Procédé de préparation de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine La L-6-diazo-5-oxo-norleucine possède des pro priétés tout à fait particulières, comme cela ressort de la description qui suit.
Ce composé contient seule ment les éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote et a la formule brute C6H@NsO'3. Il a un. poids moléculaire de 171 et peut être représenté par la for mule développée
EMI0001.0014
La L-6-diazo-5-oxo-norleucine est relativement instable à la chaleur et se décompose avant de fondre. La décomposition ne se produit pas à une tempé rature spéciale et, par conséquent, les points de décomposition et de fusion varient entre de larges limites selon la méthode employée pour leur déter mination.
La décomposition commence en général à environ 1450 C et peut continuer jusqu'à ce qu'on atteigne 155,1 C. La L-6-diazo-5-oxo-norleucine se décompose dans les acides aqueux avec libération d'azote. Les courbes de liaison d'hydrogène montrent des valeurs pour peu dans l'eau de 2,1 et 8,95. Le pouvoir rotatoire spécifique [a]D de la Lr6-diazo-5- oxo-norleucine est -I- 210 (à 5,4'% dans l'eau).
La L-6-diazo-5-oxo-norleucine est très soluble dans l'eau, mais insoluble dans les solvants organi ques non polaires ordinaires. Elle est seulement très légèrement soluble dans le méthanol absolu, Péthanol absolu ou l'acétone à froid,
mais est soluble dans les solutions aqueuses chaudes de ces solvants. Elle donne la coloration spécifique bleu pourpre dans l'essai à la ninhydrine. L'oxydation par l'acide pério- dique de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine donne l'acide L-glutamique.
La L-6-diazo-5-oxo-norleucine forme des .sels de métaux par réaction avec des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, alcoyloxydes, amidures, etc., de métaux alcalins ou alcalino-terreux.
Dans un tampon de phosphate aqueux, à un pH de 7, les maxima caractéristiques d'absorption dans l'ultraviolet sont pour Ei #m de 683 à une longueur d'onde de 274 millimicrons et de 376 à une .longueur d'onde de 244 millimicrons.
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge de- la L-6-diazo-5-oxo-norleucine est remarquable. Quand on le détermine par la méthode au disque die bro mure de potassium, le spectre montre des sommets d'absorption aux longueurs d'onde suivantes : 3,19, 3,32, 3,78, 4,6.6,, 6;14, 6,30, 6,59, 6,90, 7,18, 7,39, 7,54, 8,33, 8,66, 8,98, 9,36; 9,71,- 10,08, 10,22, 10,59, 11,65, 12,08, 12,34 et 13,16 microns.
La L-6-diazo-5-oxo-norleucine possède des pro priétés phytotoxiques bien marquées, et est particu lièrement utile comme herbicide, destructeur de mau vaises herbes et semblables. 5 Elle est également utile du fait qu'elle empêche la biosynthèse, dans les cellules vivantes,, d'acides nu cléiques essentiels et de précurseurs d'acides nucléi ques.
Le produit exerce une action inhibitrice sur le développement de néoplasmes, et pour cette raison est intéressant pour le traitement de maladies néo- plastiques chez l'homme et chez l'animal. La L-6- diazo-5-oxo-norleucine est particulièrement active contre les levures.. Grâce à cette particularité;
elle peut être utilisée pour l'isolement de bactéries, à par tir de populations, microbiennes mixtes dans lesquelles un ou plusieurs des composants est une levure.
Le procédé salon l'invention est caractérisé en ce que l'on inocule avec du Streptomyces C-2943 un milieu nutritif aqueux stérile ayant un pH de 5,0 à 8,5 et contenant des sources convenables de carbone, azote et sels minéraux, on soumet le mélange résul tant à l'incubation dans des conditions d'aérobie à une température entre environ 20 et 35o C,
on enlève les matières solides présentes dans le milieu de cul ture et isole la L-6-diazo-5-oxo-norleucine du liquide de culture aqueux.
Le Streptomyces C-2943 est un microorganisme inconnu jusqu'à présent, qui se trouve dans le sol. Il a été isolé pour la première fois d'un échantillon de terre pris à Chincha, Pérou.
