<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention se rapporte à un antibiotique pouveau et utile, dénommé Omégamycina, et à sa préparation. Elle concerne plus spéci- alement des procédés de préparation de cet antibiotique par fermentation, des procédés pour le séparer et le concentrer de ses solutions brutes et no- tamment des bouillons de fermentation, sa purification et la préparation de sels. L'invention s'étend à l'antibiotique et à ses sels en solutions di- luées, en produits concentrés bruts et en formes solides et cristallisées plus pures.
Au cours de ces dernières années, on a isolé un certain nombre de produits métaboliques du développement des bactéries et'champignons in- férieurs et on a constaté que ces produits possédaient des propriétés thé rapeutiques intéressantes. On peut citer notamment la pénicidone,la strep- tomycine, la gramicidine, la tyrocidine, la bacitracine, la subtiline, la streptothricine, l'auréomycine (chlorotétracycline), la terramycine (oxyté- tracycline) et d'autres, Certains de ces produits se sont révélés extrême- ment utiles par leur'efficacité contre les organismes pathogènes. D'autres ne possèdent qu'une utilité limitée, par exemple à cause de leur toxicité.
La chlorotétracycline et l'oxytétracycline sont particulièrement utiles par leur spectre d'activité étendu.
Le but de l'invention est de procurer un nouvel antibiotique à spectre étendu donnant de meilleurs niveaux sanguins et moins de réactions secondaires que la chlorotétracycline et l'oxytétracycline et particulière- ment plus stable que la chlorotétracycline en milieu alcalin. Un autre but de l'invention est de procurer des procédés de préparation de cette substan- ce antibiotique pouvant être appliqués à l'industrie.
On a découvert à présent, suivant la présente invention, l'an- tibiotique dénommé Omégamycine et un procédé de préparation de l'Omégamy- cine suivant lequel on cultive une souche de Streptomyces BO567201 dans une solution aqueuse d'hydrates de carbone contenant des éléments nutri- tifs azotés, dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce que la so- lution présente une activité antibactérienne appréciable, puis on sépare l'Omégamycine obtenue du bouillon de fermentation.
On a également découvert, suivant la présente invention, des substances capables d'inhiber le développement des bactéries à Gram-posi- tif et à Gram-négatif, choisies dans le groupe formé par une substance am- photère capable de former des sels avec les acides et les métaux, la dite substance étant constituée des éléments carbone, hydrogène, azote, et oxygène, étant relativement soluble sous la forme du chlornydratec dans le butanol et la méthyl-isobutyl-cétone et présentant le 'spectre de valeurs Rf décrit ci-dessous; et les sels d'acides et de métaux de cette substance.
On décrit également, suivant la présente invention, un élément choisi dans le groupe formé par les composés de la formule
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et ses sels avec des acides et des métaux.
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Les prod¯tits de la présente invention, l'Omégamycine et ses sels, exercent une action inhibitrice sur le développement de nombreuses bactéries comme décrit en détail ci-dessous.
Ce nouvel antibiotique est préparé par culture dans des conditions -=terminées particulières d'une espèce de micro-organisme non décrite jusqu'à présent, à laquelle on a provisoirement donné le nom de Streptomyces BL 567201, qu'on a isolée d'un échantillon de sol. La description de cet organisme est donnée ci-dessous.
L'organisme BL 567201 sp. nov. qui produit l'Omégamycine appar-
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tient au genre couramment appelé Strptonyces. Le développement de cet orga- nisme est satisfaisant sur un mélange de glycérol-asparagine-extrait de boeufagar à 30 C. Sur ce milieu, des hyphes aériennes gris souris se forment et un pigment vert jaunâtre est secrété dans l'agar. Le mycélium est composé d' hyphes ramifiées dont les éléments jeunes ont Gram-positifs. Des conidies se forment sur les hyphes aériennes.
Pour la préparation de l'Omégamycine, la Demanderesse ne désire pas se limiter à cet organisme particulier ou aux organismes répondant entièrement à la description ci-dessus, qu'on a donnée uniquement à titre d'illustration. Elle désire spécialement se réserver l'emploi d'organismes qui sont des produits de mutation de l'organisme décrit, obtenu par des agents
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de mutation tels que les rayons-X, les rayons ultra-violts3, .les gaz azotés, etc..
L'Omégamycine est un agent thérapeutique de valeur, par exemple en médecine humaine ou vétérinaire. L'Omégamycine possède comme avantages particuliers un spectre étendu, des niveaux sanguins élevés et une faible
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toxicité, T,'Omégamycine présente une résistance extrgmement, utile à la dégradation par la chaleur ou'l'eau dans dès milieux alcalins ou acides.
L5antibiotiq-deonk9à,Ëyeifié est actif in vitro contre un certain nombre de bactéries ...a.osLives et négatives. Le tableau ci-dessous montre l'activité antibiotique de l'Omégamycine (lot 25), de l'Auréomycine EC1, de la Ter- ramycine HC1 et de la Tétracycline placées dans une tranchée découpée dans une plaque d'infusion de coeur et d'agar (pH 7,0) :
Spectre de plaque de l'Omégamycine
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¯¯¯¯¯¯5nig/篯¯¯¯¯¯¯¯
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<tb>
<tb> Zone <SEP> d'inhibition <SEP> en <SEP> mm
<tb> Organisme <SEP> Omégamycine <SEP> Tétracycline <SEP> Auréomycine <SEP> Terramycine
<tb>
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lot 25 lot, 25 3 cm3 mv./cm ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯(5 I!1!lje) (5 rng/cr2 (3 me./cM-3 (1 m, /cm3)
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<tb>
<tb> Bodenheimer <SEP> Org.... <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 11
<tb>
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Proteus Xl9 ....... 7 8 8 10
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<tb>
<tb> Sh. <SEP> Sonnei <SEP> ........ <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 11
<tb> S, <SEP> enteritidis <SEP> .... <SEP> 9 <SEP> 11 <SEP> 11 <SEP> 13
<tb>
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S. paratyphi 9,..... 10 12 13 15
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<tb>
<tb> S. <SEP> pullorum <SEP> 8 <SEP> il <SEP> 11 <SEP> 13
<tb> A. <SEP> aérogares <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 9 <SEP> 11
<tb> Ps. <SEP> ±luorescens <SEP> 1 <SEP> 7 <SEP> 9 <SEP> 13
<tb> A1C.
