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" Procédé de préparation d'une nouvelle substance bactérici- de par la culture de Bacillus polymyxa sous forme pure, de sels et de dérivés ".
La présente invention concerne une nouvelle substance bactéricide obtenue en tant que produit métabolique de la culture de Bacillus polymyxa, ainsi que sa préparation à l'état pur et sous forme de sels et de dérivés. ,
Au cours de ces dernières années, on a préparé et décrit un certain nombre de substances antibiotiques. Parmi ces substances, on peut mentionner la pénicilline, la strep- tomycine, la bacitracine, la subtiline, la streptothricine, la gramicidine et analogues . En général, aucun des agents A
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bactéricides précédemment connus de ce typera une action efficace permanente contre les bactéries Gram-négatives. La streptomycine donne certains résultats favorables au début mais elle manque souvent d'efficacité en raison du dévelop- pement de variétés antagonistes.
Or, on a constaté qu'une substance qu'on appellera Polymyxine et qu,ton obtient à partir des liqueurs métaboli- ques de Bacillus polymyxa à la suite de culture faite dans des conditions décrites plus loin, est extrêmement active contre les infections produites par les bactéries Gram- négatives .
Le Bacillus polymyxa est un micro-organisme qui se trouve, entre autres, dans les gadoues- Une culture du microorganisme révèle généralement la présence de cellu- les végétatives Gram-négatives, en forme de spores associées à des sporanges ainsi que des spores ovales libres* Le microorganisme, dans un milieu de culture approprié, provo- que le fermentation d'hydrates de carbone tels que le dextrose, le lactose et le saccharose, avec formation d'acide et de gaz ; produit de l'acétyl-méthyl-carbinol, mais il ne forme pas une diastase amylase capable de cata- lyser la formation de dextrines cristallines à partir d'amidon.
Suivant la présente invention, on produit une substan- ce bactéricide en ensemençant du Bacillus .polymyxa dans un bouillon de culture liquide sensiblement neutre, en permettant l'évolution de la fermentation dans des condi- tigns aérobies et en récupérant ensuite une matière bactéri- cide à partir de la liqueur fermentée.
La Polymyxine obtenue par le procédé suivant la pré- sente invention peut être un mélange de substances très voisines . En les examinant à l'aide d'un procédé pour la détermination de l'homogénéité, décrit dans le Journal of Biology & Chemistry, 155 , 519 (1944), en utilisant une solution saline à 30 % au pH 3 et du butanol comme solvants,
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on a obtenu une courbe susceptible d'être reproduite. La substance obtenue par différents procédés d'isolement a donné des courbes presque identiques, ce qui indique que la ma- tière examinée, bien qu'obtenue par des procédés diffé- rents, possédait les mêmes caractéristiques de partage.
La Polymyxine est une substance ayant un poids moléculaire élevé étant donné qu'elle s'apparente par sa nature aux polypeptides. Dans une solution aqueuse, son pH se situe entre 9 et 11. Elle comporte au moins un groupe primaire amino et au moins un radical hydroxyle . Elle est optique- ment active étant donné qu'elle est lévogyre.
La substance purifiée, en solution aqueuse, peut être chauffée à 100 C entre une valeur de pH 3 et de 7,5 pendant plusieurs heures, sans manifester une perte appréciable d'activité . Dans un acide ou dans une base forte, la sub- stance en question perd complètement son activité en 48 heures, à la température ambiante.
Dans la mise en oeuvre de la présente invention la substance bactéricide Polymyxine peut être préparée par la culture de Bacillus polymyxa dans un milieu neutre pendant environ 2 à 5 jours à une température comprise entre 20 et 30 C. environ . On a trouvé qu'un milieu, qui con- vient particulièrement pour la production de grandes quanti- tés de Polymyxine, contient un hydrate de carbone tel que le glucose, l'amidon, le saccharose, le lactose, le maltose et similaires, une source d'azote telle que le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium et similaires, une substance protéique contenant des vita- mines telles que l'extrait de levure, ou la farine d'huile de soya , la liqueur de macération de mais, les produits solubles des poissons, de la levure de brasserie ou l'ex- trait de foie,
ainsi que de faibles quantités de sels miné- raux tels que le phosphate monopotassique, le sulfate de magnésium, du sulfate ferreux et du chlorure de sodium.
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Un excellent milieu de culture est celui qui contient les quantités suivantes d'ingrédients : hydrate de carbone 0,5 à 2 %; un composé contenant de l'azote 1 à 3 %; une substance protéique 0,3 à 1 %; phosphate monopotassique 0,1 à 0,5 %; sulfate de magnésium 0,0001 % à 0,005 % et une trace de chlorure de sodium.
Le Bacillus polymyxa peut être @@@@@s cultivé dans un milieu approprié réparti en couches minces . Il est généra- lement préférable d'utiliser une fermentation profonde,dans ce cas on n'obtient de bons rendements que si on fait passer des gaz à travers le mélange de fermentation. La vitesse de circulation des gaz n'est pas un facteur critique et elle peut varier dans des limites étendues (par exemple 4 à 64 litres/heure pour un milieu de culture de 8 li- tres). On obtient également de bons résultats avec des gaz tels que de l'air ou de l'azote commercial (à 99,7 % de pureté). On estime que les meilleurs résultats obtenus par passage d'air ou d'azote peuvent être attribués à l'éli- mination des gaz qui prennent naissance telsque l'anhydride carbonique .
Au cours d'une expérience, il a été constaté que le passage d'air à la vitesse approximative de 64 litres/ heure pour une quantité de 15 litres de milieu ensemencé produit d'excellents résultats. Des agents antimousse tels que 1 % d'octadécanol dans de l'huile minérale, de l'huile de saindoux et similaires, sont très utiles pour contrôler la formation de mousse qui se produit généralement dans ces conditions.
