<EMI ID=1.1> La présente invention concerne des procédés de préparation de L-leupeptines par fermentation, de même que leur extraction et leur purification à partir de bière de fermentation.
Les leupeptines sont des inhibiteurs d'enzymes
qui ont été découverts par Umezawa et ses collaborateurs dans des filtrats de culture de Streptomyces, roseus et d'une grande variété de micro-organismes de Streptomyces. Les structures chimiques
des leupeptines sont représentées par la formule générale suivante :
<EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
t
CH3 CH3
<EMI ID=4.1>
Ces leupeptines sont des substances utiles ayant une faible toxicité et exerçant des activités inhibitrices de protéases telles que des activités anti-plasmine et anti-trypsine, de même que des effets anti-inflammatoires et différents autres effets pharmacologiques (voir Brevet Japonais n[deg.] 595.140, Brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3.840.513).
Les composants principaux des leupeptines obtenues jusqu'à présent par fermentation sont le propionyl- et l'acétyl-Lleucyl-L-leucyl-DL-argininal comportant chacun un groupe argininal de la configuration stérique DL (ces leupeptines étant appelées ci-après "DL-leupeptines" ou "forme DL") [Kondo, S. et al.,
<EMI ID=5.1>
Unis d'Amérique n[deg.] 3.840.513].
Jusqu'à la présente invention, les L-leupeptines n'ont jamais été obtenues par fermentation et, par conséquent, on a considéré que les DL-leupeptines étaient préparées par fermentation.
Shimizu et al. ont effectué la synthèse chimique
de leupeptines comportant un groupe argininal de configuration L
(ces leupeptines étant appelées ci-après "L-leupeptines" ou
"forme L"), ainsi que d'autres leupeptines comportant un groupe argininal de configuration D (ces leupeptines étant appelées ci-après "D-leupeptines" ou "forme D"). Sur la base d'essais biochimiques, ils ont confirmé que le principe actif responsable des effets inhibiteurs exercés sur les enzymes était les L-leupeptines, tandis que les D-leupeptines sont inactives et que les DL-leupeptines obtenues par fermentation n'exercent que la moitié de l'activité des L-leupeptines [Shimizu, B. et al., "J. Antibiotics", 25, 515 (1972) ; Umezawa, H., "Enzyme Inhibitors of Microbial Origin", "University of Tokyo Press" (1972), pages 24-25].
La Demanderesse a entrepris des études poussées
sur le procédé de fermentation, ainsi que sur les procédés d'extraction et de purification et, suite à ces études, elle a découvert pour la première fois les faits mentionnés ci-après et ces découvertes ont abouti à la présente invention.
Un objet de la présente invention est de fournir
de nouveaux procédés pour la préparation de L-leupeptines par fermentation.
Un autre objet de la présente invention est de fournir de nouveaux procédés pour l'extraction et la purification de L-leupeptines formées dans un bouillon de culture par fermentation.
D'autres objets et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description ci-après.
La figure 1 des dessins annexés représente le déroulement de la racémisation de la L-leupeptine obtenue par le procédé de la présente invention et ce, en termes d'activité relative et de pouvoir rotatoire spécifique, mesurés tous deux en fonction de la période de conservation exprimée en jours. La figure 2 donne les spectres d'absorption des rayons infrarouges du chlorhydrate de L-leupeptine (en traits pleins) obtenu par le procédé de la présente invention, ainsi que du chlorhydrate de DL-leupeptine préparé par le procédé classique de fermentation et d'extraction (traits discontinus).
(1) Lors de la fermentation de la leupeptine au cours de laquelle le pH du milieu de culture est maintenu dans
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milieu tandis que, lorsque la réaction du milieu est déplacée vers le domaine alcalin, on obtient des DL-leupeptines. Même lorsque le pH du milieu de culture est maintenu dans l'intervalle
<EMI ID=7.1>
de L-leupeptines ait atteint. le maximum, provoque une racémisation partielle des L-leupeptines accumulées en donnant des L-leupeptines contaminées par la forme D.
(2) Les L-leupeptines purifiées subissent également une r-acémisation progressive dans un milieu légèrement alcalin
(par exemple, d'un pH de 8) dans des conditions thermiques modérées, Epar exemple, 23[deg.]C) et elles sont amenées complètement à la forme
DL après plusieurs jours.
(3) Dans des procédés de purification spécifiques connus, les leupeptines du filtrat de culture sont soumises à des traitements d'adsorption et de désorption en utilisant une colonne de charbon actif ou d'une résine échangeuse. d'ions du type à base d'un acide carboxylique, par exemple, "Lewatit CNP" (marque commerciale pour une résine échangeuse de cations contenant un groupe d'acide carboxylique, fabriquée par "Bayer Co.") ou "Amberlite IRC-50" (marque commerciale pour une résine échangeuse de cations contenant un groupe d'acide carboxylique, fabriquée par "Rohm
and Haas Co.") sous forme H, sous forme Na ou sous forme mixte.
Dans le cas des résines échangeuses de cations du type comportant un groupe d'acide carboxylique, la forme H ne provoque pas la racémisation des L-leupeptines, mais elle n'est pas économique par suite de sa faible capacité d'adsorption, tandis que la forme Na possède une capacité d'adsorption plus faible encore et provoque, en outre, une racémisation complète. Bien qu'un type mixte des formes H et Na dans un rapport approprié (7-8 : 3-2 en volume) soit supérieur à n'importe quel autre adsorbant connu en raison de sa capacité d'adsorption maximale et de ses hauts rendements d'adsorption et de désorption, ce type n'est cependant pas approprié pour obtenir des L-leupeptines, car il provoque une forte racémisation, même si les traitements sont effectués dans des conditions faiblement ou modérément acides.
