Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique Dans le brevet principal, on a décrit un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique qui a été dénommé antibiotique C . Le présent brevet concerne un procédé de préparation d'un autre nouvel antibiotique. Dans la description qui suit, ce nouvel antibiotique sera dénommé antibiotique D , à titre de simplification.
L'antibiotique D est un corps solide amor phe basique, contenant seulement les éléments carbone, hydrogène, azote et oxygène. Il fond à 252 C ; son pouvoir rotatoire
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est de 116 (C = 0,5 % dans de l'acide chlorhydri- que 0,1 N). Il est très soluble dans l'eau et le méthanol, et soluble dans l'éthanol chaud, duquel il est séparé par refroidissement. Il est insoluble dans l'acétone, l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle et le benzène.
Il est en outre caractérisé par les maxima d'absorption qu'il présente dans l'ultraviolet à 314 mu avec un
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de 123 dans l'acide chlorhydrique 0,1 N, à 302 mu avec un
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de 125 dans un tam pon de phosphate<I>pH 7,0,</I> et à 321,5 mtc avec un
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de 143 dans de la soude caustique 0,1 N. A une concentration de 12,5 icg/cms, l'antibiotique D empêche complètement la croissance du Mycobacterium <I>tuberculoses</I> var.
hominis H 37 Rv. L'antibiotique<I>D</I> a un Rf de 0,0 dans un mélange de solvants composé de 3 parties en poids d'acétate d'éthyle, de 3 parties en poids d'eau et d'une partie en poids d'acide acétique, il a un Rf de 0,19 dans un mélange de solvants composé de 10 parties en poids de n-butanol, d'une partie en poids d'acide acétique et de 4 parties en poids d'eau.
L'antibiotique D donne aussi une réaction né gative pour le groupement arylamino avec le réactif d'Ehrlich et une réaction Bratton - Marshall également négative pour le même groupement.
Il peut être précipité de ses so lutions aqueuses par plusieurs des agents de précipation usuels pour les bases, par exem <B>ple</B> l'acide p-hydroxyazobenzène-sulfonique, l'acide picrique, l'Orange II, l'acide flaviani- que, l'acide p-nitrobenzèneazo-chromotropi- que, le rouge Congo, le jaune Milling 3G. Les précipités formés sont des solides ou gommes insolubles dans l'eau, mais solubles, pour la plupart, dans les alcools inférieurs et le mé- thylcellosolve.
L'antibiotique D est très actif contre cer taines bactéries z < résistantes aux acides , qui sont les agents causant la tuberculose. L'acti vité de l'antibiotique D contre le Mycobacte- rium <I>tuberculoses</I> var.
hominis <I>H</I> 37 Rv, est à peu près égale à celle de plusieurs antibioti ques connus tels que celui produit par le Streptomyces puniceus, la streptothricine et la néomycine, et supérieure à celle de la chlor- tétracycline. Ce nouvel antibiotique est aussi fortement actif, au point de vue bactériostati que, contre les bactéries gram-positives de même que certaines bactéries gram-négatives. La table I montre de façon plus frappante le spectre antibiotique remarquable de l'antibio tique D.
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Le procédé selon l'invention, de prépara tion de ce nouvel antibiotique, est caractérisé en- ce qu'on inocule un milieu nutritif stérile avec le microorganisme<I>Streptomyces C 1730,</I> en ce qu'on cultive<B>le</B> milieu nutritif inoculé dans des conditions aérobies à une tempéra ture de 20 à 40 C pendant une période de 1 à 15 jours, et en ce qu'on isole du milieu de culture un antibiotique basique fondant sous forme pure à 252 C.
Cet antibiotique est une nouvelle substance dont le pouvoir rotatoire
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est de 116 à une concentration de 1,5% dans de l'acide chlorhydrique 0,1 N. Ses autres propriétés physiques et chimiques ont déjà été indiquées plus haut.
