Procédé pour la purification de la pénicilline. La présente invention se rapporte à un procédé pour la purification de la pénicilline, dans le but d'obtenir une pénicilline d'un haut degré de pureté.
Des procédés de préparation de sels de la. pénicilline sous une forme pure sont bien connus. Ils comprennent, par exemple, 1e traitement au charbon du 'couillon de culture acidifié et. des traitements d'extraction suc cessifs au rioyen d'un solvant organique et d'eau, des méthodes chromatographiques, la formation de dérivés cristallisables de la péni cilline, par exemple des sels alcalins ou des sels aminés, et la purification de ces composés par cristallisation, la substance pure obtenue étant finalement transformée, si nécessaire, en un sel déterminé pour un usage thérapeutique.
Ces procédés présentent cependant le dés avantage de comprendre un nombre considé rable d'opérations, ordinairement dix ou plus, chaque opération entraînant une perte de pénicilline, ce qui conduit à de très faibles rendements en pénicilline ou en dérivé recherché, généralement de l'ordre de 30 %.
L'invention a pour but. la production de pénicilline d'un haut degré de pureté, par un procédé comprenant un petit nombre d'opé rations et conduisant à un rendement total élevé en pénicilline. La pénicilline purifiée ainsi obtenue peut ensuite être transformée en un sel pur de pénicilline.
Le composé procaïne-pénicilline a une valeur thérapeutique considérable, car il pré- sente cette propriété précieuse d'assurer un niveau élevé de pénicilline dans le courant sanguin, pendant un temps considérable après l'injection. Cette propriété est due à la faible solubilité du composé dans les milieux liqui des de l'organisme. Un procédé approprié de préparation de la procaïne-pénicilline consiste à faire réagir la procaïne et la pénicilline dans un solvant de ces corps dans lequel la procaïne-pénicilline est, insoluble, et à récu pérer de ce solvant le composé qui s'est pré cipité.
On a trouvé maintenant qu'en employant. la procaïne-pénicilline comme produit inter médiaire dans la purification de la pénicilline et en utilisant la propriété de la procaïne- pénicilline d'être pratiquement insoluble dans les solvants usuels, la purification de la péni cilline peut être effectuée simplement et avec peu d'opérations, et qu'on peut obtenir des rendements supérieurs à ceux obtenus par les procédés antérieurs.
Le procédé selon l'invention pour la puri fication de la pénicilline est caractérisé en ce qu'on transforme de la pénicilline impure libre en son sel procaïne-pénicilline à l'aide de procaïne ou d'un sel de celle-ci, en opérant dans un solvant dans lequel la solubilité du sel procaïne-pénicilline est d'au plus 511/o, en ce qu'on sépare la procaïne-pénicilline ainsi précipitée, en ce qu'on suspend cette dernière dans un mélange d'eau et d'un solvant orga- nique pratiquement non miscible à l'eau,
en ce qu'on décompose la procaïne-pénicilline en traitant cette suspension à l'aide d'un agent hydrolysant non neutre, en ce qu'on sépare la phase aqueuse de la phase formée par le sol vant organique, et en ce qu'on recueille la p-NH2. C6H.r . CO . 0. CH@CI-12 . N(C.,H5)@,, . HCl est bien connu comme anesthésique local.
Par sels de procaïne, on entend ici les sels de cette base libre, tels que le chlorhydrate, formés par addition d'un acide à. l'atome d'azote trivalent, qui se transforme alors en azote pentavalent. La procaïne-pénicilline est. un sel de ce type, dans lequel une molécule de pénicilline est fiée à cet atome d'azote.
Cependant, dans la présente description, quand on parle des sels de pro- caïne en tant que produit de départ, on exclut évidemment la procaine-pénicilline. Bien que le sel de procaïne utilisé ordinairement dans la préparation de la procaïne-pénicillirie soit le chlorhydrate, d'autres sels de la procaïne peuvent être utilisés, par exemple le phos phate, le sulfate, l'ascorbate de procaïne, etc.
La procaïne-pénicilline, formée intermé- diairement, peut. être obtenue à. partir de pénicilline impure sous forme acide et, de procaïne sous forme de base libre, ou par double décomposition d'un sel de procaïne et d'un sel de pénicilline préparé d'abord à par tir de la pénicilline impure libre. Par exem ple, le chlorhydrate de procaïne et le sel de sodium de pénicilline peuvent réagir pour donner de la procaïne-pénicilline et du chlo rure de sodium.
