FR2691716A1 - Procédé de préparation de sels de déféroxamine de grande pureté. - Google Patents

Abstract

Procédé de préparation de sels de déféroxamine de grande pureté à partir de solutions de fermentation filtrées contenant de la déféroxamine B comme ingrédient actif, par adsorption de l'ingrédient actif sur une résine échangeuse d'ions et dissolution et purification subséquentes de celui-ci, comprenant la séparation du sel de déféroxamine après la concentration de l'éluat, par relargage dans une solution aqueuse ou dans un mélange d'eau et d'un solvant organique, et sa purification par des opérations répétées de relargage et/ou au moyen de procédés connus en soi, et éventuellement a) préparation du sel méthanesulfonate au moyen de procédés connus, ou b) passage de la solution aqueuse du sel de déféroxamine à travers une résine échangeuse d'ions contenant des anions méthanesulfonate comme contre-ions et récupération du sel méthanesulfonate de l'effluent, de préférence par lyophilisation.

Description

-1- Procédé de préparation de sels de déféroxamine de qrande

pureté -

Cette invention concerne un procédé de prépara-

tion de sels de déféroxamine de grande pureté, de préféren-

ce le sel méthanesulfonate, à partir de solutions filtrées

de fermentation contenant de la déféroxamine B comme ingré-

dient actif.

Parmi le grand nombre de déféroxamines qu'on con-

naît par la littérature, la déféroxamine B est celle qui

présente le plus grand intérêt, qui est un mobilisateur sé-

lectif du fer et qu'on peut utiliser en thérapie pour le traitement de différentes anémies et intoxications par le fer. Pour la production de la déféroxamine B à

l'échelle industrielle, on utilise la souche de Streptomy-

ces pilosus, qui produit essentiellement la déféroxamine B,

dans un milieu de culture pauvre en fer (description du

brevet belge n 619 532).

Pendant le déroulement de la préparation de l'in-

grédient déféroxamine B pure, on ajoute une solution de 8-

hydroxyquinoléine dans du méthanol à la solution de fermen-

tation de manière à décomposer le complexe de ferrioxamine formé par les ions de fer(III) du milieu de culture avec la

déféroxamine Ensuite, on filtre la solution de fermenta-

tion et on élimine l'excès de 8-hydroxyquinoléine de la so-

lution filtrée à l'aide de la résine échangeuse d'ions Amberlite IR-45 L'ingrédient actif est adsorbé par la résine échangeuse d'ions Amberlite IR-50 et élué avec de l'acide chlorhydrique 0,2 M De cette manière, on obtient un grand volume d'éluat dilué Pour concentrer et purifier l'ingrédient actif dans l'éluat, on extrait la solution, à p H 5, avec de l'alcool benzylique ou avec un mélange de

chloroforme et d'éthanol ( 1:1) On traite l'extrait de nou-

veau avec la 8-hydroxyquinoléine, on y ajoute de la méthyl-

isobutylcétone et on extrait de nouveau le mélange avec de -2-

l'eau On élimine l'excès de 8-hydroxyquinoléine par ex-

traction avec du chloroforme Pour isoler le chlorhydrate de déféroxamine B, on concentre la solution aqueuse sous vide et on fait recristalliser les cristaux séparés dans le mélange d'eau et de méthanol ou dans le mélange d'eau et

d'acétone (description du brevet belge N O 619 532).

Il découle de ce qui précède que le procédé de récupération est assez compliqué Pour l'extraction, on

utilise trois solvants organiques différents à trois repri-

ses et on utilise deux solvants différents pour la recris-

tallisation La séparation des solvants, leur recyclage

dans le procédé de récupération, l'élimination des contami-

nants accumulés dans la phase solvant et le traitement des

matériaux perdus sont autant d'opérations posant des pro-

blêmes, qui rendent le procédé technologique compliqué.

