KR0167723B1

KR0167723B1 - 베타-히드록시 이소부티르산의 정제방법

Info

Publication number: KR0167723B1
Application number: KR1019960009956A
Authority: KR
Inventors: 백우현; 성동호
Original assignee: 김승호; 보령제약주식회사
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1996-04-03
Publication date: 1999-03-20
Also published as: KR970069968A

Abstract

본 발명은 β-히드록시이소부티르산의 새로운 정제 방법에 관한 것으로, (a) β-히드록시이소부티르산을 포함하는 수성용액을 pH1.5~3.5에서 유기용매로 추출하여 유기용매층을 분리하는 공정; (b)분리된 유기용매층을 알카리용액으로 중화시켜 수층을 분리하는 공정; (c) 분리된 수층을 pH1.0~7.0에서 유기용매로 세척하는 공정; (d)세척한 수층을 pH1.5~3.5에서 유기용매로추출하여 유기용매층을 분리한 후 농축하여 β-히드록시이소부티르산의 농축액을 얻는 공정; (e)얻어진 β-히드록시이소부티르산 농축액을, 유기용매 중에서 또는 소량의 물이 혼재하는 유기 용매 중에서, 무기염기로 중화시켜 β-히드록시이소부티르산의 금속결정염을 제조하는 공정을 포함하여 구성되는 β-히드록시이소부티르산의 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 비교적 단순한 공정에 의하여 고순도의 β-히드록시이소부티르산을 금속염의 결정형태로 정제할 수 있으며, 정제된 β-히드록시이소부티르산은 금속 염의 형태로 산성 부위가 보호되어 있으므로 보존성이 개선되어 있고, 그대로 또는 간단한 산처리를 거쳐 β-히드록시이소부티르산으로 전환되어 합성 원료로 사용될 수 있다.

Description

β-히드록시 이소부티르산의 정제 방법

본 발명은 β-히드록시이소부티르산(이하, 'HIBA'라 칭함)의 새로운 정제 방법에 관한 것으로서, 특히 조작이 간편하고 고수율로 정제가 가능하며 산업화에 용이한 β-히드록시이소부티르산의 정제 방법에 관한 것이다.

HIBA에는 광회전성이 다른 D-체와 L-체가 있으며, 그 중에서도 D-HIBA는 항고혈압제인 1-(D-3-메르캅토-2-메틸프로피오닐)-L-프롤린 같이 비대칭 탄소원자를 보유하고 있는 생리활성 물질을 합성하는데 유용하게 사용되는 물질이다.

D- 또는 L-HIBA은 미생물 배양에 의하거나 또는 화학적 합성에 의하여 제조된다. 이러한 제조 과정에서 원료로 사용되는 이소부티르산이나 메타크릴산 등은 완전히 반응하지 않고 남아 최종 생성물인 D- 또는 L-HIBA과 함께 공존하므로, D- 또는 L-HIBA을 공업적으로 사용하기 위해서는 먼저 이러한 불순물을 제거하여야 한다.

L-HIBA를 정제하기 위한 종래의 방법으로, L-HIBA를 포함하는 배양액의 에테르 추출물을 농축하여 얻은 조 L-HIBA를 감압 증류를 하는 방법이 있다. 그러나 이 방법은 상당한 양의 L-HIBA가 분해되는 저수율의 비경제적인 방법으로, 5~10g 양으로 실시할 때는 회수율이 50% 정도되지만 30~50,g의 고용량으로 실시할 때에는 회수율이 20%로 떨어진다. 더욱이, 이 방법은 고진공(1mmHg)하에서 실시하여야 하므로 산업화가 어렵다는 단점(씨.티.굳휴와 제이.알.쉐퍼; Biotech. bioengi. 13. 203. 1971)이 있다.