<SEP> fecalis <SEP> ...... <SEP> 6 <SEP> il <SEP> 8 <SEP> 8
<tb>
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Pr. vulgaris ...... 0 6 4 0
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<tb>
<tb> V. <SEP> cholerae <SEP> ....... <SEP> 8 <SEP> 11 <SEP> 11 <SEP> 14
<tb> Neisseria <SEP> sp...... <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 11
<tb> G. <SEP> xerosis <SEP> 11 <SEP> 14 <SEP> 14 <SEP> >27
<tb>
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B. s m%âr'o.den5''.. , .. s e . la 10 16 ) 27
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Spectre de plaque de l'Omeganaycine 5 mg cm3
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<tb>
<tb> Zone <SEP> d'inhibition <SEP> en <SEP> mm
<tb> Organisme <SEP> Omégamycine <SEP> Tétracycline <SEP> Auréomycine <SEP> Terramycine
<tb> lot <SEP> 25
<tb>
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(5 mg./cm3) (5 mgp/em3) (3 mg./cm3) (1 mg./em3) B. ceretts 0604004. 10 11 13 17
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<tb>
<tb> S. <SEP> marcescens <SEP> .... <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> M.
<SEP> tetragenus <SEP> il <SEP> 15 <SEP> 27 <SEP> >
<tb>
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S. flexnerî 14 11 10 14
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<tb>
<tb> S, <SEP> dysenteriae <SEP> ... <SEP> 9 <SEP> 11 <SEP> 10 <SEP> 15
<tb>
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C. albioans ..0... 6 0 0 0
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<tb>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 13 <SEP> 18
<tb>
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E. typhosa ....0.. 7 9 10 13 E, ooli ..0..0.0.0 4 7 11 11
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<tb>
<tb> S, <SEP> paratyphi <SEP> B... <SEP> 9 <SEP> il <SEP> 16 <SEP> 14
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> .... <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 16 <SEP> 13
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 9 <SEP> 7
<tb> S. <SEP> gallinarum <SEP> 8 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13
<tb> B. <SEP> anthracis <SEP> ..... <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 19 <SEP> >27
<tb> S. <SEP> schottmulleri <SEP> . <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 15
<tb>
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B. subt3.l.is ...... 10 9 11 13
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<tb>
<tb> B.
<SEP> mycoides <SEP> 0 <SEP> .... <SEP> 13 <SEP> 8 <SEP> 15 <SEP> 20
<tb>
Le spectre est obtenu comme suit : On place environ 30 cm3 d'un bouillon d'infusion stérile de coeur (Difco) avec 2% d'agar comme agent de
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solidification dans unù vase de Pétri stérile de 3 1/2 pouce (88 mm) de di- amètre et on laisse durcir. ' On pratique ensuite dans l'agar une tranchée de 8 mm x 40 mm à l'aide d'une spatule stérile. Le fond de la tranchée est fermé par une ou deux gouttes d'agar fondu. On applique ensuite à l'aide d' une petite boucle une trace d'un bouillon de culture nutritif de 24 heures de chacune des bactéries d'essai préalablement incubées à 37 C, depuis le
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bord de la tranchée jusqu'à la paroi du vase de Pétri.
On remplit ensuite la tranchée d'une solution de l'antibiotique à 5 mg/cm'. Le vase est placé à 37 C pendant 18-24 heures. On mesure ensuite la longueur de la zone d'inhibition depuis le bord de la tranchée jusqu'au point où l'organisme d'essai a'est développé.
La méthode d'essai de diffusion sur plaque pour déterminer l'activité de l'Omégamycine est décrite ci-dessous.
Milieu de culture:
On utilise suivant les indications de l'étiquette de l'agar pour
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essai de la streptomycine (avec extrait de levure) fabriqué parla. .ltïmo.e Biolcik2bml LaboratoriégBàtîmcre,,lvkilland.Uie.p7éparation appropriée peut être ob- tenue en mettant en suspension dans un litre d'eau distillée à un pH final de 6,2 un mélange de 1,5 d'extrait de boeuf, 3 g d'extrait de levure, 6,0 g de peptone (par exemple Gélysate) et 15 g d'agar. On laisse reposer la suspension pendant 5 minutes, on mélange jusqu'à ce qu'on obtienne une suspension uniforme et on chauffe modérément en agitant. On fait bouillir la suspension pendant une ou deux minutes ou jusqu'à ce qu'on obtienne une solution.
On verse ensuite le milieu de culture et on le stérilise à 121 0 (pression de vapeur de l kg/cm au manomètre pendant 15 minutes. ) Inoculum :
L'organisme d'essai est le Bacillus subtilis A.T.C.C. 6633. On
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ajoute une suspension de spores contenant 50.000.000 de spores viables par cm3 à l'agar fondu (refroidià 53 C) pour obtenir un inoculum final à 2%.
Préparation des plaques: On place 21 cm3 de l'agar stérile dans des plaques de Petri stériles rases et on laisse solidifier. On répartit ensuite uniformément 4 cm3 d'agar inoculé sur la surface de la couche de base. On place sur le milieu des couvercles en acier inoxydable percés d'une série de trous après avoir refroidi le milieu à la température ordinaire et on place les échantillons dans les trous.
Tampon :
On utilise un tampon au pH 6,2 pour effectuer les dilutions.
