JPH07110234B2 - 天然型アブシジン酸の精製法 - Google Patents

天然型アブシジン酸の精製法

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JPH07110234B2
JPH07110234B2 JP6262591A JP6262591A JPH07110234B2 JP H07110234 B2 JPH07110234 B2 JP H07110234B2 JP 6262591 A JP6262591 A JP 6262591A JP 6262591 A JP6262591 A JP 6262591A JP H07110234 B2 JPH07110234 B2 JP H07110234B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、植物の生長を直接制御
している植物ホルモンの1つとして知られている天然型
アブシジン酸((S)−アブシジン酸)を微生物を用い
て生産する際の精製法に関する。
【0002】
【従来の技術】植物ホルモンとして強い生理活性を有す
る天然型アブシジン酸は、種々の合成方法が知られてい
るが、未だに実用的な方法は見出されていない。他方、
天然型アブシジン酸を産出する微生物の探索も行なわれ
ているが、工業化できるほどの量の天然型アブシジン酸
を産出する微生物及びその培養方法は見出されていなか
った。ところが最近になって天然型アブシジン酸を大量
に産生する微生物が発見され、該微生物を用いて天然型
アブシジン酸を大量に生産する培養方法が開発された
(特公昭59−45359号、特公昭60−6629
号、特公昭61−35838号、特開昭63−2966
96号、特開昭63−296697号、特開平1−22
8458号、特開平2−60590号、特開平2−10
9988号の各公報参照)。そして、ここで開発された
培養方法を用いて、培養法による天然型アブシジン酸の
工業的な生産の実用化が行なわれつつある。
【0003】しかるに従来の天然型アブシジン酸の培養
法による製造において、固体培養法による培養抽出液、
あるいは液体培養法による培養濾液から天然型アブシジ
ン酸を精製する方法は、一般的な方法で行なわれてい
た。この方法を固体培養法で生産した天然型アブシジン
酸の精製法の一例として例示する。この方法は培養物を
アセトンで抽出して減圧濃縮し、水溶性残渣のpHを
9.0に調節して不純物を酢酸エチルを用いて抽出除去
して残った水溶液のpHを3.0に調節した後、天然型
アブシジン酸を酢酸エチルで抽出し、天然型アブシジン
酸を含む酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ、この乾燥した酢酸エチル溶液を減圧濃縮した後、シ
リカゲルを用いたカラムクロマトにより天然型アブシジ
ンを含む溶出液を溶出し、この溶出液を減圧濃縮した
後、常法によって天然型アブシジン酸の結晶を取り出し
ている。
【0004】しかしながら、上記に例記した従来の方法
は、 酢酸エチルによる抽出操作で除去される不純物
の量が少ないため、残存する不純物によりシリカゲルカ
ラムが目詰まりを起こし、天然型アブシジン酸の損失が
大きい、 使用するシリカゲルと溶媒の量が多い、
溶液のpHを調節しなければならない、乾燥剤とし
て無水硫酸ナトリウムを多量に用いなければならない、
溶出溶媒に引火性があるn−ヘキサンを混合使用し
なければならない、 固体培養法においては固体培地
中の天然型アブシジン酸を抽出するために多量の有機溶
媒を使用しなければならない等の多くの欠点があり、こ
れらの欠点のために工業生産性が低くなり、あまり好ま
しい精製法ではなかった。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、精製工
程における天然型アブシジン酸の損失が少なく操作が容
易な、培養法による天然型アブシジン酸の精製法を確立
すべく種々検討を行なった結果、固体培養での培養抽出
液(培養物を水または温水で抽出した水溶液)、あるい
は液体培養での培養濾液(水溶液)を減圧濃縮した後、
単一の有機溶媒による処理を行なうか、あるいは異なる
有機溶媒を用いた処理を組み合わせることにより、多量
の不純物のみを選択的に分離除去した後、シリカゲルを
用いたカラムクロマトにより天然型アブシジン酸を分取
することにより、高純度な天然型アブシジン酸を高収率
で精製できることを知見し、工業的にきわめて有利な発
明課題を解決した。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明の天然型アブシジ
ン酸の精製法は、天然型アブシジン酸生産能を持つ微生
物の固体培養抽出液若しくは液体培養濾液を減圧濃縮