Généralement, on utilise la déféroxamine B sous la forme du sel méthanesulfonate qui est facilement soluble dans l'eau On prépare le méthanesulfonate à partir du chlorhydrate de déféroxamine B de manière telle qu'on fait

passer une solution aqueuse de celui-ci à travers une rési-

ne échangeuse d'anions sous la forme hydroxylée à transfor-

mer d'abord en une base, ensuite on ajoute une solution

contenant une quantité équivalente d'acide méthanesulfoni-

que à la solution aqueuse de la base de déféroxamine B On

évapore la solution et on fait recristalliser le méthane-

sulfonate de déféroxamine B ainsi obtenu dans une solution aqueuse alcoolique ou dans un mélange aqueux de méthanol et

d'acétone (description du brevet belge n' 616 139).

Le but de la présente invention est de mettre à

disposition un procédé de préparation de sels de défé-

roxamine B de grande pureté, en particulier le méthanesul-

fonate, à partir de solutions de fermentation contenant de la déféroxamine B comme ingrédient actif, lequel procédé

peut être mis en oeuvre plus facilement et plus économique-

ment que les procédés connus jusqu'à maintenant.

-3- L'invention est fondée sur la connaissance que

les sels de déféroxamine, et en particulier le chlorhydra-

te, peuvent être séparés par relargage dans des solutions

aqueuses ou dans des mélanges d'eau et de solvants organi-

ques Selon nos expériences, pendant l'isolement de l'in- grédient actif, après l'échange d'ions de la solution de fermentation filtrée et la concentration subséquente de l'éluat contenant l'ingrédient actif, on peut séparer le chlorhydrate de déféroxamine B directement au moyen d'une opération de relargage Grâce à ce moyen, l'extraction avec un solvant organique et la ré-extraction indiquée ci-dessus peuvent être supprimées de l'opération de traitement de la solution de fermentation On peut purifier le chlorhydrate

de déféroxamine B brut ainsi obtenu en recommençant plu-

sieurs fois l'opération de relargage ou au moyen de n'im-

porte quel autre procédé connu, comme la recristallisation, l'échange d'ions répété, etc Ainsi, la mise en oeuvre du relargage rend l'opération de récupération beaucoup plus

simple et beaucoup plus économique.

On a reconnu aussi qu'on peut effectuer facile-

ment la préparation du méthanesulfonate de déféroxamine B

d'une qualité appropriée à des fins pharmaceutiques à par-

tir d'un sel pur de déféroxamine B, de préférence à partir du chlorhydrate, en faisant passer une solution aqueuse concentrée du sel à travers une résine échangeuse d'anions faiblement basique sous la forme méthanesulfonate et en lyophilisant la solution contenant le sel méthanesulfonate

de déféroxamine B Ce procédé est particulièrement préféra-

ble, étant donné qu'il supprime la préparation de la base assez instable de déféroxamine B et la formation de sel à partir de ce dernier composé De plus, la séparation du sel méthanesulfonate par concentration d'une solution diluée de celui-ci et la recristallisation sont supprimées aussi, étant donné que le chlorhydrate de déféroxamine B isolé et purifié selon le procédé de l'invention est tellement pur -4-

que l'ef fluent de l'échangeur d'ions contenant le méthane-

sulfonate de déféroxamine B peut être lyophilisé directe-

ment.

Pendant nos expériences, on a traité des solu-

tions de fermentation cultivées au moyen d'une souche de

Streptomyces 101/87 (numéro de dépôt: MIMNG 1143), conte-

nant de la déféroxamine B comme ingrédient actif.

On filtre la solution de fermentation à p H acide

ou neutre de manière à empêcher la décomposition de l'in-

grédient actif à p H faiblement acide, en présence de sels

sulfates et/ou chlorures A cet effet, on utilise de préfé-

rence le chlorure d'ammonium.

