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La présente invention se rapporte à un procédé de purification de certains antibiotiques à large spectre d'activité et à la préparation de certains composés complexes de ces antibiotiques.
L'oxytétracycline (Terramycine), la chlortétracycline (Auréomy- cine) et la tétracycline (Tétracyne) sont trois antibiotiques à spectre large très voisins par leur structure chimique.,
On les appelle "antibiotiques du type tétracycline" dans la présente description. Ce terme comprend non seulement les composés ampho- tères mais également les sels avec des métaux tels que les métaux alca- lins ou les métaux alcalino- terreux et avec des acides comme les acides minéraux. Les structures de ces composés sont les suivantes
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Si R1 est OH et R est H dans cette formule, le composé est l'oxytétraoy- dline. Si R1 rest H et R2 est C1, le composé est la chlortétracycline.
Si R1 et R2 sont H, le composé est la tétracycline. Ces composés possè- dent en commun de nombreuses propriétés biologiques et physiques mais se distinguent par certaines différences individuelles.
Ces antibiotiques du type tétracycline sont souvent produits par fermentation. Dans ce cas, on les obtient sous forme de solutions aqueuses diluées très contaminées par diverses impuretés organiques et inorganiques dont ils doivent être séparés pour qu'on puisse les utiliser comme produits pharmaceutiques. Même lorsque l'antibiotique du type té- tracycline est destiné à certains usages tels que l'enrichissement des aliments pour animaux, il est souvent désirable 'obtenir au moins une purification partielle.
Dans le Brevet principal n 506.950 sont décrites la séparation et la purification de l'oxytétracycline par précipitation sélective de l'antibiotique à partir de solutions aqueuses diluées impures par cer- taines bases organiques. On a trouvé à présent que le procédé n'est pas seulement applicable à l'oxytétracycline mais qu'il peut être appliqué également à la chlortétracycline et à la tétracycline de la même manière.
La précipitation de l'antibiotique du type tétracycline sous la forme d'un produit à solubilité limitée dans l'eau est exécutée en traitant la solution aqueuse par des bases organiques au moins faiblement solubles dans l'eau. Ces bases organiques sont choisies dans le groupe formé par les amines et les sels d'ammonium quaternaires, comptant de pré- férence au moins 8 atomes de carbone, et on a trouvé que la présence d'ions métalliques polyvalents dans la solution aqueuse de l'antibiotique faci- lite appréciablement la précipitation d'une proportion importante de l'antibiotique du type tétracycline.
Le complexe précipité de l'antibiotique du type tétracycline, de la base organique et des ions métalliques polyvalents peut être utilisé tel quel dans différentes applications, par exemple pour enrichir les ali- ments pour animaux, comme agent thérapeutique, comme bactéricide indus- triel, comme bactéricide pour les plantes etc. Certains des produits, par exemple ceux qu'on obtient avec les sels d'ammonium quaternaires à poids moléculaire élevé exercent une activité remarquable sur un grand nombre d'organismes, activité beaucoup plus élevée que celle qu'on pour-
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rait attendre d'après l'activité connue des ingrédients. En variante, l'antibiotique du type tétracycline peut être régénéré de l'antibioti- que précipité par plusieurs procédés différents.
L'antibiotique régénéré peut être obtenu sous la forme du composé atphotère ou celle d'un sel d'acide,, le chlorhydrate par exemple, Un procédé permettant d'obtenir cette régénération consiste à traiter le produit régénéré dans un solvant par un acide soluble fort, de préférence un acide minéral. L'antibiotique amphotère du type tétracycline peut être isolé de la solution ainsi ob- tenue par précipitation si le solvant est bien choisie.
Des alcools alipha- tiques inférieurs (par exemple le méthanol ou l'éthanol) et des cétones inférieures (par exemple l'acétone) sont particulièrement utiles à cette fin. Un autre procédé de séparation de l'antibiotique consiste à traiter le complexe de base organique dans un alcool aliphatique inférieur par de l'acide chlorhydrique ou un chlorure de calcium afin de provoquer la dis- solution du produit précipité. La;solution peut être alors clarifiée, si on le désire, par un absorbant décolorant. L'addition d'une nouvelle quantité d'acide chlorhydrique à la solution détermine alors la sépara- tion d'un sel d'acide très pur, généralement cristallisé, de l'antibio- tique du type tétracycline.