Streptomyces C 1730 est un actinomycète du genre Streptomyces. Ce microorganisme se trouve entre autres dans les sols. On peut ob tenir des cultures en mélangeant des cultures des bactéries spécifiques inhibées par l'anti biotique b avec de l'agar aqueux et en y ajoutant un sol contenant le Streptomyces C 1730 désiré. Après incubation du mélange pendant un à dix jours, il apparaît des colo nies de l'actinomycète désiré et d'autres anta gonistes. Les colonies du<I>Streptomyces C 1730</I> sont séparées des autres, et transférées dans un milieu nutritif frais, puis isolées comme cul tures pures selon les méthodes usuelles.
Une culture vivante de ce microorganisme a été dé posée au Bureau de Culture Parke, Davis & Company, à Detroit (Michigan), sous N 04918.
Examiné au microscope, cet organisme est un actinomycète aérobie qui forme un faible mycélium aérien ramifié, rarement ou pas cloi sonné, et qui donne naissance à des chaînes de conidies unicellulaires ; il est donc un membre du genre Streptomyces. Lorsqu'il a crû sur un milieu glucose-thryptone-agar, le jeune mycé lium primaire humide apparaît incolore à jau nâtre, devenant ensuite gris ; le mycélium se condaire aérien est d'abord blanc, et devient ensuite gris. Il n'apparaît que peu ou pas de pigements dans l'agar. Les colonies en surface sont circulaires, exhaussées, ridées ou à crê tes radiales, avec un bord continu ou ondulé. Le mycélium primaire humide est hyalin et excessivement ramifié.
Il présente des embran chements primaires, secondaires et quelquefois tertiaires, qui peuvent être alternes, opposés, et parfois verticillés. Le mycélium aérien est on dulé et forme souvent des boucles terminales ou des spires lâches. Les portions distales de ce mycélium aérien se subdivisent en chaînes de conidies d'une longueur de 15 à 55 microns. Les conidies sont hyalines, sphéroïdales à ovoïdales, d'un diamètre moyen de 0,85 mi cron (compris entre 0,5 et 1,2), et d'une lon gueur moyenne de 1,3 micron (entre 0,8 et 1,8).
Cet organisme liquéfie lentement la géla tine, sans formation de pigments, et peptonise le lait tournesolé usuellement avec une réac tion basique. En milieu synthétique (de Gott- lieb), l'organisme utilise de nombreuses sour ces de carbone y compris le 1-arabinose, le dextrose, le d-fructose, le d-galactose, l'i-ino- site, le lactose, le maltose, la d-mannite, le rhamnose, l'amidon et le d-xylose ;
il utilise moins facilement l'inuline, le raffinose, la d- sorbite et le sucrose; et ne peut utiliser la dul- cite. Cet organisme utilise les sources d'azote organiques et inorganiques.
Lorsqu'on exécute le présent procédé à l'aide de milieux nutritifs aqueux, la matière solide présente dans le mélange de culture est enlevée et l'antibiotique cherché est isolé à par tir du liquide de culture par les méthodes dé crites dans la suite. Lorsqu'on emploie un mi lieu nutritif solide, le mélange de culture est bien lavé avec un solvant de l'antibiotique, tel que l'eau ou le méthanol, et l'antibiotique cher ché est isolé à partir de cet extrait. Durant la phase d'incubation, on maintient la tempéra ture de préférence dans le voisinage de 22 à 29 C. Lorsque l'on utilise des milieux nutri tifs aqueux, le<I>pH</I> initial est d'ordinaire entre 6 et 8,2, et de préférence du côté alcalin entre environ 7,3 et 7,7.
Pour l'inoculation du' mi lieu nutritif, on peut employer des suspensions de spores, des subcultures ou des cultures en tube couché du<I>Streptomyces C 1730.</I> La culture du microorganisme en milieu nu tritif aqueux peut être effectuée de bien des manières différentes. Par exemple, le micro organisme peut être cultivé dans des conditions aérobies à la surface du milieu, ou bien il peut être cultivé au-dessous de ladite surface, c'est- à-dire en condition submergée; à condition de fournir en même temps de l'oxygène.