Bien qu'on puisse obtenir la procaine-pénieilline par réaction entre tin sel de procaine et. la pénicilline sous forme acide, ou entre la procaïne et un sel de pénicilline, une telle réaction ne se fait pas d'une manière satisfaisante et n'est pas complète. Le procédé selon l'invention peut comprendre la forma tion in situ dans le mélange réactionnel de la procaïne sous forme de base libre par addi tion d'une base.
La procaïne et la pénicilline peuvent être présentes, dans le milieu réactionnel, en pro portions pratiquement équimoléculaires, mais pénicilline purifiée à. l'état libre de celle des phases qui la, contient.
On entend ici par procaïne le p-amino- benzoyl-diéthyl-amino-éthanol sons forme de base libre, dont le chlorhydrate, répondant à la formule on utilise, de préférence, un excès de proeaïne pour éviter toute perte de pénicilline.
La pénicilline peut. être employée directe ment sous forme acide, constituant la pénicil line proprement dite, mais elle peut égalemen, être d'abord transformée en un sel de pénicil line, avant. de la faire réagir avec la procaïne ou un sel de celle-ci. La pénicilline ou son sel peut se trouver en solution dans de l'eau ou dans un solvant organique.
La. procaïne-pénicilline peut être préparée à partir d'une pénicilline partiellement puri fiée. Il faut noter qu'il n'est pas avantageux d'utiliser un bouillon de culture brut conte- Liant de la pénicilline, pour la préparation de la proeaïne-pénieilline, car un tel bouillon cou. tient des impuretés très complexes qui peuvent empêcher une précipitation satisfaisante de la proca:ine-pénicilline, et surtout la pénicilline est trop diluée dans un bouillon de culture brut pour permettre la précipitation.
Il peut être utile de traiter la solution de pénicilline ou de ses sels avec une petite quantité, pal- exemple 1 à 5%, de charbon activé, avant la réaction avec la procaïne. Ce traitement au charbon peut. se faire en agitant la solution avec le charbon et en séparant ce dernier par filtration.
Bien qu'un tel traitement. ne con duise à aucune amélioration notable de la pureté de la pénicilline, il améliore considé rablement la couleur du sel procaïne-pénieil- line obtenu subséquemment.
Parmi les solvants dans lesquels la solu bilité de la. procaïne-pénicilline est. d'au plus 5 % et qui peuvent être utilisés dans le pro- cédé selon l'invention, on peut citer l'eau, les esters d'acides carboxyliques aliphatiques inférieurs, tels que l'acétate d'amyle et l'acé tate de butyle, les alcools aliphatiques, tels que l'éthanol, le propanol,
le butanol et. l'alcool amylique, les hydrocarbures aliphatiques chlorés, tels que le chloroforme, les éthers, tels que l'éther éthylique, l'éther méthyl-éthylique et l'éther éthyl-isopropylique, les cétones ali phatiques inférieures, telles que la méthyl- isobut.yl-eétone et la méthyl-éthyl-cétone, les mélanges de solvants organiques, tels que le mélange acétone-acétate de butyle ou butanol. acétate de butyle, et les mélanges d'eau et de solvants organiques, tels que l'acétone, la méthyl-éthyl-cétone, le butanol,
ete.
Pour assurer une bonne précipitation de la procaïne-pénicilline, il. faut. évidemment que la concentration en pénicilline du solvant réactionnel soit supérieure à la concentration correspondant à la solubilité de- la procaïne- pénicilline dans ce solvant.
Par exemple, la solubilité de la procaïne-pénicilline dans l'eau étant de 0,5 % en poids environ, ce qui cor- respond à une solution aqueuse contenant environ 5000 unités de pénicilline par milli litre, la solution devra contenir, si on utilise de l'eau comme solvant réactionnel, plus de 5000 unités de pénicilline par millilitre, et avantageusement plus de 25 000 unités par millilitre.
Il en est de même avec d'autres sol vants réactionnels, la concentration minimum admissible de la pénicilline dans le mélange réactionnel dépendant de la solubilité de la proeaïne-pénieilline dans le solvant utilisé.
La solubilité de la proca:ine-pénieilline dans le solvant ne doit pas dépasser 5%, et sera de préférence inférieure à 2%.
La séparation de la procaïne-pénicilline précitée peut se faire, par exemple, par filtra tion, par centrifugation ou par tout autre moyen, avant d'être convertie en pénicilline.
