FI59420B - Foerfarande foer framstaellning av en a-40104 antibiotikablandning och dess komponenter faktor a faktor b och pleuromutilin - Google Patents

Description

—1 Γ»1 kuulutusjulkaisu ” (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 594 20 C(45) Patentti myönnetty 10 OS 1931 Patent meddelat (51) Kv.ik.3/Int.ci.3 C 12 P 15/00. 19/00, C 0? H 15/18 SUOMI —FINLAND (21) Ptwnttlhakemu» — P»t«n«n*eiinlng 783708 (22) Hiktmlipllwl — Antöknlngidig 0^.12.78 ' (23) AlkupUvi—Glltlgh«tsdag ^_2 78

(41) Tullut )ulkli«k*l— Bllvlt ofTantllg nQ n/- 7Q

Patentti· ja rekisterihallitus ....... ? · .__, (44) Nthtivtkilpanon |a kuuLJulkal$un pvm. —

Patent* och registerllyiusen AntOkan utlagd och utl.skriftan publkerad ^0 0i+ 8l (32)(33)(31) Pyy*1·**/ «uolkau*—Baglrd prloritat qq 12.77 USA(US) 858505 (71) Eli Lilly and Company, 307 East McCarty Street, Indianapolis, Indiana, USA(US) (72) Karl Heinz Michel, Indianapolis, Indiana, Calvin Eugene Higgens, Indianapolis, Indiana, USA(US) (7*0 Oy Kolster Ah (5M Menetelmä A-i+OlOl antibiootti seoksen ja sen komponenttien tekijän A, tekijän B ja pleuromutiliinin tuottamiseksi-Förfarande för framställning av en A-UOlOl antibiotikablandning och dess komponenter faktor A, faktor B och pleuromutilin

Keksinnön kohteena on menetelmä sellaisen A-i*010i+-antibioottiseoksen tuottamiseksi, joka käsittää tekijät A, B ja pleuromutiliinin, ja antibiootti-tekijöiden erottamiseksi.

Antibioottikompleksia A-ä010i+, joka sisältää aktiiviset tekijät A, B ja D, tuotetaan Clitopilus pseudo-pinsituksen aerobisella submerssikäymisellä. A-l010i*:n tekijä C on antibiootti pleuromutiliini. A-t010l-tekijät A ja B ovat uusia antibiootteja, jotka ovat pleuromutiliinille läheisiä. A-U01CA:n tekijä A, jota on eniten, on pleuromutiliinin D-ksyloosiasetaalijohdannainen. A-l010l:n tekijät A ja B ovat aktiivisia gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereita, anaerobisia bakteereita ja Mycoplasmaa vastaan.

Kavanagh et ai. ^Proc. Natl. Acad. Soc. 37, 570-57^· (1951)/ eristivät pleuromutiliinia Pleurotus mutilus (Fr.) Socc.-mikro-organismista. Myöhemmin osoitettiin pleuromutiliinin rakenteen olevan seuraavan 2 59420

O-COCH^OH

0 15 /*\ !! \ ^V5V6-[ 20

• ►J-2_,i 7· II

\j/ y^c-'19 AO _U_/ 18 r ^oh 17

Pleuromutiliinin alkalinen hydrolyysi tuottaa mutiliinina tunnetun yhdisteen. Mutiliinilla on seuraava rakenne:

OH

> \/V

/'V'v x / N»

On valmistettu suuri määrä pleuromutiliinin johdannaisia; CH-patentti 572 89*+; NL-patentti 69 11083; Knauseder et ai., US-patentti 3 716 579;

Egger et ai., US-patentti 3 919 290; Brandl et ai., US-patentti 3 9*+9 079;

Riedl, US-patentti 3 979 *+23; Baughn et ai., US-patentti 3 987 19*+; Egger et ai., US-patentti U 032 530; K. Riedl, "Pleuromutiliinia ja joitakin sen johdannaisia koskevia tutkimuksia", ("Studies on Pleuromutilin and Some of Its Derivatives") J. Antibiotics ^29.» 132-139 (1976); H. Egger ja H. Reinshagen, "Uusia pleuromuti-liini-johdannaisia, joilla on lisääntynyt mikrobeja tuhoava aktiivisuus. I. Synteesi" ("New Pleuromutilin Derivatives with Enhanced Antimicrobial Activity.

3 59420 I. Synthesis"), J. Antibiotics 29, 915~922 (1976) ja "II Rakenneaktiivisuus-suhteet" ("II. Structure-Activity Correlations" ibid,, 92j-9?7 (1976); F. Knauseder ja E. Brandi, "Pleuromutiliinit: Käyminen, rakenne ja biosynteesi" ("pleuromutilins: Fermentation, Structure and Biosynthesis"). J. Antibiotics 2£, 125-131 (1976); J. Drews et al., "8l 723 hfu:n, uuden pleuromutiliinin johdannaisen mikrobeja tuhoava aktiivisuus" ("Antimicrobial Activities of 8l 723 hfu, a New Pleuromutilin Derivative") Antimicrob. Agents and Chemotherapy 7» 507~5l6 (1975)·

Nyt on löydetty kaksi antibioottia, jotka ovat antibioottien pleuromutilii-niryhmän uusia jäseniä. Lisäksi on keksitty uusi pleuromutiliinin valmistusmenetelmä.

Keksinnön avulla on mahdollista tuottaa uusia antibiootti A-bOlO^rn tekijöitä A, B ja D. Näillä tekijöillä on käyttökelpoinen antibioottinen spektri, ei ainoastaan usein gram-positiivisia ja -negatiivisia bakteereita ;sekä anaerobisia bakteereita vastaan, vaan myös Mycoplasma-organismeja vastaan. Uusien aineiden on todettu olevan tehokkaita hoidettaessa mycoplasman aiheuttamia tauteja siipikarjalla, sialla ja nautakarjalla sekä Treponema hyodysenteriaen aiheuttamaa sian punatautia.