La mé thode préférée pour produire l'antibiotique D sur une large échelle est celle à culture sub mergée ou en profondeur<I>du Streptomyces C</I> <I>1730.</I> Selon cette manière d'exécuter l'inven tion, un milieu nutritif aqueux stérile est ino culé avec du<I>Streptomyces C 1730</I> et incubé avec agitation et aération à une température entre 20 et 401, C, de préférence au voisinage de 25 à 35 C, pendant un à quatre jours. Dans ces conditions, l'organisme se développe en nombreuses particules plus ou moins séparées, réparties dans tout le milieu, en contraste avec la pellicule plus ou moins continue présente à la surface du milieu, dans la méthode de cul ture en surface.
Grâce à cette distribution de l'organisme dans tout le milieu, on peut cul tiver en une seule fois de grands volumes du milieu nutritif inoculé dans de grands réser voirs et cuves utilisés ordinairement dans l'in dustrie des fermentations. Des foudres de fer mentation stationnaires munis de moyens con venables d'agitation et d'aération, de même que des tambours rotatifs horizontaux, sont parti culièrement avantageux à ces fins. Cependant, pour la préparation de petites quantités de l'antibiotique ou de cultures du microorga- nisme, cette méthode de culture submergée peut être exécutée dans de petites bouteilles qui sont secouées ou agitées par des moyens mécaniques convenables.
L'agitation et l'aération du mélange de cul ture peuvent être obtenues de diverses ma nières. L'agitation peut être produite par un propulseur ou par un dispositif mécanique semblable d'agitation, par rotation ou secouage du récipient lui-même, par différents dispositifs de pompage, ou par passage à travers le mi lieu d'air ou d'autres gaz contenant de l'oxy gène. L'aération peut être produite en injec tant dans le mélange en fermentation de l'air ou antres gaz contenant de l'oxygène à tra vers des tuyaux ouverts, des tuyaux perforés, des organes poreux de diffusion tels que des bougies de charbon, du carborundum, du verre aggloméré et semblables ; elle peut aussi être produite en pulvérisant, projetant ou versant le mélange à travers une atmosphère contenant de l'oxygène.
Le gaz contenant l'oxygène est dé barrassé de spores, de bactéries ou autres agents de contamination avant d'être introduit dans le mélange de culture. Ceci peut être obtenu très commodément en le filtrant à travers un lit de noir animal activé. L'intensité d'aération as surant un rendement maximum en antibiotique D dépendra, il va de soi, quelque peu du genre de réservoir employé, de l'intensité et du genre de l'agitation, du<I>pH,</I> de la température et d'autres conditions de ce genre.
En tout cas, le gaz contenant de l'oxygène est de préférence fourni en quantité suffisante pour maintenir une faible pression positive dans le récipient et éliminer ainsi toute possibilité de contamina tion de la culture par rentrée d'air extérieur. Avec des récipients du type à réservoir de 30 litres de capacité, une quantité de 10 à 15 li tres d'air par minute donne de bons résultats, quand on l'utilise avec un propulseur mécani que type turbine à six pales, de 10 cm de dia mètre, tournant à 100-200 tours à la minute en regard de quatre déflecteurs périphériques ver ticaux de 2,5 cm sur 40.
On peut employer une grande variété de milieux nutritifs. De tels milieux comprennent d'ordinaire une source de carbone assimilable, une substance protéinique, des sels minéraux et des traces de diverses substances nutritives, vitamines et autres stimulants de croissance, qui se trouvent en général comme impuretés dans les autres constituants du milieu. Pour une production maximum de l'antibiotique D, le milieu nutritif contiendra aussi avantageuse ment une source de graisse. Comme source de carbone assimilable, on comprend ici les al cools polyhydroxyliques, et les mono-, di- et polysaccharides, tandis que par matière pro-.
téinique , on comprend des protéines non mo difiées et des produits de dégradation des pro téines, en particulier ceux provenant de l'hy- drolyse de protéines. De tels produits de dé gradation sont les protéases, les peptones, les polypeptides, les peptides et les aminoacides.
Comme source de carbone assimilable, on peut employer l'arabinose, le fructose, le galac tose, le lactose, le maltose, le rhamnose, le xy- lose, la glycérine, la mannite, la rhamnite et semblables, de même que des matières com plexes à base d'hydrates de carbone, tels que les amidons, la dextrine, les lavasses de fer mentation et de distillation, les céréales solides trempées à l'eau, des liquides de trempage de céréales, des résidus séchés de fermentation et autres semblables.
