceliske fragmenter af organismen til opnåelse af en frisk, aktivt voksende kultur af organismen.

Derefter overføres det vegetative podestof til en større 30 tank. Mediet, der benyttes til dyrkning af det vegetative podestof, kan være det samme medium, som benyttes til selve fermenteringen, men andre medier kan ligeledes benyttes.

147659 10

Den A-40104-producerende Clitopilus pseudo-pinsitus-stam-me kan dyrkes ved temperaturer på mellem 20 og 33 °C.

Den optimale produktion af A-40104 synes at indtræffe ved temperaturer på omkring 30 °C.

5 Som det er normalt ved dyrkningsprocesser under neddykke de aerobe forhold, blæses steril luft igennem det omrørte dyrkningsmedium. Til opnåelse af en effektiv vækst af organismen bør der foregå en luftgennemblæsning og omrystning, der er tilstrækkelig til at opretholde et niveau af 10 opløst oxygen, der er så tæt på 80% som muligt. Lavere niveauer af opløst osygen nedsætter produktionen af både faktor A og faktor C, men indvirkningen på faktor A er mest udtalt. I løbet af fermenteringen produceres først A-40104 faktor C og derefter A-40104 faktor A. Den foretrukne in-15 kubationsperiode ved produktionen af A-40104 faktor A er derfor omkring 12 dage. Tilsætning af majsolie til mediet forøger omdannelsen af faktor C til faktor A under fennen-teringen. Under de optimale betingelser for produktion af A-40104 faktor A udgør denne forbindelse fra 70 til 90% 20 af den antibiotiske produktion.

De dannede A-40104-antibiotika kan adskilles fra fermenteringsmediet ved metoder, der normalt anvendes i fermenteringsteknikken. Den antibiotiske aktivitet, der produceres under fermenteringen, forekommer først og fremmest i 25 fermenteringsvæsken. En maksimal udvinding af de producerede A-40104-antibiotika må derfor foregå ved en kombination af metoder, der omfatter filtrering, ekstraktion af den filtrerede fermenteringsvæske samt absorptionschro-matografi. Ved en særligt foretrukken metode ekstraherer 30 man først den filtrerede væske med toluen og derefter med chloroform. A-40104 faktor C kan isoleres fra toluenekstrakten, og A-40104 faktor A kan isoleres fra chloro-formekstrakten. A-40104 faktor B, som er en mindre betydelig faktor, kan fraskilles ved absorptionschromatografi 147659 11 under rensningen af A-40104 faktor A.

Alternativt kan man anvende de faste stoffer fra dyrkningen, herunder bestanddele af medium og mycelium, til udvinding af A-40104-antibiotika. Dette kan foregå uden ekstraktion 5 eller adskillelse, men fortrinsvis efter fjernelse af vand.

F.eks. kan dyrkningsmediet, efter produktion af antibiotisk aktivitet, tørres ved lyophilisering og anvendes direkte i en foderblanding. Ved en anden metode fraskilles myceliet, hvorefter den filtrerede dyrkningsvæske kan lyo-10 philiseres til opnåelse af den antibiotiske blanding A-40104 på en form, der kan anvendes direkte i foderblandinger.

Under produktionen af A-40104-antibiotika og isolationen og adskillelsen af de individuelle antibiotiske faktorer 15 foretrækkes det, at man overvåger de enkelte processer ved chromatografiske metoder. F.eks. kan man bruge tyndt-lagschr omat ograf i ved anvendelse af et opløsningsmiddel af chloroform og methanol (9il), en silicagel-absorbent samt Micrococcus luteus som bioindikator.

20 Aktivitet af de omhandlede A-40104-antibiotika

Det antibiotiske kompleks A-40104 og de individuelle A-40104 faktorer A og B inhibérer væksten af visse patogene organismer, i særdeleshed gram-positive bakterier.

A-40104-faktor A er en særlig virksom antibakteriel for-2f bindelse. De minimale inhiberingskoncentrationer (MIC), ved hvilke A-40104 faktor A inhiberer udvalgte bakterier, bestemt ved standard agar-fortyndingsprøver, er anført i tabel III.