Keksinnölle on tunnusomaista, että a) Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179-kantaa viljellään viljelyväli-aineessa, joka sisältää assimiloituvia hiilihydraattilähteitä, typpeä ja epäorgaanisia suoloja, aerobisena submerssifermentaationa kunnes on muodostunut oleellinen määrä antibioottiaktiviteettia; b) A-k0104-antibioottiseos erotetaan haluttaessa viljelyvällaineesta suodattamalla; c) antibiootti A-^OlO^-tekijä A tai pleuromutiliini haluttaessa eristetään uuttamalla b):stä saatu suodos tolueenilla ja väkevöimällä tolueeniuute, jolloin pleuromutiliini kiteytyy, tai sen jälkeen kun uutto tolueenilla on suoritettu, uuttamalla jäljelle jäänyt vesiliuos kloroformilla ja väkevöimällä kloroformiuute, jolloin antibiootti A-i+010b-tekijä A kiteytyy; tai d) antibiootti A-UoiO^-tekijä B haluttaessa eristetään uuttamalla b):stä saatu suodos ensin etyyliasetaatilla ja lisäämällä heksaania antibiootti A-U010^ tekijöiden A, B ja pleuromutiliinin saostamiseksi, liuottamalla saostuma kloroformiin ja kromatografoimalla silikageelillä käyttäen eluenttina kloroformin ja metanolin seosta,minkä jälkeen kuivatusta ja kloroformiin liuotetusta jäännöksestä erotetaan antibiootti A-i+010it-tekijä B saostamalla heksaanilla.

Seuraavien Α-^ΟΙΟ^-.η tekijöiden infrapuna-absorptiospektrit (määritetty KBr-kiteen avulla) esitetään liitteenä olevissa piirroksissa:

Kuvio 1 A-l010^ tekijä A

Kuvio 2 A-UoiOl* tekijä B

A-t010L:n tekijät A ja B ovat rakenteellisesti toistensa kaltaisia sekä antibiootti pleuromutiliinina tunnetun A-UoioU:n tekijän C kaltaisia. Tuotetta- 59420 essa fermentoinnin avulla keksinnön mukaista A-l+010l+-antibiootti-kompleksia, tuotetaan samalla ainakin neljä antibiootti-tekijää. Pleuromutiliini ja A-l+010l*:n tekijä A voidaan eristää suodatetusta viljelyliemestä sopivilla uuttamismenetel-millä. A-l+010l+:n tekijä B, jota on pieniä määriä, voidaan erottaa ja eristää kromatografisilla menetelmillä. Toinen vähäisemmässä määrässä esiintyvä tekijä, A-l+010l+:n tekijä D, voidaan erottaa kromatografisesti, mutta sitä ei ole toistaiseksi eristetty riittäviä määriä karakterisointia varten.

Seuraavissa kappaleissa kuvataan A-l+010l+:n tekijöiden A ja B fysikaalisia ja spektriominaisuuksia.

A-l+01Ql+:n tekijä A

A-l+010l+:n tekijä A kiteytyy kloroformista, ja sen sulamispiste on noin 117-120°C. A-l+OlOl* :n tekijä A:lla on empiirinen kaava alkuaineanalyysin avulla määritettynä, ja sen molekyylipaino on 510 kenttä-desorptio massaspektrometrialla määritettynä.

A-l+OlOl* :n tekijän A trifluorietanolissa määritetyn spektrin absorptio-maksimi on 2814 nmrssä (£, 32).

A-l+OlOl :n tekijä A:n trifluorietanolissa määritetyllä sirkulaarisella dikroimispektrillä on seuraavat maksimit:

Ai = + 2,81 200 nm:ssä A*.- + 1,72 295 nm:ssä A-l+OlOl* :n tekijä A:n ominaiskiertokyky on seuraava: «f —lU° (c 1,0, CgH^OH).

A-l+010l*:n tekijä A:n potentiometri sen titrauksen perusteella ei mainitussa yhdisteessä ole titrautuvia ryhmiä.

KBr-kiteen avulla määritetty A-l+OlOl* :n tekijän A infrapuna-absorptio-spektri on esitetty liitteenä olevien piirrosten kuvassa 1. Merkittävimmillä absorptiomaksimeilla on seuraavat jaksoluvut (cm ^): 3590, 3500, 3^50 (leveä), 3280 (leveä), 2990, 29Ö0, 2960, 29I+O, 2920, 2890, 2860, 1755, 1735, 16U5.1U65, 11+^7, 11+20, 1380, 1330, 1310, I27I4, 121+0, 1220, ll60, 1117, 1093, 1070, 1060, 101*0, lOlU, 98I+, 955, 9I+O, 921, 905, 865, 760, 7l+2, 698, 67I*, 603, 530 ja 1*1+2.

A-l+010l+:n tekijä A liukenee alkoholeihin, kuten esim. metanoliin ja etanoliin, se liukenee osittain kloroformiin ja on veteen liukenematon.

Fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksiensa perusteella A-l+010l+:n tekijä A:n uskotaan olevan pleuromutiliinin β,D-ksylopyranosyyli-asetaali-johdannainen, jolla on seuraava rakenne: 59420 r

H0X /\ ,'0H

t r

V

Q-COCH j f j) Ch,n / \

/\ /\ ' -T

_______/ CHcs Ih

A-40104:n tekijä B

A-40104:n tekijä B on valkoinen amorfinen yhdiste, jota on A-40104:n antibiootti-kompleksissa pieniä määriä. Se käsittää vain 0,01-0,1 % A-40104:n antibiootti-kompleksin aktiivisuudesta. Elektroni-impulssi massaspektrometrian perusteella on A-40104:n tekijä B:lle saatu molekyylipainoksi 394. Molekyyli-ionia ja joitakin osa-ioneja vastaavat piikit osoittavat, että A-40104:n tekijä B:llä on empiirinen kaava C22H34°6" B:n massaspektrissä huippu, jolla m/e:n arvo on 318 (C^gH^gO^), on analoginen pleuromutiliinin spektrin huipun kanssa, jolla m/e:n arvo on 302, jonka perusteella tekijän B lisähappi sijaitsee runkorakenteessa pikemmin kuin sivuketjussa· Fragmentti m/e 163 on yhteinen sekä tekijälle B että pleuromutiliinille. Pleuromutiliinin spektrissä sijaitseva huippu, jonka m/e:n arvo on 245 (C17H450), on siirtynyt tekijä B:n spektrissä m/e:n arvoon 261 (C17H25O2). A-40104:n tekijä B:llä on kolme hydroksyyliryhmää, jotka voidaan asyloida. Esimerkiksi A-40104:n tekijä B muodostaa tri-asetyylijohdannaisen, kun sitä käsitellään pyridiinillä ja etikka-happohydridillä, tuottaen yhdisteen, jonka koostumus on C^H^gOg (molekyylipaino 520 ), mikä osoittaa, että lisähappi on A-li010l :n tekijä B:n hydroksyyliryhmässä.