(4) Le procédé comportant l'adsorption de leupeptines provenant d'un filtrat de culture sur du charbon actif avec désorption ultérieure au moyen d'un solvant organique acide aqueux (par exemple, du méthanol à 80% d'un pH de 2) donne des DL-leupeptines lorsqu'il est appliqué à la bière fermentée par les procédés classiques sans contrôle du pH. La Demanderesse a trouvé que ce procédé donnait des L-leupeptines lorsqu'il était appliqué à la bière préparée par les procédés mis au point suivant la présente invention. Toutefois, le rendement est faible (30 à
<EMI ID=8.1>
ou l'alumine, le charbon actif est un adsorbant que l'on emploie utilement lors de la chromatographie en colonne effectuée au cours de l'étape de purification ultérieure.
(5) Le procédé de la présente invention, dans lequel on utilise une résine adsorbante non ionique poreuse, est applicable à la fois à la première étape d'extraction-purification impliquant l'adsorption de leupeptines à partir d'un filtrat de culture et la désorption des leupeptines adsorbées, ainsi qu'à la dernière étape de la purification complémentaire des L-leupeptines de la solution contenant des L-leupeptines préalablement purifiées, l'application à la première étape étant particulièrement avantageuse.
Lorsqu'un filtrat de culture contenant des leupeptines est traité conformément au procédé de la présente invention, on observe des avantages nettement supérieurs à ceux de n'importe quel autre procédé connu, par exemple, une capacité d'adsorption de loin plus élevée que dans n'importe quel procédé classique, l'absence de racémisation de L-leupeptines et un haut rendement d'environ 90% lors de l'étape d'adsorption-désorption.
(6) En ajoutant de la L-leucine,de la L-arginine
(sous forme de chlorhydrate) et de la glycine en une quantité de
<EMI ID=9.1>
la production de L-leupeptines est accrue 4 à 6 fois comparativement à celle obtenue dans les procédés classiques.
(7) Le rendement en L-leupeptines est porté à une valeur aussi élevée que 7 à 10 fois celui obtenu par les procédés classiques en ajoutant, au milieu ci-dessus contenant les acides aminés précités, au moins une des différentes substances organiques naturelles telles que les acides ribonucléiques, l'extrait de levure et l'hydrolysat de caséine.
(8) Lorsqu'on utilise un milieu de fermentation contenant les trois acides aminés précités (ce milieu ne contenant pas plus de 0,3% (poids/volume) d'acides aminés, y compris les acides aminés eux-mêmes et les substances en contenant, par exemple, les peptides, les protéines, etc., autres que les trois acides
<EMI ID=10.1>
d'acétyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal seul et elle ne contient aucune autre leupeptine comportant un groupe propionyle, un groupe isoleucine ou un groupe valine.
Par la\mise en oeuvre de la présente invention sur la base des découvertes précitées, on a mis au point pour la première fois des procédés de préparation de L-leupeptines (qui sont une formé active) avec de hauts rendements par fermentation. De même, une découverte importante pour la production d'une seule leupeptine de qualité constante réside dans le fait que l'on peut
<EMI ID=11.1>
L-leucyl-L-argininal avec de hauts rendements en effectuant le procédé de la présente invention avec un milieu de culture contenant de la L-leucine, de la L-arginine (sous forme de chlorhydrate)
<EMI ID=12.1>
compris les acides aminés eux-mêmes et les substances en contenant telles que les peptides, les protéines, etc., autres que les trois acides aminés précités.
Les avantages de la présente invention sont illustrés dans les exemples expérimentaux ci-après.
Suivant la présente invention, on mesure la puissance des leupeptines de la manière suivante :
A 2,5 ml d'une solution 1,25 x 10-4M du chlorhydrate d'ester méthylique de p-toluène-sulfonyl-L-arginine dans un tampon tris d'un pH de 8,1, on ajoute 0,5 ml d'une solution de leupeptine préparée de telle sorte que la concentration puisse atteindre environ 8 mcg (puissance)/ml. Après pré-incubation à 32[deg.]C pendant 5 minutes, à ce mélange, on ajoute 0,1 ml d'une solution aqueuse de trypsine (7,5 mcg/ml). Immédiatement après incubation à 32[deg.]C pendant 30 minutes, on soumet le mélange réactionnel à un essai
de détermination de la capacité d'absorption à .247 nm pour obtenir la valeur d'essai. La valeur témoin est obtenue de la même manière que celle indiquée ci-dessus, avec cette exception que l'on n'ajoute pas de leupeptine. On calcule le degré d'inhibition de la trypsine en divisant, par la valeur témoin, la différence entre cette valeur témoin et la valeur d'essai. Suivant ce procédé d'essai, la con-
<EMI ID=13.1>
d'acétyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal de la pureté la plus élevée est de 0,98 mcg/ml. On utilise cette substance comme échantillon de référence et la puissance des leupeptines est exprimée en poids
(par exemple, en mcg et en mg (puissance)).
Les DL-leupeptines de la pureté la plus élevée que l'on obtient par les procédés classiques de fermentation et
<EMI ID=14.1>
On mesure la teneur en L-leupeptines d'un mélange
de L-leupeptines et de D-leupeptines de la manière décrite ci-après.