Bien que le présent.= procédé soit applica- ble à divers types de solutions impures d'antibiotiques du type tétracycline et par exemple à des solutions impures de tétracycline elle-même, obtenues par réduction catalytique de chlortétracycline, il est particulièrement intéressant pour effectuer la séparation d'antibiotiques du type tétra- cycline de bouillons de fermentation contenant des micro-organismes, Ces bouillons ont généralement une puissance de 500 microgrammes par cen- timètre cube ou plus et contiennent déjà comme impuretés des ions métal- liques polyvants provenant du milieu de culture nutritif initial.
On ajou- te à ce bouillon une amine organique ou un sel d'ammonium quaternaire sub- stitué par un groupe organique, susceptible de s'y dissoudre au moins partiellement, et on rend le milieu de préférence alcalin, ou on le main- tient à un pH neutre à basique. Le précipité obtenu est séparé et on ob- tient un sel complexe d'antibiotique du type tétracycline qui contient à la fois des ingrédients métalliques et la base organique ajoutée et présente à l'analyse une activité d'environ 300 à 500 mcg/mg d'antibio- tique du type tétracycline. Une opération en une seule phase contribue donc grandement à concenter et à purifier l'antibiotique.
Le sel com- plexe peut être facilement décomposé pour en séparer l'antibiotique pur ou ses sels d'acide simples on peut être utilisé directement comme agent thérapeutique ou en addition aux alimentso Par exemple les sels d'ammoni- um quaternaires à poids moléculaires élevé sont par eux-mêmes des germi- cides particulièrement énergiques.
Comme on l'a mentionné plus haut, les sels métalloorganiques com- plexes peuvent être traités pour régénérer l'antibiotique du type tétra-- cycline qu'ils contiennent en les dissolvant, de préférence après élimi- nation de l'excès d'humidité- : dans des aclools inférieurs et des cé- toneso A cette fin, le méthanol est un solvant très satisfaisant parce que peu coûteux, facilement récupéré et favorisant l'obtention d'un pro- duit très pur. On prépare généralement une solution méthanolique contenant environ 4 à 8 litres du solvant par kg d'activité de l'antibiotique du ty- pe tétracycline et on la traite par de l'acide chlorhydrique concentré.
Il peut se manifester à ce moment une tendance de l'antibiotique amphotère libre à précipiter avant d'être transformé en chlorhydrate ; nouvelle addition d'acide dissout la plus grande artie de ce précipité, mais il peut subsister un petit résidu. Pour éviter de perdre cette petite propor- tion, le précipité séché d'antibiotique du type tétracycline et de base organique est ajouté de préférence au méthanol utilisé comme solvant, tan- dis que le pH apparent de la solution est continuellement maintenu à envi-
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ron 2 à 2,5 par addition d'acide chlorhydrique concentré. On obtient ainsi une solution limpide.
On peut utiliser du chlorure de calcium dans un but analogue, c'est-à-dir'e pour augmenter la solubilité du produit anti- biotique du type tétracycline dans le méthanol et éviter sa précipitation prématurée. Une fois la solution séparée, l'introduction d'un acide con- centré, par exemple d'une quantité supplémentaire d'acide chlorhydrique dé- termine la formation du sel d'acide simple de l'antibiotique en question.
Lorsqu'on utilise en premier lieu de l'acide chlorhydrique pour faciliter la dissolution du sel complexe, il faut environ 0,4 à 0,7 cm3 de l'acide concentré (36%) pour dissoudre une quantité de sel métallo-organique équi- valente à 1,0 g d'activité dans de l'antibiotique du type tétracycline, et l'on prépare ainsi des solutions dont les puissances varient entre 60.000 et 1500000 microgrammes d'antibiotique par cm3 ou davantage. La solution limpide peut être ensuite traitée par un adsorbant comme, le charbon déco- lorant afin d'éliminer diverses impuretés qui la contaminent. On utilise généralement environ 0,5 à environ 1,5 g de charbon par g de puissance de l'antibiotique du type tétracycline dans la solution, une plus forte pro- portion donnant un produit plus pur, sans pertes importantes dues à l'ad- sorption de l'antibiotique.