Au cours de la fermentation, on dispose d'une indica- tion sur la réaction par les changements produits dans le pH du milieu . Au commencement de la fermentation, ce pH est avantageusement d'environ 7. Après 3 jours il descend autour de 6 pour s'élever au quatrième jour à environ 6,5 où il reste indéfiniment . A ce point, la liqueur de fermentation
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présente une odeur caractéristique analogue à celle de la levure . Dans le cas où la fermentation . ne produit pas de Polymyxine par suite de contamination ou pour d'autres raisons, le pH du milieu au quatrième jour,est généralement inférieur à 5 et peut diminuer encore au cours des jours suivants. La liqueur présente, dans ce cas, une odeur caractéristique désagréable et âcre.
Lorsque la fesmentation est terminée, les bactéries et les matières en suspension sont éliminées, soit par centrifugation, soit par traitement avec une terre d'in- fusoires (Kieselguhr) , suivi d'une filtration . Le fil- trat est ensuite traité avec du charbon de bois, de la terre siliceuse ou du charbon actif, etc.. pour adsorber la Polymyxine sur la substance utilisée . La matière contenant la Polymyxine adsorbée est séparée par filtra- tion. On lave ce solide complètement à l'eau et avec un alcool aqueux. La matière active est ensuite séparée de la matière solide par un traitement à l'alcool acidifié.
Toutefois, si l'on utilise de la terre siliceuse en tant d'agent adsorbant, il est préférable de séparer la matière active en utilisant un mélange de pyridine dans l'acide acétique ou l'acide chlorhydrique . On précipite ensuite la matière active de l'alcool acide en utilisant un agent de précipitation tel que l'acétone, ou bien, on peut récupérer la substance par concentration de l'éluat ou par tout autre moyen approprié . On recueille la substance, on la lave et on la sèche . La matière active est géné- ralement obtenue sous forme d'un sel. On peut la purifier ultérieurement en convertissant le sel obtenu en premier lieu en un picrate, comme dans l'exemple 3 ci-après,ou bien, on peut le dissoudre dans de l'eau à une valeur de pH d'environ 9, puis l'extraire avec un alcool non misci- ble à l'eau .
L'alcool est ensuite traité avec de l'acide
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dilué, et après avoir éliminé l'alcool, on obtient le produit purifié par séchage sous vide à la température de congélation.
Suivant une variante, on peut obtenir la Polymyxine sous forme d'un dérivé aldéhydique par précipitation à partir de la liqueur alcalinisée de fermentation en ajoutant une aldéhyde tel que la benzaldéhyde, la formaldéhyde, etc..
Ce dérivé aldéhydique est traité avec du méthanol acide,et le sel de Polymyxine peut être récupéré comme ci-dessus.
Eventuellement, on peut obtenir directement d'autres déri- vés à partir du dérivé aldéhydique .
On peut également récupérer directement la, Polymyxine de la liqueur de fermentation par alcalinisation et extrac- tion à l'aide d'un alcool non miscible à l'eau, tel que le butanol, le 2-éthylhexanol, etc.. Si l'on ajoute à la liqur une quantité suffisante de sel minéral tel que du chlorure de sodium, on peut effectuer l'extraction sans alcalinisation . Le solvant est séparé en utilisant un acide minéral dilué, et le sel de Polymyxine est obtenu par séchage à la température de congélatign .
En outre, on peut récupérer la Polymyxine de là li- queur clarifiée de fermentation en utilisant un agent de précipitation tel que l'acide tannique .
La Polymyxine est particulièrement active contre les bactéries-Gram-négatives . On a constaté qu'elle possédé une action bactéricide sur les espèces appartenant aux genres suivants :
Aérobactère, Brucella, Eberthella, Escherichia, Hemophilus, Klebsiella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella et Vibrio. L'activité in vitro de la Polymyxine n'est pas affectée d'une manière significative par les variations dans la composition du milieu de culture, par exemple la présence de 10 à 50 % de sang opar des changements de la valeur du pH en-
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tre 5 eq 8.
On a constaté que la Polymyxine est extrêmement effi- cace sur les souris lorsqu'elle est administrée en injection sous-cutanée en une seule dose immédiatement après l'infec- tion avec environ 1. 000 doses mortelles de variétés virulen- tes de Pasteurella Multocida, ou de Klebsiella pneumonia.
Dans des infections produites expérimentalement au moyen de l'une quelconque des variétés très virulentes de Klebsiel- la, une seule dose de 20 milligrammes de Polymyxine sous forme de chlorhydrate par 20 gr. de souris, a suffi pour protéger de 90 à 100 % des animaux . Dans des conditions analogues d'expériences, une dose de 80 milligrammes a été également efficace dans des infections expérimentales pro- duites par chacune de six variétés de Pasteurella .
Une faible dose unique de Polymyxine a été très efficace même lorsque le traitement était effectué avec un retard allant jusqu'à 4 heures après l'infection. Lorsqu'on a accru la gravité de l'infection par des Klebsiella, en inoculant 100.000 et 10.000.000 de doses mortelles la dose nécessaires de Polymyxine pour assurer une survivance de 90 à 100 % s'est élevée respectivement à 40 et 80 milligrammes par souris.
Les doses inoculées par la voie sous-cutanée et intraveineuse avaient la même efficacité par la voie buccale, il a fal- lu augmenter la dose pour obtenir une survivance de 90 à 100 % . Des doses de 18 gilligrammes par kg de poids des sujets, administrées par la voie sous-cutanée, une fois par jour pendant 4 jours, ont protégé des poulets de deux semaines d'une infection, qui aurait été par ailleurs mor- telle, produite à l'aide d'une variété de typhoide des poules.