On forme une solution aqueuse des leupeptines soumises à l'essai et, avec du permanganate de potassium, on oxyde
en acides de leupeptines (la fraction argininal de la leupeptine
est oxydée pour former de l'arginine). On purifie les acides
obtenus et on les isole par chromatographie sur du charbon actif
et sur de l'alumine acide. On hydrolyse les acides isolés avec de l'acide chlorhydrique 6N à 110[deg.]C pendant 24 heures. On détermine la teneur totale en arginine de l'hydrolysat au moyen d'un instrument d'analyse des acides aminés. D'autre part, on détermine la teneur
en L-arginine de l'hydrolysat par dosage biologique en utilisant
des bactéries d'acide lactique. On suppose que la teneur en L-arginine (%) de la quantité totale d'arginine est égale à la
teneur en L-leupeptines (pourcentage de forme L) de la quantité totale de leupeptines. La teneur en forme L de l'échantillon
de référence est de 100% et celle des DL-leupeptines obtenues par
les procédés classiques de fermentation est de 52%.
Exemple expérimental 1
On inocule une culture inclinée de Streptomyces roseus MA839-A1 (FERM-P N[deg.] 3017 ; ATCC 31245) dans 100 ml d'un milieu contenant 2% de glucose, 2% d'amidon, 3% de polypeptone, 0,5% de NaCl et 0,3% de KH2P04 que l'on dépose dans un ballon et que l'on stérilise, après quoi on effectue une culture agitée à une température de 27 à 28[deg.]C pendant 2 jours pour préparer l'inoculum (les pourcentages utilisés ci-dessus sont des pour-cent en
<EMI ID=15.1>
ci-après). On prépare 20 litres du même milieu que celui indiqué ci-dessus dans une cuve de fermentation de 30 litres et on inocule
<EMI ID=16.1>
avec aération et agitation. A intervalles réguliers, on prélève une portion du bouillon de culture et on la purifie sans racémisation conformément à la présente invention pour obtenir des chlorhydrates de leupeptines purifiés sous forme d'une poudre. Les résultats des essais de détermination de l'activité et du pourcentage de forme L sont indiqués dans le tableau 1 ci-après.
<EMI ID=17.1>
<EMI ID=18.1>
Ainsi qu'on le constate d'après le tableau 1, la puissance de la poudre de leupeptine est de 1.000 mcg/mg après culture pendant 42 et 48 heures, tandis qu'elle est réduite à 910 mcg/mg après culture pendant 60 heures et à
620 mcg/mg après culture pendant 72 heures. La teneur en forme L de la poudre de leupeptine est également réduite en dessous de 100% après culture pendant 42 et 48 heures, à 92% après culture pendant 60 heures et à 84% après culture pendant
72 heures. En conséquence, il convient de veiller à éviter une prolongation superflue de la culture car, même si l'on contrôle le pH dans l'intervalle de 5 à 7, après avoir atteint une accumulation maximale de L-leupeptines, une prolongation de la culture semble provoquer une racémisation partielle des L-leupeptines déjà formées.
Exemple expérimental 2
On dissout les chlorhydrates de L-leupeptines obtenus après la culture de l'exemple expérimental 1 pendant
<EMI ID=19.1>
former une solution à 1%. On laisse reposer la solution obtenue
à 23[deg.]C et l'on mesure les changements survenant dans l'activité relative (mcg/mg) et le pouvoir rotatoire spécifique en fonction de la durée. Les résultats obtenus sont représentés en figure 1. Les leupeptines récupérées après 7 jours ont une teneur en forme
L de 50% et une activité relative de 490 mcg/mg, ce qui indique qu'il s'est produit une racémisation complète. D'après les résultats ci-dessus, il est évident que les L-leupeptines subissent une racémisation même dans des conditions modérées telles qu'un pH de 8 et une température de 23[deg.]C.
Exemple expérimental 3
En utilisant le bouillon de culture obtenu après avoir effectué une culture pendant 48 heures de la même manière
<EMI ID=20.1>
purification ci-après.
Procédé A : On fait passer le bouillon de culture dtun pH de 6,0 à travers une colonne de "Lewatit CNP-80" (marque commerciale déposée, forme Na : forme H = 2:8 en volume) pour adsorber les L-leupeptines. On élue le produit d'adsorption avec du méthanol
<EMI ID=21.1>
de l'éluat sont acides. On'évapore les fractions actives pour obtenir une solution aqueuse. De la solution aqueuse, on extrait les leupeptines avec du n-butanol et l'on évapore la solution
de n-butanol sous pression réduite pour éliminer le n-butanol.
On fait passer la solution aqueuse obtenue à travers une colonne de charbon actif et on développe la phase adsorbée avec de l'acétone aqueuse à 20% réglée à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique. On recueille les fractions actives de l'effluent et on
<EMI ID=22.1>
constituée d'amines primaires, secondaires et tertiaires, cette résine étant fabriquée par "Dow Chemical Co."), après quoi on
les concentre et on les sèche par évaporation de glace. On dissout la poudre obtenue dans du méthanol et on l'adsorbe dans une colonne d'alumine acide remplie de méthanol, après quoi on développe avec
du méthanol. On recueille les fractions actives de l'effluent et
on les évapore à sec pour obtenir des chlorhydrates de L-leupep- tines purifiés. Le rendement à partir du filtrat de culture est de 33%.
Procédé B : On fait passer le même filtrat de culture que celui utilisé dans le procédé A à travers une colonne d'"Amberlite XAD-2"
(marque commerciale pour une résine adsorbante non ionique cons-tituée d'un copolymère de styrène.et de divinyl-benzène, cette résine étant fabriquée par "Rohm and Haas Co.") pour adsorber la leupeptine, après quoi on élue la phase adsorbée avec du méthanol à 50% d'un pH de 2,0. On recueille les fractions actives de l'éluat et on les libère du méthanol par distillation, pour obtenir une solution aqueuse. Avec du n-butanol, on extrait les leupeptines de la solution aqueuse et les procédés ultérieurs à l'extraction au n-butanol sont effectués de la même manière que dans le procédé A pour obtenir des chlorhydrates de leupeptines purifiés. Le rendement à partir du filtrat de culture est de 65%.