L'adsorbant peut être éliminé en se servant d'un auxiliaire de filtration et lavé avec du solvant acidifié pour éli- miner la matière résiduelleo
Le chlorhydrate cristallisé de l'antibiotique du type tétra- cycline ou un sel analogue de bonne qualité est préparé à partir de la solution clarifiée ainsi obtenue en y ajoutant un acide susceptible de former des sels avec les antibiotiques du type tétracycline, par exemple de l'acide chlorhydrique concentré. Un sel d'acide de l'antibiotique, par exemple le chlorhydrate, cristallise dans la solution.
Si on le désire, la solution peut être concentrée avant la cristallisation.En général, un rapport d'au moins 200 cm3 environ d'acide chlorhydrique concentré par kg d'activité d'antibiotique présent dans la solution est nécessaire; des quantités d'acide un peu plus importantes peuvent améliorer le rendement des cristaux obtenus, et 0,95 litre de l'acide par kg d'activité de l'anti- biotique du type tétracycline est une proportion souvent préférée. Les volumes qui donnent les meilleurs résultats sont facilement déterminés par un. spécialiste, mais l'addition de plus d'un filtre d'acide par kg d'antibiotique n'est pas souvent recommandable. La cristallisation s'ef- fectue en pratique à la température ordinaire',') bien qu'une température plus basse puisse donner un rendement de produit un peu meilleur.
A des températures plus élevées, le rendement est légèrement diminuée
En plus de la régénération de l'antibiotique du type tétracycline par cristallisation directe de ses sels d'acide à partir des composés mé- tallo-organiques, la régénération peut être exécutée en dissolvant ces composés dans un solvant organique comme le méthanol, à l'aide d'un acide.
La présence d'une proportion mineure d'eau n'est pas nuisible. L'acide sul- furique est le plus souvent utilisé à cette fin. Les impuretés précipi- tées telles que le sulfate de calcium sont éliminées par filtration et le pH est porté à un point situé dans la gamme de 5 à 7 environ. On obtient ainsi un précipité contenant une forte proportion d'antibiotique amphoté- re libre du type tétracycline. Une partie du précipité peut se présen- ter en combinaison avec des métaux polyvalents. La présence d'un agent de chélation comme l'acide éthylène-diamine-tétraacétique facilite la prépara- tion d'un antibiotique amphotère très pur. On peut transformer ce der- nier en un sel d'acide cristallisé par des procédés connus, si on le dé- sire.
Le solvant organique peut être éliminé par distillation et remplacé par de l'eau avant de filtrer. On augmente ainsi le rendement dans une dertaine mesure. En variante, on peut filtrer le produit puis éliminer le solvant pour obtenirun second précipité, d'une puissance légèrement in-
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féricure, qui peut être retraitée
Différentes amines organiques et composés d'ammonium quaternaires peuvent être utilisés dans le présent procédé pour préparer les nouveaux sels basiques des antibiotiques du type tétracycline. Il est préférable que le poids moléculaire de la base soit suffisamment élevé pour qu'un pré- cipité se forme facilement dans le système dilué et entraîne une proportion appréciable de la teneur totale en antibiotique.
Les bouillons de fermen- tation des antibiotiques du type tétracycline ont généralement une puissan- ce d'au moins 500 mcg d'antibiotique par cm3. La base organique de ces sels doit être relativement soluble dans l'eau pour que la réaction de for- mation de l'antibiotique insoluble du type tétracycline s'effectue en un temps raisonnable. Des exemples de bases organiques préférées sont les amines primaires secondaires et tertiaires, les halogénures d'ammonium quaternaires et les composés analogues. Parmi ces derniers, les chlorures d'alkyl-triméthyl-ammonium à chaîne longue dans lesquels le groupe d alkyle compte environ 8 atomes de carbone ou plus sont particulièrement économi- ques et utiles.