Liitteenä seuraavien piirrosten esittämässä kuviossa 2 on 6 59420 A-l*010U:n tekijä B:n infrapuna-absorptiospektri, joka on määritetty KBr-kiteella. Tärkeimmillä absorptiomaksimeilla on seuraavat taajuudet (sm 1): 3^30 (leveä), 29^0, 2880, 1735, 1660, 1U52, 1385, 13,75, 1305, 128ο, 1233, 1152, 109^, 1020, 997, 967, 933, 912, 888, 752 ja 66θ.

Fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksiensa perusteella A-U010U:n tekijä B:llä uskotaan olevan seuraavan likimääräisen rakenteen: 0

O-C-CHg-OH

: / *\ / \^/CH3 ^--ϊΟΗ i_ 1 i__!

r_L/x I

-f-- H3C oh

A-1+010 U-kompleksin neljä yksityistä tekijää voidaan erottaa ja identifioida kromatografisin menetelmin. Esimerkiksi tekijät voidaan erottaa ohutkerroskroma-tografiällä (TLC) käyttäen piihappogeeliä (Merck Darmstadt) CHCl^rCH^OH:a (9=1) liuottimena ja Micrococcus luteusta bioindikaattorina. A-l010U:n tekijöiden A-D likimääräiset Rf-arvot mainittuja olosuhteita käytettäessä on annettu taulukossa I. Taulukko I

A-I+OIOU tekijä Rf-arvo A 0,21 B 0,36 c 0,52 D 0,67

Tekijät voidaan erottaa myös paperikromatografisesti käyttämällä käsittelemätöntä paperia (Whatman n:o l), butanolilla kyllästettyä vesiliuotinta ja Micrococcus luteusta ilmaisuorganismina. A-1+0101+ :n tekijöiden A-D likimääräiset Rf-arvot tätä järjestelmää käytettäessä on annettu taulukossa II.

Taulukko II

A-1+0101* tekijä Rf-arvo A 0,61+ B 0,51 C 0,37 D 0,31 7 59420 A-*4 010*4-antibioottikompleksin valmistaminen

Keksintö koskee A-l4010*4:n antibioottikompleksin tuottamismenetelmää ja sen kautta A-H010t:n tekijöiden A ja B sekä tunnetun pleuromutiliini-antibiootin valmistusmenetelmää. Menetelmä sisältää A-*4010*4:ää tuottavan kantasienen Clitopilus pseudo-pinsituksen viljelyn aerobisena submerssikäymisenä sopivassa elatusaineessa, kunnes riittävä määrä antibioottiaktiivisuutta tuotetaan. Antibioottikompleksi ja yksityiset antibiootit saadaan käyttämällä erilaisia eristys- ja puhdistusmenetelmiä, jotka ovat yleisesti tutkimustyössä käytettyjä.

Clitopilus pseudo-pinsitus-kanta, joka on käyttökelpoinen A-k010*4-antibiootteja tuotettaessa, saatiin Alankomaissa toimivalta talletuslaitokselta the Centralbureauvoor Schiromelcultures (CBS). CBS-viljelmä (CBS 270.36) luokiteltiin Octojuga pseudo-pinsitaksi. Sukunimeä Clitopilus, joka on Octojugan synonyymi, käytetään keksinnössä organismia nimitettäessä. Octojuga pseudo-pinsitus oli väliaikainen nimi ja sen synonyymi on Clitopilus (Octojuga) pleurotelloides, jonka oikea nimi on nyttemmin Clitopilus hobsonii. Organismin kykyä tuottaa antibiootteja ei aikaisemmin tunnettu. Nyt on laajojen tutkimusten tuloksena havaittu sen kykenevän tuottamaan A-*4 010*4-antibiootteja.

Clitopilus pseudo-pinsitus-kanta, joka soveltuu A-*4010*4:n tekijöiden A ja B sekä pleuromutiliinin tuottamiseen, on talletettu kantaviljelmänä Northern Marketing and Nutrition Research Service, Peoria, Illinois 6160*4, kantaviljelmä-kokoelmaan, josta se on saatavissa numerolla NRRL 11179·

Kuten muillakin organismeilla, A-*4010*4:ää tuottavan viljelmän Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179:n ominaisuudet vaihtelevat:

Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179:än kasvattamiseen voidaan elatus-aineena käyttää useita elatusaineita. Tiettyjä elatusaineita pidetään parempina, jotta valmistaminen olisi taloudellista, saanto paras mahdollinen ja tuotteen eristäminen helppoa. Täten esim. kun käyminen suoritetaan suuressa mittakaavassa, glukoosi, tapioka-dekstriini, tärkkelys ja maissiöljy ovat suositumpia, vaikka voidaan käyttää myös glyserolia, maltoosia, fruktoosia yms. Oleaatti, lauraatti ja lesitiini ovat muita käyttökelpoisia hiilenlähteitä. Parempana pidettyjä typen lähteitä ovat karkea ja hieno soijapapujauho tai kuiva koiranruoka-hiivayhdistelmä. Muihin hyväksyttyihin typen lähteisiin sisältyy hiiva, puuvillasiemenjauho, maa-pähkinäjauho, lihapeptoni ja kuiva koiranruoka. Vaikka elatusaineen epäorgaaniset suolat eivät ole välttämättömiä kasvulle ja antibioottien tuotolle, saatetaan lisätä liukoisia suoloja, jotka tuottavat natrium-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti-, nitraatti- yms. ioneja. Esim. elatusaineeseen suoritettu 0,05 #:n lisäys MgSO^.7H20:a ja 0,2 %:n lisäys CaCO^ra nostaa antibiootin tuottoa.