On le prépare en mélangeant 192,12 g d'acide citrique anhydre avec 1C6,3 g
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d''h?''::-()''7de de sodium dans un litre d'eau dist.;11 et en diluant 1ètil"Snge "- 1/10 de sa concentration pàrde.l'eaudist:iJ1ée:epRdutampon doit à Lre ver-y- .....;.c p=à1. -cL meznoae posenwioawwi-uue er, si necessaire, ramené au pH 6,2 par addition d'acide citrique ou d'hydroxyde de sodium. Les variations du pE ou de la concentration du tampon modifient fortement les dimensions des zones d'inhibition. On n'a pas trouvé nécessaire de stériliser le tampon.
La solution mère est conservée dans du chloroforme ou du toluène et des solutions de travail fraîches sont préparées journellement.
Essai :
Les échantillons inconnus sont dilués en cas de besoin dans le tampon au citrate au pH 6,2. On utilise 3 trous de chaque plaque pour recevoir une même dilution de l'échantillon. Après incubation à 32 C, on mesure les diamètres des zones et on fait la moyenne entre ces diamètres.
On a distingué le Streptomycète donnant la variété BL 567201
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d'une souche de Sa a/1ré¯daciens (NRRL 2209) obtenue du Northern Regional Research Laboratory, Péoria, Illinois, où elle était déposée comme souche authentique productrice d'auréomycine, en observant les caractéristiques
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de développement sur un milieu glycérol-asparagimr-extrait de boeuf-agar et agar-Czapek-Dox contenant 1% de dextrine.
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<tb>
<tb> Glycérol <SEP> asparagine-extrait <SEP> de <SEP> boeuf-agar
<tb> Glycérol <SEP> 1%
<tb> Asparagine <SEP> 0,05%
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 0,02%
<tb> K2HP04 <SEP> 0,05%
<tb> Agar <SEP> 1,5%
<tb> pH <SEP> 7,2 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> BL <SEP> 567201 <SEP> Streptomyces
<tb>
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¯¯¯¯¯¯ aureofaciens
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<tb>
<tb> Développement:
<SEP> bon <SEP> bon
<tb> Sporulation: <SEP> bonne <SEP> bonne
<tb> -Pigment <SEP> diffusible: <SEP> vert <SEP> jaunâtre <SEP> pas
<tb> Formation <SEP> de <SEP> spirales: <SEP> abondantes, <SEP> peu <SEP> pas
<tb> enroulées
<tb> Hyphes <SEP> aériennes <SEP> : <SEP> gris <SEP> souris <SEP> gris <SEP> rosé
<tb> Inverse <SEP> : <SEP> brun <SEP> khaki <SEP> olive
<tb>
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<tb>
<tb> Dextricn <SEP> Czapek-Dox
<tb> NaNo <SEP> 0,2%
<tb> K2HPO <SEP> 0,1%
<tb> M2SO4 <SEP> 0,05%
<tb> KC1 <SEP> 0,05%
<tb> FeSO <SEP> trace
<tb> Agar4 <SEP> 1,5%
<tb> pH <SEP> 7,2 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> BL <SEP> 567201 <SEP> Streptomyces
<tb> auréofaciens
<tb> Développement: <SEP> assez <SEP> bon <SEP> à <SEP> bon <SEP> assez <SEP> bon
<tb> Sporulation: <SEP> bonne <SEP> faible
<tb> Pigment <SEP> diffusible:
<SEP> pas <SEP> pas
<tb> Formation <SEP> de <SEP> spirales <SEP> : <SEP> peu <SEP> rares, <SEP> très <SEP> peu
<tb> enroulées <SEP> enroulées
<tb> Hyphes <SEP> aériennes: <SEP> gris <SEP> souris <SEP> chamois <SEP> à <SEP> gris
<tb> Inverse <SEP> : <SEP> brun <SEP> claire <SEP> chamois <SEP> à <SEP> brun <SEP> rouge
<tb>
Le Streptomycète BL 56201 'est encore caractérisé par la pro- duction d'un pigment vert bleuâtre intense en culture submergée dans un mi- lieu contenant 1% de sucrose, 1% de farine de soya, de peptone de soya, 1,5% de KS2PO et 0,5% de (NH)2 HPO 4. Le Strebtomyces auréfaciens (NRR1 2209) ne produit pas ce pigment.
L'invention s'étend à un procédé de culture d'une espèce de mi- croorganisme nouvelle et non décrite jusqu'à présent, le Streptomyces BL 567201 à 24-30 C environ, dans des conditions submergées d'agitation et d' aération sur des milieux contenant une source de carbone, une source d'azo- te, une source de substances de développement, des sels minéraux comme le chlorure de sodium, le phosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le nitrate de sodium et, si on le désire, un agent tampon comme le carbonate de calcium.
Comme source de carbone dans le milieu nutritif, on peut utili- ser un des composés suivants :
Amidon ordinaire Xylose
Amidon soluble Arabinose
Sucrose Rhamnose
Glucose Fructose
Maltose Lactose
Dextrose Inuline
Glycérol Dextrine
Galactose
Ces sources de carbone sont introduites dans le milien à l'é- tat pur ou sous la forme de produits concentrés. La quantité de ces sour- ces de carbone pour une prénaration antibiotique optimum varie considéra- blement dans le milieu, 'de 1/2% à 5% en poids du poids total du milieu de fermentation.
Des sources d'azote appropriées comprenant certaines sources de substances de développement pour le procédé de fermentation sont très nom- breuses et on peut citer entre autres : les amino-acides la caséine, hydrolysée et non hydrolysée la farine de poisson la farine de soya
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les extraits de viande le tourteau de foie l'urée les nitrates les composés d'ammonium les bouillies de grain pour la distillation la liqueur de macération du mais la liqueur de macération de froment le petit-lait ou les concentrés de petit-lait le gluten de mais traité par hydrolyse acide le gluten de froment traité par hydrolyse acide la peptone les abatis la levure de brasserie la farine de graines de coton la lactalbumine la tryptone
Ces ingrédients protéiques ne doivent pas être appliqués à un haut degré de
pureté. Les matières moins pures qui contiennent des traces de facteurs de développement et des quantités considérables d'agents nutritifs minéraux peuvent convenir. Il n'est évidemment pas possible, à cause de la nature brute de la plupart de ces substances azotées de spécifier des proportions définies de la matière à ajouter. Une quantité d'environ 0,1% à 5,0% en poids sur base solide correspond à la gamme utile de substances azotées à ajouter au milieu dans la plupart des cas.