Les résultats obtenus par les deux procédés sont comparés dans le tableau 2 ci-après.
TABLEAU 2 Comparaison entre les procédés A et B '
<EMI ID=23.1>
D'après les résultats ci-dessus, on constate que, lors de l'extraction et de la purification de L-leupeptines, si l'étape d'adsorption-désorption est effectuée en utilisant une résine échangeuse d'ions faiblement acide du type comportant un groupe d'acide carboxylique partiellement transformé sous la
forme Na, une importante proportion des L-leupeptines subissent
une racémisation, même si les solutions contenant des leupeptines restent acides.
<EMI ID=24.1>
tion et le milieu classique concernant la productivité de leupeptines.
1. Milieu
<EMI ID=25.1>
0,75% de chlorhydrate de L-arginine, 0,75% de glycine,
<EMI ID=26.1>
Japonais n[deg.] 595.140 ; Brevet des Etats-Unis d'Amérique N[deg.] 3.840.513).
(3) Milieu synthétique classique (témoin) : 1% de glucose,
1% d'amidon, 0,26% de L-leucine, 0,4% de chlorhydrate
<EMI ID=27.1>
page 20).
2. Souche utilisée : identique à celle employée dans l'exemple
expérimental 1.
3. Conditions de culture : Dans 100 ml du milieu déposé dans un
ballon de 500 ml, on inocule <1> ml de l'inoculum cultivé de la même manière qu'à l'exemple expérimental 1. On cultive le milieu inoculé à une température de 27 à 28[deg.]C avec une machine à agitation fonctionnant à une amplitude de 7 cm et à 135 mouvements de va-et-vient par minute. On prélève des échantillons après 48 et 72 heures et on les soumet à des essais en vue de déterminer la puissance des leupeptines.
4. Résultats : les résultats obtenus sont repris au tableau 3.
TABLEAU 3
<EMI ID=28.1>
Ainsi qu'on le constate d'après le tableau 3, après une culture pendant 72 heures, le milieu de l'invention donne une productivité de leupeptiries 4 à 6 fois supérieure à celles obtenues avec le milieu classique et le milieu synthétique classique utilisés comme témoins. Bien que ces milieux comprennent presque les mêmes ingrédients, le rendement obtenu avec le milieu de la présente invention est six fois supérieur à celui obtenu avec le milieu synthétique classique car, dans le milieu de l'invention, on a amélioré les concentrations en L-leucine,
en L-arginine et en glycine, ainsi que leur équilibre.
Exemple expérimental 5
Intervalles appropriés des quantités de L-leucine, de L-arginine et de glycine.
1. Milieu : on ajoute des quantités variables
(indiquées au tableau 4) de L-leucine, de chlorhydrate de Larginine et de glycine au milieu de base comprenant 3% de glucose,
<EMI ID=29.1>
à base de silicone.
2. Souche utilisée : identique à celle employée dans l'exemple expérimental 1.
3. Conditions de cultures : identiques à celles de 1'exemple expérimental 4.
<EMI ID=30.1>
qués au tableau 4'
TABLEAU 4
<EMI ID=31.1>
Ainsi qu'on le constate dans le tableau 4, lorsque, au milieu, on ajoute de la L-leucine, du chlorhydrate de L-arginine et de la glycine chacun en une quantité de 0,25%, le rendement en leupeptines après culture pendant 72 heures est insignifiant tandis que, lorsquton ajoute 0,5 à 1,25% de chacun de ces acides aminés, au cours de la même période de culture, le rendement en leupeptines atteint 2.560 à 4*370 mcg/ml. Toutefois, lorsque
la quantité de chacun de ces acides aminés est portée à 1,50%,
on n'obtient qu'une quantité insignifiante de leupeptines. Ces résultats confirment que l'on obtient spécifiquement un haut rendement en leupeptines lorsque, au milieu, on ajoute de la L-leucine, de la L-arginine (sous forme de chlorhydrate) et de
<EMI ID=32.1>
Exemple expérimental 6 : Effet de l'addition de substances organiques complexes naturelles.
1. Milieu : On ajoute des substances organiques naturelles indiquées au tableau 5 au milieu de la présente invention, utilisé dans l'exemple expérimental 4.
2. Souche utilisée : identique à celle employée dans l'exemple expérimental 1.
3. Conditions de culture : identiques à celles de l'exemple expérimental 4.
4. Résultats : les résultats obtenus sont indiqués au tableau 5.
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
Ainsi qu'on le constate d'après le tableau 5, lorsque, au milieu initial de la présente invention (utilisé comme témoin), on ajoute 0,1 à 0,2% d'extrait de levure, d'acides casaminés ou d'acides ribonucléiques, on augmente davantage le rendement en leupeptines ; en particulier, lorsqu'on ajoute des acides ribonucléiques, le rendement atteint une valeur égale à deux fois celui obtenu avec le milieu initial.