Des cultures de cet or ganisme vivant ont été ajoutées aux collections per manentes du Bureau de Culture de Parke, Davis & Company, Detroit, Michigan, sous le No 04997, et aux collections de cultures du Département de d'Agri- culture des USA, Fermentation Division, Northern Utilization Research Branch , Peoria, Illinois, USA.
On peut obtenir des cultures de ce microorga nisme en préparant une suspension dans de l'eau sté rile d'un échantillon de terre le contenant, en laissant les particules plus lourdes se déposer, en étendant la suspension surnageante résultant, en dilutions en sé rie, sur des plaques d'agar nutritif, en incubant les plaques à 24-28 C pour obtenir des croissances de microorganismes et en transplantant des croissances individuelles choisies, qui ressemblent au Streptomy ces C-2943 sur des plaques fraîches d'agar nutritif.
Par un sélectionnement répété et une transplantation sans contamination de croissances caractéristiques sur des plaques fraîches d'agar nutritif, on obtient des thalles, constituant dies cultures pures des mioroorga- nismes cherchés.
Le Streptomyces C-2943 est un membre aérobie et formant à l'air des spores, de l'ordre des Actinomy- cetes et appartient au genre Streptomyces tel qu'il est décrit à la sixième édition du Manual of Determi- native Bacteriology de Bergey. Cet organisme a la caractéristique suivante:
quand: il est cultivé sur des milieux glucose-tryptone ou agar nutritif, le myce- lium principal de fond est gris à blanc<B>;</B> sur des mi lieux asparagine-glycérol ou glucose synthétique-agar, ce mycelium est blanc ou légèrement gris à légère ment pourpre ou rouge clair à gris<B>;
</B> sur des milieux Czapek ou de malate de calcium-agar, il est blanc à jaune clair ou gris. Sur ces milieux, le mycelium aé rien est d'abord blanc, puis il passe au gris.
Quand cet organisme est cultivé sur des milieux glucose-tryp- tone ou agas nutritif, une coloration brun foncé ou noire apparaît dans la couche inférieure, mais quand il est cultivé dans des milieux glycérol-asparagine, de Czapek ou malate de calcium-agar, la couleur du milieu reste sensiblement inchangée.
Microscopique- ment, les hyphes aériens sont longs, d'une longueur d'environ 100 à 500 microns. Il se produit dies em branchements primaires et parfois: des secondaires, ainsi que des boucles et spirales terminales. Les spi rales varient de longueur et consistent en 2 à 15 tours.
Les spires sont souvent lâches et irrégulières. Les parties distales de ces hyphes se subdivisent en chaînes de spores.
Cet organisme liquéfie lentement la gélatine, en formant une couleur brun foncé dans le milieu, et ordinairement il ne peptonise pas le lait de tournesol.
En milieu synthétique [Pridham et al., J. Bacterio- logy, 58, 108 (1948)] cet organisme utilise de nom breuses sources de carbone, parmi lesquelles le L-ara- binose, la cellobiose, la dextrine, le glucose, le D-ga- lactose, le glycérol, l'i-.inosite, l'inuline,
le lactose, le lévulose, le maltose, la D-mannite, le D-mannose, le mélibiose, le raffinose, le rhamnose, l'amidon, le sucrose, le tétralose et le D-xylose ;
il utilise moins facilementl'adonite,l'aesculineet la salicine, et pas la dulcite, le melezitose, et la D-sorbite. Cet organisme uti lise les sources organiques et inorganiques. d'azote.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on inocule avec un champignon de l'espèce Streptomyces C-2943 un milieu nutritif aqueux sté rile ayant un pH de 5,0 à 8,5 et contenant des sour ces de carbone et d'azote et des sels minéraux, en ce qu'on soumet le mélange résultant à l'incubation dans des conditions d'aérobiose à une température entre 20 et 35,1 C,
en ce qu'on sépare les matières solides présentes dans le milieu de culture et isole la L-6 diazo-5-oxo-norleucine du liquide die culture aqueux.
Pour l'inoculation, on peut employer des, spores ou eonidies. de Streptomyces C-2943, ainsi que des suspensions aqueuses de ceux-ci contenant une faible quantité de savon ou autre agent mouillant. Pour des fermentations en grand, il est préférable d'utiliser des cultures jeunes et vigoureuses du Streptomyces C-2943, plutôt que des spores ou conidies ou des sus pensions aqueuses de ceux-ci.