Parmi les matières protéiniques utilisables dans les divers milieux, on peut citer l'extrait de boeuf, la caséine hydrolysée à l'acide, la peptone de boeuf, la farine de tourteau de soya; des résidus secs de fermentation, la fa rine de fèves de soya, soluble à l'eau, dégrais sée et partiellement hydrolysée, des mélanges d'acides aminés provenant de sources naturel les ou synthétiques, l'urée, les purines et sem blables. L'emploi de farine de tourteau de soya ou de dérivés de protéines de soya comme constituant du milieu est avantageux et four nit une faible quantité de graisse, utilisable par le microorganisme.
On peut satisfaire aux prin cipaux besoins en constituants minéraux par ad dition de 0,1 à 0,5 % d'un ou plusieurs sels inorganiques tels que le chlorure de sodium, le carbonate de calcium, le phosphate dipotas- sique, le phosphate monopotassique et sembla bles. Les autres constituants du milieu nutritif, c'est-à-dire les vitamines, les stimulants de croissance et semblables, sont généralement présents en quantités suffisantes dans les sour ces de carbone assimilable impures et/ou les matières protéiniques.
L'antibiotique D peut être isolé du mélange brut de culture par de nombreuses voies dif férentes. Lorsqu'on a utilisé un milieu de cul ture solide, le mycélium est traité pour extrac tion avec un dissolvant de l'antibiotique D, tel que l'eau, et le produit est isolé de l'extrait comme décrit dans la suite. Quand on a em ployé un milieu de culture liquide, le mélange peut être filtré pour enlever le mycélium, ou bien on peut amener le<I>pH</I> du mélange avec un acide à environ 2 à 4, et éliminer ensuite le mycélium par filtration.
Pour obtenir "l'antibiotique à partir des ex traits ainsi formés, on peut procéder par ex traction par solvant, avec des alcools alipha tiques inférieurs miscibles à l'eau, tels que le n-butanol ou par les méthodes d'adsorption et élution, en employant du charbon activé ou des échangeurs d'ions comme absorbants et du méthanol acidifié ou de l'ammoniaque aqueuse, respectivement, comme éluants.
Les méthodes ci-dessus conduisent à l'ob tention de concentrats bruts, lesquels peuvent ensuite être purifiés par fractionnement avec des solvants organiques, par exemple par dis solution dans du méthanol et précipitation frac tionnée avec de l'éther éthylique, ou par pré cipitation avec un acide arylsulfonique suivie d'une régénération à partir du sel colorant ainsi formé.
La séparation de l'antibiotique D à partir des concentrats bruts purifiés peut être effec tuée de diverses façons. Par exemple, l'anti biotique D peut être obtenu à partir de la li queur mère provenant de la séparation, par cristallisation, d'un corps solide du résidu de concentration de l'effluent aqueux.
Selon une variante; l'antibiotique D peut être obtenu à partir de la liqueur mère provenant du traite ment d'une' solution aqueuse du concentré brut avec de l'ammoniaque en vue d'éliminer une fraction indésirée. Finalement, l'antibiotique D peut aussi être obtenu à partir de la liqueur mère subsistant après addition d'acétate de po tassium à une solution aqueuse du concentré, pour précipiter une fraction indésirée par ajus tement du<I>pH</I> et par relargage.
Les liqueurs mères provenant d'une des méthodes susindiquées sont utilisées efficace ment pour l'obtention de l'antibiotique D. Une chromatographie à la cellulose permet un iso lement convenable de l'antibiotique D. Ce der nier est adsorbé par la cellulose à partir de sa solution dans un mélange d'acide acétique, acétate d'éthyle et eau. L'élution avec de l'eau donne un liquide effluent à partir duquel l'an- tibiotique D -peut être obtenu facilement par concentration.
A côté de l'antibiotique D, il se forme tou jours dans le milieu de culture un autre anti biotique, dénommé antibiotique C. Ce dernier constitue un 'sous-produit de valeur, suscepti ble d'être également récupéré et purifié en vue de son utilisation thérapeutique.