て得られた濃縮原液と有機溶媒を混合し、分離してくる
不純物を濾過或いはデカンテーションによって除去し、
その濾液或いは上澄み液を減圧濃縮した後、得られた濃
縮液と有機溶媒を混合したときに不純物が分離しなくな
るまで濃縮液と有機溶媒の混合、分離してくる不純物の
除去、減圧濃縮といった一連の操作を繰り返し行ない、
さらにシリカゲルを用いたカラムクロマトを用いて不純
物を除去し、通常の方法で晶析を行うことにより、天然
型アブシジン酸を精製することを特徴とするものであ
る。
【0007】また、この天然型アブシジン酸の精製法に
おいては、濃縮液と有機溶媒を混合する際に、メチルア
ルコール、エチルアルコール、1−プロピルアルコー
ル、2−プロピルアルコール、1−ブチルアルコール、
2−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、t−ブ
チルアルコール、2−メトキシエタノール、2−エトキ
シエタノール、アセトン、1−メトキシ−2−プロパノ
ール、メチルエチルケトン、酢酸メチル、または酢酸エ
チルから選ばれる有機溶媒を単独で用いるか、或 いは一
連の操作ごとに異なる有機溶媒を用いるのが適当であ
る。
【0008】以下に本発明を説明する。本発明において
天然型アブシジン酸を製造するための培養法は、固体培
養法、液体培養法のいずれでも良い。本発明において使
用する微生物は天然型アブシジン酸生産能、あるいはア
ブシジン酸類縁化合物の生産能を有する微生物であれば
いずれでもかまわない。天然型アブシジン酸生産能、あ
るいはアブシジン酸類縁化合物の生産能を有する微生物
の具体例として、セルコスポラ・ロシコラ、セルコスポ
ラ・クルエンタ、ボツリチス・シネレア、ステムフィリ
ウム・エスピーD302等の微生物が挙げられる。
【0009】上記の天然型アブシジン酸生産能を有する
微生物を用いて、固体培養法あるいは液体培養法で天然
型アブシジン酸を製造する。培養条件等については、そ
れぞれの菌株にとって適切な条件を用いて培養する。培
養方法などの具体例としては、例えば、菌株としてボツ
リチス・シネレアを用いた培養法による天然型アブシジ
ン酸の製造法が、特開平1−109988号公報に詳細
に記述されている。
【0010】培養終了後、固体培養法の場合は、培養物
を水または温水で抽出して天然型アブシジン酸を含む培
養抽出液を得る。液体培養法の場合は、培養液を濾過し
て天然型アブシジン酸を含む培養濾液を得る。このよう
にして得られた培養抽出液または培養濾液を50℃〜5
5℃で減圧濃縮して濃縮原液とし、この濃縮原液と有機
溶媒(後記)とを混合して分離してくる不純物を濾過あ
るいはデカンテーションによって除去し、その濾液ある
いは上澄み液を減圧濃縮する。この減圧濃縮液と有機溶
媒とを混合して不純物を析出させて除去する。このよう
な天然型アブシジン酸を含む溶液の減圧濃縮、有機溶媒
との混合、および濾過あるいはデカンテーションといっ
た一連の操作を、濃縮液と有機溶媒とを混合したときに
不純物が分離しなくなるまで繰り返し行なう。
【0011】本発明で使用する有機溶媒は、メチルアル
コール、エチルアルコール、1−プロピルアルコール、
2−プロピルアルコール、1−ブチルアルコール、2−
ブチルアルコール、イソブチルアルコール、t−ブチル
アルコール、2−メトキシエタノール、2−エトキシエ
タノール、1−メトキシ−2−プロパノール、アセト
ン、メチルエチルケトン、酢酸メチル、または酢酸エチ
ル等の有機溶媒が適当である。天然型アブシジン酸を含
む濃縮液と混合する有機溶媒は上記の有機溶媒のいずれ
か1種類でも良いし、一連の操作ごとに異なる有機溶媒
を用いても良い。
【0012】不純物が分離しなくなった天然型アブシジ
ン酸を含む溶液を減圧濃縮する。この天然型アブシジン
酸を含む濃縮液をシリカゲルカラムに添加し、上述した
有機溶媒で天然型アブシジン酸を溶出する。天然型アブ
シジン酸を含むこの溶出液を減圧濃縮し、通常の方法で
結晶化して、天然型アブシジン酸を得る。あるいは、カ
ラムクロマト処理を行なわないで、不純物が分離しなく
なった天然型アブシジン酸を含む溶液を減圧濃縮した
後、通常の方法で結晶化して、天然型アブシジン酸を得
る。このようにして得られた天然型アブシジン酸の純度
が低い場合には、再結晶化を行なって精製する。
【0013】以下に本発明の培養法例及び精製の実施例
を示す。 ◎培養法例1 天然型アブシジン酸の固体培養法による製造 フスマ600g、コーン600g、炭酸カルシウム12
0g、及び水1.2lを含む培地に適切な方法で滅菌処
理を施し、この培地にボトリチス・シネレア菌(FER
M P−6156)の胞子または菌糸体を培地1gあた
りに1×10個以上の細胞を接種し、25℃で7日間
暗所で静置培養する。培養終了後、培養物を10lの水