Au lieu de ces composés individuels, on peut en utiliser Ces mélanges techniques qui existent dans le commerce et contiennent ces chlorures d'alkyl- et alkényl-triméthyl-ammonium dont les chaînes d'a- tomes de carbone varient entre C8 et C18.
Ces matières sont peu coûteuses et très efficaces. Différents groupes tels que des chaînes alkyliques longues ou des groupes acrylalkyles peu- vent remplacer un ou plusieurs des radicaux alkyles de ces composés. Par- mi les amines, les types aliphatiques à chaîne longue comme l'ootylamine, la nonylamine ou la décylamine, et des mélanges techniques contenant plu- sieurs de ces substances sont particulièrement utiles. D'autres bases or- ganiques comme les composés hétérocycliques et les cycloalkylamines ou bases quaternaires de ces composés peuvent être utilisées. En général, il semble que l'agent de précipitation organique utilisé contienne au moins hui atomes de carbone environ. L'amploi de bases à poids moléculaire moins élevé donne une précipitation faible ou nulle.
Un agent de précipitation organique basique particulièrement utile pour les bouillons de fermentation d'antibiotiques du type tétracycline est la matière connue sous la déno-- mination Arquad C, fournie en solution à 50% en poids dans l'isopropanol ou en solution aqueuse à 33%. Cette matière est un mélange technique con- tenant environ 50% de chlorure de dodécyl-triméthyl-ammonium avec des quan- tités moins importantes de chlorures de octyl-, décyl-,tétradécyl-hexadécyl- octadécyl-et octadécényl-triméthyl-ammonium.La petite quantité d'isopropanol introduite lorsque cette solution est utilisée ne réduit pas sensiblement l'efficacité de la précipitation des sels d'antibiotiques du type tétracycli. ne.
On peut obtenir des résultats très satisfaisants avec une quantité ne dépassant pas 0,5% en volume de la solution aqueuse à 33% dans le procédé de l'invention et les bouillons de fermentation ont une puissance générale- ment réduite à moins de 100 mcg/cm3 par cette précipitation. Si l'on réduit la proportion de réactif, une plus grande quantité d'antibiotique a tendan- ce à rester en solution. Il n'est généralement pas utile d'augmenter la pro. portion indiquée;cette augmentation ni accroît pas fortement la quantité d'antibiotique précipitée, ce qui indique que la limite de solubilité a été atteinte.
En fait, lorsqu on utilise des quantités excessives d'Arquad comme agent de précipitation, une dissolution partielle du précipité se produit quelquefois. - En général, une proportion d'environ 1,0 à environ 2,5 g (base sèche) de ce réactif particulier par litre de bouillon normal est préférée.' D'autres agents de précipitation des antibiotiques du type tétracycline sont également afficaces en proportion semblable. Toutefois, on a constaté que les composés à poids moléculaire moins élevé (par exemple' ceux qui comportent 8 à 12 atomes de carbone) doivent être utlisés en quan- tité un peu plus faible, tandis qu'il faut des quantités un peu plus fortes
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de matières à poids moléculaire plus élevé.
Le caractère plus ou moins complet de la précipitation de l'an- tibiotique de ces solutions aqueuses et particulièrement des bouillons de fermentation par des bases organiques varie avec le pH auquel on règle la solution. L'emploi de pH inférieurs à 5,5 environ n'est pas indiqué tandis que les pH de 6 à 10 environ donnent d'excellents résultats. Comme la sta- bilité de l'antibiotique du type tétracycline diminue lorsque le pH augmen- te, on préfère un pH d'environ 8,0 à 9,5. Le procédé est généralement utilisé pour séparer l'antibiotique du type tétracycline d'un bouillon de fermentation contenant des microorganismes consiste à séparer par filtra- tion le mycélium du bouillon acidifié, à ajouter l'agent de précipitation (la base organique) désiré et à régler le pH de la solution par un alcali soluble comme la soude ou la potasse caustique.