A partir de la solution filtrée, la déféroxamine est fixée sur une résine échangeuse de cations faiblement acide sous la forme hydrogène Selon nos expériences, on

peut augmenter la capacité d'adsorption de la résine en ga-

rantissant des conditions appropriées pour diminuer la

quantité des contaminants liés à la résine On peut obte-

nir ceci en filtrant la solution de fermentation à p H fai-

blement acide, comme on l'a indiqué ci-dessus, et en di-

luant la solution filtrée Il est même plus préférable de

maintenir le p H de la solution filtrée à une valeur compri-

se entre 5 et 8 avec une solution tamponnée, de préférence

avec de l'acétate d'ammonium ou du chlorure d'ammonium.

On peut augmenter l'effet de purification du pro-

cédé échangeur d'ions en utilisant une colonne de tête con-

tenant une résine échangeuse de cations faiblement acide,

sous la forme ammonium incapable d'adsorber la déféroxami-

ne, de manière à lier une partie des contaminants présents

dans la solution filtrée.

Après l'échange d'ions, on peut éluer l'ingré-

dient actif à un p H compris dans une vaste plage, allant de

2 à 12 selon le p H de l'éluat, mais il est préférable d'ef-

fectuer l'élution avec une solution alcaline diluée, par exemple une solution 0,05 à 1,5 M d'hydroxyde de sodium ou -5- d'hydroxyde d'ammonium Pendant l'élution effectuée à p H

alcalin, une partie considérable des contaminants est éli-

minée de la colonne avant l'apparition des fractions conte-

nant l'ingrédient actif, et on obtient celui-ci de manière concentrée, par rapport à la solution filtrée. On peut empêcher la décomposition de l'ingrédient actif en utilisant une température basse ( O à 51 C) Il est

préférable aussi d'effectuer une élution sur gradient.

Avant la séparation de la déféroxamine B, on

ajuste l'éluat à p H neutre à faiblement acide avec un aci-

de, de préférence avec de l'acide chlorhydrique dilué, et on le concentre dans des conditions modérées, par exemple par évaporation sous vide ou par hyperfiltration On sépare le sel brut de déféroxamine B du concentré aqueux au moyen d'une opération de relargage et par refroidissement Pour

le relargage, on utilise de préférence du chlorure d'ammo-

nium ou du sulfate d'ammonium.

On peut effectuer la purification du produit brut

obtenu de la manière décrite ci-dessus au moyen de plu-

sieurs procédés, par exemple en recommençant plusieurs fois l'opération de relargage dans une solution aqueuse ou en faisant recristalliser la substance dans un mélange d'eau

et d'alcool Si on utilise ce dernier procédé, on peut amé-

liorer le rendement de la recristallisation grâce à l'addi-

tion de chlorure d'ammonium au mélange Pour éliminer les agents colorants concomitants et d'autres adsorbants de contaminants, comme le gel de silice ou du charbon activé, ou une résine échangeuse de cations, on peut utiliser, de préférence, une résine échangeuse de cations faiblement

acide sous la forme hydrogénée On peut effectuer la puri-

fication à grand rendement en recommençant plusieurs fois le relargage en solution aqueuse ou dans un mélange d'eau

et d'alcool.

Grâce aux opérations et aux procédés de purifica-

tion décrits ci-dessus, on obtient des sels de déféroxamine -6-

de grande pureté, par exemple le chlorhydrate pur de défé-

roxamine B, qu'on peut transformer directement en le métha-

nesulfonate sans autre purification complémentaire, en le dissolvant dans de l'eau et en transférant la solution sur une résine échangeuse d'ions contenant des contre-ions mé-

thanesulfonate Si on purifie le chlorhydrate brut de défé-

roxamine B au moyen d'un procédé échangeur d'ions, on peut transférer directement l'effluent contenant l'ingrédient

actif sur une résine échangeuse d'ions sous la forme métha-

nesulfonate, après avoir ajusté le p H. On effectue l'opération d'échange d'anions en utilisant une résine échangeuse d'anions faiblement acide, et pour empêcher la décomposition du méthanesulfonate de déféroxamine B pendant le refroidissement, on utilise de préférence une température comprise entre 5 et 10 'C On

peut isoler l'ingrédient actif de la solution par lyophili-

sation.