Des milieux nutritifs aqueux qui conviennent sont ceux dont le pH est entre 5,0 et 8,5 et qui contien nent des sources de carbone et d'azote, ainsi que des sels inorganiques. Comme sources de carbone et d'azote, il y a entre autres la farine de tourteau de soya, la poudre de gluten de froment, la levure de brasserie, l'estomac de porc (extrait au sel), les hydrolysats de protéines de viande,
les produits solubles de distilleries et les corps solides de macération de grains. Diverses com binaisons de ces sources de carbone et d'azote avec d'autres matières azotées, telles qu'un mélange de farine de tourteau de soya, de caséine hydrolysée à l'acide et de levures débarrassées des substances amè res, un mélange d'estomac de porc (extrait au sel) et de peptone de soya,
et un mélange de farine de tour teau de soya et de caséine hydrolysée à -l'acide, ont été trouvées aussi propres à donner des résultats par ticulièrement bons. La concentration optimum de ces ingrédients est comprise entre 1,
5 et 2 % du poids total du milieu. La source de carbone peut n'être composée que des substances susmentionnées, mais les meilleurs résultats sont obtenus quand on ajoute au milieu du glucose ou du galactose. La concentra tion en glucose ou galactose peut varier de 0 à 2 %.
Des concentrations supérieures à 2 0/0 paraissent avoir un effet défavorable sur le rendement en le pro duit cherché. Comme sels inorganiques, on peut em ployer le chlorure de sodium, le chlorure d'ammo nium, le nitrate d'ammonium, le chlorure de potas- sium, le carbonate de calcium, etc. Les sels d'ammo nium tels que le chlorure et le nitrate d'ammonium sont des constituants particulièrement avantageux et conduisent à de hauts rendements en le produit cher ché.
La concentration maximum de ces sels. d7ammo- nium est entre 0,1 et 0,5 -% du milieu nutritif.
La culture du Streptomyces C-2943 en milieu nutritif aqueux peut être effectuée de diverses ma nières. Par exemple, le microorganisme peut être cul tivé dans des conditions d'aérobie à la surface d'a milieu, ou i1 peut être cultivé au-dessous de la surface du milieu, c'est-à-dire à l'état submergé, à condition que l'on fournisse simultanément de l'oxygène.
Dans la méthode préférée pour produire la Lr6- diazo-5-oxo-norleucine par fermentation sur une large échelle, on emploie des cultures submergées ou en profondeur de Streptomyces C-2943.
Dans cette manière d'effectuer la fermentation, on inocule un milieu nutritif aqueux stérile avec du Streptomyces C-2943 et le soumet à l'incubation avec agitation et aération à une température entre environ 20 et 35 C, de préférence au voisinage de 23-29 C, jusqu'à pro duction d'une concentration maximum de L-6-diazo- 5-oxo-norleucine dans le liquide de culture.
Le temps requis pour cette production maximum de L-6-diazo- 5-oxo-norleucinc varie avec les dimensions et le genre de l'équipement employé. Par exemple, dans les fer mentations industrielles sur une large échelle, telles qu'on les effectue dans les appareils de fermentation du genre à réservoir, la production maximum de L- 6-diazo-5-oxo-norleucine est atteinte en environ 32 heures ou moins.
Quand on emploie des ballons se- coueurs pour la culture, le temps de production maxi mum peut être plus long, soit de trois à huit jours, que celui requis pour les cuves de fermentation sur une grande échelle. Dans les conditions de culture submergée, le microorganisme se développe en parti cules plus ou moins séparées, dispersées dans tout le milieu nutritif,
ce qui contraste avec la pellicule plus ou moins continue présente à la surface du milieu dans le procédé de culture en surface. Grâce à cette distribution de l'organisme dans le milieu, on peut cultiver en une seule fois de grands volumes du mi lieu nutritif inoculé dans les grands réservoirs ou cuves employés ordinairement dans l'industrie de la fermentation.