Le pH du milieu de fermentation doit être environ 6,0 à 6,2 au début de la fermentation. La température préférée pour le procédé de fer-
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mentation, est environ 26 à 280C. Le rendement maximmm du produit est géné- ralement obtenu en 2 à 3 jours suivant le procédé de culture du Streptomyces.
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L'0mégamycine est active in vivo et in intro et exerce une acti- vité chimicothérapeutique marquée sur les infections expérimentales chez les souris. Les résultats de ces essais et déterminations de toxicité sont reproduits dans le tableau ci-dessous.
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<tb>
<tb>
Omégamycine <SEP> Essai <SEP> de <SEP> plaque <SEP> Toxicité <SEP> aiguë <SEP> CD50 <SEP> mg/kg <SEP> - <SEP> souris
<tb>
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Lot N e Réaction en rmn LD5 "Bg/kg-souris intrapéritonéale intramusculaire 1 25 à 1 mg/cm3 98 - 3"Ï3 45
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<tb>
<tb> 25 <SEP> 28 <SEP> à <SEP> 1/16e <SEP> mg/cm3 <SEP> --- <SEP> 4,6
<tb>
La CD50 (dose curative - 50) est la dose minimum d'Omégamycine qui guérit 50% d'un groupe de souris ayant subi des injections intrapéri-
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tonéales de 10C i). 1000 doses LD fl de Diplocaccus pneumon2-ae chaque dose LD50 étant suffisante, administrée seule, pour tuer 50% d'un groupe de souri. L'infection est communiquée immédiatement après la seconde dose du mé- dicament d'essai. Le médicament d'essai est administré en deux doses égales à 18 heures d'intervalle environ.
Les animaux sont observés pendant 4 jours et les morts de chaque groupe sont exprimés en proportion du total des ani- maux du groupe. La proportion des morts est transformée en valeurs de pro- bit et ces valeurs sont comparées au logarithme de la dose en mg/kg de sou- ris. Le point d'intersection de la courbe 5 de probit et de la meilleure courbe passant par les points expérimentaux indique la concentration d'un médicament qui doit protéger la moitié des animaux dans les conditions de l'expérience, L'antilogarithme de ce terme est appelé la valeur CD50.
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exemple 1.-
Pour préparer l'Omégamycine en laboratoire, on effectue la fermentation dans des flacons agités, ouverts à l'air, mais protégés de la con-
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tamination par un tampon de coton ou de gaz.
Le Str,etomyces BL 567201 est cultivé dans un milieu nutritif approprié par la méthode de culture submergée, l'agitation et l'aération de la culture étant obtenues en plaçant les flacons dans un agitateur à va-et-vient qui pulvérise et projette la bouillie dans une atmosphère contenant de l'oxygène. Dans un cas typique, on introduit 500 cm3 d'un milieu de culture composé de 1% de sucrose 1% de farine de soya
1% de peptone de soya
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1,5% de KH PO 0,5% d, (4)p#04 ' 42 4 dans des flacons de 4 litres et on stérilise. Après passage à l'autoclave, on inocule le milieu avec 1% en volume environ d'une suspension aqueuse trou-
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ble de spores de Streptomyces provenant d'une souche sur agiz.l"pH est 6,0 - 6,2 au début de la fermentation.
On incube ensuite le contenu du f'i tion-à 26 - 28 C pendant 43 heures , tout en agitant à 130 secousses par minute, les secousses ayant une amplitude de 1 1/4 pouce (30 mm). Après la période d'incu- bation, la liqueur de fermentation est vert bleuâtre et, soumise à l'essai décrit ci-dessus, donne des zones d'inhibition d'environ 27 mm lorsque le bouillon est dilué trente fois.- Ce bouillon contient de l'Omégamycine qui peut être isolée comme décrit ci-dessous.
Exemple 2.- Pour une préparation de l'Omégamycine à plus grande échelle, on prépare un inoculum dans un milieu de fermentation contenant en poids
1% de liqueur de macération de mets
1% de sucrose
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0,5% de (NH )HI'0 1,5% de KH:211>0 4 0,2% de MgSO . 7 Hz0 pH 6,2 - 6,4 étendu à 2500 cm3 et introduit dams un flacon de 2 1/2 gallons (8,5 1. env. ).
Le milieu est stérilisé par la vapeur à 118 -120 pendant 1 heure. Refroi- di, on l'inocule d'environ 0,5% en volume d'une suspension aqueuse trouble de spores de Streptomyces provenant d'une souche sur agar. Le contenu du flacon est incubé à 26 -28 pendant 48 heures dans un agitateur du type à va-et-vient et on souffle de l'air stérile sur la surface du liquide. On fait passer le bouillon de Streptomyces sp. de la bouteille d'inoculation dans un réservoir de fermentation dans des conditions parfaitement asepti- ques. Au moment voulu, la liqueur peut être traitée comme décrit ci-dessous et l'Omégamycine peut etre isolée.
Exemple 3.- @
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On peut préparer, à grande écb ("11 ç:" le produit antibiotique,,0"4.,",, rivé de Streptomyces BL 567201 , 1' Oméeaaveihe , n Tulture profonde ou submergée. Des cuves de. fermentation fixes munies de dispvsi1.iÍlS approprias d'agitation et d'aération peuvent convenir à cette fin.