On a constaté que l'addition rapide d'une solution alcaline a tendance à précipiter un produit finement divisé qui peut être difficile à filtrero Une addition plus lente, donne un produit plus facilement filtrableo
Les précipités qu'-on obtient en traitant les solutions d'anti- biotiques du type tétracycline par les différentes bases organiques utilisables en -présence d'ions métalliques polyvalents ne sont pas des sels simples de l'antibiotique et de la base choisie, mais plutôt des sels complexes contenant différents ions métalliques présents pendant le trai- tement.
Ce fait est mis en évidence parce qu'on n'obtient aucun pré- cipité en traitant une solution aqueuse diluée d'antibiotique pur du ty- pe tétracycline, d'une concentration comparable à un bouillon de fermenta- tion ordinaire d'un atibiotique du type tétracycline, par une amine connue pour sa capacité de précipiter l'antibiotique du type tétracycline de ses bouillons de fermentation.Mais l'addition de petites quantités d'ions métalliques
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bi.;;61i trivci1:tentSYÊ1'ufie lsô:;utîoW¯pt1:I! 'tri tm:tiiêb'ioiÙiJUlU13 du type;, tétraçyôl7lneÈL46ter*l- ne une précipitation rapide des sels de l'antibiotique, Apparemment, le précipité est formé de composés complexes de l'antibiotiques de la base organique et d'un ou plusieurs ions métalliques polyvalents.
Comme on l'a déjà mentionné, ces derniers sont normalement présents dans les bouillons de fermentation. Par exemple, un précipité typique obtenu à partir d'un bouillon de fermentation d'oxytétraoycline traité par de l'Arquad C contient à l'analyse approximativement 51% d'oxytétracycline, 19% d'ion ammonium quaternaire.et 7% de cendres. Les ingrédients métalliques de ces cendres sont environ 45% de magnésium et environ 45% de calcium. Comme le milieu utilisé dans la préparation de l'antibiotique du type tétracycline par fermentation varie quelque peu dans sa composition au point de vue ions métalliques, la composition du précipité obtenu avec une amine ou un sel quaternaire donné varie également.
Le milieu de fermentation normal d'un antibiotique du type tétracycline contient au moins assez d'ions métalli- ques polyvalents pour assurer la précipitation lorsqu'une base organique appropriée est ajoutée au bouillon filtré et que le pH est rendu basique.
En fait, le bouillon contient souvent plus de constituants métalliques qu'il n'est néaessaire et dans ce cas, l'excès peut être préalablement éli- miné de toute façon appropriée, par exemple par le procédé de chélation dé- crit dans le brevet américain n 2.658.078. Suivant ce procédé, on trai- te un bouillon acide et clarifié d'oxytétracycline par des agents de ché- lation des ions métalliques polyvalents, des exemples de tels agents étant les composés acides hydroxylés et faiblement ionisés comme l'acide citrique ou l'acide gluconique; le tétraphosphate de sodium etc. et des amino-acides
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comme l'acide éthylène-diamine-tétraacétique et des sels d'acides polysmimo- carboxyliques comme le produit vendu sous la dénomination "Perma-Kleers".
Si le bouillon d'antibiotique du type tétracycline contient trop peu d'ions métalliques, on peut y ajouter du fer, du zinc, du magnésium, etc. pour faciliter la précipitation. Ces additions sont évidemment nécessaires pour
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traiter de façon appropriée une solution aqueuse d'antibiotique du type tétracycline ne provenant pas d'un bouillon ou ne contenant pas naturelle- ment des métauxo Comme on peut s'y attendre la sélectivité des différen- tes bases organiques varie, c'est-à-dire que la proportion d'antibiotique,, présente dans les sels précipités ne reste pas constante avec les différent: agents de précipitation;, La composition du précipité varie aussi dans une certaine mesure suivant le pH utilisé.
Bien qu'il soit possible d'utiliser des solutions ou des bouillon: ayant une puissance d'antibiotique du type tétracycline de 500 mcg/cm3 ou moins on préfère celles qui ont une puissance un peu plus élevée pour que le produit ait une puissance suffisamment élevée et soit obtenu avec un bon rendement. En générale on ne trouve qu'une fraction du sel d'ammoni- um quaternaire ou de toute autre base organique dans le précipité obtenu, ce qui signifie qu'un excès doit être employé pour obtenir une séparation relativement complète de l'antibiotique. Un excès d'un peu plus du triple de réactif en moles est particulièrement satisfaisant.