Des appareils de fermentation à cuve stationnaire, munis de dispositifs convenables d'agita tion et/ou d'aération, de même que des appareils à tambour horizontal, ont été trouvés particulièrement utilisables sous ce rapport. En revanche, pour la pré paration de faibles quantités de l'antibiotique ou de cultures du microorganisme, le procédé par culture submergée peut être exécuté dans de petits ballons ou vases qui peuvent être -secoués ou agités par des moyens mécaniques. convenables. L'agitation et l'aération de la culture peuvent être réalisées de diverses manières.
L'agitation peut être produite par des turbines, des pales, des propulseurs ou autres dispositifs d'agitation mécaniques., en fai sant tourner ou en secouant le récipient de fermenta- tion lui-même, par divers dispositifs de pompage ou par passage d'air ou autre gaz contenant de l'oxygène à travers le milieu.
L'aération peut être effectuée en injectant de l'air ou autre gaz contenant de l'oxygène dans le mélange en fermentation par des tuyaux ouverts, par des. tuyaux perforés, à l'aide de moyens de diffusion poreux tels que des bougies de charbon, de carborundum, de verre aggloméré, etc. ; elle peut aussi être effectuée par projection ou écoulement de la masse dans ou à travers une atmosphère contenant de l'oxygène.
Selon la méthode de culture en surface pour la production de L-6-diazo-5-oxo-norleucine, .on inocule une couche peu profonde, en général de moins de 2 cm, d'un milieu nutritif stérile aqueux, avec du Streptomyces C-2943 et soumet le mélange à l'incu bation dans des conditions d'aérobie à une tempéra ture d'environ 20-350 C, de préférence dans le voisi nage de 23-290 C.
Il faut en général un temps d7incu- bation plus long que pour la culture en profondeur pour obtenir la production maximum de L-6-d#iazo-5- oxo-norleucine. En. général, cette période d'incube tion dure environ trois à huit jours.
Lorsque la phase<B>de</B> fermentation est terminée, la matière solide est enlevée du liquide de culture, par exemple par filtratiôn, centrifugation, etc. Le liquide résultant qui contient la L-6-diazo-5-oxo-norleucine possède les propriétés désirées d'inhibition des néo plasmes..
Cependant, pour les résultats optimums, on traite le liquide pour isoler la L-6-diazo-5-oxo-nor- leucine sous forme concentrée ou cristalline. Une méthode qui convient pour isoler le produit consiste à concentrer à un faible volume le liquide de culture clarifié, par exemple jusqu'à 1/5 -1/2o de son volume original,
à ajouter environ 3 à 10 volumes d'un sol vant organique miscible à l'eau, tel que le méthanol ou l'éthanol, à séparer de la solution les impuretés qui ont précipité, à soumettre la solution purifiée à une adsorption et une élution avec un.
adsorbant pour la L,6-diazo-5-oxo-norleucine et à récupérer le produit de l'éluat. Scion une autre méthode qui con vient, on concentre à siccité le liquide de culture cla rifié, on extrait le produit résiduaire avec un solvant organique miscible à l'eau et contenant moins.
de 50 % d'eau, on soumet l'extrait à une adsorption et élution avec un adsorbant pour la L-6-diazo-5-oxo- norleucine et récupère le produit de l'éluat. L'adsorp tion est effectuée en faisant passer la solution diluée ou l'extrait mentionné à travers une colonne d'ad sorption
contenant un adsorbant neutre ayant un pH ou ajusté à un pH d'environ 5 à 8, de préférence 6 à 8. Des exemples d'un tel adsorbant sont l'alumine et l'alumine de Brockmann. Le produit est élué <B>da</B> l'adsorbant avec de l'eau ou une solution aqueuse d'un solvant organique miscible à l'eau.
L'éluat est recueilli en fractions, et les fractions montrant la plus forte absorption dans l'ultraviolet à une longueur d'onde de 275 millimicrons environ, sont séchées. Vu la nature instable du produit aux températures éle vées, il est préférable d'enlever le diluant en con gelant l'éluat et soumettant la masse congelée à un vide élevé. Le produit peut être encore purifié par adsorption et élution en employant du charbon activé.
A ces fins, le produit sec préparé comme décrit ci- dessus, est dissous dans une petite quantité d'eau contenant une faible proportion de solvant organique miscible à l'eau, le pH de la solution est ajusté à 6-7, si nécessaire, et on fait passer la solution à travers une colonne d'adsorption contenant du charbon ac tivé, et produit l'élution de la colonne avec de l'eau. contenant une faible proportion d'un solvant organi que miscible à l'eau, de préférence de l'acétone.