Un avantage du procédé selon la présente inven-

tion réside dans le fait qu'on obtient le méthanesulfonate

désiré de déféroxamine B à partir d'un sel pur de défé-

roxamine en une seule étape, sans le transformer en une base Grâce à ce moyen, on peut supprimer la préparation de la base difficilement soluble dans l'eau et susceptible de

décomposition et la formation de sel à partir de la solu-

tion diluée ainsi obtenue.

Un autre avantage du procédé selon l'invention est qu'on n'utilise pas de solvant pour l'isolement et la

purification de l'ingrédient actif pendant la cristallisa-

tion dans l'eau, basée sur le relargage, ou pendant la re-

cristallisation dans l'eau On supprime les opérations

d'extraction, et par conséquent, l'opération de récupéra-

tion est économique, simple et sûre De plus, l'ingrédient actif peut être isolé de la solution de fermentation avec

une grande pureté et un bon rendement.

On explique l'invention de manière complémentaire -7-

au moyen des exemples non limitatifs suivants Les solu-

tions de fermentation traitées selon les exemples sont cul-

tivées au moyen d'une souche de Streptomyces 101/87 (numéro

de dépôt: MIMNG 1143).

Exemple 1 On ajuste 250 kg d'une solution de fermentation (teneur en ingrédient actif: 800 g) à p H 5,8 à 6,2 avec de l'acide sulfurique On filtre la solution de fermentation à travers une couche primaire de perlite, avec lavage à l'eau On fait passer les 450 kg ainsi obtenus de solution filtrée d'abord à travers 12,6 1 de résine Lewatit CNP 80 sous la forme ammonium et ensuite, à travers 28 1 de résine

Amberlite IRC 50 sous la forme hydrogène On lave les rési-

nes avec de l'eau et on élue l'ingrédient actif avec une

solution ammoniacale 0,3 M, à une température comprise en-

tre O et 50 C La fraction de l'éluat contenant l'ingrédient actif contient 679 g de déféroxamine B, ce qui représente

un rendement de 85 % par rapport à la solution de fermenta-

tion On ajuste le volume de 76 1 de la fraction à p H 6,0 à 6,3 avec de l'acide chlorhydrique dilué et on le concentre dans des conditions modérées à un dixième de son volume original Ensuite, on ajoute 700 g de chlorure d'ammonium

au concentré et après dissolution complète, on fait cris-

talliser le mélange, tout en le refroidissant, pour obtenir 877 g de chlorhydrate brut de déféroxamine B, qu'on fait recristalliser dans un mélange d'eau et de méthanol ( 1:4), on le sèche et on le dissout sous la forme d'une solution aqueuse à 5 %, on le traite par portions avec une quantité totale de 37 g de charbon activé et on le fait passer d'abord à travers 400 ml de résine Amberlite IRC 50 sous la

forme hydrogène et ensuite, à travers 400 ml de résine Am-

berlite IRA 900 sous la forme chlorure On concentre la so-

lution ainsi obtenue, dans des conditions modérées, à une

concentration de 20 % et on sépare le chlorhydrate de défé-

roxamine B à -100 C après l'addition d'un quadruple volume -8- de méthanol, on le filtre et on le sèche On obtient ainsi 385 g de sel chlorhydrate convenant pour la formation du sel méthanesulfonate Teneur en ingrédient actif déterminée

par un procédé photométrique: 99,8 %.

A partir du sel chlorhydrate pur de déféroxamine B, on prépare une solution aqueuse à 5 %, qu'on refroidit à C et qu'on fait passer à travers 1 400 ml de résine Am- berlite IRA 68 sous la forme méthanesulfonate Ensuite, on soumet la solution ainsi obtenue à une lyophilisation et on obtient 396 g de méthanesulfonate de déféroxamine B Teneur

en ingrédient actif déterminée par un procédé photométri-

que: 99,5 %.