Dans une étude pour déterminer si on peut trouver dans de grands agglomérats de cellules (10 milliards, environ) des organismes résistants parmi chacune de 12 variétés
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normalement sensibles, représentant sept genres pathogéni- ques Gram-négatifs différents, on n'a pas jusqu'ici obtenu des organismes quelconques ayant un degré appréciable de résistance à la Polymyxine . Dans les mêmes conditions, des organismes qui, dans toutes les applications pratiques, résistent complètement à la streptomycine, peuvent être facile- ment obtenus à partir de toutes ces variétés . La strepto - mycine est le meilleur des antibiotiques précédemment connus pour les organismes Gram-négatifs.
La Polymyxine se distingue de tous les antibiotiques connus en raison d'une grande variété de propriétés biolo- giques et chimiques .Des variétés de bactéries qui étaient auparavant sensibles à la Polymyxine, à la streptomycine et à la streptothricine,ont conservé leur sensibilité à la Polymyxine , après avoir été rendues résistantes à la strepto- mycine ou à la streptotricine . Les spectres d'absorption d'infra-rouge du chlorhydrate de Polymyxine et du picrate de Polymyxine , représentés sur le dessin annexé, se ressem- blent étroitement. Toutefois, lorsqu'on compare les spectres de la Polymyxine avec ceux d'autres antibiotiques connus, également représentés sur le dessin, on constate des varia- tions considérables, surtout dans la gamme de fréquences exprimées en inverse de longueur d'onde entre 700 et 1400 (cm-1).
Les lettres de référence indiquées sur le dessin annexé ont la signification suivante :
A : spectres d'absorption d'infra-rouge d'antibiotiques
B : fréquence en cm-1
C : absorption en %
D : Nujol
E : chlorhydrate de Polymyxine
F : picrate de olymyxine
G : acide aspergillique
H : bacitracine @
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I : clavacine ci
J : gramidine- S
K : acide penicillique
L : streptomycine HCl - CaCl2 M : Streptothricine
N :
Subtiline
0 : chlorhydrate de thyrocidine
Une unité de Polymyxine est définie comme étant l'activité d'une quantité de Polymyxine contenue dans un centimètre cube d'agar nutritif qui empêche tout juste la culture de l'organisme d'essai qui est une variété de Escherichia Coli que l'on désigne par E.Coli (MacLeod).
Des solutions d'un concentré brut de Polymyxine (500 unités par milligramme) n'ont pas été affectées par une incubation prolongée avec des enzymes protéolytiques telles que la pepsine, la trypsine, la pancréatine et l'érepsine. On sait que dans des conditions identiques, la subtiline antibiotique se décompose . La Polymyxine n'a pas d'action semblable à celle de l'histamine lors- qu'on l'essaie sur un morceau d'intestin de cochon d'Inde.
On peut préparer des sels de Polymyxine avec des acides tels que du 2,4,8-trinitro-m-crésol, du 2,4,6-tri- nitro-résorcinol, de l'acide hélianthique et de l'acide lnitro-naphtalène-5-sulfonique en traitant une solution aqueuse de chlorhydrate de Polymyxine avec la substance appropriée . L'acide flavianique (acide 2-4 dinitro 1 naph- tol sulfonique) précipite la matière active provenant des solutions alcooliques ou aqueuses de chlorhydrate . Ce sel est légèrement soluble dans le méthanol , dans l'éthanol ou dans l'eau chaude, et il est insoluble dans l'acétone et autres solvants organiques.
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L'un des dérivés les plus importants est celui qu'on obtient par le traitement d'une solution aqueuse la alcaline de Polymyxine avec de/formaldéhyde, et en solubi- lisant ce produit par traitement au bisulfite de sodium. e dérivé permet l'emploi de doses relativement grandes de Polymyxine inoculée par injections parentérales sans irritation locale . Des dérivés analogues peuvent être préparés en remplaçant la formaldéhyde par d'autres aldéhydes aliphatiques et aromatiques tels que l'acétal- déhyde, l'acroléine, la benzaldéhyde, la salicylaldéhyde, la p-nitrobenzaldéhyde et l'aldéhyde cinnamique . De même, les aldéhydes du type hydrate de carbone tels que le glucose, le galactose et le fructose peuvent être utilisés . Il est également possible de préparer les sulfoxylates au lieu des bisulfites décrits plus haut.
Les dérivés acylés de la Polymyxine tels que les dérivés acétylés, succinylés, phtalylés, nicotinylés et analogues peuvent être préparés en faisant réagir de la Polymyxine avec de l'anhydride ou le chlorure correspondant.
L'invention sera maintenant décrite plus en détail en se référant aux exemples ci-après décrivant la prépa- ration de la Polymyxine ainsi que ses sels et ses produits réactionnels . Bien entendu, ces exemples sont donnés à titre explicatif et concernent certains procédés préférés mais ils ne limitent pas l'invention aux pro- cédés ou produits qu'ils décrivent.
Les parties s'entendent en poids, à moins d'indi- cation différente.