Organismin kasvulle ja kehitykselle välttämättömien hivenaineiden tulisi 8 59420 sisältyä elatusaineeseen. Sellaiset hivenaineet esiintyvät yleisesti epäpuhtauksina elatusaineen muissa aineosissa tyydyttäen organismin kasvuvaatimukset.

Saattaa olla välttämätöntä lisätä pieniä määriä (esim. 0,2 ml/1) vaahtoamista estävää ainetta, kuten esim· polypropyleeniglykolia suuressa mittakaavassa suoritettavan käymisprosessin elatusaineeseen, jos vaahtoamisesta tulee ongelma.

Pidetään parempana suorittaa aerobinen submerssikäyminen säiliöissä riittävien A-l+OlOU-antibioottimäärien tuottamiseksi. Pieniä määriä A-l+OlOU-antibiootteja saatetaan saada ravistelupulloissa viljeltäessä. Koska ympättäessä suuria säiliöitä pienillä viljelmtmäärillä antibiootin tuotossa esiintyy yleisesti viiveaika, on suositeltavaa käyttää kasvavaa ymppiä, joka sisältää runsaasti aktiivisessa kasvuvaiheessa olevia soluja. Kasvava ymppi saadaan ymppäämällä pieni tilavuus elatus-ainetta organismin myseelifragmenteilla, jotta saadaan organismin aktiivisesti kasvava viljelmä. Kasvava viljelmä siirretään sitten suurempiin säiliöihin. Ympin kasvatukseen käytetty elatusaine voi olla. sama, jota käytetään suuremmassa mittakaavassa tapahtuvaan käymiseen, mutta voidaan käyttää myös muita elatusaineitä.

A-^010ii:ää tuottava Clitopilus pseudo-pin s itu s voi kasvaa lämpötiloissa, jotka ovat 20°C:n ja 33°C :n välillä. Suotuisin A-i+010^:n tuotto tapahtuu noin 30°C:n lämpötiloissa.

Kuten on tavallista, aerobisissa submerssiviljelymenetelmissä, steriili ilma puhalletaan ravistellun elatusaineen läpi. Jotta organismi kasvaisi riittävästi, ilmastuksen ja ravistelun tulee olla riittävän, jotta liuenneen hapen taso pysyy niin lähellä 80 % kuin mahdollista. Alhaisempi liuenneen hapen määrä vähentää A-k010U:n tekijöiden A:n sekä C :n tuottoa, mutta tekijää A kohtaan vaikutus on selvempi.

Käymisen kuluessa A-14010¼: n tekijää C syntyy ensin, ja A-*+010i+:n tekijä A ilmenee myöhemmin. Suositeltava inkubointiaika A-l+010U.:n tekijä A:n tuottamiseksi on sentähden noin 12 päivää. Maissiöljyn lisäys elatusaineeseen lisää tekijä C:n muuttumista tekijä A:ksi käymisen aikana. Olosuhteissa, jotka ovat suotuisat A-1+010¼ :n tekijä A:n tuottamiselle tuotetusta antibiootista, on 70-90 % tekijää A.

Aerobisen submerssikäymisen jälkeen voidaan A-i+010it-antibiootit, joita edellä on kuvattu, saada talteen elatusaineesta tunnetuilla käymismenetelmien alalla käytetyillä menetelmillä. Käymisen aikana tuotettu antibiootin aktiivisuus on pääasiallisesti viljelyliemessä. A-l+OloU-antibioottien suurin saanto saadaan siksi menetelmien yhdistelmällä, johon kuuluu suodattaminen, suodoksen uutto ja absorp-tiokromatografia. Erityisen hyvänä pidetään suodatetun viljelyliemen uuttamista ensin tolueenilla ja sitten kloroformilla. A-U01oU:n tekijä C eristetään tolueeni-uutteesta, ja A-lt010U:n tekijä A eristetään kloroformiuutteesta. A-^OlOhrn vähäisessä määrässä esiintyvä tekijä B eristetään absorptiokromatografiän avulla A-UOlOl* :n tekijä A:n puhdistuksen aikana.

Vaihtoehtoisesti viljelmän kiinteitä aineita, elatusaineen aineosat ja 9 59420 huovasto mukaan luettuina, voidaan käyttää ilman uuttoa ja erottamista, mutta mieluummin veden poiston jälkeen A-UOIOU-antibioottien lähteenä. Esim. A-^OIOU-antibioottiaktiivisuuden tuoton jälkeen elatusaine voidaan kuivata lyofilisoinnin avulla ja sekoittaa suoraan ruokaseokseen.

Toisaalta, elatusaineissa suoritetun A-i+OlOäjn aktiivisuuden tuoton ja huo-vaston erottamisen jälkeen, suodatettu viljelyliemi voidaan lyofilisoida, jotta saadaan A-1+010¼-antibioottikompleksi muodossa, jossa sitä voidaan käyttää suoraan ruokaseoksessa.

A-l+OlOU-antibioottien tuoton ja eristämisen sekä yksityisten antibiootti-tekijöiden erottamisen aikana on suotavaa valvoa tuottamis- ja eristämisprosesseja kromatografisesti. Esim. pidetään hyvänä TLC-menetelmää, jossa käytetään liuottimena CHCl^lCH^OH (9=1), piihappogeeliabsorbenttia ja Micrococcus luteusta bio-indikaattorina.

A-l+010l+-antibioottien aktiivisuus A-U010ä-antibioottikompleksi ja yksityiset A-l+OlOlt :n tekijät A ja B inhiboivat tiettyjen patogeenisten organismien, erityisesti gram-positiivisten bakteerei-den kasvua. A-l+010l+:n tekijä A on erityisen käyttökelpoinen bakteereita tuhoavana aineena. Pienimmät inhiboivat konsentraatiot (MIC:t), joilla A-UOIOU:n tekijä A inhiboi valitut bakteerit, määritettyinä normaaleilla agarlaimennuskokeilla, on esitetty yhteenvetona taulukossa III.