Exemple 2

On ajoute 1,28 g d'acétate d'ammonium à 8 000 ml

de solution filtrée obtenue selon l'exemple 1 Après disso-

lution complète, on fait passer la solution filtrée à tra-

vers 700 ml de résine Amberlite IRC 50 sous la forme hydro-

gène On lave le mélange avec de l'eau, on l'élue avec une

solution ammoniacale 1 M et on obtient 1 100 ml d'une frac-

tion principale contenant 23 g de déféroxamine B, ce qui représente un rendement de 90 % par rapport à la solution

de fermentation.

On ajuste l'éluat à p H 6,0 à 6,2 avec de l'acide

chlorhydrique 1 M et on le concentre sous vide à un cin-

quième de son volume original On refroidit le concentré à

C, on filtre la substance séparée, en l'espace de 24 heu-

res, et on la sèche On obtient ainsi 30 g de chlorhydrate brut de déféroxamine B, qu'on dissout ensuite dans 250 ml

d'un mélange d'eau et de méthanol ( 1:4) et on traite la so-

lution avec 1,3 g de charbon On maintient la solution cla-

rifiée à -10 C pendant 24 heures, on filtre le chlorhydrate

de déféroxamine B séparé, on le lave avec une petite quan-

tité du mélange de solvants et on le sèche On dissout les 18,8 g de chlorhydrate de déféroxamine B ainsi obtenus dans 290 ml d'eau désionisée, on les fait passer à travers 10 ml -9- de résine Varion KCP sous la forme hydrogène et on lave la résine avec 10 ml d'eau désionisée On ajuste la solution à

p H 5,5 avec de la résine Varion ADM sous la forme hydroxy-

le, on la filtre, on la refroidit à 2 C et on la fait pas-

ser à travers 70 ml de résine Amberlite IRA 68 sous la for- me méthanesulfonate On combine les fractions de l'effluent

échangeur d'ions contenant le méthanesulfonate de défé-

roxamine B, on les filtre et on les soumet à une lyophili-

sation On obtient ainsi 18 g de méthanesulfonate de défé-

roxamine B Teneur en ingrédient actif déterminée par un

procédé photométrique: 99,4 %.

Exemple 3

On dissout du chlorhydrate pur de déféroxamine B

contenant 75 g d'ingrédient actif dans 1 100 ml d'eau dé-

sionisée, à 40 C, sous agitation Ensuite, on refroidit la

solution à 5 C et on la transfère, à la vitesse d'écoule-

ment de 150 ml/heure, dans un lit fixe de 300 ml de résine

échangeuse d'anions Amberlite IRA 68 sous la forme méthane-

sulfonate garnissant une colonne Après l'échange d'ions,

on lave la résine avec 200 ml d'eau désionisée préalable-

ment refroidie On combine les fractions, on filtre la so-

lution ainsi obtenue de manière qu'elle soit exempte de fi-

bres et on la lyophilise On obtient ainsi 86 g de méthane-

sulfonate de déféroxamine B Teneur en ingrédient actif dé-

terminée par un procédé photométrique: 99,5 % Le rende-

ment en préparation est de 97 % par rapport au chlorhydrate pur.

Exemple 4

On met 660 g de chlorhydrate brut de déféroxamine B, obtenu selon l'exemple 1, en suspension dans 990 ml d'une solution de chlorure d'ammonium à 20 %, à 5 C On maintient la suspension à la même température pendant 24 heures et on la filtre On dissout le produit ainsi obtenu, mouillé par succion, dans 1 300 ml d'eau désionisée, à 60 C Après dissolution complète, on refroidit la solution -10- à 50 C et on filtre la substance séparée, en l'espace de 48

heures On dissout le chlorhydrate de déféroxamine B mouil-

lé ainsi obtenu dans 2 000 ml d'un mélange d'eau et de mé-

thanol ( 1:3), à 450 C, et on le refroidit à -100 C On filtre le produit séparé en l'espace de 24 heures et on le sèche dans un dessicateur à vide On obtient ainsi 195 g de chlorhydrate pur de déféroxamine B Teneur en ingrédient

actif déterminée par un procédé photométrique: 99,6 %.