D-HIBA를 정제하기 위한 방법으로는, D-HIBA가 포함된 배양액을 아세트산에틸로 추출한 후 농축하고, 실리카겔로 충진된 칼럼에 적용하여 주요 불순물인 이소부티르산을 제거하고, D-HIBA를 용리한 다음, 감압 증류하여 정제하는 방법(준조 하세가와 등 J. Ferment. Technol. 59, 203, 1981 ; 특허공고 84-1150)이 알려져 있다. 그러나, 이 방법 역시 수율이 35~40%로 낮고, 연속 사용이 불가능한 고단가의 실리카겔을 사용하고 있으므로 비경제적이다.

한편, 정제된 D- 또는 L-HIBA은 불안정하여 천천히 축합되고, 산촉매에 의하여 탈수화된다. 따라서, 에스테르 유도체 형태로 제조한 후 감압 증류하여 정제하는 방법이 필요하다(씨.티.굳휴와 제이.알.쉐퍼; Biotech. bioengi. 13. 203. 1971). D-HIBA도 그 자체로는 불안정하므로, D-HIBA의 메틸에스테르 형태로 제품화되어 판매되고 있다.

광학적으로 S형 또는 R형의 메틸-3-히드록시이소부틸레이트를 탄산나트륨 수용액에서 가수분해한 후, D-, L-α-페닐에틸아민의 염으로 만들어서, 고체상테인 D-, L-HIBA의 D-, L-α-페닐에틸아민의 염으로 만드는 방법이 알려져 있으나, 이 역시 수율이 약 15% 밖에 되지 않는다(피.엠. 루그라프와 알. 팍스톤; J.Bio.Chem. 263, 327, 1988).

그런데 D- 또는 L-HIBA의 에스테르는 항고혈압제인 1-(D-3-메르캅토-2-메틸프로피오닐)-L-프롤린 등의 제조 원료로 직접 사용할 수 없으므로, 사용시에는 탈 메틸화 공정을 거쳐 D- 또는 L-HIBA로 복원시켜 합성 원료로 사용하여야 한다. 이 탈메틸화 공정은 번거로울 뿐만 아니라 이 과정에서 D- 또는 L-HIBA이 광학활성을 잃어 버리는 경우도 있다.

본 발명자들은 종래기술에 있어서의 상기와 같은 문제점을 해결하고자, 정제 공정이 간단하면서도 수율이 높고, 잘 변질되지 않는 상태로 D- 또는 L-HIBA을 정제할 수 있는 새로운 방법을 찾아내고자 부단히 연구한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 공정이 간단하고, 산업화 현장에서 용이하게 적용가능한 고수율의 HIBA (이하, HIBA D-체 및 L-체 양자를 포함하는 개념으로 사용한다)의 정제 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 잘 변질되지 않고, 합성원료로 사용시 용이하게 HIBA로 전환되는 형태로 HIBA를 정제하는 방법을 제공하는 데에 있다.

이러한 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 의하면,

(a) β-히드록시이소부티르산을 포함하는 수성용액을 pH1.5~3.5에서 유기용매로 추출하여 유기용매층을 분리하는 공정;

(b) 분리된 유기용매층을 알카리용액으로 중화시켜 수층을 분리하는 공정;

(c) 분리된 수층을 pH1.0~7.0에서 유기용매로 세척하는 공정;

(d) 세척한 수층을 pH1.5~3.5에서 유기용매로 추출하여 유기용매층을 분리한 후 농축하여 β-히드록시이소부티르산의 농축액을 얻는 공정;

(e) 얻어진 β-히드록시이소부티르산 농축액을, 유기용매 또는 소량의 물이 혼재하는 유기용매 중에서, 무기염기로 중화시켜 β-히드록시이소부티르산의 금속결정염을 제조하는 공정을 포함하여 구성되는 β-히드록시이소부티르산의 정제 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 HIBA의 정제 방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따르면, 먼저, 미생물 배양액, 효소 전환액, 합성액 등과 같은 HIBA을 포함하는 수성용액을 pH1.5~3.5의 산성 상태에서 아세트산 에틸, 아세트산 부틸, n-부탄올, 디에틸 에테르 등의 추출용매로 추출한다. 이때 적은 양의 용매로 추출량을 늘리기 위해 초기 수성용액을 감압농축, 역삼투 농축 등의 방법으로 농축하여 사용할 수 있다. 이 과정에서 물에 잘 녹는 불순물은 수층에 그대로 남아 제거되고 HIBA을 포함한 유기산은 유기층으로 전이된다(a 단계).