L'invention est illustrée par les exemples sui vants <I>Exemple 1</I> Un mélange formé de -180 g d'amidon de blé en poudre, 180 g de caséine hydrolysée à l'acide, 90 g de farine de tourteau de soya, 90 g de chlorure de sodium, et d'eau en suf fisance pour faire un volume de 18 litres, est mis dans un récipient de verre type cuve sta tionnaire, pourvu d'une calotte d'acier inoxy dable et d'un propulseur à turbine. Le récipient est revêtu de verre et possède quatre déflec teurs intérieurs verticaux de 2,5 cm sur 40. Il est équipé pour introduire trois courants d'air dans les eaux du propulseur.
On règle le<I>pH</I> du mélange dans le réci pient à 7,5 avec une solution de soude caus tique 10 N. On additionne le mélange de 72 g de saindoux brut et d'huiles végétales contenant des mono- et di-glycérides et 18 g de carbo nate de calcium. Le récipient et le milieu de culture sont stérilisés sous 1,35 atm de vapeur pendant deux heures, puis le récipient et son contenu sont refroidis et sortis de l'autoclave. Le milieu est inoculé aseptiquement avec 10 cmD d'une suspension de spores de<I>Strepto-</I> <I>myces C 1730</I> préparée en secouant une cul ture en tube couché de<I>Streptomyces C 1730</I> de 7 jours sur glucose-tryptone-agar avec 10 ce d'une solution aqueuse de savon blanc dit de Castille à 0,01 %.
Après inoculation, le mélange de culture est incubé à 24-26 C pendant 24 heures. Pen dant l'incubation, on fait passer de l'air stérile à travers l'anneau de diffusion à raison de 0,9 à 1,16 litre d'air à la minute par litre du milieu, e on fait tourner l'agitateur à une vi tesse d'environ 200 tours à la minute.
On suit la production d'antibiotique durant l'incubation en prélevant de temps en temps des échantillons et en les essayant par rapport <I>à</I> l'Escherichia coli. Au bout de 64 heures, cha que millilitre de culture équivaut à 920 ,ug de l'étalon, dans l'essai par rapport<I>à</I> l'Escheri- chia coli. L'étalon est un concentrai de l'anti biotique D d'une activité telle qu'une solution de 2,5 ,ug de l'étalon par cm8 produit une inhi bition de 50 % de l'Escherichia coli.
Les bières de plusieurs fermentations effec tuées comme décrit ci-dessus, sont combinées à la fin de la période d'incubation. Le<I>pH</I> du mélange est amené 'à 2,47 avec de l'acide sul furique, et le mycélium est enlevé par filtra tion et lavé à fond avec de l'eau. Le filtrat et les eaux de lavage combinés (41,1 litres) sont amenés à un<I>pH</I> de 9,10 et extraits avec six portions de 10 litres de n-butanol. Les extraits au n-butanol combinés sont concentrés à 10,6 litres dans un évaporateur à une température au-dessous de 29,) C. Un précipité jaune pâle, sensiblement inerte, qui se forme pendant cette concentration, est éliminé par filtration.
Le fil trat est extrait avec 8 portions de 1,5 litre d'acide chlorhydrique aqueux 0,01 N. Les ex traits acides combinés sont traités avec suffi samment d'un échangeur d'ions résineux (phase basique) pour éliminer l'excès d'acide, et la solution est concentrée à l'évaporateur à 30o C, jusqu'à 1,5 litre. Cette solution est alors sé chée à l'état congelé, et le résidu, du poids de 20,08 g, contient, d'après l'essai avec l'Escherichia coli, <I>452</I> pg de l'étalon par mg.
Pour purifier encore ce concentrat brut, on en ajoute 5,0 g à 25 ml de méthanol absolu. Il se sépare environ 1,4 g d'un solide insolu ble blanc, que l'on lave avec quatre portions de 5 ml de méthanol absolu. Les liquides surna- geants combinés sont dilués à 50 ml avec du méthanol absolu. On ajoute alors 100 ml d'éther éthylique et le précipité jaune brun qui se forme est séparé par centrifugation, lavé avec de l'éther éthylique, et séché dans le vide. Le rendement est de 2,4 g et le produit con tient, selon l'essai avec l'Escherichia coli, 900 ,ug de l'étalon par par mg.