Exemple 1
A chaque ballon d'une série de douze ballons ayant une capacité individuelle de 22 litres, on ajoute 7,5 cc de chlorure de sodium à 10 %, 600 cc de sulfate d'am- monium à 50 %, 300 cc de phosphate monopotassique à 10 %, 75 cc de sulfate de magnésium heptahydrate à
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10 %, 15 cc de sulfate ferreux heptahydrate à 1 %, 750 cc d'extrait de levure à 10 % et 12.650 cc d'eau . Le pH est réglé à 7,9-8,0 (ce qui nécessite environ 23 cc de solution de soude caustique saturée). Après avoir obturé avec un tampon d'ouate de coton et de la gaze,la solution est stérilisée à l'autoclave pendant 1 heure à une pression de vapeur d'environ 1 kg par cm2. Après avoir refroidi à la température ambiante, on ajoute 600 cc de dextrose à 25 % dans de l'eau distillée (préalable- ment stérilisée ).
Au milieu, on ajoute 15 cc d'une culture âgée de 24 à 48 heures de Bacillus Polymyxa (ensemencée à partir d'une quantité d'agar contenue dans 100 cc du milieu de fermentation placé dans un ballon de 500 cc et soumis à l'incubation à 25 C) ainsi que 15 cc d'une solu- tion à 1 % d'octadécanol dans de l'huile minérale (préala- blemenq stérilisée). Le pH final du milieu, avant le commencement de la fermentation, se situé entre 7,2 et 7,5.
Les ballons sont reliés à une canalisation d'air comprimé et l'aération du milieu s'effectue par passage d'air stérilisé à la cadence de 64 litres par heure par ballon , pendant une période de 5 jours à 25 C. Des échantillons peuvent être prélevés les troisième et qua- trième jours pour des essais individuels, et un échantil- lon commun, le cinquième jour, pour une vérification de la moyenne .
On clarifie la liqueur métabolique par centrifuga- tion dans une machine centrifuge à vapeur Sharples et la liqueur présente une teneur d'environ 200 unités par cc.
On agite pendant une usure une quantité de 33 1. de liqueur métabolique clarifiée avec 330 gr. de charbon actif. Le gâteau de charbon filtré est lavé avec 30 1. d'eau, et ensuite, avec 50 % d'éthanol, jusqu'à ce que le filtrat
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devienne incolore . 10 1. d'alcool environ sont nécessaires.
La substance lavée est placée dans 10,5 litres d'éthanol acidifié ( 4 cc. d'acide chlorhydrique concentré par litre d'éthanol à 95 %)puis agitée toute la nuit. On répupère 9,5 litres d'éluat alcoolique après filtration, et on effectue la concentration presque à siccité par distillation sous vide .Le résidu est placé ensuite dans environ 90 cc d'étha- nol neutre à 95 % et on l'ajoute en remuant à environ 10 vo- lumes d'acétone . Le produit actif qui précipite de l'acétone est essentiellement incolore .
On le recueille par centri- fugation, on le lave d'abord avec de l'acétone, puis avec de l'éther, et on sèche sous vide, Le rendement en chlorhydra- te de Polymyxine est de 1,65 grs. de produit, avec une teneur de 1.024 unités par mg. ce qui représente une récupération de 27,5 % de l'activité estimée dans la liqueur métabolique.
L'analyse du produit a révélé la présence de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, d'azote et de chlore. L'essai de coloration à la ninhydrine est positif. La réaction du biuret est positive.
Exemple II.
La fermentation a lieu en quatre jours à 25 C, comme on l'a décrit dans l'exemple 1' Après avoir éliminé les bactéries et les matières en suspension par traitement avec de la terre d'infusoires et par filtration, on traite 180 litres de filtrat de la culture avec 1,7 kgs de terre sili- ceuse et le mélange agité est passé à travers un filtre préalablement revêtu de 1,7 kgs de terre siliceuse. On agite ensuite le filtrat avec 684 grs de charbon qu'on ajoute en deux parties chacune étant agitée pendant une durée d'en- viron 30 minutes. On élimine le charbon par filtration sous pression et on lave ensuite le gâteau pour éliminer les solides inertes. Le lavage s'effectue avec environ 150 li- tres d'eau, puis avec 95 litres d'éthanol à 50 %, et ensuite
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de 22,5 litres de méthanol absolu .
Le charbon lavé est traité pour l'élution par 15 litres de méthanol acidifié par de l'acide chlorhydrique, la teneur en acide étant 0,05N, divisés en 5 parties, Les dlutions s'effectuent en agitant 1/2 heure à 25 C. On précipite la substance active à partir de l'éluat alcoolique en ajoutant de 5 à 10 volumes d'acéto- ne . On récupère le solide par décantation des substances surnageant, par centrifugation des matières solides, par lavages à l'acétone et à l'éther, et enfin, par séchage à 25 C sous vide .La matière active, c'est-à-dire la Poly- myxine est obtenue sous forme de son chlorhydrate . Il est dans blanc, soluble x l'eau, il fond en noircissant un peu à 195-215 C et présente une activité d'environ 1400 unités par mg.
Le chlorhydrate de Polymyxine obtenu ci-dessus présente une faible absorption dans la région ultra-violette du spectre (2.400 à 4.000 AO) sans maxima ni minima caractéris- tiques (concentration 0,05 %). Le pouvoir rotatoire optique est de [[alpha]] 23 D = - 40 à - 35 .
Lorsqu'on applique 10 mg. de chlorhydrate de Polymy- xine ayant une'concentration de 1400 à 1600 unités par mg à un chromatogramme préparé à partir de 4 grs. de gel de silice contenant 6 cc d'un mélange tampon contenant 0,015 molécule de sulfosuccinate ayant un pH de 2, en utilisant du butanol suivant la technique de Martin et Synge (Journal of Biochimie Chemistry, 35, 1358 (1941) et qu'on mesure l'activité bactéricide du liquide effluant, on constate une répartition de cette activité qui est carac- téristique .