Dans les procédés de la présente invention, on
peut utiliser n'importe quel micro-organisme capable de produire des L-leupeptines. Parmi ces micro-organismes, il y a, par exemple, Streptomyces roseus [2 souches, leurs numéros du laboratoire de l'"Institute of Microbial Chemistry" sont : MA839-A1 et MB262-M1, ; la souche MA839-A1 est déposée au "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology", Japon (Kogyo
<EMI ID=35.1>
Type Culture Collection", Maryland, E.U.A., les numéros de dépôt sont FERM-P N[deg.] 3017 et ATCC 31245 respectivement], Streptomyces roseochromogenes (3 souches : MA943-Ml, MB 456-AE1 et MB260-A2),
<EMI ID=36.1>
albireticuli (1 souche : MB26-A1), Streptomyces thioluteus
(1 souche : MB321-A1), Streptomyces lavendulae (1 souche :
MB172-A2) et Streptomyces noboritoensis (1 souche : MB46-AG). Les propriétés de ces espèces ont été décrites dans "The Actinomycetes", volume II (par S.A. Waksman, �'The Williams & Wilkins
<EMI ID=37.1>
Les sources de carbone pouvant être utilisées dans le milieu producteur de leupeptines de la présente invention sont l'acide acétique, le glycérol, le glucose, le sucrose, le maltose, la dextrine, l'amidon et autres ; parmi ces sources,
le glycérol et le glucose sont particulièrement utiles. Comme source d'azote inorganique, l'azote d'ammoniac est supérieur à l'azote de nitrate.
Les acides aminés devant être ajoutés au milieu sont la L-leucine, la L-arginine et la glycine.
Parmi les substances organiques naturelles ajoutées au milieu, il y a les acides ribonucléiques, l'extrait de levure et l'hydrolysat de caséine ; les acides ribonu�léiques peuvent être de qualité purifiée ou de qualité brute et l'on peut égale-ment utiliser des substances contenant des acides ribonucléiques en concentrations relativement élevées.
Parmi les résines adsorbantes non ioniques poreuses utilisées suivant la présente invention, il y a, par exemple, les résines "Amberlite XAD-1, XAD-2, XAD-4 et XAD-5" (marques commerciales, fabriquées par "Rohm and Haas Co.", E.U.A.) et
<EMI ID=38.1>
commerciales, fabriquées par "Mitsubishi Chemical Co.", Japon),
(ces neuf résines sont constituées d'un copolymère de styrène/ divinyl-benzène), les résines "Amberlite XAD-7 et XAD-8" (marques commerciales pour des adsorbants constitués d'un polymère d'ester acrylique, fabriquées par "Rohm and Haas Co."), ainsi que la
résine "Duolite S-30" (marque commerciale pour un adsorbant constitué d'une résine phénolique, fabriquée par "Chemical Process Co.", E.U.A.).
Les L-leupeptines sont préparées par les procédés de la présente invention comme décrit ci-après.
Le milieu de culture contient, par exemple, 1 à
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L-leucine, 0,5 à 1,25% de L-arginine (sous forme de chlorhydrate), 0,5 à 1,25% de glycine, 0,05 à 0,3% d'une substance organique naturelle telle que l'acide ribonucléique, l'extrait de levure
et l'hydrolysat de caséine, de même que 0,01 à 0,3% d'un agent antimousse à base de silicone (pH : 6,5). Après stérilisation
de la manière habituelle, on inocule , dans le milieu et dans des aseptiques, une culture d'ensemencement préparée en cultivant une souche productrice de leupeptines telle que Streptomyces roseus
(souche MA839-A1 ; FERM-P N[deg.] 3017 ; ATCC 31245), puis on cultive à une température de 23 à 37[deg.]C, de préférence, de 25 à 30[deg.]C.
<EMI ID=40.1> par addition d'acide sulfurique ou d'acide phosphorique. Habituellement, après fermentation pendant 3 à 4 jours, l'accumulation
<EMI ID=41.1>
On filtre le bouillon de culture ainsi obtenu et
on traite le filtrat avec une résine afin de récupérer les Lleupeptines. On peut effectuer le traitement à la résine de diverses manières, mais le plus efficacement en utilisant une colonne de résine. On charge la résine adsorbante dans une-
colonne, puis on l'active en y faisant passer, par exemple, du méthanol aqueux à 80% et en la lavant convenablement avec de
l'eau. On règle le filtrat de culture contenant des leupeptines
à un pH compris entre environ 5 et 6, puis on le fait passer à travers la colonne de résine afin d'adsorber les leupeptines
sur cette dernière. Après adsorption, on lave la colonne avec
de l'eau et on élue les leupeptines adsorbées. Parmi les éluants pouvant être utilisés, il y a les alcools inférieurs tels que le méthanol, l'éthanol, le n-propanol, l'isopropanol, le n-butanol
et l'isobutanol, les alcools inférieurs aqueux, l'acétone aqueuse, la méthyl-éthyl-cétone aqueuse, les solvants organiques contenant
de l'eau acide, de même que l'eau acide. Parmi les éluants souhaitables, il y a, par exemple, le méthanol aqueux à 10-95%,
réglé à un pH de 4 ou moins avec un acide inorganique tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique ou l'acide phosphorique. Une vitesse spatiale appropriée du liquide est de 0,5 à 2 dans l'étape d'adsorption et de 0,1 à 1, en particulier, d'environ 0,5 dans l'étape d'élution. On recueille
l'éluat en fractions de quantités définies. On obtient une fraction de l'éluat contenant des leupeptines en combinant les fractions présentant une activité anti-trypsine, une réaction positive de sakaguchi ou une réaction positive de Rydon-Smith. C'est ainsi que l'on peut obtenir une solution partiellement purifiée de L-leupeptines en effectuant l'adsorption et la désorption dans
des conditions acides. Etant donné que l'on n'a pas encore trouvé un procédé industriellement économique pour la séparation des D-leupeptines et des L-leupeptines, pour la production de L-leupeptines par fermentation, il est nécessaire de prendre
des mesures permettant d'éviter la racémisation des L-leupeptines tout au long des étapes opératoires de fermentation et de purification. Un des avantages principaux des procédés de la présente invention réside dans le fait qu'ils permettent dtobtenir une récupération efficace de L-leupeptines à partir d'un filtrat de bouillon de culture contenant uniquement des L-leupeptines. On peut effectuer une purification complémentaire des L-leupeptines ainsi obtenues par une combinaison appropriée de techniques connues de purification telles qu'une chromatographie dans des conditions acides avec du charbon actif, de l'alumine (de préférence, de l'alumine acide) ou du gel de silice, de même qu'une extraction à partir d'une solution aqueuse avec du n-butanol ou analogues.