On peut utiliser en milieu nutritif contenant 56,8 litres de liqueur de ma-
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cération de mais, 56,8 kg de sucrose, 28,4 kg de (NH )2HPO , 85,2 kg de KHPO , 7.1,3 kg de MgSO . 7 H20 et de l'eau pour fixe 13-00 gallons (5.700 1. env.). Ce milieu peut être préparé dans un récipient de fermentation de
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2000 gallons (7.500 1.env.) doublé de verre et muni d'une chemise à circulation d'eau pour le réglage de la température, d'un agitateur en acier in- oxydable et d'un dispositif arroseur approprié pour aérer le milieu. Celuici est stérilisé par chauffage avec de la vapeur sous pression, puis refroidi. Après stérilisation, la concentration en ions hydrogène du milieu doit correspondre approximativement au pH 6,2.
Le milieu nutritif est inoculé avec 15% en volume d'une culture végétative effectuée soit dans un appareil de fermentation similaire préalablement inoculé avec un inoculum décrit plus haut ou avec un inoculum préparé en laboratoire. La culture dans l'appareil de fermentation de 2000 gallons est incubée à 83 F (28 G) pendant deux ou trois jours. Pendant cette incubation, on fait tourner l'agitateur à 90 tours par minute et on introduit de l'air stérile dans le milieu par l'arroseur à raison de 100 pieds cubes (2.800 1. env. ) par minute.
A la fin de la période d'incubation, le liquide de culture possède normalement une activité antibiotique suffisante pour donner une zone d'inhibition d'environ 23 mm de diamètre dans les organismes d'essai, lorsqu'on utilise un bouillon dilué 16 fois suivant le procédé d'essai décrit plus haut,. L'Omégamycine est isolée comme décrit plus loin.
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Exemple 4.-
On prépare une liqueur de fermentation contenant de l'Omégamyci-ne en suivant le procédé de l'exemple 1, avec le milieu de culture suivant :
1% de gluten de froment
1% de glycérol 0,05 % d'éléments solubles de distillation
0,5% de NaCl
0,1% de CaCO3 Exemple 5.-
On prépare une liqueur de fermentation contenant de l'Omégamycine en suivant le procédé de l'exemple l, avec le milieu de culture ci-dessous :
1% de farine de coton
1% de glucose
0,05% d'éléments solubles de distillation 0,5% e NaCl
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0,1 de Ga\Jv3 Exemple 6. -
On prépare une liqueur de fermentation contenant de l'Omégamycine suivant le procédé de l'exemple 1, avec le milieu de culture ci-dessous:
1% de liqueur de macération de maïs
1% de Cérélose
0,5 de NaCl
0,1% de CaCO3
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Exenrole 7.....-
On prépare une liqueur de fermentation contenant de l'Omégamyci- ne suivant le procédé de l'exemple 1, avec le milieu de culture ci-dessous:
1% de farine de soya
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7.. de Cérélose 0,5% 'dE NaCl
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0,05% à'ex2rai.u de levure 0,1% de CaCO3
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Exemple 8.-
On prépare une liqueur de fermentation contenant de l'Omégamycine suivant le procédé de l'exemple 1, avec le milieu de culture ci-dessous:
3% de farine de soya
0,5% d'amidon de mais
0,1% de N-Z-Amine B (produit de digestion enzy- matique de la caséine)
0,3% dE NaNO3
0,5% de CaCO3 3 Exemple 9.-
On prépare une liqueur de fermentation contenant de l'Omégamy- cine suivant le procédé de l'exemple 1, avec le milieu de culture ci-dessous:
1% de N-Z-Amine B
1% de Cérélose
0,5% d'extrait de levure
0,5% de NaC1
0,1% de CaCO3
Lorsque la fermentation est achevée, on sépare l'Omégamycine du bouillon, par exemple en filtrant pour enlever le mycélium, en agitant le bouillon (de préférence au pH 8,4 environ) avec du butanol ou de la méthyl- isobutyl-cétone, en séparant la couche de solvant contenant l'Omégamycine, en la réduisant à un faible volume par distillation et en la mélangeant avec
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un hydrocarbure inférieur, par exemple le Skellysolve C, pour préci"itpr il flmégamcine solide sous forme de base, si le bouillon extrait, est aun pH alcalin, par exemple au pH $,5 , ou sous forme de ahlortmàratexi le vai1Lwii a été acidifié avant extraction par l'acide chlorhydrique.
L'Omégamycine so- lide ainsi obtenue peut être encore purifiée en formant un magma avec de 1, hydroxyde d'ammonium et également par adsorption à partir d'une solution de
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la base libre sur un adsorbant ehromatographique (par exemple une silice com- me le Florisil), suivie de lavage (par exemple à l'acétone ou au méthanol)pour éliminer les impuretés, puis d'un entraînement par un acide. Le sel d'aci-
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de d'Omégamycine purifié dans le liquide d'entraînement est ensuite séparé par cristallisation, précipitation, lyophilisation, ou par un procédé analogue.
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Divers sels de l'Omégamycine peuvent être préparés très simple- ment en ajoutant l'acide désiré, minéral ou organique, à l'antibiotique dans l'eau jusqu'à ce qu'on obtienne une solution limpide.
Les sels solides peuvent être préparés en réglant le pH d'une telle solution de sels d' Omégamycine à un point immédiatement inférieur à celui du début de la séparation de l'antibiotique. La solution peut être alors séchée, par exemple en exposant la solution congelée au vide. Les sels acides d'Omégamyci- ne sont obtenus par l'évaporation d'une solution du sel dans l'eau à un pH peu élevé. Les acides minéraux qui peuvent étre utilisés sont l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosporique. Les acides organiques
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qui peuvent être utilisés sont l'acide citrique, 15acide,i*P , ilegMo;Vecide gluconique, etc..