Lorsqu'on applique 10 mg de chlorhydrate de Polymy- xine ayant une activité de 1400 à 1600 unités par mg à un chromatogramme préparé à l'aide de 6 grammes d'une terre siliceuse contenant 6 cc d'un mélange tampon contenant 0,015 molécule, de sulfosuccinate ayant un pH de 2, en
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utilisant du butanol suivant la même technique que celle décrite plus haut, et qu'on mesure l'activité bactéricide du liquide effluant, on constate également une répartition de cette activité qui est caractéristique .
Lorsqu'on utilise du cyclohexanol au lieu de butanol comme solvant non aqueux, on constate une répartition d'acti- vité différente mais caractéristique.
Lorsqu'on utilise du 2-éthylhexanol à la place des solvants indiqués ci-dessus, l'activité bactéricide n'est pas supprimée dans la colonne par le passage de 350 cc de ce solvant.
En ajoutant 10 % de benzène au butanol du premier exemple, l'activité se répartit dans le liquide effluant d'une manière différente mais caractéristique .
Le chlorhydrate de olymyxine se caractérise par le fait que la substance bactéricide peut être extraite de solutions aqueuses par certains solvants organiques, dans des conditions déterminées, Dans des solutions salines aqueuses à 30 % avac un pH d'environ 2 à environ 7, on extrait la partie active à l'aide d'alcool butylique normal et le coefficient de partage est d'environ 1. En utilisant les mêmes conditions mais avec une concentration de 10 % de chlorure de sodium, le coefficient de partage est supérieur à 1, alors qu'en utilisant de l'eau pure le coeffi- cient est d'environ 5 à 10. On ne'peut pas extraire de Polymyxine à partir d'une solution saline aqueuse à 30 % au pH de 7 à l'aide d'acétate de butyle, de chlorure d'éthy- lène ou de chloroforme .
Dans des solutions aqueuses au pH de 9, Ûrois extractions à l'aide de volumes égaux d'alcool butylique normal éliminent environ 90 % du pouvoir bactérici- de . Cette partie active peut être récupérée du butanol dans un acide aqueux. Dans ces conditions, on l'extrait égale- ment avec du cyclohexanol et avec du 2-éthylhexanol, mais /
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d' @@ une façon moins complète qu'avec le butanol. La Rolymyxine est complètement adsorbée au pH de 7 et au-dessus, mais elle n'est que faiblement adsorbée au pH de 1 à 2 par un agent adsorbant tel que le charbon de bois.
Exemple III
On ajoute, à 42,6 grs de chlorhydrate de Polymyxine à 1400 unités par mg., 6 litres d'eau et on traite le mé- lange avec 15 grs- d'acide picrique;ainsi on sépare une faible fraction initiale de picrate . La partie principale de la concentration active est ensuite précipitée par traitement à l'aide de 23 grs. d'acide picrique . On isole le picrate par refroidissement et on dissout le solide huileux dans du méthanol, pour le précipiter de nouveau avec de l'éther afin d'éliminer l'excédent d'acide picri- que . On dissout ensuite le picrate dans du méthanol et on traite la solution avec une solution alcoolique d'acide chlorhydrique, la matière active étant précipitée par l'ad- dition de 10 volumes d'acétone .
On effectue deux fois encore la dissolution dans la solution d'acide chlorhydrique dans le méthanol et la précipitation avec de l'acétone, le produit obtenu étant un chlorhydrate blanc ayant une activi- té d'environ 1700 unités par mg. Le filtrat provenant de la deuxième fraction de picrate est traité avec une quantité ultérieure d'acide picrique (23 grs. ) afin d'obtenir une faible fraction finale de picrate qui est rénnie avec la fraction initiale en vue d'une purification ultérieure.
Le chlorhydrate de Polymyxine obtenu ci-dessus donne à l'analyse les proportions suivantes : C. 45,8 %, H.
8,4 %, N. 14,8 %, Cl. 9,8 %, NH-N (Van Slyke) - 5,7 % à 3 minutes et 7,2 % à 30 minutes. La réaction de ... ninhy- drine n'a révélé aucun groupe carboxyle libre . Après hydrolyse en milieu acide, NH2 - N ( Van Slyke) est égal à 5,7 % à 3 et 30 minutes. La réaction de Sakaguchi pour les guanidines substituées est négative . On a constaté que
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le poids équivalent acidimétrique dans lteau (point final au pH de 10) est de 340 et qu'il est le même en présence de formaldéhyde, ce.qui démontre l'absence d'un groupe carboxyle libre . Après 1 'hydrolyse en milieu acide, le poids équivalent acidimétrique dans l'eau (pH 5,5) était de 122.
Un contrôle microbiologique du produit dhydrolyse a indiqué la présence de thréonine .
Le chlorhydrate obtenu est soluble dans l'eau et dans le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, le triméthyl- carbinol et l'alcool butylique normal humide . Il est sen- siblement insoluble dans l'éther, l'acétone, le benzène, les solvants chlorés et l'alcool butylique normal sec.
Exemple IV
A chaque ballon d'une série de douze ballons ayant une capacité de 22 litres, on ajoute 150 gr. de farine d'huile de soya, 7,5 cc de chlorure de sodium à 10 %, 300 cc de phosphate monopotassique à 10 %, 75 cc de sulfate de magnésium heptahydrate à 10 %, 15 cc de sulfate ferreux heptahydrate à 1 % et 13.400 cc d'eau . On règle le pH à 7,9 - 8,0. Après avoir bouché à l'aide d'un tampon d'ouate de coton et de gaze, on stérilise la solution à l'auto- clave pendant 1 heure sous une pression de vapeur d'environ 1 kg. Après refroidissement à la température ambiante, on ajoute 600 cc de glucose à 25 % dans de l'eau distillée ( préalablement stérilisée) ainsi que 600 cc de sulfate d'ammonium à 25 % (préalablement stérilisé), et on ensemence les Bacillus polymyxa .