147659 12

TABEL III

MIC (yug/ml) A-40104

Testorganisme faktor A

Staphylococcus aureus 3055 4 0,5

Staphylococcus aureus 3074 40,5

Streptococcus faecalis 40,5

Bordetella bronchiseptica 40,5

Et væsentligt aspekt ved denne aktivitet er, at A-40104 antibiotika inhiberer væksten af organismer, som er resistente overfor andre antibiotika. I tabel IV er anført aktiviteten af A-40104 faktor A og B overfor repræsenta-5 tive organismer målt ved en såkaldt skivemetode. Aktivi teten bestemmes som diameteren (i mm) af den observerede inhiberingszone. Den anvendte skivediameter var i alle forsøg 6,35 nim.

147659 13 ✓—> 1 pq 4 οΡΗσ»4ΐηιηοοο

JLj |—{ O

ø O-P

-P -4-,¾ CV)HC\JHC\JHC\JH ω i cd S <J£h cd Ή τ3 0) ΰ o

NI

<! 4 O u H 0<MC\]C\l4OC\JOO O-p - - ------- 4¾ ΗΙ>-σιΙΛ4σιΙΝ-Η |CdCnC\IC\JC\JCnC\lC\JCVl !>

H

iJ

g ? CQ ί> <ij Ή

Eh ^jOOOOOOOO

• MOHOHOHOH O''-. i—1 H rH H

5 bl o 3 « "k

Η H C\J C\i m 14 m in 4 4 O O

in 14 14 N- C4 14

O O O O Η H

cncncncncntn44 ω ω ratQrarararaøø

333333SS

øøøøøøøø

PnPPiSH^fHbObO

33333300 cdcdcdcdcdcdj>r!>> p, p, ω ra ra ra to w Φ333333ωαι 800000033 moooqoooo •ΗΟΟΟΟΟΟΟΟ

poooooooo rooooooooo bOHrHHrHrHrH O O Pi !4 |>i ί>5 1>5 Ϊ4 r“> -P -P

O ,3 £ Æ ,3 ,3 ,3 Pi Pi -P ft ft ft ft ft ft 0 ø IQCdCdCdCdCdCtipPi

Ø-P-P-P-P-P-P-P-P

E-icacococacoMcQCQ

147659 14

I CQ

O O

fn O ^ » »

0 H O O O C"- CM

-P O-P Η H

ω -3-,¾ S i Cd

cd <J 'H

•r-i

Ti

CD

Pi o

NI

<i -P <f-

cd O P t·» O O

CQ H O ·» ·» ·> -P O -P 00 O O <t-

Ph -3,« CM H

o i cd

<P <! <P

>

H

PI 0 m i>

PQ -H

c ^i O O O O

EH · CQ O iH O rH

O"·. Η H

Pi &£ o p « "k in ιλ -p

O O 0 0 Pi -P

PQ PQ Cd cd 0 Pi cn m -ri ·Η b -p ø σ\ σ\ pi S o cq -p o o cq -η ø • •as h ø ·η

ft ft 3 3 SØM

0 CQ 0 0 'H Ph 0

Pi Pi w „ P«

0 0 0 ft ft O O

S Pi Pi I I Pi

CQOOCQCQ Sfl-H

•Η O O p P ·Η ·Η Η

PiOOOO Η Η Η <i Ω 0 Ο Ο Ο Ο Η Η ·Η W) Ο Ο Ο Ο -Η-ΗΟ00 Ρη-Ρ-ΡΟΟ Ο Ο ·Η ft ft ο ft ft ο ο ·η ·η ,ρ ο, a •Ρ 0 0 Η Η Pi Ρ -Ρ 0 Ρ 0 Ρη Ρη Ρη Ρη øØØPhPh Ø-P-P-H-H di Pi g Ο Ο EHCOCOPQ Η CM ΓΛ -3 Ά 147659 15 I tabel V vises det, at A-40104 faktor A med fordel kan sammenlignes med ampicillin. Dette vises ved en serie in vitro forsøg, hvor man anvender en agar-fortyndingsmetode (gradient-plade).