Dans la séparation de l'antibiotique pur du type tétracycline ou de ses sels simples comme le chlorhydrate de tétracycline des solutions de complexes métallo-organiques, la base organique¯utilisée comme agent de pré- cipitation et une partie de 1 antibiotique lui-même restent dans la liqueur- mère et les déchetso Il peut être désirable de récupérer et réemployer ces natières. Par exemple, si cette liqueur-mère est recyclée et ajoutée au lot suivant de solution d'antibiotique ou de bouillon à traiter suivant la présente invention, la quantité de base organique nécessaire peut être alors sensiblement réduite sans abaisser appréciablement le rendement du préci- pité d'antibiotique du type tétracycline.
Une partie ou la totalité du solvant peut être éliminée d'abord de la liqueur-mère avant de l'ajouter au lot suivant, mais cette opération n'est pas essentielleo Certaines impure- tés colorées peuvent être recyclées dans la liqueur-mère et peuvent donner un sel dantibiotique un peu plus foncé. Si le recyclage est répété trop souvent cette coloration du produit peut être gênante et le rendement peut diminuer. Mais quelques recyclages de la liqueur-mère sont tout à fait faisables et ne diminuent pas la quantité du produite
Le procédé de la présente invention comporte de nombreux avanta- ges.
Il utilise des ingrédients peu coûteux, faciles à obtenir et peu to- xiques; on obtient un sel cristallisé de qualité supérieure à partir de solutions très diluées et/ou très brutes d'un antibiotique du type tétra- cycline; et le procédé comporte un minimum de phases et assure de bons ren- dements de l'antibiotique.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans limiter sa portée.
EXEMPLE 1.-
On traite un volume de bouillon d'oxytétracycline acidifié et fil- tré contenant 25,3 g d'antibiotique par 5 g d'acide citrique par litre¯de solution afin d'y bloquer une partie des ions métalliques polyvalents.
On y ajoute ensuite 5 cm3 d'une solution aqueuse à 33% d'Arquad C par litre de bouillon et on règle le pH de la solution à 9 en y introduisant une so- lution d'hydroxyde de sodium en l'espace d'une heure. Il se forme un pré- cipité complexe contenant de l'oxytétracycline, des bases d'alkyl-triméthyl- ammonium en mélange eh divers métaux, qu'on filtre avec un auxiliaire de filtration. Le filtrat résiduel contient 0,83 g d'activité d'oxytztracycli- ne à l'essaie Le gâteau. de filtration est séché à 50 C sous vide puis broyé.
La matière solide finement divisée ainsi obtenue est extraite par assez de méthanol pour qu'on obtienne une solution contenant 136 mg d'oxytétracycline
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par cm3. On filtre cette solution et on ajoute graduellement de l'acide chlorhydrique concentré en agitant constamment. Le chlorhydrate cristal- lisé d'oxytétracycline se sépare. On le filtre, on le lave au méthanol acidifié et on le sèche. On obtient ainsi par un procédé simple un total de 14,2 g de chlorhydrate cristallisé et purifié d'oxytétracycline.
EXEMPLE 2.-
On traite un bouillon d'oxytétracycline filtré contenant 25,3 g d'activité d'oxytétracycline par 0,2% d'Arquad C solution aqueuse à 33%.
On ajoute à cette solution la liqueur-mère obtenue au cours de la cristal- lisation du chlorhydrate d'oxytétracycline préparé dans l'exemple 1. Cette liqueur de recyclage contient 6,6 g d'activité d'oxytétracycline. La so- lution mixte est réglée au pH 9 en y ajoutant lentement une solution d'hy- droxyde de sodium et le précipité obtenu est filtre, et séché. Le filtrat contient 1,08 g de l'antibiotique. Le précipité est formé de sels complexes métallo-ammonium quaternaires d'oxytétracycline dans lesquels la quantité totale d'antibiotique est 29,8 g. On dissout ce produit dans de l'éthanol et on ajoute simultanément de l'acide chlorhydrique concentré à raison de 0,48 cm3 d'acide par g d'activité d'oxytétracycline. On obtient une so- lution contenant 62,5 mg d'antibiotique par cm3.