Le pH final du milieu avant fermentation est de 7,1 . Après 5 jours de fermenta- tion le pH est d'environ 5,5 et l'activité de 78 unités par cc. On sépare la liqueur de fermentation et on extrait la Polymyxine comme dans l'exemple II.
Exemple V
Trois Erlenmeyers de 500 ce, contenant 100 cc d'une
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solution à 1 % d'amidon soluble, 2 % de sulfate d'ammonium, 0,5 % d'extrait de levure, 0,2 % de phosphate monopotassique, 0,05 % de sulfate de magnésium, 0,001 % de sulfate ferreux et 0,005 % de chlorure de sodium, stérilisée sous une pres- sion de vapeur d'environ 1 kg/cm2, sont ensemencés en Bacillus polymyxa . Après une fermentation stationnaire pendant 4 jours à 25 C, on réunit les solutions et l'essai permet de constater la présence de 167 unités par cc.
Dans des expériences exécutées dans des conditions analogues une solution à 1 % de glucose a donné 210 unités par cc et 1 % de lactose adonné 116 unités par cc.
Exemple V1
On a stérilisé trois Erlenmeyers contenant 100 cc d'une solution à 1 % de glucose, 2 % de sulfate d'ammo- nium, 2 % de liqueur de macération de mais, 0,2 % de phosphate monopotassique, 0,05 % de sulfate de magnésium-, 0,001 % de sulfate ferreux et 0,005 % de chlorure de sodium, la stérilisation ayant lieu sous une pression de vapeur de 1 kg/cm2 et étant suivie de l'ensemencement en Bacillus polymyxa . Après une fermentation stationnaire durant quatre jours à 25 C, on a réuni les solutions dont l'analyse a révélé la présence de 102 unités par cc.
On a effectué un certain nombre d'expériences en utilisant le procédé de l'exemple ci-dessus. On a obtenu les résultats suivants : une solution à 1 % de levure séchée de baasserie a donné 43 unités par cc, une solution à 1 % de parties solubles des résidus de fermentation sé- chés a donné 50 unités par cc, une solution à 1 % de farine d'huile de soya a donné 132 unités par cc, une solution à 2 % de matières solubles tirées du poisson a donné 37 unités par cc et une solution à 0,5 % d'extrait de levure a donné 132 unités par'ce.
Exemple VII Picrate de Polymyxine.
On dissout 1,1 partie de chlorhydrate de Polymixine -17-
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à la concentration d'environ 1600 unités/mg. dans 45 parties d'éthanol aqueux à 50 %, puis on traite la solution avec 1,56 partie d'acide picrique . On agite et on chauffe le mélange à 50 C jusqu'à dissolution de l'acide picrique et ensuite on refroidit pendant une nuit. On décante la solution de la gomme séparée et celle-ci est triturée trois fois aveu 45 cc d'éther , Après filtration et élimination de l'éther, on obtient le picrate de Polymyxine sous forme d'une poudre jaune . Le rendement est de 1,6 partie de picrate ayant une activité d'environ 900 unités/mg.
La calcination du picrate de Poly-myxine ne laisse aucune cendre . Son examen spectrophotométrique a révélé dans la région de l'ultraviolet une teneur en acide picrique comprise entre 30 et 35 %. Son pouvoir rotatoire est de [ [alpha]] 24 D = - 27 à -30 . Le picrate est très soluble dans
D l'acétone et dans la méthyl-éthyl-cétone ; est soluble dans la méthyl-isobutyl-cétone, la méthyl-n-amyl-cétone, le méthanol et l'éthanol; il est légèrement soluble dans l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle et le butanol chauds; il est enfinnsoluble dans le chloroforme, l'éther, le pétrole et l'éther di-éthylique .
Exemple VIII composé de Polymyxine formaldéhyde et bisulfite de sodium .
On dissout 18 gr. de chlorhydrate de Polymyxine de 1600 unités/mg. dans 85 cc d'eau et on traite avec 52 cc d'une solution de formaldéhyde à 37 %. On réduit le précipité actif bactéricide en ajoutant 2,5 gr. de soude caustique dans 700 cc. d'eau . Le solide spongieux blanc obtenu est filtré sous vide, puis lavé à l'eau . On chauffe ensuite le solide humide avec 5,5 g de méta-bisul- fite de sodium et 50 cc d'eau .
On ajoute de l'acide chlor- hydrique dilué pour maintenir le mélange aux environs de la neutralité. On soumet la solution neutre résultant de cette
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réaction à un séchage sous vide à la température de congéla- tion pour obtenir le composé Polymyxine-formaldéhyde-bisulfi- te de sodium, qui est une poudre blanche ayant une activité d'environ 1200 unités/mg. On peut également préparer cette matière en faisant réagir du formaldéhyde sulfonate de sodium avec la Polymyxine basique au lieu de chlorhydrate de Polymyxine . Le dérivé du formaldéhyde sulfonate de so- dium est très soluble dans l'eau, insoluble dans l'alcool, l'acétone et l'éther de pétrole .
Le composé eonvient parti- culièrement à l'injection parentérale en raison de sa propriété remarquable de ne pas causer d'irritation locale.
Il contient des éléments C, H, 0, N, S, Na. Il se décompose à 250-300 C sans fondre . Son activité optique est de [[alpha]] 25 = - 30 à -25 (C = 3,42 dans l'eau).
D
Exemple II
Composé de Polvmvxine , acétaldéhyde et bisulfite de sodium.