Taulukko III

Koeorganismi MIC (mg/ml)

A-1+010¼ tekijä A

Staphylococcus aureus 3055 <0,5

Staphylococcus aureus 307¼ <0,5

Streptococcus faecalis <0,5

Bordeteliä bronchiseptica <0,5 Tämän aktiivisuuden eräs tärkeä piirre on, että A-^010ä-antibiootit inhiboivat organismien kasvua, kun kysymyksessä ovat muita antibiootteja kohtaan resistentit organismit. Taulukossa IV on esitetty yhteenvetona A-l+010^:n tekijöiden A ja B normaalilla pyöreä—levy-menetelmällä määritetty aktiivisuus koeorganis-meja kohtaan. Aktiivisuus mitataan havaitun inhiboidun vyöhykkeen läpimittana (mm:nä)j käytetyn pyöreän levyn läpimitta on kussakin tapauksessa 6,35 mm.

59420 10

Taulukko IV

Vyöhykkeiden läpimitat (mm)

Koeorganismi kons. A—U010*+ A—*+010U

mg/levy tekijä A tekijä B

Staphylococcus aureus 30551 100 31,2 27,1

Staphylococcus aureus 30551 10 27,2 18,9

Staphylococcus aureus 307*+^ 100 29,2 25,*+

Staphylococcus aureus 307*+^ 10 25,*+ 13,5

Staphylococcus aureus 3130^ 100 3*+,0 29,5

Staphylococcus aureus 3130^ 10 29,2 19,0 1+

Streptococcus pyogenes 100 27,0 23,0

U

Streptococcus pyogenes 10 21,0 19,0

Streptococcus sp. 9960^ 100 8,7 0

Streptococcus sp. 9960^ 10 0 0

Diplococcus pneumoniae 100 20,0 17,0

Diplococcus pneumoniae 10 ll*,0 12,0 1 penisilliinin!:lle herkkä 2 .....

penisilliini-G:lie vastustuskykyinen 3 .....

met is illi mille vastustuskykyinen

*+ , ., . ryhmä A

^ryhmä D

11 59420

Taulukko V ilmaisee, että A-^010l+:n tekijä A on hyvin verrattavissa ampi-silliiniin jji vitro suoritettujen kokeiden sarjassa, jossa käytetään gradientti-agarme ne t eImää.

Taulukko V

MIC fyig/ml)

Koeorganismi A-U010U Ampisilliini

tekijä A

Streptococcys pyogenes <0,01 <0,01

Streptococcus sp. X-66 (ryhmä D) 0,5 0,8

Streptococcus sp. 9960 (ryhmä D) 70 0,6

Neisseria gonorrhea 0,5 0,5

Neisseria gonorrhea Sand. 0,07 0,07 ' Neisseria gonorrhea Lind. 0,5 0,5

Hemophilus influenzae Brun^ 2 0,5

Hemophilus influenzae Dick. 2 0,5

Hemophilus influenzae Laiv.^ U 0,5 2

Hemophilus influenzae 251 0,7 70 2

Hemophilus influenzae 259 0,7 70

Hemophilus influenzae 260^ 0,7 70 A-U010h:n tekijä A on soittanut in vivo mikrobeja tuhoavaa aktiivisuutta bakteeri-infektioita vastaan. Kun esimerkkinä olevissa infektiotapauksissa hiirelle annettiin tätä yhdistettä kaksi annosta, havaittu aktiivisuus mitattiin ED -arvona /50-¾:isesti koe-eläimiä suojaava tehokas annos ilmaistuna mg/kgj ks. Warren Vick et ai., J. Bacteriol. 81 , 233-235 (1961^7- Näille yhdisteille ha-havaitut ED^-arvot on esitetty taulukossa VI.

59420

Taulukko VI

A-lt010lt tekijä A:n aktiivisuus

Koeorganismi Annostelutapa ED^ x ^ Infektoiva koeannos

Staphylococcus aureus 3055 subkutaaninen 15,7 1,260 x LD^^ (ip)

Streptococcus pyogenes C203 subkutaaninen 3,6 195 x

Streptococcus pneumoniae

Park I subkutaaninen 21,5 1,280 x LD^-q (ip) A-lt010lt antibiootit inhiboivat myös erilaisten anaerobisten bakteereiden kasvun. Taulukossa VII esitetään yhteenvetona A-U010^:n tekijä A:n aktiivisuus normaalilla agar-laimennuskokeella määritettynä.

Taulukko VII

Koeorganismi MIC (pg/ml)1

Actinomyces israelii is 0,5

Clostridium perfringens 8

Clostridium septicum 8

Eubacterium aerofaciens l6

Peptococcus asaccharolyticus < 0,5

Peptococcus prevoti 0,5

Peptostreptococcus anaerobius 2

Peptostreptococcus intermedius £0,5

Bacteroides fragilis 111 8

Bacteroides fragilis 1877 " 6

Bacteroides fragilis 1936B 8

Bacteroides thetaiotaomicron 2

Bacteroides melaninogenicus 1856/28 ^

Bacteroides melaninogenicus 2736 it

Bacteroides vulgatis it

Bacteroides corrodens 8

Fusobacterium symbiosum it

Fusobacterium necrophorum <0,5 MIC on määritetty agar-laimennusmenetelmällä. Päätepisteet luettiin 2h tunnin inkuboinnin jälkeen.

A-lt010it-antibioottien erityisenä etuna on, että ne ovat suhteellisen myrkyttömiä. Esim. A-U010l*:n tekijä A:n LD^-arvot, kun aineet on injektoitu hiiren vatsaonteloon, ovat suuremmat kuin 300 mg/kg.