얻어진 유기층을 다시 알칼리 용액으로 중화하여 HIBA을 포함한 유기산을 수층으로 전이시킨다. 이때 알카리 용액으로는 수산화 나트륨 용액, 수산화 칼륨 용액 또는 암모니아수를 사용할 수 있다.(b 단계)

이어 수성용액을 분리하고 pH1.0~7.0에서 물과 분리되는 적당한 유기용매로 세척하면 잔류한 미반응 원료인 이소부티르산, 메타크릴산 등의 불순물이 선택적으로 제거된다. pH를 1.0 내지 5.5로 조절할 경우에는, 유기 용매로 n-헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 벤젠, 시클로헥산, 펜탄 또는 사염화탄소를 사용하며, pH를 3.5 내지 7.0으로 조절할 경우에는, 아세트산 에틸, 아세트산 부틸, n-부탄올, 디에틸 에테르 등을 용매로 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 유기용매로 세척시 수성용매에 황산 암모늄, 염화 나트륨, 황상 나트륨, 염화 암모늄, 염화 칼륨 등을 용해시켜 사용하면 보다 용이하게 불순물을 제거할 수 있다. (c 단계)

불순물이 제거된 수층을 pH1.5~3.5에서 아세트산 에틸, n-부탄올, 아세트산 부틸, 디에틸 에테르 등의 유기용매로 다시 추출하고 유기층을 농축하여 HIBA 농축액을 제조한다. (d 단계)

얻어진 HIBA 농축액은, 유기용매 또는 소량의 물이 혼재하는 유기용매 중에서, 무기 염기로 중화시켜 HIBA의 금속 결정염으로 제조한다.

이 공정에 있어서 유기용매로는 아세톤, 메탄올, 이소프로필 알코올, 에탄올, n-부탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, n-헥산, 시클로헥산, 펜탄, 사염화탄소 또는 이들의 혼합 용매를 사용하고, 무기 염기로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 수산화 알루미늄 등을 사용할 수 있다. 따라서, 얻어진 금속 결정염은 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 칼슘 염, 알루미늄 염 등의 형태이다. (e 단계)

본 발명의 다른 실시 형태에 의하면, 상기 (c) 단계가 (a) 단계 보다 먼저 실시될 수 있다. 이 방법에 의하면, (ㄱ) β-히드록시이소부티르산을 포함하는 수성용액을 pH1.0~7.0에서 유기용매로 세척하는 공정; (ㄴ) 세척된 용액을 pH1.5~3.5에서 유기용매로 추출하여 유기용매층을 분리하는 공정; (ㄷ) 분리된 유기용매층을 알카리용액으로 중화시켜 수층을 분리하는 공정; (ㄹ) 분리된 수층을 pH1.5~3.5에서 유기용매로 추출하여 유기용매층을 분리한 후 농축하여 β-히드록시이소부티르산의 농축액을 얻는 공정; (ㅁ) 얻어진 β-히드록시이소부티르산 농축액을, 유기용매 또는 소량의 물이 혼재하는 유기용매 중에서, 무기염기로 중화시켜 β-히드록시이소부티르산의 금속결정염을 제조하는 공정에 의하여 β-히드록시이소부티르산 정제된다.