Pour faire la solution pour l'opération d'adsorption, on peut employer de l'eau contenant une faible propor tion d'un solvant organique tel que l'acétone, le méthanol, l'éthanol, le phénol et semblables.
De pré férence, on emploie de l'eau contenant environ 1 0/0 d'acétone, et utilise suffisamment de solvant pour avoir une solution contenant environ 2 à 10 mg de L-6-diazo-5-oxo-norleucine par millilitre. La quan tité de charbon activé nécessaire pour adsorber tout le produit cherché de la solution varie avec la con centration du produit sec en L-6-diazo-5-oxo-norleu- cine. Par exemple un produit donnant à l'essai 5 % de cette substance requiert environ 15 grammes de charbon activé par gramme. On obtient les meilleurs
résultats quand le charbon activé a été préalablement mélangé avec de la terre de diatomées, cette dernière aidant à maintenir une vitesse d'écoulement satisfai sante. Après l'adsorption, la colonne est éluée par lavage avec un éluant convenable tel que de l'eau contenant moins de 25 % d'un solvant organique miscible à l'eau.
Les meilleurs résultats sont obtenus en employant une solution aqueuse d'acétone à 1 u/o. L'éluat est recueilli en fractions et les fractions mon trant la plus forte absorption dans. l'ultraviolet à une longueur d'onde d'environ 275 millimicrons sont séchées à partir de l'état congelé. Si on le désire, le produit sec ainsi obtenu peut encore être traité par recristallisation dans un solvant convenable tel que le méthanol aqueux, l'éthanol aqueux et semblables.
Le produit est identique sous tous les rapports à la substance produite par synthèse chimique. <I>Exemple 1</I> On met 300 ml d'un milieu nutritif de la compo sition suivante
EMI0004.0049
Pour <SEP> cent
<tb> Maltose <SEP> ........................ <SEP> 1,0
<tb> Résidu <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> butanol-acétone <SEP> 0,5
<tb> Caséine <SEP> hydrolysée <SEP> à <SEP> l'acide <SEP> <B>........</B> <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>............</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>..............</B> <SEP> 0,5
<tb> Eau <SEP> en <SEP> suffisance <SEP> pour <SEP> faire <SEP> <B>.....</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 100,0 dans chacun de deux flacons d'Erlenmeyer de 1 litre, et le pH est ajusté à 7,5 avec de l'hydroxyde de so dium 6 N. Le milieu nutritif es stérilisé en chauffant les flacons à 1200 C pendant 25 minutes. On refroi dit le milieu et inocule chacun des deux flacons avec 2 ml d'une suspension, dans 40 ml d'une solution sté rile de savon de Castille à 0,01 /o de spores. de qua tre cultures en pente sur agar (glucose-tryptonessels minéraux) de Streptomyces C-2943.
Les flacons sont maintenus à la température ordinaire (24-26 C) pen dant 90 heures avec agitation produite par des se- coueurs mécaniques qui font tourner les flacons à 160 tours par minute dans un cercle de 6 cm de dia mètre.
Le liquide de culture contient alors approxi mativement 1 mg de L-6-diazo-5-oxo-norleucine, la détermination étant faite par des essais de diffusion sur plaques-disques d'agar, dans lesquels on mesure l'étendue de l'inhibition du développement de la le vure Torulopsis albida N R R L Y 1400. Le liquide de culture est filtré et le produit cherché, la L-6 diazo-5-oxo-norleucine, est isolé du filtrat par les méthodes d'adsorption et élution décrites en détail ci-après.
<I>Exemple 2</I> On place 12 litres d'un milieu ayant la composi tion suivante
EMI0004.0077
Pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> <B>----- <SEP> ....</B> <SEP> 2,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> tourteau <SEP> de <SEP> soya <SEP> <B>........</B> <SEP> 1,0
<tb> Estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> (extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> .......... <SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>............</B> <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>......</B> <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Eau <SEP> en <SEP> suffisance <SEP> pour <SEP> faire <SEP> . <SEP> .