A-i>010i*-antibioottien mikrobeja tuhoavan aktiivisuuden erityisen tärkeä näkökohta on aktiivisuus mykoplasmaa kohtaan. Mykoplasma-lajit ovat ihmiselle ja 13 594 20 monenlaisille eläimille patogeenisiä. Mykoplasmaa kohtaan aktiivisia aineita tarvitaan erityisesti estettäessä ja hoidettaessa siipikarjan, sian ja nautakarjan mycoplasmaperäisiä tauteja.

A-k010k :n tekijä A:n vähimmäiset inhiboivat konsentraatiot (MIC:t) erilaisia Myrcoplasma-laj eja kohtaan, in vitro käymisliemilaimennus-tutkimuksella määritettynä, on esitetty taulukossa XIII

Taulukko XIII

Koeorganismi A-kOlOk

tekijä A

Mycoplasma gallisepticum <0,78

Mycoplasma synoviae <0,78

Mycoplasma hyorhinis 1.56

Mycoplasma hyopneumoniae 0,195

Keksinnön eräs tärkeä näkökohta on A-k010k-antibioottien käyttö sian punataudin hoidossa. Kuten W.E. Brown et ai. US-patentissa k Okl 175 ovat esittäneet, pleuromutiliini on tehokas sian punataudin hoidossa. Nyt, on havaittu, että keksinnön mukaiset A-k010k-antibiootit ovat myös aktiivisia Treponema hyodysenteriae-organismia kohtaan, joka on useimmiten kytkeytynyt sian punatautiin. Aktiivisuus määritettiin käyttämällä in yitro-koetta. johon liittyy yhdisteen käyttö tryptikaa-si soi ja -agar -levyissä 50, 5,0, 0,5 ja 0,05 pig/ml:n konsentraatioissa, levyjen sisältäessä 5 % härän verta, josta fibrinogeeni oli poistettu. Agarin pinta ympättiin 0,1 ml:11a T. hyodysenteriaen suspension laimennusta 10 1. Levyjä inkuboitiin anaerobisissa olosuhteissa neljän päivän ajan, ja ne arvioitiin hemolyyttisen treponeman kasvun suhteen. Tässä kokeessa A-k010k:n tekijä A ihhiboi T. hyodysenteriaen kasvua konsentraatioissa, jotka olivat 50, 5,0 ja 0,5 ^ig/ml agaria.

Sian punataudin hoidossa käytetään A-k010k-antibiootteja, joita voidaan antaa taudin tartuttamalle sialle suun kautta tabletin, kapselin, jauheen tai muun sellaisen muodossa, vaimistetaan inertia aineosan kanssa eläinlääketieteellinen koostumus, jossa A-k010k-antibiootti on aktiivisena aineosana. Suositumpi annostelu-tapa on kuitenkin sisällyttää A-kOlOk-antibiootit sian päivittäiseen ravintoannokseen.

Eräs toinen keksinnön eläinlääketieteellinen näkökanta on A-kOlOk-antibioottien aktiivisuus Pasteurelia-1 ajeja kohtaan. P. multocidä on esimerkiksi nautakarjan, siipikarjan ja sian hengitystieinfektion aiheuttaja. P. hemolytica on nautakarjan hengityssairauksien pääasiallinen aiheuttaja. Taulukossa IX on esitetty yhteenvetona A-kOl0k:n tekijä A:n aktiivisuus Pasteurellaa kohtaan normaaleilla in vitro kokeilla määritettynä.

114 59420

Taulukko IX

MIC (ug/ml)

Koeorganismi A-1+010&

Pasteurelia multocida (nautakarja) 6,25

Pasteurelia multocida (kalkkuna) 12,5

Pasteur elia hanolytica 25,0

Eräs keksinnön tärkeä aspekti on A-itOlOlt-antibioottien aktiivisuus Spiro-plasma-lajeja kohtaan. Spiroplasma citri aiheuttaa sitrushedelmien huonon sulavuuden; toinen Spiroplasma, maissin kitukasvuisuuden aiheuttava Spiroplasma, vaikuttaa maissin kasvuun. In vitro kokeissa, jotka on tehty Spiroplasma citritä kohtaan, A-itOlOUzn tekijä A ja sen dihydrojohdannainen inhiboivat S. citriin. kun niitä annetaan niin vähän kuin 0,01 ppm.

A-l+OlOU-antibiootit ovat aktiivisia kasvipatogeenejä kohtaan. Esimerkiksi lehdille ruiskutettuna tai maata kast el omalla annosteltuna A-UOIOU :n tekijä A on aktiivinen kuivaa viljaruostetta kohtaan. Kokeissa, jotka on suoritettu sekä pavulla että ohrakasveilla, kuiva viljaruoste on torjuttu käyttämällä A-ä010lj:n tekijä A maan kasteluun noin 100 ppm:aa, mikä osoittaa näillä yhdisteillä olevan sisäistä aktiivisuutta. Näiden antibioottien sisäinen aktiivisuus on erittäin edullista torjuttaessa kasvipatogeeneja tai Spiroplasma-lajeja.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä:

Esimerkki 1 A. A-U010^;n valmistus ravistelupullossa

Noin ll+ päivän vanhaa Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11179 :n agar-vino-pintaa raapaistaan steriilillä välineellä ja siirretään aseptisesti agar-vinopin-nalle, jolla on seuraava koostumus:

Komponentt i Määrä

Sakkaroosi 25 g

Musta melassi 36 g

Maissin liuotusneste 6 g

Mallasuut e 10 g i^HPO^ 2 g

Entsymaattisesti hydrolysoitu kaseiinix 10 g

Pesty agar 25 g

Deionisoitu vesi q.s. 1 litra XN-2 Case, Humko Sheffield, Norwich, N.Y.

Siirrostettua vinopintaa inkuboidaan noin 30°C:ssa noin it päivää, minkä jälkeen vinopintaviljelmää raapaistaan steriilillä välineellä ja liuotettua myseeliä, joka on saatu agarin pinnalta noin 5 neliösenttimetrin alalta, käytetään siirrostetta- i5 5 9 4 2 0 essa 50 ml:aa elatusainetta, jolla on seuraava koostumus:

Komponentti Määrä

Glukoosi 10 g

Tapioka dekstriinix 10 g

Soija-hydrolysaattijauhe 10 g

Olutpanimon hiivafraktio 5 g

Vesijohtovettä q.s. 1 litra

Elatusaineen pH on noin 5,3’, säädä pH 6,9:ksi 5N NaOH:lla XStades 11, A.E. Staley, Dacatur, 111.