Comme l'Omégamycine est amphotère on peut pxp,ae" des sels de divers éléments métalliques avec l'antibiotique, et en particulier les sels de métaux alcalins de l'Omégamycine sont formés en traitant une suspension aqueuse de l'antibiotique par un hydroxyde alcalin. Les sels soli-
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des de métaux et d'Oméga.m3rcine sont obtenus en évaporant sous vide une so- lution aqueuse de l'antibiotique au pH approprié.
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E,ele ifs .On extrait faciel(-ment l't3m.êgamycine des liqueurs de fermenta- tion alcaline par des sol ants rganiques non polaires. Le procédé suivant a été utilisé.
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On extrait un litre de bouillon de fermentation de Streptomyces BL 567201 au pH 8,5 par 0,5 litre de méthyl-isobutyl-cétone. Le solvant organique est séparé, lavé à l'eau, réduit par distillation azéotropique à un volume d'environ 20 cm3 et ajouté à 250 cm3 de Skellysolve C. 20 g d' Omégamycine (lot 26) précipitent et sont recueillis par filtration; ils pos- sèdent une activité de 19,5 mm (diamètre de la zone sur plaque d'essai de B. subtilis au pH 6,2 dans l'agar) à une concentration de 1 mg/cm3, dilu- tion 1:64; de 24,2 mm pour une dilution de 1 :16 de 27,7 mm pour une di- lution de 1:4. Le bouillon original donne 27,3 mm pour une dilution de 1:4.
Exemple 11.-
Dans un autre procédé, on amène au pH 5,5 par addition d'hydro- xyde de sodium 2 N, 4,5 litres d'un bouillon de fermentation de Streptomyces BL 567201 au pH 6,7 et on extrait par 3 litres de butanol. L'extrait par le butanol est séparé, lavé à l'eau, son volume est réduit à 35 trait par par distillation aséotropique et on y ajoute 350 cm3 de Skellysolve C.
L'Omégamycine (lot 27) précipite sous forme solide et ext recueillie par filtration (1,2 g possèdant une activité de 23,2 mm à 1 mg/cm3, dilution 1:16; diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2).
Le bouillon au pH 5 restant après l'extraction par le butanol est amené au pH 8,5 et extrait par 3 litres de butanol. L'extrait par le butanol est séparé, lavé à l'eau et réduit à un volume d'environ 30 cm3, puis ajouté à 350 cm3 de Skellysolve C. L'Omégamycine brute (lot 28) pré- cipite sous forme d'un solide jaune orangé ayant une activité de 25,2 mm à 1 mg/cm3, dilution 1:16 (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2). Le bouillon original donne 27,3 mm pour une dilution de 1:4. lxemple 12. -
Dans un troisième procédé, on règle au pH 6,4 un bouillon de fermentation de 2,5 litres de Streptomyces BL 567201 donnant 25,7 mm à l'essai avec une dilution de 1 :4 on l'extrait par 2 litres de butanol.
On sépare le butanol, on lave à l'eau, on réduit le volume à environ 50 cm par distillation azéotropique et on ajoute à 1 litre de Skellysolve C. L' Omégamycine solide jaune foncé (500 mg) (lot 24) précipite et est recueillie par filtration; elle présente une activité de 18 mm à 1 mg/cm3, dilution 1 :6 (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2) et de 23 mm pour une dilution de 1:4.
Le bouillon au pH 6,4 après extraction par le butanol est con- servé en chambre froide pendant 3 jours, puis amené au pH 8,5 par l'hydro- xyde de sodium et extrait par 2 litres de butanol. Le butanol est séparé, lavé à l'eau, réduit à un volume d'environ 30 cm3 par distillation azéotropique et ajouté à 600 cm de Skellysolve c. L'Omégamycine solide, brun fon- cé (140 mg) (lot 25) précipite et est recueillie par filtration; elle présen- te une activité de 28 mm à 1 mg/cm3, dilution 1:16 (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2) .
Exemple 13.-
3. Dans un autre procédé, on extrait par 380 cm3 de n-butanol, 760 cm d'un bouillon de fermentation de Streptomyces BL 567201 réglé au pH 9,4 par de l'hydroxyde de sodium.. On sépare le n-butanol, on l'ajoute à de 1' acide chlorhydrique aqueux pour obtenir un pH de 7,35, et on élimine le bu- tanol par distillation sous vide; le concentré aqueux résiduel est étendu à 38 cm3 environ par de l'eau, et lyophilisé pour obtenir 339 mg d'Omégamyci- ne solide présentant une activité de 25 mm à 1 mg par cm3 de tampon (diamè- tre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2)
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et de 18,7 mm pour une dilution de 1:3.
Le bouillon original donne 26,3 mm (et 20,0 mm à une dilution de 1:3) et le bouillon épuisé donne 19,0 mm (et 12,7 mm pour une dilution de 1:3).
Exemple 14.-
Dans un autre procédé, on extrait par 3 litres de n-butanol, 5,5 litres d'un bouillon de fermentation de Streptomyces BL 567201 réglé au pH 5,5 par de l'hydroxyde de sodium 2 N. Le solvant est séparé, lavé à l'eau, réduit à un volume de 35 cm environ.par distillation azéotropique et ajouté à 350 'cm de Skellysolve c. solide jaune d'or (1,2 L'Omégamycinine précipite et est -recueillie g) filtration (solide A) . Elle présente une activité à 1 mg/cm3, dilution 1:16 de 23,2 mm (diamètre- de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2) et de 26,9 mm à une dilution de 1:4.
Le bouillon restant après l'extraction par le butanol au pH 5,5 est amené au pH 8,5 et extrait par 3 litres de butanol. Le butanol est séparé, lavé à l'eau, réduit à un volume de 30 cm environ par distillation azé- otropique et ajouté à 350 cm3 de Skellysolve C (heptanes pureté technique).
Une nouvelle quantité d'Omégamycine solide jaune orangé (0,,5 g) (lot 30) pré- cipite et est recueillie par filtration (solide B). Elle présente une acti- vité à 1 mg/cm3, dilution 1:16, de 25,2 mm (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2) et de 28,5 mm pour une dilu- tion de 1:4.