La présente invention sera illustrée ci-après plus en détail par des exemples n'ayant cependant aucun caractère limitatif.
Exemple 1
On divise, en portions de 100 ml, un milieu cQntenant 2% de glucose, 2% d'amidon, 3% de polypeptone, 0,5% de
<EMI ID=42.1>
chaque portion de 100 ml dans un ballon à agitation de 500 ml
et on les stérilise à 120[deg.]C pendant 20 minutes. Dans le milieu stérilisé, on inocule une boucle en platine d'une culture inclinée d'une souche productrice de leupeptines [Streptomyces roseus,
<EMI ID=43.1>
culture agitée à 27[deg.]C pendant 2 jours. On inocule 200 ml du bouillon de culture obtenu dans une cuve de fermentation de 30 litres contenant 20 litres du même milieu que celui utilisé
<EMI ID=44.1>
de 20 litres/minute et à une vitesse d'agitation de 400 tours/ minute. Des échantillons prélevés après culture pendant 24, 36,
42 et 48 heures présentent respectivement un pH de 6,7, de 6,8, de 6,4 et de 6,7, tandis que la puissance des leupeptines est
<EMI ID=45.1>
On mélange le bouillon de culture ainsi obtenu avec 5% (poids/volume) d'un produit auxiliaire de filtration
<EMI ID=46.1>
hydrique dilué pour obtenir environ 15 litres d'un filtrat de culture présentant une puissance de leupeptines de 665 mcg/ml.
On fait passer 4 litres (puissance totale = 2.660 mg unité) du filtrat de culture à travers une colonne garnie de 100 ml d'"Amberlite XAD-2" (résine adsorbante non ionique) à une vitesse spatiale de 1 pour adsorber des leupeptines sur la résine. Après lavage à l'eau, on élue les leupeptines adsorbées avec du méthanol aqueux à 80% réglé à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique.
On combine les fractions actives de ltéluat, puis on les libère du méthanol par distillation sous pression réduite et on règle
la solution aqueuse résiduelle à un pH de 5,5 avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium pour obtenir 100 ml d'une solution aqueuse d'une puissance de 24,5 mg/ml (le rendement à partir du filtrat de culture est de 92%). On extrait deux fois cette solution aqueuse avec 70 ml de n-butanol et on libère la couche des extraits combinés du n-butanol par distillation sous pression réduite tout en ajoutant de l'eau pour obtenir 50 ml d'une solution aqueuse ayant une puissance de 47 mg/ml (puissance totale = 2.350 mg unité et le rendement à partir du filtrat de culture est de 88%). On règle la solution aqueuse ainsi obtenue à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique dilué et on l'introduit
<EMI ID=47.1>
actif ("Refined Shirasagi" pour chromatographie, fabriqué par
<EMI ID=48.1>
l'acétone par distillation pour obtenir une solution aqueuse.
<EMI ID=49.1>
"Dowex 44" (marque commerciale déposée, forme OH) et on la sèche par évaporation de glace pour obtenir 3,31 g d'une poudre jaune pâle ayant une puissance de 582 mcg/mg (la puissance totale est de 1.926 mg et le rendement à partir du filtrat de culture est de
72%). On dissout la poudre dans 30 ml de méthanol, on introduit la solution ainsi obtenue dans une colonne garnie de 90 g d'alumine acide avec.du méthanol et on développe avec du méthanol à une vitesse spatiale de 0,5. On combine les fractions actives de l'effluent et on les évapore à sec. On dissout la poudre obtenue dans de l'eau, on sépare les produits insolubles par
<EMI ID=50.1>
1,85 g de chlorhydrates de L-leupeptines ayant une puissance
de 988 mcg/mg. La puissance totale de la poudre est de 1.828 mg et le rendement à partir du filtrat de culture est d'environ
69%. La teneur de la poudre en forme L est de 100%.
Exemple 2
On charge chaque portion de 100 ml d'un milieu
(pH : 6,5) contenant 2% de glycérol, 1% de polypeptone et 1% d'extrait de viande dans des ballons Erlenmeyer de 500 ml, on
les stérilise à 120[deg.]C pendant 30 minutes, on y inocule une
boucle en platine d'une culture inclinée de Streptomyces roseus, MA839-A1 (FERM-P N[deg.] 3.017 ; ATCC 31245) et on effectue une culture agitée à 27[deg.]C pendant 24 heures pour obtenir un bouillon préalablement cultivé. Dans un ballon de 500 ml, on charge une portion de 100 ml d'un autre milieu (pH : 6,5) contenant 3% de glycérol, 0,75% de L-leucine, 0,75% de chlorhydrate de L-arginine, 0,75%
<EMI ID=51.1>
antimousse à base de silicone, on stérilise à 120[deg.]C pendant 30 minutes puis, dans des conditions aseptiques, on inocule 1 ml du bouillon préalablement cultivé ci-dessus et on effectue une culture à 27[deg.]C pendant 3 jours dans une machine à agitation fonctionnant à une amplitude de 7 cm et à 210 mouvements de vaet-vient par minute. Le déroulement de la culture est indiqué
<EMI ID=52.1>
TABLEAU 6
Déroulement de la culture
<EMI ID=53.1>
Après culture pendant 72 heures, on filtre le bouillon cultivé pour éliminer le mycélium et on règle le filtrat
<EMI ID=54.1>
à un pH de 6, puis on le fait passer à travers une colonne garnie de 120 ml de "Diaion HP 40" afin d'adsorber la leupeptine . Après lavage à l'eau, on élue la leupeptine adsorbée avec du méthanol aqueux à 50% d'un pH de 2 pour recueillir 235 ml d'une fraction de leupeptine. Après élimination du méthanol de la fraction de
<EMI ID=55.1>
<EMI ID=56.1>
aqueuse à un pH de 5,5 avec une solution aqueuse diluée d'hydro- xyde de sodium et on ltextrait trois fois avec 50 ml de n-butanol.