Ce produit brut purifié est très soluble dans l'eau. Pour isoler l'antibiotique D, on dissout 150 mg de concentre brut purifié dans un mélange de 3 parties d'acétate d'éthyle, 3 par ties d'eau et 1 partie d'acide acétique. Cette solution est introduite à raison de 3-4 ml à l'heure, dans une colonne contenant 35 g d'une cellulose connue sous la marque Solka Floc . La colonne est alors développée avec du solvant frais, et l'on recueille des fractions de 3 ml à intervalles de 1 heure. Lorsque les fractions de l'effluent deviennent négatives au réactif d'Ehrlich, la colonne est éluée avec 100 ml de solvant, puis avec de l'eau. L'éluat aqueux (environ 100 ml) est séché à l'état congelé, et l'on obtient une poudre brune.
En dissolvant ce produit dans du méthanol et pré cipitant avec de l'éther éthylique, on a obtenu une poudre légèrement bronzée, dont l'activité envers l'Escherichia coli a été trouvée être de 1070 yg/mg de l'étalon.
L'antibiotique solide D présente une activité prononcée quand on l'essaie contre le Mycrobacterium <I>tuberculoses</I> var. hominis <I>H 37</I> Rv. Les spectres d'absorp tion de l'antibiotique<I>D</I> à des<I>pH</I> différents ne présentent qu'un maximum à 314 m,p,
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est de 103 dans l'acide chlorhydrique 0,1 N, est de 125 dans un tampon à 302 mu, au phosphate<I>pH 7,0,</I> et à<B>321,5</B> mie,
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est de 143 dans une solution de soude causti-
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que 0,1 N.
<I>Exemple 2</I> Un mélange formé de 1,5 g de cérélose, 1,5 g de glycérine, 0,9 g de caséine partielle ment hydrolysée, 0,75 g de peptone, 0,3 g de levure de brasserie, 0,75 g de céréales solides trempées à l'eau, 0,75 g de farine de tour teau de soya, 1,5 g de résidus de fermentation butanol-acétonique, 1,5 g de chlorure de so dium, 0,3 g de carbonate de calcium et suffi samment d'eau pour porter le volume à 300 ml, est mis dans plusieurs flacons d'Erlen- meyer de 1 litre.
Les flacons sont couverts par de la gaze de coton et stérilisés sous 1,25 atm de vapeur pendant 25 minutes, puis chaque fla con est inoculé aseptiquement avec 1 cm-3 d'une suspension de spores de<I>Streptomyces C 1730</I> préparée à l'aide d'une culture en tube cou ché de trente jours sur glucose-tryptone-agar. Les flacons sont secoués sur une machine se- coueuse du type rotatif, à 150 tours par mi nute, pendant quatre jours. La température pendant la période d'incubation est maintenue à 22-24 C. A la fin de cette période d'incu bation, la bière de culture a un<I>pH</I> d'environ 6,7.
En l'essayant par rapport au Staphylococ- cus aureus, on a constaté que cette bière de culture produit une inhibition de 63 % de la croissance de l'organisme d'essai à une dilution de 1 à 100.
Le mycélium est séparé par filtration du bouillon contenu dans les flacons ci-dessus mentionnés, et le<I>pH</I> du filtrat est amené de 8,6 à<B>7,17</B> avec de l'acide sulfurique 3 N. L'antibiotique est retiré de 100 ml du filtrat par quatre extractions avec des portions de 25 ml de n-butanol. Les extraits alcooliques combinés sont évaporés à siccité à moins de 45,# C et l'on obtient un concentrat brut.
1,0 g de ce concentrat brut est dissous dans 20 cm-3 d'eau. On ajoute alors une solu tion de 550 mg d'acide p-hydroxyazobenzène- p-sulfonique dans 11 cm3 d'eau, ce qui provo que la formation immédiate d'un précipité gommeux. Le mélange est centrifugé, et le li quide surnageant, décanté. Le résidu gommeux est lavé à l'eau et recristallisé à partir de 6 ml d'éthanol absolu et 9 ml d'eau. Le précipité qui se forme par refroidissement est retiré par centrifugation, bien lavé à l'eau, et séché dans le vide (poids .: 570 mg).