VV ·

HySoy T, Humko Sheffield, Norwich, N.Y.

XXX

Amber BYF300, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

Siirrostettua elatusainetta inkuboidaan 250 ml:n Erienmeyer-pullossa noin 25°C:ssa 96 tunnin ajan, ravistelijassa, joka pyörii 5,1 cm:n läpimittaista kehää nopeudella 250 kierrosta/min.

Tätä inkuboitua elatusainetta saatetaan käyttää suoraan siirrostettaessa toisen vaiheen elatusainetta. Vaihtoehtoisesti ja edullisesti sitä voidaan säilyttää myöhempää käyttöä varten pitämällä viljelmää nestemäisessä typessä. Viljelmä valmistetaan sellaista säilytystä varten moniin pieniin ampulleihin seuraavasti: kuhunkin ampulliin pannaan k ml:aa inkuboitua elatusainetta ja 2 ml glyseroli-laktoosi-liuosta, jolla on seuraava koostumus:

Komponentti Määrä

Glyseroli 300 g

Laktoosi 150 g

Deionisoitu vesi cp s. 1 litra

Valmistetut suspensiot säilytetään nestemäisessä typessä.

Täten valmistettua varastoitua suspensiota (1 ml) käytetään ymppäämään 50 ml ensimmäisen vaiheen elatusainetta, jolla on sama koostumus kuin aikaisemmin kuvatulla elatusaineella. Ympätty ensimmäisen vaiheen elatusaine inkuboidaan 250 ml :n vetoisessa laajasuisessa Erienmeyer-pullossa, 25°C:ssa, noin neljän päivän ajan, käyttäen ravistelijaa, joka pyörii 5,1 cm:n läpimittaista kehää nopeudella 250 kierrosta/min.

B. Säilökäyminen

Jotta saadaan suurempi tilavuus ymppiä, käytetään 10 ml yllä kuvattua inkuboitua ensimmäisen vaiheen elatusainetta ympättäessä 1*00 ml toisen vaiheen elatus-ainetta, jolla on sama koostumus kuin ensiksimainitulla elatusaineella. Toisen vaiheen elatusainetta inkuboidaan 2 litran vetoisessa laajasuisessa Erienmeyer-pullossa, 25°C:ssa noin 2+8 tunnin ajan käyttäen ravist elijaa, joka pyörii 5,1 cm:n läpimittaista kehää nopeudella 250 kierrosta/min.

i6 59420

Inkuboitua toisen vaiheen elatusainetta (800 ml), joka on valmistettu, kuten edellä on kuvattu, käytetään ympättäessä 100 litraa steriiliä tuotantoelatus-ainetta, jolla on seuraava koostumus:

Komponentti Määrä

Glukoosi 15 g/1

Glyseroli 5 g/1

Tapioka dekstriini 30 g/1

Kuivaa koiran ruokaax 25 g/1

Hiivauutetta 5 g/1 KC1 1 g/1

MgSO^Tl^O 0,5 g/1 F eSO^·7 H^O 0,1 g/1

MnCl^Ul^O 0,05 g/1

ZnSO^-T^O 0,05 g/1

CaC03 0,1 g/1

Deionisoitua vettä q.s, 1 litra pH säädetty 5,0Jksi UN:lla HCl:lla XPurina Dog Chow, Ralston Purina Co., St. Louis, Mo 63188.

Ympätyn tuotantoelatusaineen annetaan käydä 165 litran vetoisessa käymis-astiassa, noin 30°C:n lämpötilassa noin 12 tunnin ajan. Käymiselatusaine ilmastetaan steriilillä ilmalla siten, että liuenneen hapen taso pidetään noin 80 #:ssa. Esimerkki 2 Käyminen suoritetaan, kuten esimerkissä 1, mutta käytetään elatusainetta, jolla on seuraava koostumus:

Komponentti Määrä

Dekstroosi 5 g/1

Galaktoosi 5 g/l

Glyseroli 5 g/1

Liukoinen tärkkelys 5 g/l

Hiivauute 2 g/1

Kuiva koiran ruokaX 5 g/1

Soijaöljy 2 g/1

Maissiöljy 2 g/1 KHgPOjj 3 g/1

MgSO^'THgO 0,5 g/1

FeS0u-7H20 0,1 g/1

CaC03 1,0 g/1

MgCl2-7H20 0,05 g/1 Ζηεο^.γικ,ο o,05 g/i

Deionisoitu vesi q.s. 1 litra 1T 59420

Elatusaineen pH noin 5,7# säädetty UN HCl:lla 5,0:ksi.

Purina Dog Chow

Esimerkki 3 Käyminen suoritetaan esimerkin 1 menetelmän mukaisesti, mutta käyttämällä elatusainetta, jolla on seuraava koostumus:

Komponentti Määrä

Glukoosi 50 g/1

Soijaryynit 7,5 g/1

MgSO^^O 1,0 g/1

CaC03 2,0 g/1

Deionisoitu vesi q.s. 1 litra pH on noin 7,U; säädä pH 6,5;ksi UN:lla HCl:lla.