L"Oégamycine produite dans ces procédés est caractérisée de fa- çon certaine même lorsqu'elle est contaminée par des composés organiques a- nalogues par son "spectre" d'activité (c.à.d. le degré de migration ou valeurs Rf) avec une série de solvants dans le procédé appelé chromatographie sur bande de papier. Cette technique est relativement nouvelle, mais déjà bien établie pour l'identification des composés organiques; comme dans le cas des maxima dans l'infrarouge, les valeurs Rf dans une série de systèmes solvants constituent une caractéristique unique et reproduetible d'un pro- duit chimique déterminé et sont en quelque sorte ses empreintes digitales.
Le procédé utilisé est le suivant: On suspend au bord d'une cu- vette des bandes de papier filtre dense,, exempt de cendres, à forte capacité de rétention (par excemple le papier 589 Blue Ribbon Spécial de Carl Schlei- cher & Schnell Co. Keene, N.H.) d'un demi pouce (13 mm) de largeur et de 58 cm de longueur à une température ambiante, constante dans une zone pro- tégée (par exemple dans un grand bocal) .Lesommet dela bande esten contact avec une réserve d'un système solvant particulier (également appelée le phase de dé- veloppement) contenu dans la cuvette. La partie inférieure de la bande pend librement et n'atteint pas la quantité de système solvant (ou de ses éléments volatils) placée en dessous des bandes suspendues pour faciliter la saturation de l'air par le solvant choisi.
Le produit à examiner (qui peut être un bouillon de fermenta- tion ou un solide isolé) est placé sur un point marqué à la partie supérieure de la portion de la bande qui pend librement dans l'air. Dans le cas d'un so- lide, on le dissout dans un solvant utilisable quelconque. Les quantités u- tilisées sont celles qui donnent une zone de grandeur pratique lors de l'essai final et on peut les déterminer par des expériences simples. Par exemple, une quantité utile est 5 microlitres (0,005 expe cm3) d'une solution contenant 1 mg d' Omégamycine par cm3 de solvant pour l'essai sur B. subtilis. La bande est sé- chée, puis pracée en position dans la cuvette qui contient la système solvant choisi.
On laisse migrer le solvant vers le bas, c.à.d. dévélopper la bande jusqu'à ce que le front du solvant atteigne la partie inférieure de la bande.
Il faut pour cela environ 15 heures; l'atmosphère environnante est maintenue à une température constante, sans courant d'air, et saturée de la vapeur du solvant placé au fond du bocal.
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La bande est ensuite retirée, séchée à l'air et placée sur une plaque d'agar à un pH déterminé (6,2 dans le cas présent), inoculé par un organisme d'essai, dans ce cas le B. subtilis. Après un séjour jusqu'au lendemain dans un réfrigérateur, les bandes sont enlevées et les plateaux marqués pour identifier les bandes, incubés jusque au.lendemain, puis rele- vés directement ou photographiés pour obtenir un document permanent.
La silhouette de la bande toute entière est visible. La si- tuation de chaque agent antibiotique sur la bande est marquée par une zone claire qui contraste avec la zone trouble oû l'organisme d'essai s'est dé- veloppé. La bande représentée sur la photographie est divisée en zones re- présentant 5, 10,10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 15% de la'distance entre le point de l'application de l'échantillon et la partie inférieure de la ban- de et ces zones sont décrites comme possédant des valeurs Rf de 1 à 10 in- clus. Une petite tache au centre exact de la bande aurait donc une valeur Rf6, tandis qu'une tache plus grande s'étendrait dans les zones adjacentes et aurait des valeurs Rf 5, 6, 7 en comptant .La zone toute entière.
Suivant ce procédé, le.spectre de valeurs Rf de l'Omégamycine (lot 30) est le suivant, en utilisant 5 microlitres d'une solution de l'an- tibiotique à lmg/cm3 comme échantillon et en effectuant l'essai avec le B. subtilis dans de l'agar au pH 6,2 dans les douze systèmes solvants ci-dessous:
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<tb>
<tb> Système <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> G <SEP> H <SEP> I <SEP> J <SEP> K <SEP> L
<tb> solvant
<tb> Valeurs <SEP> 6,7 <SEP> 5,6 <SEP> 4,5 <SEP> 4,5,6 <SEP> 1 <SEP> 8,9,10 <SEP> 6,7 <SEP> 8 <SEP> 5 <SEP> 9,10 <SEP> 6,7,8 <SEP> 3,4,5
<tb> Rf
<tb>
La composition de ces systèmes solvants s'établit comme suit :
A - Eau B - Citrate de sodium en solution aqueuse à 10% G - Citrate de sodium en solution aqueuse à 40% D - Butanol saturé d'eau E- Méthyl-isobutyl-cétone anhydre F - Mélange de 100 parties. de méthanol à 80% et de 10,5 parties de pipéri- dine, réglé au pH 9,5 par l'acide acétique.
G - Mélange en volume de 80 parties de métinanol, 5 parties d'acide acétique glacial et 15-prtiés d'eau.
H- Butanol saturé d'cau et contenant 2% d'acide p-toluène-sulfonique.
I- Mélagne de 100 d'eau butanol saturé d'eau et de 5 ene d'acide acétique glaciale J - Butanol saturé d'eau et contenant 2% d'acide p-toluène sulfonique et 2% de pipéridine.
K - 100 parties de butanol saturé d'eau et 2 g d'acide p-toluène-sulfonique plus 2 car de pipéridine plus 2 g d'acide laurique.
L - Mélange de 2 parties d'alcool isoamylique et de 1 partie de tétrachloru- re de carbone saturé d'une solution aqueuse de citrate de sodium à 10%.
Dans ce cas, avant application de l'échantillon, les bandes sont saturées d'une solution aqueuse de citrate de sodium à 10% réglée au pH 5,7 à 1' aide d'acide citrique, et séchées.