147659 16 ft! •Η HH ΙΝ •HOGOvoif\Oir\ir\mir\ Q ΛΛΛΛΛΙνΙνΛ·' •ΗΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟ Ρ V 0- C— t>-

Η S

s <3 u 5 o

H

3 „ <1" rH £">- 0 ft) o in m o m f> o- t> H O *«*·» Λ ** *

O-P OOOOOOCVjCvJ-iOOO

<1-^ «/ c- 1 CO v > m n

/-N /-N

Ω P

cd ω P> P> ,

ft ft HH

3 3 H · ·

U £ g M > CM c\j C\J

rj ϋ · · 3 O ·Η H CT\ O

O· w TiTiSHcdiAlAVO

d dPPPtM<M^

CQ vo o CD -H

Q) VD CO ΏΡΦΦΦΦΦω diere cd cd cd ctJ cd cd

(DWCTiCdCdCONNNNNN

&o øcDødPPPPP

O · .rtrlr|(D(DØCDCDCD

PiCQ ω ft) ftt ft)HHHHHH

O O O'H'HfrH'H'H'H

(DcQcQmdPPPPPPftlP S 3 3 3 o O O Η Η Η Η Η ·Η

ω o o o 60 60 taO

•HCOO 03CQC/30JMW

dOOOcdcOcd3P2PPP 3 o o οηήηΗΗΗΗΗΗ 60 O O O ft) ft) ft) ·Η ·Η ·Η ·Η -Η ·Η d-p-μ-μ Cl) ω ø ,d ,d ,3 ,3 ,3 Λ O P)p)P)M CQ CQ ft ft ft ft ft ft ΡΦΦΦΜΜΚΙΟΟΟΟΟΟ coft)ft)ft)HHHSSSSsa Φ+3+3-Ρ CD ω ωφφφφφω

EHWWCQSSSKmidKffiK

1Λ7659 17 A-40104 faktor A og 19,20-dihydro A-40104 faktor A (di-hydro-A-40104A) har vist antimikrobiel virkning in vivo overfor eksperimentelle bakterieinfektioner. Når to doser af disse forbindelser blev indgivet til mus med illustra-5 tive infektioner, måltes den observerede virkning som en ED^Q-værdi, som er den effektive dosis i mg pr. kg, der kan beskytte 50% af forsøgsdyrene (Warren Wick et al., J. Bacteriol. 8_1, 233-235 (1961). De observerede EDj-q-vaerdier for disse forbindelser er anført i tabellerne 10 VI og VII.

147659 18

✓—S /^N

ft ft ft Η Ή *rl ·Η 0 N_x V—'

CO

CQ O O O

ri in ία in

ri P ft P

-p j a j cq o tf tf tf

•H

-P

X o in o φ vo σι co

tH CM H CM

S * ·

H rH iH

CM

X is vd in o ·» ** ·»

in in tn H

g π cm •n φ >

CQ

Φ

CQ

H

Q) O O O

> CQ CQ CQ

•H

H W

> Ti ti a h

M

H

.tf ri in cti in o cu m cm o o φ m cd CQ ·Η CQ φ si

ti ti o H

φ Φ g cd ri ω 3 φ ps o φ ri cd >> ri o

ft ft -P

CQ *H

Φ pi CQ CQ p! ίπ S o ri ri 3 ω cq o o o -p ft •h o o o ri cd ri o o o ,tf ri

3 o o o & -P

&o h o o ri ri

ri >> -P -P CQ -H

° Λ3 ft ft „ -p ft φ φ ii ii CQ cd ri ri Φ -P -P -P o ft E-l CO CO CO CQ ·Η 147659 19

/-Ν s /"S /*N y—S

ft ft ft ft ft ft Η ·Η ·Η ·Η ·Η ·Η Ή Q) ν_»> '—' \_^ '—/ W Ν '

CQ

ω ο ο ο ο ο ο ρ ιρ ιρ ιλ ιλ m m ri Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ -Ρ ι-1 ι-3 ι-3 ι-l ι-1 ι-1

ri Μ Μ :Χ Μ X X

ο •Η ΙΓ\ „ „ -ρ ^ Ο Ο Ο Ο Ο ii φ Ο Ο (Γ\ tf\ 4 φ V£) <j- LT\ VO ΚΊ CH . · - ri η Η c\l <|- 00 (Μ X «· ·* Ο <1· 00 Ν ΙΛ ΙΛ ΙΛ oj <Μ m Η c •ri" Ο ·η η 5* ο >