<SEP> <B>....</B> <SEP> 100,0
<tb> Hydroxyde <SEP> de <SEP> sodium <SEP> (10 <SEP> N) <SEP> en <SEP> suf fisance <SEP> pour <SEP> porter <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,5 dans un récipient de fermentation en verre de 30 li tres, muni d'accessoires en acier inoxydable compre nant distributeur, propulseur, chicanes et tube de prise d'échantillons et le milieu est stérilisé par chauf fage à 1211, C pendant 2 heures. Le pH du milieu après stérilisation est de 7,8.
On refroidit le milieu et on l'inocule avec une suspension, dans 10 ml d'une solution stérile d'heptadécyl-sulfate de sodium à 0,1 % de spores d'une culture en pente sur agar (glu- cose-tryptone-sels minéraux)
<B>de</B> StreptomycesC-2943. Le milieu inoculé est incubé à 25-260 C pendant 72 heures pendant lesquelles le milieu est agité à 225 tours par minute et pendant lesquels on fait passer de l'air stérile à travers le milieu à raison de 12 litres par minute. Pendant l'incubation, on ajoute pour contrôler la formation de mousse, 98 ml d'un mé lange stérilisé de graisse de porc crue et d'huiles minérales contenant des mono- et diglycérides. La culture incubée ainsi obtenue est employée pour ino culer les cultures en grand, comme décrit ci-après.
Quatre récipients de fermentation de 30 litres, contenant chacun 16 litres du milieu décrit ci-dessus, sont stérilisés à 1211, C pendant 2 heures, :le pH après stérilisation étant de 7,6.<I>On</I> laisse refroidir à la température ordinaire les récipients contenant le mi lieu stérile puis on introduit dans chaque récipient une portion de 800 ml de la culture incubée d'écrite ci-dessus, et on soumet les milieux inoculés à l'incu bation à 25-260 C pendant 40 heures.
Pendant cette période d'incubation, on fait arriver de l'air par un distributeur à raison de 16 litres à la minute et pro duit une agitation par un propulseur tournant à 200 tours par minute. Durant l'incubation, on ajoute 30 ml du mélange stérilisé de graisse de porc et d'hui les minérales mentionné ci-dessus, à chaque récipient de fermentation, selon besoin pour contrôler la for mation de mousse.
La concentration en L-6-diazo-5- oxo-norleucine dans les milieux de fermentation après incubation est d'approximativement 37 micro- grammes par ml.
Les matières solides présentes dans les milieux de fermentation incubés, sont enlevées par mélange avec 1 % de terre de diatomées et filtration. La matière filtrée possède l'activité biologique désirée ;
ainsi, une injection intrapéritonéale journalière de 0,1 ml de ce filtrat pendant cinq jours inhibe totalement la crois sance de tumeurs de Sarcoma 180 implantées dans des souris.
Le gâteau de filtre est lavé avec de l'eau et le filtrat et les eaux de lavage sont combines (41,5 litres) et concentrés dans le vide à un volume de 1920 ml. On ajoute de l'éthanol au concentrai <B>da</B> façon à porter le volume à 19,2 litres; le précipité qui se forme est enlevé par filtration et le gâteau de filtre est lavé avec de l'éthanol. Le filtrat -alcoolique (pH 6,5) est fait passer à travers une colonne d7ad- sorption préparée comme décrit ci-dessous.
2,3 kg d'alumine sont agités avec de l'acide chlor hydrique dilué de telle sorbe que le pH reste constant à 6,4. L'alumine est retirée, lavée avec de l'eau et activée par chauffage à 200 C pendant 4 heures.. L'alumine est remuée avec de l'éthanol aqueux à 90 % et entassée dans une colonne de 10 cm de dia- mètre (volume. retenu 2300 ml;
taux d'écoulement par gravité 5 litres à l'heure).
On fait passer le filtrat alcoolique préparé ci dessus dans la colonne d'adsorption, puis la colonne est lavée successivement avec 1,9 litre d"éthanol aqueux à 90 % et 12,1 litres d'éthanol aqueux à 75 0/0. Le percolatum est mis de côté.
La colonne est alors éluée avec 18 litres d'éthanol aqueux à 25 % et l'éluat est recueilli en fractions de 1 litre. Les cinq premières fractions d'éluat sont concentrées d'ans le vide et le concentre est séché à l'état con gelé sous un vide poussé.