On combine les couches d'extrait et on les distille à 40[deg.]C pour éliminer le n-butanol sous forme d'un azéotrope avec de l'eau et l'on obtient 100 ml d'une solution aqueuse contenant 28 mg
(puissance) de leupeptine/ml. On règle la solution aqueuse ainsi obtenue à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique et on élimine
le précipité formé par filtration. On fait passer le filtrat à travers une colonne garnie de 100 ml de charbon actif ("Refined Shirasagi", fabriqué par "Takeda Chemical Co.") pour adsorber
la leupeptine. Après lavage avec de l'acide chlorhydrique dilué d'un pH de 2, on élue la leupeptine adsorbée avec de ltacétone aqueuse à 20% d'un pH de 2 pour obtenir 210 ml d'une fraction de leupeptine. On règle la fraction de leupeptine à un pH de 5 avec la résine "Dowex 44" (forme OH) et on la concentre à sec sous pression réduite pour obtenir 4 g d'une poudre presque blanche ayant une activité de 580 mcg/mg. On dissout la poudre dans du méthanol, puis on la fait passer à travers une colonne contenant
60 g d'une alumine acide (fabriquée par"Woelm Co.", République Fédérale d'Allemagne) en suspension dans du méthanol et on développe avec du méthanol pour recueillir des fractions de leupeptines. On concentre les fractions de leupeptines combinées à sec sous pression réduite pour obtenir 2,22 g d'une poudre blanche de chlorhydrate de leupeptine ayant une puissance de 1.000 mcg/mg, le rendement à partir du filtrat de culture étant de 68%.
La poudre ci-dessus a un pouvoir rotatoire spécifique la] <2><3> de -75[deg.] (c = 1, H20) et un point de fusion de 143-146[deg.]C
(décomposition) ; cette poudre donne une réaction de Sakaguchi positive, une réaction de Rydon-Smith positive et une réaction négative à la ninhydrine. Elle ne présente aucune absorption spécifique dans la zone de l'ultraviolet, mais.une absorption finale uniquement. Comme représenté en figure 2, le spectre d'absorption des rayons infrarouges de cette poudre coïncide avec celui d'une DL-leupeptine obtenue par un procédé classique.
On hydrolyse 20 mg des chlorhydrates ci-dessus avec de l'acide chlorhydrique 6N dans un tube scellé à 110[deg.]C pendant 24 heures et on extrait l'acide gras libre contenu dans l'hydrolysat avec de l'éther éthylique. On conc.entre la couche d'extrait et on la soumet à une chromatographie gazeuse en uti-
- lisant une colonne garnie de "Chromosolb 101" (60-80 mailles) <EMI ID=57.1>
de l'acide acétique. En conséquence, il se confirme que la
poudre est un chlorhydrate de leupeptine ne comportant qu'un
groupe acétyle comme groupe acyle.
Ensuite, on dissout environ 200 mg du chlorhydrate dans 8 ml d'eau. A la solution de chlorhydrate ci-dessus, tout
en agitant à la température ambiante, on ajoute goutte à goutte
une solution de 52 mg de permanganate de potassium dans 2 ml
d'eau et l'on poursuit l'agitation pendant deux heures supplémentaires pour assurer l'oxydation. Ensuite, on neutralise le permanganate de potassium en excès avec du thiosulfate de sodium
et on fait passer le mélange obtenu à travers une colonne garnie
de 5 ml de charbon actif. Après lavage à l'eau, on élue la phase adsorbée avec de l'acétone aqueuse à 20% d'un pH de 2 pour recueillir des fractions donnant une réaction de Sakaguchi positive.
On combine ces fractions, on les règle à un pH de 5 avec la résine "Dowex 44" (marque commerciale déposée, forme OH) et on évapore
à sec pour obtenir 170 mg d'une poudre. On dissout cette poudre dans 1 ml de méthanol et on la fait passer à travers une colonne contenant 5 g d'une alumine acide en suspension dans du méthanol, puis on développe avec 15 ml de méthanol et ensuite, avec 25 ml
de méthanol aqueux à 50% et d'un pH de 3,0. On combine les fractions de l'effluent donnant une réaction de Sakaguchi positive,
on les règle à un pH de 5 avec la résine "Dowex 4411 (marque commerciale déposée, forme OH) et on évapore à sec pour obtenir
75 mg d'acide de leupeptine (acyl-L-leucyl-L-leucyl-arginine).