<f CQ

| Φ <J CQ ι—I γΗ ι ι—i cd Φ Ο Φ Ο ri ri Ο Ο Ο Η ri > cq ο ο cq cq cq Η Ti Ή > b ,¾ ,Ρ ·Ό Ρ -Η £ ΐϋ τί Η Ρ C «Η Εη cd -Ρ φ ΚΊ <Μ +3 <]- σ\ - < •Η ΚΛ <t

ί> I I

•Η ΓΛ Η Η +3 ΙΛ ΙΛ 1Γ\ Ο W Μ ιη ιλ ιη <Μ a ο ο ο ο φ φ ΙΛ ΙΛ η cd cd CQ ·Η ·Η ω CQ CQ φ ri ri ri ri ri ri ο ο η φ φ Φ Φ s s 5 ri ri ri tao ri ri 2 ri ri ri o φ φ «

δ cd cd !>> ri ri R

ft ft ft ij

CQ CQ CQ _ P

CDriririWPP S-m g o o o ri ri ri $2 CQ O O O O O O -g •Ηοοοοου 3r

riOOOOOO

Cd O O O O O O 'Sh MHHHOOO 35

ri S £>> >, -Ρ -Ρ -P CQ-H

o p ,ri ,ri ft ft ft .i ri

-p p< ft ft CD <D (D il II

<D .μ .μ .μ .μ .μ .μ SS1

EHCOCOCOCOCOCO W*H

147659 20

De omhandlede A-40104-antibiotika inhlberer ligeledes væksten af en række anaerobe bakterier. I tabel VIII er vist aktiviteten af A-40104 faktor A, bestemt ved en standard agar-fortyndingstest.

5 TABEL VIII

Testorganisme MIC (nyug/ml)

Actinomyces israelii - 0,5

Clostridium perfringens 8

Clostridium septicum 8 10 Eubacterium aerofaciens 16

Peptococcus asaccharolyticus £ 0,5

Peptococcus prevoti £0,5

Peptostreptococcus 15 anaerobius 2

Peptostreptococcus intermedius £0,5

Bacteriodes fragilis 111 8

Bacteroides fragilis 1877 8 20 Bacteroides fragilis 1936B 8

Bacteroides thetaiotaomicron 2

Bacteroides melaninogenicus 1856/28 4 25 Bacteroides melaninogenicus 2756 4

Bacteroides vulgatis 4

Bacteroides corrodens 8

Fusobacterium symbiosum 4 30 Fusobacterium necrophorum £.0,5 * MIC bestemt ved agar-fortyndingsmetoden. Slutpunkter aflæses efter 24 timers inkubation.

En særlig fordel ved de omhandlede A-40104-antibiotika er, at de er relativt ikke-toxiske. F.eks. har A-40104 147659 21 faktor A og tetracetyl-derivatet af A-40104 faktor A ved intraperitoneal injektion hos mus en LD^Q-værdi, der er større end 300 mg pr. kg.

Aktivitet overfor mycoplasma er et særligt vigtigt aspekt 5 ved den antimikrobielle aktivitet af de omhandlede A-40104-antibiotika. Mycoplasma-arter er patogene overfor mennesker og forskellige dyr. Specielt til forebyggelse og behandling af mycoplasma-fremkaldte sygdomme hos fjerkræ, svin og kvæg har man brug for midler, der er 10 virksomme overfor mycoplasma. De minimale inhiberings- koncentrationer (MIC) af A-40104-faktor A, 19,20-dihydro-A-40104-faktor A og tetraacetyl-derivatet af A-40104A overfor forskellige mycoplasma-arter, bestemt ved fortyndingsforsøg in vitro, er anført i tabel IX.

147659 22 γΗ >t -Ρ ω C o<l· cdo la ο ο ια cd Η * ·> ·> *· ί)0 Ν Ο ΙΓ\ ί\Ι +><t Η ΙΑ (Μ Η

ω I

ΕΗ <J

I < 0<r ΙΑ LA ΙΑ Ι>- ffO ctv σ\ σ\ σ\ "ti Η Η Η Η Ο Ο >ίΟ ·> ·> *· *· Η Æl-d- Ο Ο Ο Ο S -Hl Q <! X <