On chauffe une solution de 40 mg de chlorhydrate de Polymyxine dans 2 cc de souda caustique à 0,1 N avec 0,06 cc d'acétaldéhyde .Le solide blanc obtenu est lavé, puis on le fait réagir avec du bisulfite de sodium comme dans l'exem- ple précédent. Le produit obtenu est le Polymyxine- acétaldéhyde-bisulfite de sodium , qui est une substance blanche, soluble dans l'eau , insoluble dans les solvants organiques et qui se décompose sans fondre à une température élevée .
Exemple X.
Dérivé du composé Polymyxine.benzaldéhyde bisulfite de sodium.
On dissoutù40 mg. de chlorhydrate de Polymyxine dans 2 cc de soude caustique à 0,1 N et on chauffe avec 0,1 cc de benzaldéhyde .Le solide blanc obtenu est lavé à l'eau et on le fait réagir avec 10 mg. de méta-bisulfite de sodium en chauffant. Le composé blanc soluble dans l'eau Polymyxine-
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benzaldéhyde bisulfite de sodium est isolé par séchage sous vide, à la température de congélation.
Exemple II
Dérivé de Polymyxine 4-Nitrobenzaldéhyde.
On dissout 40 mg de chlorhydrate de Polymyxine dans 2 cc. de soude caustique à 0,1 N et on chauffe avec 80 mg de 4-nitrobenzaldéhyde . La matière solide jaune pâle qui se sépare est lavée à l'eau et à l'éther. Le dérivé Polymyzine 4-nitrobenzaldéhyde est insoluble dans l'eau et dans les solvants organiques en général et il fond en se décomposant au-dessus de 240 C.
Exemple XII
Dérivé de Polymyxine-4-Nitrobenzaldéhyde-Bisulfite de sodium.
40 mg. de chlorhydrate de Polymyxine sont dissous danh 2 cc de soude caustique 0,IN, puis chauffés avec 80 mg. de 4-nitrobenzaldéhyde . La matière solide jaune pâle qui se sépare du mélange réactionnel est ensuite lavée à l'eau puis chauffée avec 10 mg de méta-bisulfite de so- dium. La Polymyxine 4-nitrobenzaldéhyde-bisulfite de so- dium est isolée, par séchage sous vide, à la température de congélation sous forme d'un solide jaune pâle, soluble dans l'eau et à point de fusion élevé.
Exemple XIII
Acétyl Polymyxine.
On traite une solution basique de 20 mg de Polymy- xine dans de l'eau avec 0,06 cc d'anhydride acétique . Après la réaction rapide, on isole le produit par séchage sous vide à la température de congélation. L'acétyl-Polymyxine est une substance neutre blanche soluble dans l'eau et insoluble dans l'éther de pétrole.
Exemple XIV
Carbobenzoxy Polvmyxine.
On maintient à 8 la valeur du pH d'une solution de
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17,5 mg de chlorhydrate de Polymyxine dans 0,6 cc d'eau en ajoutant une solution de soude caustique tout en trai- tant par parties avec 10,2 mg de chlorure de carbobenzoxyle dans 0,8 cc de toluène, en agitant, La substance solide est recueillie puis lavée à l'eau . On obtient un rendement de 13,5 mg de Carbobenzoxy Polymyxine qui se décompose à 228-230 C.
Exemple XV
Sulfatede Polymyxine.
Une solution de 8 mg de picrate de Polymyxine dans 2 cc d'éthanol est traitée avec 0,2 cc d'une solution al- coolique d'acide sulfurique, puis versée dans un grand volume d'éther . On recueille le précipité puis on le lave avec de l'acétone et de l'éther. Le sulfate solide de Polymyxine révè. le une activité biologique d'environ 1300 unités/mg.
Exemple XVI
Flavianate de Polymyxine.
On ajoute une solution de 46 mg. de trihydrate d'aci- de flavianique (acide flavianique: acide 2-4 dinitrm-1-naphtol 7 sulfonique ) dans 1 cc d'alcool absolu à une solution de 36 mg de chlorhydrate de Polymyxine dans 3 cc d'éthanol absolu à 60 C. On refroidit le mélange réactionnel et le solide qui se forme est ensuite lavé à l'éthanol. Son poids est de 48 mg et son activité bactéricide est d'envi- ron 900 unités/ mg. Il est soluble dans l'éthanol chaud et se sépare de la solution froide sous forme d'une huile'. Il est soluble dans l'eau chaude et se sépare au cours du re.- froidissement sous forme d'huile . Il est insoluble dans l'acétone chaud.
Exemple XVII.
Polymyxine 2, 3. 5 - Triedobenzoate.
On ajoute une solution de 10 mg de chlorhydrate de 'olymyxine dans 1 cc d'alcool aqueux à 50 % à une solution chaude de 32,2 mg. de 2,3,5-triiodo benzoate de sodium dans 4 cc d'alcool aquex à 50 %. On fait évaporere la solution -21- @
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jusqu'à 3 cc, on la refroidit et on sépare le précipité recueilli . Ce dernier est séché, puis lavé à l'éther.
On obtient 36 mg de produit ayant une activité bactéricide d'environ 400 unités/mg. Cette substance est insoluble dans l'éther, le dioxane, le chlorure d'éthylène, le tétra- chlorure de carbone, le nitroéthane, l'eau, la méthyléthyl- cétone et l'acétate d'éthyle froid. Elle est très soluble dans le méthanol et dans l'éthanol.
Exemple XVIII
Sel de Polymyxine avec 2,4,6 - trinitro-m-crésol.