On la traite par 0,99 g d'un charbon activé du commerce par g d'activité d'oxytétracycline. Après agitation pendant une demi-heure, on filtre le charbon avec un auxiliaire de filtration. On ajoute à la solution clarifiée 0,19 g de chlorure de cal- cium anhydre par g d'oxytétracycline pour éviter la cristallisation pré- maturée d'oxytétracycline amphotère et assurer la formation d'un chlorhy- drate d'oxytétracyoline de qualité supérieureo On ajoute à la solution limpide 0,60 cm3 d'acide chlorhydrique concentré par g d'antibiotique pré- sento Cette addition provoque la formation de chlorhydrate cristallisé d'oxytétracycline. Les cristaux précipités sont filtrés soigneusement, lavés au méthanol acidifié, puis au méthanol, et séchés sous vide à 50 C.
On obtient ainsi un total de 15e75 g du sel d'acide cristallisé. La li- queur-mère de la cristallisation contient 19,3 mg d'antibiotique par cm3 soit un total de 8,56 g de l'antibiotique. On peut récupérer une partie de cet antibiotique par une seconde extraction des gâteaux de filtration et du charbon décolorant.
EXEMPLE 3.-
On traite un bouillon filtré d'oxytétracycline par différents chlorures d'ammonium quaternaires en solution aqueuse et en solution dans l'isopropanol (IPO)o L'arquad 12 contient principalement du chlorure de dodécyl-triméthyl-ammonium et l'Arquad 18 est le composé octadécyl cor- respondant. Dans lé tableau ci-dessous on a indiqué le volume de réactif utilisé pour traiter 500 cm3 du bouillon d'oxytétracycline, la puissance du bouillon épuisé après élimination du précipité avec la base organique et la puissance du précipité après séchage. On règle chaque échatillon du bouillon au pH 9,0 par de l'hydroxyde de sodium pour effectuer la préci- pitation.
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<tb>
Réactif <SEP> Volume <SEP> Puissance <SEP> du <SEP> Puissance <SEP> du
<tb> filtrat <SEP> produit <SEP> séché
<tb> Arquad <SEP> C <SEP> ( <SEP> 33% <SEP> dans <SEP> l'eau) <SEP> 2,5 <SEP> cm3 <SEP> 45 <SEP> mog/om3 <SEP> 505 <SEP> mcg/mg
<tb> Arquad <SEP> 12( <SEP> 33% <SEP> dans <SEP> 1--eau) <SEP> 2,5 <SEP> 40 <SEP> 480
<tb> Arquad <SEP> 12( <SEP> 50% <SEP> dans <SEP> IPO) <SEP> 1, <SEP> 65 <SEP> 40 <SEP> 515
<tb> Arquad <SEP> 18( <SEP> 50% <SEP> dans <SEP> IPO) <SEP> 1, <SEP> 65 <SEP> 50 <SEP> 445
<tb>
On remarquera que les changements de nature de la base organique ne modifient pas appréoiablement la séparation efficace de l'antibiotique du bouillon ou la qualité du produit.
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EXEMPLE 4.-
Un autre groupe de sels d'ammonium quaternaires et certaines ami-
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nes sont rès efficaces pour précipiter 1'otétracyoline d'un bouillon de fermentation clarifiée
On traite un bouillon de fermentation clarifié d'oxytétracycline par 5 g d'acide citrique par litre de bouillon et on ajoute à des portions d'un litre de ce bouillon traité 5eO g (5,0 cm3 de liquide) des ingrédients indiqués ci-dessous. Dans chaque cas, la solution est ensuite amenée par addition d'hydroxyde de sodium dilué à un pH d'environ 8,5 à environ 9,0. Les produite précipités contenant l'oxytétracycline sont filtrés avec une petite porportion d'un auxiliaire de filtration.