Η LA

O Sh 00 CX) vo ΟΛ

J Η O C^- IS LA H

fV] 0 κ «\ *\ *>

CQ <1-^ O O H O

<! I ro / . i EH «aJLH ^ ø Φ ri cd o ·Η Ή ri

P> CQ O

ft <D H ø cd cd ri ri

CQ -ri -H CD

•H > Λ ri H O U ft

H ri O O

<D cd IS >i t»> 0 60 CQ £ £

CQ

H cd cd cd cd ri S 0 0 0

cd CQ CQ CQ CQ

W) cd cd cd cd ft Γ—ί Γ—l T—4 Γ—Ϊ O ft ft ft ft

-P O O O O

CQ O O O O

® ,£> Ε·ί ft ft ft ft 147659 23 A-40104-antibiotika kan anvendes til behandling af svine-dysenteri. Som beskrevet i USA-patentskrift nr. 4 041 175 er pleuromutilin virksomt ved behandlingen af svinedysen-teri. Det har nu vist sig, at de øvrige omhandlede A-40104-5 antibiotika også er virksomme overfor Treponema hyodysen-teriae, som er den mikroorganisme, der oftest forbindes med svinedysenteri. Virkningen blev bestemt ved et forsøg in vitro, ved hvilket man inkorporerede forbindelsen i koncentrationer på 50, 5,0 og 0,5 og 0,05^.ug/ml i tryp-10 ticasesoja-agarplader indeholdende 5% defibreret okseblod. Agaroverfladen blev podet med 0,1 ml af en 10 gange fortyndet suspension af Treponema hyodysenteriae. Pladerne blev inkuberet under anaerobe forhold i fire dage og derefter vurderet med hensyn til en eventuel vækst af hæmo-15 lytisk treponema. Det viste sig, at A-40104 faktor A og 19,20-dihydro-A40104 faktor A inhiberede væksten af Treponema hyodysenteriae ved agarkoncentrationer på 50, 5,0 og 0,5^ug/ml.

Når de omhandlede antibiotika skal anvendes til behandling 20 af svinedysenteri, kan de indgives oralt til svin, der er inficeret med sygdommen, i form af tabletter, kapsler, pulvere og lignende. Der kan således fremstilles et veterinært middel, der indeholder en inert bestanddel og som aktiv bestanddel et A-40104-antibiotikum. En særligt fore-25 trukken indgivelsesmetode er imidlertid at inkorporere antibiotiket i svinefoderet.

A-40104-antibiotika udviser også aktivitet overfor Pasteu-rella-arter. F.eks. er Pasteurella multocida ansvarlig for infektioner i åndedrætssystemet hos kvæg, fjerkræ og svin.

30 Pasteurella hemolytica er en væsentlig årsag til åndedrætssygdomme hos kvæg. Aktiviteten af A-40104 faktor A og dets dihydro-derivat overfor Pasteurella, bestemt ved standard in vitro forsøg, er anført i tabel X.

147659 24

TABEL X

MIC (/Ug/ml) A-40104 Dihydro-

Testorganisme faktor A A-40104A

5 Pasteurella multocida (okse) 6»25 6,25

Pasteurella multocida (kalkun) 12,5 12,5

Pasteurella 10 hemolytica 25,0 16,5

De omhandlede A-40104-antibiotika er også virksomme overfor plantepathogener. Således har A-40104 vist sig at være virksom overfor meldug, når forbindelsen påsprøjtes plantens blade eller hældes i jorden omkring planten. Ved for-15 søg på bønneplanter og kornsorter har det vist sig, at man kan kontrollere udbredelsen af meldug ved at vande jorden med A-40104 faktor A i en koncentration på 100 ppm, hvilket viser, at disse forbindelser har systemisk virkning. Den systemiske virkning af disse antibiotika er spe-20 cielt fordelagtigt ved kontrol af plantepathogener eller spiroplasma-arter. Spiroplasma citri er således ansvarlig for sygdomme hos citrusfrugter, mens andre spiroplasma-arter påvirker væksten af majs. In vitro forsøg har vist, at A-40104 faktor A og dets dihydro-derivat inhiberer Spiro-25 plasma citri ved indgivelse på niveauer helt ned til 0,01 ppm.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 A. Fermentering til fremstilling af A-40104 i rysteflasker 30 En moden agar-skråkultur af Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 skrabes med et sterilt instrument og overføres aseptisk til en agar-skråkultur med følgende sammensæt- 147659 25 ning:

Ingrediens Mængde

Sucrose 25 g Mørk sirup 36 g 5 Maj s ekstrakt 6 g

Maltekstrakt 10 g K2HP04 2 g

Enzymatisk hydrolyser et casein x 10 g 10 Vasket agar 25 g

Demineraliseret vand op til 1 liter x N-Z Case, Humko Sheffield, Norwich, N.Y.