본 발명의 또 다른 실시 형태에 의하면, 상기 (b)단계와 (c)단계를 통합하여 실시할 수 있다. 즉, (b) 단계에서 pH3.5~7.0으로 조절하면 (c)단계를 생략할 수 있다. 이 방법에 의하면, (ㄱ)β-히드록시이소부티르산을 포함하는 수성용액을 pH1.5~3.5에서 유기용매로 추출하여 유기용매층을 분리하는 공정; (ㄴ) 분리된 유기용매층을 알카리용액으로 중화시켜 pH3.5~7.0으로 조절하여 수층을 분리하는 공정; (ㄷ) 분리된 수층을 pH1.5~3.5에서 유기용매로 추출하여 유기 용매 층을 분리한 후 농축 하여 β-히드록시이소부티르산의 농축액을 얻는 공정; (ㄹ) 얻어진 β-히드록시이소부티르산 농축액을, 유기용매 또는 소량의 물이 혼재하는 유기용매 중에서, 무기염기로 중화시켜 β-히드록시이소부티르산의 금속결정염을 제조하는 공정에 의하여 β-히드록시이소부티르산 정제된다.

이상과 같은 본 발명에 의하면, 비교적 단순한 공정에 의하여 고순도의 HIBA을 금속염의 결정형태로 정제할 수 있다. 정제된 HIBA는 금속염의 형태로 산성 부위가 보호되어 있으므로 보존성이 개선되어 있고, 합성원료로 사용시 직접 사용이 가능하며, 필요한 경우에는 간단한 산처리를 거쳐 HIBA로 전환시켜 사용할 수 있다.

다음에 본 발명의 실시예를 기재한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 보다 용이하게 하기 위하여 제공되는 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

β-D-HIBA 204g을 포함하고 있는 배양액 2ℓ를 원심 분리하여 균체를 제거하였다. 상등액을 분리하여 10N-황산으로 pH2.5로 조절한 후, 황산암모늄을 녹여 포화시킨 후 다시 황산으로 pH2.5로 조절하였다. 아세트산 에틸 8ℓ를 가하여 추출한 후 층분리하고, 수층에 다시 10N-황산을 가하여 pH2.5로 조절한 후 아세트산 에틸 8ℓ로 2차 추출하였다. 추출한 아세트산 에틸액을 모은 후, 5℃ 이하에서 가성소다 용액으로 pH7.5로 조절하여 수층을 분리하였다. 분리된 수층에 10N-황산을 가하여 pH2.5로 조절한 후 황산암모늄으로 포화시켰다. 여기에 n-헥산 1000㎖씩을 가하여 2회 세척하였다. 얻어진 수층에 10N-황산을 가하여 pH2.5로 조절한 후 아세트산 에틸을 2000㎖ 씩을 가하여 2회 추출하였다. 아세트산 에틸층을 모아 무수황산나트륨으로 건조시킨 후, 40℃에서 감압 농축하여 시럽상의 조 D-HIBA 251.69g을 얻었다. 단계 수율=94.20% (순도 76.35%, 메틸화후 GC분석). 조(粗) D-HIBA 200g을 2000㎖ 아세톤에 녹인 후 5℃로 냉각하고, 수산화 나트륨 69.16g을 1000㎖ 메탄올에 녹여 만든 용액을 서서히 적가하여 결정을 생성시켰다. 적가 완료후 0~10℃에서 1시간 교반하여 여과하고, 얻어진 결정을 감압 건조하여 D-HIBA 나트륨 염 180.77g을 얻었다. 메틸화하여 가스크로마토그라피 분석하였을 때 97.2%의 순도를 보였다. 단계 수율=95.01%, 전체 수율 = 89.50%

[실시예 2]