Esimerkki U

A-UOIOU ;n tekijöiden A ja C eristäminen

Esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä saatu koko käymisliemi (5^55 1), suodatettiin suodatuksen apuaineella (Hyflo Supercel, piimää, John-Manville Products Corp. ), jolloin saatiin 3 6U0 litraa suodosta. Huovaston muodostama kakku pestiin deionoidulla vedellä, jolloin saatiin suodosta lisää 1 Ö20 litraa. Yhdistetyt suo-dokset (5U6 litraa) uutettiin käymisliemen pH:ssa tolueenilla (1/2 tilavuutta) yhden tunnin ajan, jolloin saatiin 2 500 litraa tolueeniuutetta. Tämä tolueeniuute sisälsi pääasiallisesti A-UOIOU:n tekijää C (pleuromutiliinia). Tolueeniuute konsentroitiin noin 23 litran tilavuuteen. Ensimmäinen A-l010U:n tekijän C erä (l 9^3 g) kiteytettiin ja saatiin takaisin suodattamalla. önäliuos konsentroitiin noin 8 litran tilavuuteen. Erotettiin toinen erä tekijää C (282 g). Emäliuos konsentroitiin jälleen noin 6 litran tilavuuteen, jäähdyttäen noin U°C:ssa 72 tunnin ajan, jolloin saatiin tekijää C lisää 158 g. Tämän kolmannen erän emäliuos konsentroitiin sitkeäksi öljyksi; öljy liuotettiin dietyylieetteriin (6 litraa)^ liuos jäähdytettiin U°C:een 72 tunnin ajaksi, jolloin saatiin neljäs erä (112 g) A-U010U:n tekijää C.

Vesiliuos, joka jäi jäljelle tolueenilla suoritetun uuton jälkeen, uutettiin edelleen kloroformilla (1/2 tilavuutta) yhden tunnin ajan. Saatu kloroformiuute konsentroitiin noin 10 litran tilavuuteen, ja sitä jäähdytettiin i+°C:ssa 72 tunnin ajan. Muodostuneet kiteet erotettiin suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin 588 g A-it010U :n tekijää A.

Esimerkki 5 A-UOIOU-kompleksin ja tekijä B:n eristäminen

Esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä saatu koko käymisligni (21^ litraa), suodatettiin käyttämällä suodatuksen apuainetta, jolloin saatiin suodosta 119 litraa. Huovastokakku pestiin vedellä, jolloin saatiin suodosta lisää 80 litraa- 18 59420

Yhdistetyt suodokset (199 litraa) uutettiin kaksi kertaa etyyliasetaatilla (80 litraa kummallakin uuttokerralla) käymisliemen fH:ssa. Lisättiin heksaania (noin 20 litraa) aktiivisen kompleksin saostamiseksi. Saostettu antibioottikompleksi erotettiin suodattamalla, liuotettiin sitten uudelleen etyyliasetaattiin (noin 300 ml) ja saos-tettiin uudelleen heksaanilla. Sakka pestiin heksaanilla ja kuivattiin, jolloin saatiin 27,3 g A-iiOlOt-antibioottikompleksia (sisältää tekijät A:n, B:n ja C:n).

Osa tätä kompleksia (5 g) liuotettiin kloroformiin (hO ml). Kloroformiliuos suodatettiin ja suodos kromatografoitiin avoimessa lasipylväässä (5,6 x 28 cm) si-likageeliä käyttäen (Vfoelm). Pylväs pakattiin liettämällä kloroformin kanssa ja eluoitiin kloroformilla virtausnopeuden ollessa 2 ml/min ja koottiin fraktiot, joiden tilavuus oli 20 ml. Fraktion n:o 7 kohdalla eluentti muutettiin CHCl^CH^OHtksi (95*5), fraktion n:o 28 kohdalla liuotin vaihdettiin CHCl^CH^OHiksi (9:1). Fraktiot n:ot 72-100 yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin kuiva jauhe (U g).

Lisäkäymisliemi käsiteltiin samalla tavalla, jolloin saatiin vielä 6 g tätä ainetta. 100 ml kloroformia lisättiin yhdistettyihin näytteisiin (10 g); kloroformiin liukenematon aine (1,6 g A-UOlOk tekijä A) erotettiin suodattamalla. Suodos kromatografoitiin avoimessa lasipylväässä (5,8 x 1+8 cm) silikageeliä (Woelm) käyttäen. Pylväs pakattiin ja pestiin kloroformilla ja eluoitiin sen jälkeen CHCl^:0Η^0Η:11a (97,5;2,5) kooten samalla fraktiot, joiden tilavuus oli 20 ml, ja virtausnopeuden ollessa h ml/min. Fraktiot, joiden numerot olivat 156-190, yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Jäännös liuotettiin pieneen tilavuuteen kloroformia; liuokseen lisättiin heksaania tuotteen saostamiseksi. Sakka erotettiin suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin 99 mg A-i+010U tekijä B:tä.

Claims (1)

1. i9 59420 Patenttivaatimus: Menetelmä sellaisen A-UOIOU-antibioottiseoksen tuottamiseksi, joka käsittää tekijät A, B ja pleuromutiliinin ja antibioottitekijoiden erottamiseksi, tunnettu siitä, että a) Clitopilus pseudo-p>insitus NRRL 11179_kantaa viljellään viljelyväli-aineessa, joka sisältää assimiloituvia hiilihydraattilähteitä, typpeä ja epäorgaanisia suoloja, aerobisena submerssifermentaationa kunnes on muodostunut oleellinen määrä antibioottiaktiviteettia; b) A-i401(A-antibioottiseos erotetaan haluttaessa viljelyväliaineesta suodattamalla; c) antibiootti A-ä010ä-tekijä A tai pleuromutiliini haluttaessa eristetään uuttamalla b):stä saatu suodos tolueenilla ja väkevöimällä tolueeniuute, jolloin pleuromotuliini kiteytyy, tai sen jälkeen kun uutto tolueenilla on suoritettu, uuttamalla jäljelle jäänyt vesiliuos kloroformilla ja väkevöimällä kloroformiuute, jolloin antibiootti A-äOlO^-tekijä A kiteytyy; tai d) antibiootti A-kOlOU-tekijä B haluttaessa eristetään uuttamalla b):stä saatu suodos ensin etyyliasetaatilla ja lisäämällä heksaania antibiootti A-UoiOä tekijöiden A, B ja pleuromutiliinin saostamiseksi, liuottamalla saostuma kloroformiin ja kromatografoimalla silikageelillä käyttäen eluenttina kloroformin ja metanolin seosta, minkä jälkeen kuivatusta ja kloroformiin liuotetusta jännök-sesta erotetaan antibiootti A-i+010i+-tekijä B saostamalla heksaanilla.