Den podede skråkultur inkuberes ved ca. 30°C i omkring 15 14 dage. Derefter skrabes den modne skråkultur med et sterilt instrument, og de opnåede mycelier fra omkring p 5 m agaroverflade anvendes til podning af 50 ml af et vegetativt medium med følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde 20 Glucose 10 g

Tapioka-dextrin K 10 g

Sojahydrolysatpulver 10 g Ølgærfraktion KKK 5 g

Postevand op til 1 liter

25 pH i medium: Ca. 5>3; indstilles til pH 6,9 med 5N NaOH

x Stadex 11, A. E. Staley, Decatur, 111. xx HySoy T, Humko Sheffield, Norwich, N.Y. xxx Amber BYF300, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.

147659 26

Det podede vegetative medium inkuberes i en 250 ml Erlenmeyerkolbe Ved omkring 25°C i 96 timer på et rysteapparat,, der roterer i en cirkelbue med diameter 5,08 cm med en hastighed på 250 omdrejninger pr. minut. Dette in-5 kuberede vegetative medium kan anvendes direkte til podning af det næste vegetative medium, men fortrinsvis kan det opbevares til senere brug ved at opretholde kulturen i dampfasen af flydende nitrogen. Kulturen forberedes til en sådan opbevaring i et antal små flasker på følgende 10 måde: I hver flaske anbringes 4 ml inkuberet vegetativt medium og 2 ml af en glycerol-lactose-opløsning, der har følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde

Glycerol 300 g

Lactose 150 g

Demineraliseret vand op til 1 liter

De fremstillede suspensioner opbevares i dampfasen fra flydende nitrogen.

15 En ml af en således fremstillet, opbevaret suspension benyttes til podning af 50 ml af et første vegetativt medium, der har den samme sammensætning som tidligere beskrevet.

Dette podede første vegetative medium inkuberes i en 250 ml Erlenmeyerkolbe med stor munding ved 25°C i omkring 4 20 dage på et rysteapparat, der roterer i cirkelbevægelser med diameter 5,08 cm og en omløbshastighed på 250 omdrejninger pr, minut.

B. Tankfermentering

Med henblik på at opnå et større volumen podestof, anvendes 25 10 ml af det ovenfor beskrevne inkuberede første vegetative medium til at pode 400 ml af et andet vegetativt vækstmedium., der har samme sammensætning som det vegetative medium. Dette 147659 27 andet medium inkuberes i en 2-liter Erlenmeyerkolbe med stor munding ved 25°C i omkring 48 timer på et rysteapparat som ovenfor beskrevet.

800 ml af dette andet vegetative medium, fremstillet som 5 beskrevet ovenfor, anvendes til at pode 100 liter sterilt produktionsmedium, der har den følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde

Glucose 15 g/1.

Glycerol 5 g/1.

Tapioka-dextrin 30 g/l.

Tørt hundefoder* 25 g/l Gærekstrakt 5 g/l.

KC1 l,g/l '

MgS04*7H20 0,5 g/1

FeS04.7H20 0,1 g/1.

MnCl2.4H20 0,05 g/1.

ZnS04-7H20 0,05 g/l.

CaC03 0,1 g/1.

Demineraliseret vand op til 1 liter pH indstilles til 5>0 med 4N HC1 * Purina Dog Chow, Ralston Purina Co., St. Louis,

Mo. 63188

Det podede produktionsmedium får lov at fermentere i en 165 1 fermenteringstank ved en temperatur på omkring 30° C i ca. 12 dage. Fermenteringsmediet gennemluftes med steril 10 luft, idet man opretholder et niveau af opløst oxygen på omkring 80%.

EKSEMPEL 2

Fermenteringen gennemføres som i eksempel 1, idet man anvender et vegetativt medium med følgende sammensætning: 147659 28

Ingrediens Mængde

Dextrose 5 g/1.

Galactose 5 g/1.