Les filtrats de cha- cun des précipités sont soumis à un essai biologique standard pour déter- miner la quantité d'antibiotique qu'ils contenaient encore. Le tableau ci-dessous donne les réactifs avec leurs appellations commerciales et
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leur nom générique, ainsi que la proportion dog,ytétraccline séparée du bouillon de fermentation.
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<tb> Réactif <SEP> % <SEP> ocytétracycline <SEP> séparé <SEP> d
<tb> bouillon <SEP> de <SEP> fermentation.
<tb>
EMI8.4
Chlorure d'alkyl-(Ç8-Ql8)triméthyl-
EMI8.5
<tb> ammonium <SEP> Arquad <SEP> C+) <SEP> 93 <SEP> % <SEP>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> stéaryl-imidazolinum
<tb>
<tb> substitué <SEP> (Quaternay <SEP> S+) <SEP> 93
<tb>
EMI8.6
Chlorure d alkyl benzyltriméthylm ammonium (Orpnite, 9 Af050) 96 Chlorure de p#diisobutyl#phénoxy# éthoxy-é thyl-diméthyl-benzyl-ammonium 96
EMI8.7
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> cétyl-diméthyl-benzyl-
<tb>
<tb>
<tb> ammonium <SEP> 98
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Décylamine <SEP> 93
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nonylamine <SEP> 78
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Octylamine <SEP> 90
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Amine <SEP> tertiaire <SEP> hétérocyclique <SEP> à <SEP> poids
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> moléculaire <SEP> élevé <SEP> substituée <SEP> par <SEP> un
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> groupe <SEP> alkyle <SEP> (Amine <SEP> -0*)
<SEP> 96
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Amine <SEP> tertiaire <SEP> hétérocyclique <SEP> à <SEP> poids
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> moléculaire <SEP> élevé <SEP> substituée <SEP> par <SEP> un <SEP> groupe
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> alkyle <SEP> (Amine <SEP> -C+) <SEP> 88
<tb>
+ Appellation commerciale du produit EXEMPLE 5.- On règle au pH 2,9 par de l'acide sulfurique un litre de bouillon de ferment;
EMI8.8
tion préparé-par culture da-n%-des conditions aérobies,avec agitation d'un OJ:'.9'1 nisme produisant une forte proportion de têtracyclineT a-6 "une faible propor- tion d'autres antibiotiques à large spectre d'activité.On filtre le mélange: l'aide d'une petite quantité d'auxiliaire de filtration.
On traite 1 litre du filtrat contenant à l'essai 220 mcg d'activité de tétracycline par cm3 par 23 cm3 d'une solution d'Arquad C préparée en dissolvant 24 g de la solution à 33 1/3 % dans l'eau pour obtenir un volume de 200 cm3. En même temps que l'Arquad on ajoute également 6 cm3 d'une solution aqueuse
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de chlorure de calcium à 3%. On agite le mélange et on le règle au pH
9 par de l'hydroxyde de sodium à 10%. Le produit solide est filtré à l'ai- de d'une petite quantité d'auxiliaire de filtration et le gâteau de filtra- tion, après avoir été séché par aspiration, est dispersé dans l'eau. Le mélange est réglé au pH 2,5 au moyen d'acide sulfurique et le résidu solide est filtrée Le filtrat aqueux a une activité de tétracycline de 2.800 mcg/ cm3.
Cette solution est réglée au pH 7 par une solution d'hydroxyde de sodium. La tétracycline purifiée se sépare sous la forme d'un solide jau- neo Ce produit est filtré, lavé avec un petit volume d'eau et séché. Il est très actif contre divers micro-organismes et efficace lorsqu'il est ajouté en petites quantités à l'alimentation des animaux dont il favorise la croissanceo
EXEMPLE 6.-
On prépare un bouillon de fermentation dechlortétracycline en cul- tivant une souche produisant de la clortétracycline se Streptomyces aureo- faciens sur un milieu nutritif dans des conditions aérobies avec agitation.
La solution est filtrée et le procédé décrit dans l'exemple 5 est utilisé pour précipiter la chlortétracycline. La chlortétracycline solide et pu- rifiée est isolée et identifiée par ses propriétés caractéristiques.