On ajoute à une solution saturée de 0,6 cc de 2,4,6 -trinitro-m-crésol dans de l'alcool aqueux à 50 %, une solution de 2,5 mg. de chlorhydrate de Polymyxine dans 0,6 cc d'eau . Un précipité se forme immédiatement pour se redissoudre lorsqu'on chauffe le mélange jusqu'à 50 . En refroidissant le précipité, le sel jaune de Polymyxine avec 2,4,6-trinitro-m-crésol réapparaît.
Exemple XIX
Sel de Polymyxine avec 2,4,6 trinitrorésorcinol.
A 0,5 cc d'une solution saturée de 2,4,6-trinitro- résorcinol dans de l'eau, on ajoute une solution de 2,5 mg. de chlorhydrate de Polymyxine dans 0,6 cc d'eau . Un trou- ble se produit immédiatement et disparaît au chauffage. Le précipité de sel jaune de Polymyxine de 2,4,6-trinitrorésorci- nol réapparaît au refroidissement.
Exemple XX.
Polymyxine 1-intronaphtalène-5-sulfonate.
A 0,5 cc d'une solution diluée d'acide 1-nitro- naphtalène-5-sulfonique dans l'eau on ajoute une solution de 2,5 mg de chlorhydrate de Polymyxine dans 0,6 cc d'eau.
Un précipité dense se forme immédiatement et on le dissout en ajoutant un volume égal d'eau et en chauffant à 50 C.
Au cours du refroidissement lent, le n-nitronaphtalène-5-
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sulfonate de Polymyxine se sépare sous forme d'une huile jaune.
Exemple XXI.
Dérivé 2.4-Dinitrophénylé de la Polymyxine.
Une solution de 1 7,5 mg de chlorhydrate de Polymyxi- ne et de 17 mg de bicarbonate de sodium dans 0,5 cc d'eau est traitée avec 18,6 mg de 2,4-dinitrofluorobenzène dans 0,2 cc d'éthanol par le procédé défini par Sanger (Biochem. J. 39, 511 (1945)). Le mélange réactionnel est extrait avec de l'éther pour éliminer l'excédent de réactif et on recueille le'produit insoluble . On le lave à l'eau . Le dérivé jaune vif 2,4-dinitrophényle de la Polymyxine pèse 23,3 mg. La substance se ramollit progressi- vement par chauffage jusqu'à 235 C et se décompose de 235 à 250 C. Elle est insoluble dans l'acétone , le chloroforme, l'acétate d'éthyle, le nitrométhane et l'eau . Elle est faiblement soluble dans de l'acide acéti- que glacial et très soluble dans la pyridine.
Exemple XXII.
Dérivé p-toluène-sulfonyle de la Polymyxine.
On traite une solution de 17,5 mg de chlorhydrate de Polymyxine dans 0,25 cc de pyridine avec une solution de 47,5 mg. de chlorure de p-toluène-sulfonyldans 0,25 cc de chloroforme et on laisse reposer pendant deux jours à la température ambiante . On élimine le chloroforme en faisant passer un courant d'azote et on verse la pyridine dans de l'eau . On constate que la substance insoluble est aussi insoluble dans le benzène et dans l'hexane alors qu'elle est soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone et le chloroforme. Elle est peu soluble dans l'acétate d'éthyle et dans le tétrachlorure de carbone . On ob- tient un rendement ge 22,6 mg. du dérivé p-toluène-sulfony- le de la Polymyxine sous forme d'un solide légèrement tein- té.
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Exemple XXIII
On prépare une colonne pour la séparation chromato- graphique à partir de 36 gr. de terre siliceuse à la- quelle on ajoute 38 cc d'une solution tampon de sulfo- succinate au pH de 2.146 mg de chlorhydrate de Polymyxine ayant une activité de 1800 unités par mg. sont dissous dans 1 cc d'une solution tampon de sulfosuccinate au pH de 2 puis mélangée avec 1 gr. de terre siliceuse . Après avoir placé eette substance au sommet de la colonne,on fait passer à travers celle-ci du butanol préalablement ajusté à pH 2 avec un mélange tampon au sulfosuccinate.
On recueille des échantillons du butanol effluent et on les soumet à l'essai d'activité. La courbe volume-effluent en fonction de la concentration d'activité présente une pointe aigue à 400-500 cc d'effluent. Cette pointe re- présente environ 70 % de l'activité utilisée . Une pointe ultérieure à 800-1.000 cc d'effluent correspond à environ 15 % de l'activité utilisée . Les substances actives correspondant à chaque pointe sont extraites du buta- nol effluent à l'aide d'acide chlorhydrique dilué et on les isole sous forme de poudres blanches par séchage sous vide à la température de congélation . Cela indique que la Polymyxine peut être un mélange de substances très voisine ayant des coefficients de partage légèrement différents, dont l'un est prédominant.
Les propriétés de distribution qu'indiquent ces résultats sont des carac- téristiques des matières actives (susceptibles d'être re- produites) telles qu'elles sont révélées par les pointes de la courbe représentant l'activité en fonction de au l'effluent @@@@mêmes points caractéristiques, lorsque séparées les substances actives séparée de telle manière, sont ultérieurement passées à travers des colonnes de sépara- tion chromatographiques analogues. Les mêmes propriétés
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caractéristiques de partage sont démontrées par des expériences à une plus grande ou plus petite échelle lorsqu'on opère des changements appropriés et propor- tionnels sur les quantités.
REVENDICATIONS --------------
1. Procédé de préparation d'une matière bactéri- cide, caractérisé en ce qu'on ensemence du bacillus Polymyxa dans un milieu de culture liquide et sensi- blement neutre en laissant s'effectuer la fermentation dans des conditions aérobies et, ensuite, en récupérant une substance bactéricide à partir de la liqueur fermen- tée .