Glycerol 5 g/1.

5 Opløselig stivelse 5 g/1.

Gærekstrakt 2 g/1.

Tørt hundefoder 5 g/1.

Sojabønneolie 2 g/1.

Majsolie 2 g/1.

io kh2po4 3 g/1.

MgS04.7H20 0,5 g/1.

FeS04.7H20 0,1 g/1.

CaCO^ 1,0 g/1.

MgCl2-4H20 0,05 g/1.

15 ZnS04-7H20 0,05 g/1.

Demineraliseret vand op til 1 liter

Mediets pH: omkring 5>7» justeres med 4N HC1 til pH 5,0 20 s Purina Dog Chow - EKSEMPEL 5

Fermenteringen gennemføres ved anvendelse af den i eksempel 1 beskrevne metode, idet man anvender et fermenteringsmedium med følgende sammensætning: 25 Ingrediens Mængde

Glucose 50 g/l.

Sojabønnegryn 7,5 g/1.

MgS04.7H20 1,0 g/1.

CaC03 2,0 g/1.

30 Demineraliseret vand op til 1 liter pH: omkring 7,4; justeres til pH 6,5 med 4N HC1 147659 29 EKSEMPEL 4

Isolation af A-40104 faktor A og C

En fermenterings-væske fremstillet ved metoden beskrevet i eksempel 3 blev filtreret igennem et filter (Hyflo Super- cel, en diatoméjord, Johns-Manville Products Corp.) 5 til opnåelse af 3640 liter filtrat. Den myceliske kage blev vasket med demineraliseret vand til opnåelse af yderligere 1820 liter filtrat. Det samlede filtrat (5460 1) blev ekstraheret ved fermenterings-væskens pH med toluen (1/2 volumen) i en time til opnåelse af 2500 1 toluen-10 ekstrakt. Denne ekstrakt indeholdt fortrinsvis A-40104 faktor C (pleuromutilin). Toluenekstrakten blev koncentreret til et volumen på omkring 23 1. Et første udbytte af A-40104 faktor C (1943 g) udkrystalliserede og blev opsamlet ved filtrering. Moderluden blev koncentreret til et 15 volumen på omkring 81, og et ekstra udbytte af faktor C (282 g) blev skilt fra. Moderluden blev igen koncentreret til et volumen på omkring 61, og der blev afkølet til omkring 4°C i 72 timer til opnåelse af yderligere 158 g af faktor C. Moderluden fra dette tredje udbytte blev koncen-20 treret til en tyktflydende olie. Denne blev opløst i diethyl-ether (6 1), og denne opløsnning blev afkølet til 4°C i 72 timer, hvilket gav et fjerde udbytte på 112 g af A-40104 faktor C.

Den vandige opløsning, som blev tilbage efter ekstraktionen 25 med toluen, blev yderligere ekstraheret med chloroform (l/2 volumen) i en time. Den opnåede chloroformekstrakt blev koncentreret til et volumen på omkring 10 1 og blev nedkølet til 4°C i 72 timer. De dannede krystaller blev skilt fra ved filtrering og tørret til opnåelse af 588 g 30 A-40104 faktor A.

147659 30 EKSEMPEL 5

Isolation af den antibiotiske blanding A-40104 og den individuelle faktor B

214 1 fermenteringsvæske opnået ved metoden beskrevet i ek-5 sempel 1 blev filtreret igennem et filtersystem til opnåelse af 119 1 filtrat. Den myceliske kage blev udvasket med vand, hvilket gav yderligere 80 1 filtrat. De kombinerede filtrater (199 1) blev ekstraheret to gange ved fermenteringsvæskens pH med 80 1 ethylacetat. De samlede ethylace-10 tat-ekstrakter blev koncentreret under vakuum til et volumen på omkring 2 1. Derefter blev tilsat omkring 20 1 hexan til at udfælde den aktive blanding. Den udfældede antibiotiske blanding blev skilt fra ved filtrering, genopløst i omkring 300 ml ethylacetat og genudfældet med 15 hexan. Bundfaldet blev udvasket med hexan og tørret til opnåelse af 27,3 g af det antibiotiske kompleks A-40104 (indeholdende faktorerne A, B og C).