Exemple 5

On ajuste 25 kg d'une solution de fermentation à p H compris entre 6,0 et 6,3 avec de l'acide chlorhydrique 1 M et on filtre la solution de fermentation On fait passer la solution filtrée à travers 3 1 de résine LEWATIT CNP 80, à une vitesse d'écoulement de 4,5 1/heure Après l'échange d'ions, on lave la résine avec 6 1 d'eau désionisée On élue l'ingrédient actif avec de l'acide chlorhydrique 0,2 M. On ajuste les 30 1 d'éluat ainsi obtenus à p H compris entre ,0 et 5,2 et on les concentre à 500 ml On ajoute 500 ml de méthanol et 30 g de chlorure d'ammonium au concentré, sous agitation On refroidit le mélange à 00 C et on le

laisse reposer pendant 24 heures Après filtration et sé-

chage, on obtient un produit brut contenant 59 g d'ingré-

dient actif.

Exemple 6

On fixe la quantité d'ingrédient actif de 5 kg de

solution de fermentation filtrée à 550 ml de résine Amber-

lite IRC 50 sous la forme hydrogène, ensuite on l'élue avec une solution ammoniacale 0,5 M On ajuste l'éluat actif

( 1,4 1) à p H compris entre 5,5 et 5,7 avec une solution di-

luée d'acide sulfurique, on évapore l'éluat jusqu'à l'ob-

tention d'un volume de 100 ml et on le refroidit à 50 C sous agitation On laisse reposer le mélange pendant 24 heures,

on filtre le produit séparé et on le sèche On obtient ain-

si 14,4 g de sulfate brut de déféroxamine d'une pureté de

66 %.

-11- A partir du produit brut, on prépare du sulfate pur de déf 6 roxamine selon le procéd 6 d 6 crit dans l'exemple 4, sauf qu'on effectue le relargage avec du sulfate d'ammo- nium Le sel sulfate de déféroxamine est transformé en 6,5 g de méthanesulfonate pur de déféroxamine selon le procédé décrit dans l'exemple 3 Teneur en ingr 6 dient actif déter-

minée par procédé photométrique: 99,4 %.

-12-

Claims (4)

REVENDICATIONS

1 Procédé de préparation de sels de déféroxamine

de grande pureté à partir de solutions de fermentation fil-

trées contenant de la déféroxamine B comme ingrédient ac-

tif, par adsorption de l'ingrédient actif sur une résine

échangeuse d'ions et dissolution et purification subséquen-

tes de celui-ci, comprenant la séparation du sel de défé-

roxamine après la concentration de l'éluat, par relargage dans une solution aqueuse ou dans un mélange d'eau et d'un solvant organique, et sa purification par des opérations répétées de relargage et/ou au moyen de procédés connus en soi, et éventuellement a) préparation du sel méthanesulfonate au moyen de procédés connus, ou b) passage de la solution aqueuse du sel de déféroxamine à travers une résine échangeuse d'ions contenant des

anions méthanesulfonate comme contre-ions et récupéra-

tion du sel méthanesulfonate de l'effluent, de préféren-

ce par lyophilisation.

2 Procédé selon la revendication 1, comprenant le maintien du p H de la solution filtrée, avant l'échange

d'ions, à une valeur comprise entre 5 et 8 avec une solu-

tion tampon.

3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, compre-

nant la réalisation de l'élution avec une solution ammonia-

cale ou d'hydroxyde de sodium 0,05 à 1,5 M.

4 Procédé selon une quelconque des revendica-

tions 1 à 3, comprenant l'utilisation, comme mélanges d'eau et de solvant organique pour le relargage, de mélanges d'eau et de méthanol ou d'eau et d'éthanol ou d'eau et d'acétone. Procédé selon une quelconque des revendica-

tions 1 à 4, comprenant la formation du sel méthanesulfona-

te au moyen d'un procédé d'échange d'ions à une température

inférieure à 250 C, avec refroidissement.