Le complexe de couleur est alors dissous dans 10 ml de mé thanol et précipité sous forme de poudre jaune orange par addition de 30 ml d'éther éthylique (poids : 475 mg).
450 mg de ce complexe coloré sont dis sous dans 20 ml de méthanol à 50 0/a, et on y ajoute une solution aqueuse d'acétate de ba ryum jusqu'à ce que la précipitation de p-hy- droxyazobenzène-p-sulfonate de baryum soit complète. Le précipité est éliminé par centri fugation et au liquide surnageant, on addi tionne 1 ml en excès d'acide sulfurique 2 N après que tout ion baryum a été éliminé comme sulfate de baryum. Ce dernier est enlevé par centrifugation. Le liquide jaune clair surna geant est alors envoyé à travers une colonne d'échangeur d'ions en résine synthétique (phase basique). Le liquide effluent jaune clair a un<I>pH</I> de 7,6.
La colonne est lavée à l'eau jusqu'à ce que les eaux de lavage ne réagis sent plus avec le réactif d'Ehrlich. L'effluent et les eaux de lavage donnent, par séchage à partir de l'état congelé, une poudre légère ment jaune (poids : 173 mg) d'une activité par mg de 1150 ,ug de l'étalon, quand on l'es saie par rapport<I>à</I> l'Escherichia coli.
A 49 mg du concentrai brut purifié, on ajoute 1 cm3 d'eau et assez d'hydroxyde d'am monium 1 N pour porter le pH à 9,0. Il se forme un précipité blanc que l'on sépare par centrifugation. L'antibiotique-D peut être isolé du liquide aqueux ammoniacal surnageant par le procédé chromatographique à la cellulose, comme décrit dans l'exemple 1. <I>Exemple 3 : ,</I> Un mélange formé de 180 g de glycérine, 90 g de farine de tourteau de soya, 180 g de caséine hydrolysée à l'acide, 90 g de chlorure de sodium et assez d'eau pour avoir un volume total de 18 litres, est introduit dans un réci pient de verre type cuve stationnaire pourvu d'une calotte en acier inoxydable et d'un pro pulseur type turbine.
Le récipient est revêtu de verre et possède quatre déflecteurs intérieurs verticuax de 2,5 cm sur 40. Il est équipé pour introduire trois courants d'air dans les eaux du propulseur.
Le<I>pH</I> du mélange est réglé à 7,5 avec une solution 10 N de soude caustique. On ajoute au mélange 180 g de saindoux pour em pêcher la formation d'écume et 18 g de car bonate de calcium. Le récipient et le milieu de culture sont stérilisés sous 1,35 atm de vapeur pendant deux heures. Le récipient et son con tenu sont refroidis et sortis de l'autoclave.
Le milieu est .inoculé aseptiquement avec 10 ml d'une suspension de spores de<I>Streptomyces C</I> <I>1730</I> préparée en agitant une culture en tube couché de 7 jours sur glucose-tryptone-agar avec 10 ml d'une solution aqueuse à 0,01 % de savon blanc dit de Castille. Après inoculation, le mélange de culture est incubé à 251, C pendant 88 heures.
Pendant l'incubation, -on fait passer de l'air stérile à travers l'anneau de diffusion à raison de 0,3 à 1,0 litre à la minute par litre du milieu, et fait tourner l'agitateur à environ 200 tours par minute.
On suit la production d'antibiotique durant l'incubation, en prélevant de temps en temps . des échantillons et en les essayant par rapport <I>à</I> l'Escherichia coli. Au bout de quarante heu res, chaque millilitre de culture équivaut à 188 ,ug de l'étalon dans l'essai avec l'Escheri- clzia coli <I>;</I> après soixante heures, chaque milli litre équivaut à 410 p.g ; et nu bout de 88 heures, chaque millilitre est l'équivalent de 636 ,icg de l'étalon.