Le produit séché possède l'activité biologique cherchée ; par exemple l'injection intrapéritonéale deux fois par jour pendant cinq jours, de 0,5 ml d'une solution aqueuse de ce produit (300 gamma par ml) empêche totalement la croissance de tumeurs de Sarcoma 180 implantées dans des souris.
8,5 grammes de cette substance sèche, donnant à l'essai approximativement 4'% de L-6-diazo-5-oxo- norleucine, sont dissous dans 120 ml d'acétone aqueuse à 1 % (pH 6,2). On prépare une colonne d'adsorption en ajoutant un mélange de 125 g de charbon activé et 125 g de terre de diatomées,
dans une solution à 1 % d'acétone dans l'eau, le diamètre de la colonne étant de 6,5 cm (volume retenu 800 ml ; taux d'écoulement par gravité, 750 ml par heure).
On fait passer la solution aqueuse contenant la L-6-diazo-5-oxo-norleucine à travers la colonne, puis on lave celle-ci avec 4,8 litres d'une solution d'acétone à 1%. L'éluat est recueilli en fractions de 100 ml. Les fractions de la quinzième à la vingt- troisième inclusivement sont concentrées et le con centrai est séché à l'état congelé sous un vide poussé.
Lamatière sèche est dissoute dans du méthanol aqueux chaud à 90'0/0 et la solution est maintenue à 50 C pendant plusieurs heures. La L-6-diazo-5-oxo-norleu- cine qui se sépare en cristaux est recueillie et séchée dans le vide ;
El @m = 643 à 274,5 millimicrons. <I>Exemple 3:</I> a) On introduit 150 ml d'un milieu nutritif ayant la composition suivante
EMI0005.0132
Pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> <B>............</B> <SEP> 2,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> tourteau <SEP> <B>d</B>e <SEP> soya <SEP> <B>........</B> <SEP> 1,0
<tb> Extrait <SEP> salin <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> <B>....</B> <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ..........
<SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>............</B> <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>............</B> <SEP> 0,5
<tb> Eau <SEP> en <SEP> suffisance <SEP> pour <SEP> donner <SEP> <B>....</B> <SEP> 100;0
<tb> Hydroxyde <SEP> de <SEP> sodium <SEP> (10 <SEP> N) <SEP> en <SEP> suf fisance <SEP> pour <SEP> porter <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,5 dans un flacon d'Erlenmeyer de 1 litre.
Ce milieu nutritif est alors stérilisé en chauffant le flacon à 1210 C pendant 1/2 heure, puis il est refroidi et inoculé avec 5 ml d'une suspension, dans 10 ml d'une solution stérile de heptadécyl-sulfate de sodium à 0,
1 % de spores provenant d'une culture en pente sur agar (glucose-tryptone-sels minéraux)
de Strepto- mycesC-2943. Le flacon est soumis à l'incubation à 26 C pendant 72 heures en l'agitant au moyen d'un secoueur mécanique le faisant tourner à 160 tours par minute dans. un cercle de 60 mm<B>de</B> .diamètre. La culture incubée ainsi obtenue est utilisée pour inocu ler le milieu de 67,5 litres décrit en b) ci-après.
b) 67,5 litres d'un milieu nutritif ayant la compo sition ci-dessus indiquée en a) sont placés dans un récipient de fermentation en acier inoxydable de 135 litres, et le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant 1 heure. Le pH du milieu après stérilisation est de 6,9. Le milieu est refroidi et inoculé avec 90m1 de la culture incubée décrite ci-dessus.
Le milieu ino culé est soumis à l'incubation à 260 C pendant 24 heures. Pendant ce temps, on introduit de l'air stérile dans ce milieu à travers un distributeur à raison de 96 litres.
par minute, et le mélange est agité à l'aide d'un propulseur à 200 tours par minute. La culture incubée de Streptomyces C-2943 ainsi obtenue est utilisée pour inoculer 675 litres du milieu décrit en c) ci-dessous. c) 675 litres d'un milieu nutritif ayant la compo sition décrite en a) ci-dessus sont placés dans un réci pient de fermentation de 900 litres, en acier inoxyda ble,
et sont stérilisés par chauffage à 1210 C pendant 1 heure. Le pH du milieu après stérilisation est de 6,7. Le milieu est refroidi et inoculé avec 67,5 litres de la culture incubée décrite en b) ci-dessus.