On pèse avec précision environ 10 mg de cet acide de leupeptine, on y ajoute 2 ml d'acide chlorhydrique 6N et on hydrolyse dans un tube scellé à 110[deg.]C pendant 24 heures. On évapore la solution de l'hydrolysat à sec et on la dissout dans l'eau. On soumet une partie de la solution obtenue à une analyse qualitative et quantitative des acides aminés constitutifs. On soumet le reste de la solution à un dosage biologique en utilisant, comme organismes d'essai, des bactéries d'acide lactique nécessitant de la L-arginine afin de déterminer la teneur en L-arginine. Les résultats
<EMI ID=58.1>
TABLEAU 7
Composition des acides aminés dans l'hydrolysat d'acide de leupeptinc
<EMI ID=59.1>
D'après les résultats ci-dessus, on peut conclure que l'acide de leupeptine ayant subi l'hydrolyse contient de la L-leucine et de la L-arginine dans un rapport molaire de 2:1, tandis qu'il ne contient pas de valine, d'isovaline et de D-arginine. En conséquence, il se confirme que la leupeptine obtenue
<EMI ID=60.1>
L-leucyl-L-argininal.
Exemple 3
Dans un ballon de 500 ml, on charge 100 ml d'un milieu (pH : 6,5) contenant 3% de glycérol, 0,75% de L-leucine, 0,75% de chlorhydrate de L-arginine, 0,75% de glycine, 0,5% de
<EMI ID=61.1>
d'un agent antimousse de silicone et on stérilise à 120[deg.]C pendant 30 minutes. Dans le milieu stérilisé, on inocule 1 ml d'un bouillon préalablement cultivé et préparé de la même manière
<EMI ID=62.1>
une machine à agitation fonctionnant à une amplitude de 7 cm et à 210 mouvements de va-et-vient par minute. Le déroulement de la. culture est indiqué au tableau 8-.
TABLEAU 8
Déroulement de la culture
<EMI ID=63.1>
Du filtrat de culture (2.350 mcg/ml, 800 ml), on extrait la L-leupeptine de la même manière qutà l'exemple 2, avec cette exception que l'on utilise l'"Amberlite XAD-4" au lieu de la résine "Diaion HP40" et l'on obtient 1,22 g de chlorhydrate de L-leupeptine.
Exemple 4
Dans un ballon de 500 ml, on charge 100 ml d'un milieu (pH : 6,5) contenant 3% de glucose, 0,75% de L-leucine, 0,75% de chlorhydrate de L-arginine, 0,75% de glycine, 0,8% de
<EMI ID=64.1>
0,2% d'acide ribonucléique et 0,1% d'un agent antimousse à base de silicone, puis on stérilise à 120[deg.]C pendant 30 minutes. Dans le milieu stérilisé, on inocule 1 ml d'un bouillon de culture d'ensemencement préparé de la même manière qu'à l'exemple 2 et on cultive à 27[deg.]C pendant 3 jours dans une machine à agitation
<EMI ID=65.1>
va-et-vient par minute. Le déroulement de la culture est indiqué au tableau 9.
TABLEAU 9
Déroulement de la culture
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
extrait la L-leupeptine et on la purifie de la même manière qu'à l'exemple 2, avec cette exception que l'on utilise la résine "Diaion HP20" au lieu de la résine "Diaion HP40" et l'on obtient 1,96 g de chlorhydrate de L-leupeptine.
Exemple 5
Dans des ballons de 500 ml, on charge chaque fois des portions de 100 ml d'un milieu (pH : 6,5) contenant 3% de
<EMI ID=68.1>
de silicone et on stérilise à 120[deg.]C pendant 20 minutes. Dans chaque portion, on inocule ensuite 1 ml d'un bouillon préalablement cultivé et préparé de la même manière qu'à l'exemple 2, puis on cultive à 27[deg.]C pendant 3 jours avec une machine à agitation fonctionnant à une amplitude de 7 cm et à 210 mouvements de vaet-vient par minute. Les résultats obtenus sont indiqués au tableau 10.
TABLEAU 10
Déroulement de la culture
<EMI ID=69.1>
Du filtrat de culture (3.700 mcg/ml, 800 ml), on isole la L-leupeptine de la même manière qu'à l'exemple 2, avec cette exception que l'on utilise la résine "Diaion HP30"au lieu de la résine "Diaion HP40" et l'on obtient 1,93 g de chlorhydrate de L-leupeptine.
Exemple 6
Dans une cuve de fermentation de 30 litres, on charge 20 litres d'un milieu (pH : 6,5) contenant 3% de glycérol, 0,75% de L-leucine, 0,75% de chlorhydrate de L-arginine, 0,75%
<EMI ID=70.1>
0,05% de KC1, 0,2% d'acide ribonucléique et 0,05% d'un agent j
<EMI ID=71.1>
s
30 minutes. Dans le milieu stérilisé, on inocule 200 ml d'un
<EMI ID=72.1>
<EMI ID=73.1>
conditions suivantes : vitesse de l'agitateur : 400 tours/minute débit d'air : 20 litres par minute. Le déroulement de la culture est indiqué au tableau 11.
<EMI ID=74.1>
Déroulement de la culture
<EMI ID=75.1>
Du filtrat de culture (4.350 mcg/ml, 800 ml chaque fois), on isole la L-leupeptine de la même manière qu'à l'exemple 2, avec cette exception qu'au lieu de la résine "Diaion HP40", on utilise les résines "Amberlite XAD-1, XAD-5,
<EMI ID=76.1>
<EMI ID=77.1>
2,01 g de chlorhydrate de L-leupeptine.
REVENDICATIONS
1. Procédé de production de L-leupeptines, caractérisé en ce qu'il consiste à inoculer une souche de Streptomyces productrice de leupeptines dans un milieu contenant des
sources nutritives, cultiver cette souche dans des conditions
aérobies à un pH compris entre 5 et 7 pour produire et accumuler
des L-leupeptines dans le milieu, puis extraire et purifier les L-leupeptines du bouillon de culture à un pH de 7 ou moins.