La culture brute acidifiée est filtrée pour éliminer le mycélium et le filtrat est amené à un<I>pH</I> de 7,0 avec de la soude caustique di luée. A une colonne contenant 600 cm2 d'une résine échangeuse de cations dans le cycle de l'hydrogène, on ajoute 7,5 litres du filtrat-bouil- lon de<I>pH</I> 7,0. Après lavage de la colonne avec de l'eau, la fraction antibiotique est com- plètemént évacuée de la colonne par élution avec de l'ammoniaque aqueuse 5 N.
La frac tion antibiotique peut être obtenue à partir de cet éluat comme concentré brut, purifiable par les méthodes décrites aux exemples 1 et 2.
L'antibiotique D est obtenu à partir du con- centrat brut purifié par la méthode décrite à l'exemple 1.
<I>Exemple 4</I> 100 cm3 de bouillon filtré, obtenu dans des conditions analogues à celle de l'exemple 3 et dont<I>le pH</I> a été amené à 7,5 avec une solu tion aqueuse de soude caustique, sont agités pendant 20 minutes avec 300 mg de charbon activé. La suspension est filtrée et le gâteau de charbon est agité avec 25 cm3 de métha nol acidifié (contenant 0,05 cm3 d'acide chlor hydrique 5 N par 100 cm-3 de méthanol). Le mélange est filtré, et l'élution est répétée.
Les extraits au méthanol sont réunis et concentrés dans le vide ; le concentrat brut contient en- viron 50 % de l'activité du bouillon original. L'antibiotique D peut être isolé à partir du bouillon de culture par chacune des métho- de & décrites dans les exemples précédents.
<I>Exemple 5</I> Un mélange formé de 1,0 g de glycérine, 0,5 g de farine de tourteau de soya, 0,5 g de peptone du commerce, 0,5 g de chlorure de sodium, et d'eau en suffisance pour porter le volume à 100 ml, est mis dans plusieurs fla cons d'Erlenmeyer. Les contenus de ces fla cons sont réglés à un<I>pH</I> de 7,5 avec une so lution 10 N de potasse caustique, et on y ajoute 0,1 g de carbonate de calcium.
Les flacons sont recouverts avec de la gaze de coton, et stéri lisés sous 1,02 atm de vapeur pendant 20 mi nutes ; chaque flacon est alors inoculé avec 1 ml d'une suspension de spores d'une culture en tube couché de vingt-sept jours sur glucose- tryptone-agar. Les flacons sont secoués sur une machine secoueuse du type rotatif, à 160 tours par minute, pendant six jours. La température est maintenue à 24-26 C pendant la période d'incubation. A la fin de cette période, le bouil lon de culture a un<I>pH</I> de 8,3. Essayé par rap port<I>à</I> l'Escherichia coli, un millilitre de bouil lon est équivalent à 800 pg de l'étalon.
L'antibiotique D peut être isolé de ce bouil lon de culture par chacune des méthodes dé crites aux exemples 1, 2 et 3.
Des résultats analogues peuvent être obte nus en remplaçant la peptone par de la levure de brasserie débarrassée de ses substances amè res. <I>Exemple 6</I> Un milieu nutritif formé de 1,25 g de gly cérine, 0,75 g de caséine hydrolysée à l'acide, 1,25 g de céréales solides trempées à l'eau, 1,25 g de chlorure de sodium, et d'assez d'eau pour porter le volume à 250 ml, est rendu alcalin à un<I>pH</I> de 7,3 avec une solution 10<I>N</I> de soude caustique. Après addition de 0,25 g de carbonate de calcium, le mélange est mis dans un flacon de Fernbach bouché avec un tampon de coton, et stérilisé sous pression de vapeur de 1,25 atm pendant 25 minutes.
Le milieu est inoculé avec 2 ml d'une suspension de spores de<I>Streptomyces C 1730</I> provenant d'une culture en tube couché de 7 jours sur glucose-tryptone-agar. Le mélange résultant est incubé à 29o C pendant 11 jours. Au bout de ce temps, le bouillon de culture a une activité, déterminée par rapport<I>à</I> l'Escherichia coli, équivalant à 273 ,ug de l'étalon, par millilitre de bouillon.
L'antibiotique D peut être isolé à partir du bouillon de culture par chacune des méthodes décrites aux exemples 1, 2 et 3.