Exemple 15.-
On extrait le solide A de l'exemple 14 par 50 cm3 d'hydroxyde d'ammonium en solution aqueuse au pH 6,4, ce qui laisse 220 mg d'un solide brun. On extrait le solide B, (0,5 g) de l'exemple 14 par 30 cm d'hydroxy- de d'ammonium en solution aqueuse au pE 6,4, en laissant 120 mg de matières solides. Les solutions aqueuses basiques d'Omégamycine sont réunies et ver-
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sées dans une colonre chromatographique (0,5 x 4 ponces) (13 x 100 mm) con-
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tem.nt y5 g de Florisil (silice chrouatographique).. On sépare de l'effluent brun êhtiroti 600 mg de matière solide brune ne possédant qu'une faible acti- vité.
On lave ensuite la colonne avec 125 cm3 d'acétone, puis 125 cm3 d'éthanol et on rejette les produits de lavage jaunes. On lave ensuite la colonne par de l'acide chlorhydrique à 1% (100 car). La solution de lavage éthanolique acide est déplacée par l'eau et l'eau est neutralisée par de 1'
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hydroydê d'ammonium, puis lyophilisée pour donner 1-'Omégam . solide (lot 32) pesant 0,5 g et possédant une activité de 24 mm à 1 mgcm3, dilution 1:16 (dian1Èjtre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec . subtilis au pH 6,2).
Exemple 16.-
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De la même fagon que dans l'exemple 15 ei=àé%ua4s , on extrait un bouillon adsorbé sur Florisil par du butanol au pH 8,5 et on sèche l'attrait par distillation azéotropique. En le versant dans du Skellysolve C, l'Oméga- mycine solide est précipitée et on peut la séparer (500 mg; lot 36) . Elle possède une activité supérieure à 30 mm à 1 mg/cm , dilution 1 :16 (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2).
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E.ty ..f..G r' On peut transformer une 0mégamyeine de pureté quelconque en sel de sodium en traitant la matière dans leau par de l'hydroxyde de sodium jusqu'à ce que le pH dépasse 9,5. La solution est ensuite congelée et séchée
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sous vide pour obtenir le sel de sodium sec sous forme d'UJi.M"Poud1:-e stable soluclé dans l'eau.
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Exemn.e 8 - On peut transformer de 1'Omégamycine de pureté quelconque en chlorhydrate en traitant la matière dans l'eau par de l'acide chlorhydrique jusqu'à ce qu'on obtienne une solution limpide et que le pH soit inférieur à 3 - 4. La solution est congelée et séchée sous vide pour obtenir une poudre facilement soluble.
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L'Omégamyoine de la présente invention est identique à la tétracyclone dont les propriétés ont été décrites dans le Journal of tne Amerioan Chemical Society, Volume 75, pages 4621 à 4623, 1953. On attribue a l'0lmégamycme (I ) à la tétracycline (I ) a".'ljttracycline (II) et à la chlorotétracycline (III) les structures suivantes :
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Un échantillon de base libre de la tétraayaline, préparé suivant les indications de la littérature à partir de chlorotétracycline, fond à 170- 175 C et contient 0,71% de chlore, ce qui indique une contamination par environ 10% de chlorotétracycline n'ayant pas réagie Cet échantillon est iden-
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tique à un échantillon d'Omégamycine (lot 30), et toutes les impuretés sont distinguées par examen de ces échantillons et d'échantillons de chlorotétracycline et d'oxytétracycline, seules et en mélange, par chromatographie sur bande de papier (particulièrement avec le système solvant L).
Le fait que l'Omégamycine (lot 30) est identique à la tétracycline est également prouvé par une vitesse identique de perte d'activité dans un tampon au pH 8,0 à 370 C à environ 0,7mg/cm3 (28% de perte en 48 heures); la chlorotétracycline perd environ 50% de son activité en 14 heures et l'oxy- tétracycline perd environ 50% de son activité en 26 heures dans les mêmes conditions.
En outre, l'Omégamycine se différencie clairement de la chlorotétracycline et de l'oxtétracycline par un essai sur de l'agar au pH 8,0 dans lequel la chlorotétracycline et l'oxytétracycline se révèlent beaucoup moins actives que l'Omégamycine.
Des essais de matières solides ont été exécutés sur des plaques de B. subtilis avec de l'agar au pH 6,2 et au pH 8,0 en utilisant comme diluant des tampons correspondants au pH de l'agar. Les résultats :'essais caractéristiques sont les suivants :
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Antibiotique Concentration Dimension de la zone en mm introduite dans Bs. (6,2) Bs.
(87êff le cylindre '' cm3 Chlorotétracycline ,( o .5 19 NR z2 20.2 m Oxytétracycline 4 15.5 Nl Tétracycline 50 21.5 19.0 Chlorotétracycline 1 21.5 18.2 plus Tétracycline 5 0 Omégamycine (lot 25) 100 20.2 16.6 0mégamycine (lot 30) f25 23.2 15.1 12.5 20.8 12.9
L'Omégamycine peut être débarrassée des quantités contaminantes de chlorotétracycline ou d'oxytétracycline en maintenant une solution aqueuse au pH 8,0 environ jusqu'à ce que toute la chlorotétracycline ou l'oxytétracycline se soit décomposée puis en isolant l'Omégamycine purifiée comme ci-dessus, R E V ENDICATIONS. l.
Substances Inhibant le développement des bactéries à Grampositif et à Gram-negatif, choisies dans le groupe formé par une substance amphotère pouvant donner des sels avec les acides et les métaux, ladite substance étant constituée des éléments carbone, hydrogène., azote et oxygène, étant relativement soluble sous la forme du chlorhydrate dans le butanol et la méthyl-isobutyl-cétone et possédant le spectre de valeurs Rf décrit plus haut; et les sels d'acide et de métaux de cette substance.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.