5 g af dette kompleks blev opløst i 40 ml chloroform. Chlo-roformopløsningen blev filtreret, og filtratet blev chroma-20 tograferet gennem en åben glaskolonne (5,6 x 28 cm) over silicagel (Woelm). Kolonnen blev pakket med chloroform og elueret med chloroform ved en strømningshastighed på 20 ml pr. minut, og der opsamledes fraktioner med et volumen på 20 ml. Ved fraktion nr. 7 blev elueringsvæsken ændret til 25 en blanding af chloroform og methanol (95:5), og ved fraktion nr. 28 blev opløsningsmidlet atter ændret, denne gang til en blanding af chloroform og methanol i blandingsforholdet 9:1. Fraktionerne nr. 72 til 120 blev samlet og inddampet under vakuum til opnåelse af 4 g af et tørt pulver.

30 Yderligere fermenteringsvæske blev behandlet på samme måde, hvorved opnåedes endnu 6 g af dette materiale. Der sattes 100 ml chloroform til de samlede pulvere (10 g), og det i chloroform uopløselige materiale (1,6 g A-40104 faktor A) 147659 31 blev skilt fra ved filtrering. Filtratet blev chromatogra-feret på en åben glaskolonne (5,8 x 48 cm) over silicagel (Woelm). Kolonnen blev pakket og udvasket med chloroform og derefter elueret med en blanding af chloroform og metha-5 nol (97,5:2,5), og der opsamledes fraktioner med et volumen på 20 ml ved en flowhastighed på 4 ml pr. minut. Fraktionerne nr. 156-190 blev sammenføjet og inddampet til tørhed under vakuum. Inddampningsresten blev opløst i et lille volumen chloroform, og der sattes hexan til denne opløs-10 ning for at udfælde produktet. Bundfaldet blev skilt fra ved filtrering og tørret til opnåelse af 99 mg A-40104 faktor B.

EKSEMPEL 6

Fremstilling af 19,20-dihydro-A-40104 faktor A

15 10,15 g (0,0199 mol) antibiotisk A-40104 faktor A, opnået ifølge eksempel 4 eller 5, blev opløst i 188 ml tetrahy-drofuran, og der tilsattes 2,5 g 5% palladium på carbon.

Reaktionsblandingen blev hydrogeneret i 4 timer ved rumtemperatur og derefter filtreret igennem en glasfilter-20 tragt indeholdende et lag silicagel. Filtratet blev ind dampet til tørhed under vakuum, og inddampningsresten blev omkrystalliseret fra ethylacetat og methanol (2:1) til opnåelse af 7,0447 g (0,01375 mol, 69% udbytte) 19,20-dihydro-A-40104 faktor A.

25 Fremstilling af tetraacetyl-A-40104 faktor A

2 g A-40104 faktor A, opnået ifølge eksempel 4 eller 5, blev opløst i 5 ml tør pyridin, og der tilsattes 5 ml ed-dikesyreanhydrid. Den resulterende klare opløsning blev hensat ved rumtemperatur i 120 t. Derefter blev opløsnin-30 gen sat til 20 ml ethanol, og den resulterende opløsning blev inddampet under vakuum indtil alle spor af pyridin

Claims

147659 og eddikesyre var forsvundet, hvorved opnåedes 2, 1 g af tetraacetyl-derivatet af A-40104 faktor A. Lllf =22,2° (c 1,0, 0£Η^0Η)| empirisk formel C35H50°13 og m°lekylvægt 678,325 ved massespektrometri med 5 sammenligning af toppe. Analyse: Beregnet for C35H50013: C, 62,00, H, 7,40; 0, 30,60. Pundet: C, 62,06; H, 7,32; 0, 30,19. Patentkrav : Fremgangsmåde til fremstilling af en antibiotisk blanding 10 benævnt A-40104, dens komponenter A-40104 faktor A, B og D samt pleuromutilin eller 19,20-dihydro- eller tetra-(C^-Cg)-alkanoyl-derivater af A-40104 faktor A eller 19,20-dihydro- eller tri-(C2~Cg)-alkanoyl-derivater af A-40104 faktor B, hvor pleuromutilinet har formlen ' (jhCOCHaOH i__i I -I ! .K - / V ' 15 og hvor A-40104 faktor A er /3,D-xylopyranosylacetal-deri-vatet af pleuromutilin med formlen