β-D-HIBA 135.09g을 포함하고 있는 배양액 1.3ℓ를 원심 분리하여 균체를 제거하였다. 상등액을 분리하여 10N-황산으로 pH 7.0으로 조절한 후, 50℃에서 감압 농축하여 초기 부피의 ¼로 농축하였다. 농축액을 황산 암모늄으로 포화시키고 1000㎖ 아세트산 에틸로 각각 2회 추출하였다. 추출한 아세트산 에틸액을 모은 후, 5℃이하에서 수산화 나트륨 용액으로 pH 6.9로 조절하고 수층을 분리하였다. 10N-황산을 가하여 pH 2.5로 조절한 후, 황산 암모늄으로 포화시키고, 아세트산 에틸을 1500㎖씩 사용하여 2회 추출하였다. 아세트산 에틸 층을 모아 무수황산나트륨으로 건조시킨 후, 40℃에서 감압 농축하여 시럽상의 조(粗) D-HIBA 175.07g을 얻었다. 단계 수율=94.32% (순도 72.78%, 메틸화후 GC분석) 조D-HIBA 170.45g을 1700㎖ 아세톤에 녹이고 5℃로 냉각한 후, 수산화나트륨 62g을 850㎖ 메탄올에 녹여 만든 용액을 서서히 적가하여 결정을 생성시켰다. 적가완료 후 0~10℃에서 1시간 교반하여 여과하고, 얻어진 결정을 감압 건조하여 D-HIBA 나트륨염을 148.93g을 얻었다. 메틸화하여 가스크로마토그라피 분석하였을 때 96.69%의 순도를 보였다. 단계 수율=95.84% 전체 수율=90.40%

[실시예 3]

실시예 1의 조D-HIBA 시럽 10g에, 수산화 나트륨 3.64g 5㎖ 증류수에 용해 후 150㎖ 이소프로필알콜과 혼합한 용액을 0~10℃에서 서서히 적가하였다. 결정을 0~10℃에서 1시간 교반하여 여과한 다음, 이소프로필알콜로 세척하고 감압 건조하여 8.97g의 결정을 얻었다. 단계 수율=92.38%, 전체 수율=87.02%(순도 95.23%, 메틸화후 GC분석)

[실시예 4]

실시예 1의 조D-HIBA 시럽 5g에, 수산화 나트륨 1.82g을 50㎖ 에탄올에 용해한 용액을 0~10℃에서 서서히 적가하였다. 결정을 0~10℃에서 1시간 교반하여 여과한 다음, 에탄올로 세척하고 감압 건조하여 4.13g의 결정을 얻었다. 단계수율=85.93%, 전체수율=80.95%(순도 96.20%, 메틸화후 GC분석)

Claims

(a) β-히드록시이소부티르산을 포함하는 수성용액을 pH1.5~3.5에서 유기용매로 추출하여 유기용매층을 분리하는 공정; (b) 분리된 유기용매층을 알카리용액으로 중화시켜 수층을 분리하는 공정; (c) 분리된 수층을 pH1.0~7.0에서 유기용매로 세척하는 공정; (d) 세척한 수층을 pH1.5~3.5에서 유기용매로 추출하여 유기용매층을 분리한 후 농축하여 β-히드록시이소부티르산의 농축액을 얻는 공정; (e) 얻어진 β-히드록시이소부티르산 농축액을, 유기용매 또는 소량의 물이 혼재하는 유기용매 중에서, 무기염기로 중화시켜 β-히드록시이소부티르산의 금속결정염을 제조하는 공정을 포함하여 구성되는 β-히드록시이소부티르산의 정제 방법.
상기 (c)공정에서, 수층의 pH를 1.0~5.5로 하며; 유기용매로 n-헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 벤젠, 시클로헥산, 펜탄, 사염화탄소 중에서 선택된 어느 하나를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c)공정에서, 수층의 pH를 3.5~7.0로 하며; 유기용매로는 아세트산 에틸, n-부탄올, 아세트산 부틸, 디에틸 에테르 중에서 선택된 어느 하나를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (e)공정의 유기용매로 아세톤, 메탄올, 이소프로필 알코올, 에탄올, n-부탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, n-헥산, 시클로헥산, 펜탄, 사염화탄소 또는 이의 혼합 용매를 사용하고; 무기염기로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 수산화 알루미늄 중 어느 하나를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 금속 결정염이 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염 또는 알루미늄염인 것을 특징으로 하는 방법.