Le mi lieu de culture est incubé à 27() C pendant 27 heures durant lesquelles on introduit de l'air stérile dans le mélange à travers un distributeur à raison de 700 litres à la minute, tout en agitant le mélange à l'aide d'un propulseur tournant à 200 tours par minute. En vue de contrôler la formation de mousse, on ajoute de temps en temps, selon besoin, 2,4 litres d'un mé lange stérile de graisse de porc brute et d'huiles miné rales contenant des mono- et diglycérides.
Les-matières solides contenues dans le mélange incubé sont enlevées par filtration à travers un filtre- presse à plateaux et châssis revêtu préalablement de terre de diatomées, puis le filtrat est concentré sous pression réduite à un volume d'environ 36 litres,. Le concentrat est mélangé avec 324 litres d'éthanol, et le précipité qui se forme est enlevé par filtration et rejeté.
d) On fait passer une portion (214 litres) du fil trat éthanolique (volume total 344 litres ; pH 5,9) à travers une colonne d'adsorption préparée de la ma nière su ivan:te : on agite avec de l'acide chlorhydri que dilué 6,75 kg d'alumine, de telle manière que le pH reste constant à 6,0. L'alumine est filtrée, lavée avec de l'eau déionisée, puis activée par chauffage à 2000 C pendant 4 heures.
L'alumine est remuée avec de l'éthanol aqueux à 90 p/o et entassée dans une colonne de 1,8 m ayant un diamètre de 15 cm (vo lume retenu 21,15 litres : vitesse d'écoulement 40,5 litres à l'heure sous une pression de 845 g/cm2).
Le filtrat alcoolique préparé ci-dessus est percolé à travers la colonne d'adsorption sous une pression absolue de 845g/cmY, puis la colonne est lavéesucces- sivement avec 21,15 litres d'éthanol aqueux à 90 % et 142,6 litres d'éthanol aqueux à 75 0/0.
La colonne est ensuite éluée avec 128,2 litres d'éthanol aqueux à 25 %, et l'éluat est recueilli en fractions de 10a8 li- tres. Les quatrième, cinquième et sixième fractions sont combinées, concentrées dans le vide à 350 C, et le concentrai est séché à l'état congelé sous un vide poussé.
e) La portion restante <B>(130</B> litres) dû filtrat étha- nolique de c) est chromatographiée sur 13 kg d'alu mine, de la façon décrite en d) ci-dessus, et l'éluat est concentré et séché à l'état congelé.
Les poudres sèches de d) et e) sont combinées. Le produit ainsi obtenu contient 2,16 g de L-6-diazo- 5-oxo-norleucine. Ce produit est purifié par adsorp tion et élution de la façon suivante : une boue de 780 g de charbon activé et 780 g de terre de diato- mées dans une solution aqueuse d'acétone à 1% est placée dans une colonne de 1,5 m, ayant un diamètre de 10 cm. Le lit formé d'adsorbant a 55 cm de hau teur ;
il a un volume retenu de 4 litres, et un taux d'écoulement par gravité de 1,75 litre à l'heure avec une pression de 950 mm. Le produit est dissous dans 858 ml de solution aqueuse d'acétone à 1 0/0, et on fait passer la solution à travers la colonne. Celle-ci est éluée avec 20 litres d'une solution à 1 % d'acé- tone dans l'eau. On recueille des fractions de 500 ml chacune.
Les fractions de la 17f'me à la 20Ème inclu sivement sont combinées et concentrées dans le vide. Le concentrat est congelé et la glace en est sublimée sous un vide poussé. Le produit, la L-6-diazo-5-oxo- norleucine, est recristallisé dans du méthanol aqueux à 90'% ; Ei l-rl = 676 à 274 millimicrons. Le pro- duit cristallin possède l'activité biologique désirée ;
par exemple une injection journalière intrapéritonéale d'une solution aqueuse du produit (0,25 mg/kg) pen dant cinq jours inhibe complètement le développe ment de tumeurs de Sarcoma 180 implantées dans les souris.