で2時間浸漬して天然型アブシジン酸を抽出する。この
抽出液に含まれる天然型アブシジン酸の量は約4.9g
であった。 ◎培養法例2 天然型アブシジン酸の液体培養法による製造 馬鈴薯抽出液の4倍希釈液(1l中にはグルコース5
g、馬鈴薯50g相当分の抽出物を含む)15lにコー
ンスチープリカー1.9g、炭酸カルシウム37gを加
えた培地を基本培地とし、この基本培地に粉砕コーンを
300g添加して、120℃で20分間滅菌し、培養培
地を調整する。この培養培地にボトリチス・シネレア菌
(FERM P−6156)の胞子または菌糸体を培地
1lあたり1×10個以上を接種し、30lジャーフ
ァーメンターを用いて25℃で7日間通気撹拌培養(2
0rpm)を行なう。培養終了後、培養培地を濾別し、
天然型アブシジン酸を含む培養液約15lを得た。この
培養液には約1gの天然型アブシジン酸が含まれてい
た。
【0014】◆〔実施例1〕 培養法例1で製造した天然型アブシジン酸の精製 培養法例1で得られた培養抽出液を50℃〜55℃で約
1lまで減圧濃縮する。この濃縮液とエタノール1.5
lを混合し、析出した不純物の沈澱を濾別し、この濾液
を50℃〜55℃で減圧濃縮して、得られた濃縮液とエ
タノール2lを混合して析出した不純物の沈澱を濾別
し、この濾液を再び減圧濃縮し、天然型アブシジン酸を
含む濃縮液とエタノールの混合、析出した不純物の沈澱
の濾別、得られた濾液の減圧濃縮といった一連の操作を
さらに1回行なう。次に、この一連の操作をエタノール
のかわりに酢酸エチルを用いて3回繰り返し行ない、約
20mlの天然型アブシジン酸を含む濃縮液を得、この
濃縮液20mlをシリカゲルカラム(BW820MH、
富士デヴィソン社製、ゲル容量70ml)に添加し、天
然型アブシジン酸を酢酸エチルで溶出させ、分取する。
分取した天然型アブシジン酸を含む酢酸エチル溶液を濃
縮後、通常の方法にしたがって、天然型アブシジン酸を
結晶として析出させる。一連の結晶化の操作を2回繰り
返し行なって、天然型アブシジン酸の結晶約3.1gを
得た。収率は約63%以上、純度は98%以上であっ
た。
【0015】◆〔実施例2〕 培養法例2で製造した天然型アブシジン酸の精製 培養法例2で得られた天然型アブシジン酸の培養液約3
0lを用いて、実施例1と同様な方法で、約0.7gの
天然型アブシジン酸を得た。収率は約70%、純度は9
8%以上であった。
【0015】
【発明の効果】本発明は、上述した構成になるものであ
、乾燥剤としての無水硫酸ナトリウムの使用、および
溶液のpHの調節等の操作を行なうことなく、また固体
培養法においては培養物の抽出の際に多量の有機溶媒を
用いることなく、減圧濃縮、有機溶媒との混合および不
純物の除去という一連の操作を必要に応じて繰り返し行
なうだけで、微生物を利用した培養法により天然型アブ
シジン酸を製造し、高純度の天然型アブシジン酸をより
簡単な精製法で高収率に得ることができ、工業的規模で
の天然型アブシジン酸の生産性を飛躍的に向上させるこ
とができる効果がある。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 天然型アブシジン酸生産能を持つ微生物
    の固体培養抽出液若しくは液体培養濾液を減圧濃縮して
    得られた濃縮原液と有機溶媒を混合し、分離してくる不
    純物を濾過或いはデカンテーションによって除去し、そ
    の濾液或いは上澄み液を減圧濃縮した後、得られた濃縮
    液と有機溶媒を混合したときに不純物が分離しなくなる
    まで濃縮液と有機溶媒の混合、分離してくる不純物の除
    去、減圧濃縮といった一連の操作を繰り返し行ない、さ
    らにシリカゲルを用いたカラムクロマトを用いて不純物
    を除去し、通常の方法で晶析を行うことにより、天然型
    アブシジン酸を精製することを特徴とする天然型アブシ
    ジン酸の精製法。
  2. 【請求項2】 濃縮液と有機溶媒を混合する際に、メチ
    ルアルコール、エチルアルコール、1−プロピルアルコ
    ール、2−プロピルアルコール、1−ブチルアルコー
    ル、2−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、t
    −ブチルアルコール、2−メトキシエタノール、2−エ
    トキシエタノール、アセトン、1−メトキシ−2−プロ
    パノール、メチルエチルケトン、酢酸メチル、または酢
    酸エチルから選ばれる有機溶媒を単独で用いるか、或い
    は一連の操作ごとに異なる有機溶媒を用いる請求項1記
    載の天然型アブシジン酸の精製法。
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