La procaïne-pénicilline séparée est ensuite suspendue dans de l'eau, en présence d'un sol vant organique pratiquement non miscible l'eau, et la procaïne-pénicilline est décomposée soit à un pH acide, soit- à uni pH alcalin. Pour la suspension, on utilise, de préférence, un mélange d'eau et de solvant en volumes égaux. En milieu acide, la procaïne-pénicilline est décomposée en pénicilline libre qui passe dan, le solvant organique, et en un sel de procaïne (lui reste en solution dans la phase aqueuse.
Les deux phases sont alors séparées, et la péni cilline libre est isolée à partir de la phase formée par le solvant, le sel de proca:ine pou vant également être isolé à partir de la phase aqueuse. En milieu alcalin, il se forme d'abord un sel de pénicilline et de la procaïne sous forme de base libre. Le sel de pénicilline reste dans la phase aqueuse et est ensuite trans formé en pénicilline libre par adjonction d'un acide. La procaïne-base reste dans le solvant organique et peut en être isolée.
Parmi les solvants pratiquement non mis cibles à l'eau, on peut citer les alcools, tels que le butanol et l'alcool amylique, les esters, tels que l'acétate de butyle et l'acétate d'amyle, les cétones, telles que la méthyl-isobutyl- cétone, les hydrocarbures aliphatiques chlorés, tels que le chloroforme, et les éthers, tels que l'éther di-éthylique et l'éther di-isopropylique.
La décomposition de la proca;ine-pénicil- line se fait de préférence en milieu acide et <B>de</B> préférence à un pH compris entre 1,5 et 2,5. On peut suspendre la procaïne-pénieilline dans de l'eau, en présence d'un solvant. orga nique de la pénicilline pratiquement non miscible à, l'eau, et acidifier la suspension par adjonction d'une substance appropriée, telle qu'un acide minéral ou organique. La, péni cilline libérée reste dans le solvant, organique, d'où elle est isolée, tandis que le sel de pro caïne formé reste dans la phase aqueuse.
On évite évidemment l'emploi d'un acide décom posant la pénicilline, comme l'acide nitrique.
La pénicilline, obtenue sous forme puri fiée, peut servir à la préparation de diffé rents sels purs de la. pénicilline.
Lorsqu'on a décomposé la procaïne-pénicil- fine en milieu acide, on peut isoler la pro- caïne ù. partir de la phase aqueuse, en ajus tant le pH de celle-ci entre 10 et 10,5, par exemple par addition d'hydroxyde de sodium, ce qui entraîne la. précipitation de la pro- caïne. Si un solvant organique est présent, la procaïne passe dans le solvant et peut être isolée par évaporation et cristallisation, ou par addition d'un second solvant dans lequel la procaïne est:
pratiquement insoluble, par exemple l'éther de pétrole, La procaïne-pénicilline peut être décom posée aussi en la suspendant dans de l'eau, en présence d'un solvant organique pratiquement non miscible à l'eau, en ajoutant lui agent hydrolysant alcalin à la suspension et à une température ne dépassant pas la température ordinaire, de préférence entre 0 et. 5 C, la pénicilline risquant d'être décomposée à des températures supérieures, lorsque le milieu est alcalin.
La pénicilline passe alors dans la phase aqueuse, sous forme du sel correspon- clant à l'alcali utilisé - par exemple le sel de sodium si on utilise l'hydroxyde de sodium -, et la procaine-base passe dans la phase organique. Ensuite, la pénicilline est libérée de son sel, dans la phase aqueuse, par adjonction d'un acide.
On veillera à ce que l'addition d'alcali ne conduise, à aucun moment, à un excès d'alcali dans la suspension de la procaïne-pénicilline à. décomposer. On utilise, de préférence, l'alcali sous forme de solution aqueuse diluée, <U>que</U> l'on ajoute très lentement, en agitant, à la suspension de la procaïne-pénicilline. On a trouvé qu'en ajoutant à la suspension une solution de l'alcali d'une normalité d'environ 0,025, goutte à goutte et en agitant, on évite pratiquement complètement une destruction de l'activité de la pénicilline.
La mise en oeuvre du procédé selon l'in vention est illustrée par les exemples suivants. Les parties exprimées en poids et les parties exprimées en volume ont entre elles le même rapport que si elles étaient exprimées en jrammes et en millilitres. <I>Exemple 1:</I> La pénicilline à purifier est isolée comme suit On filtre un bouillon. de culture contenant de la pénicilline, on l'acidifie et on l'extrait avec de l'acétate de butyle. La solution orga nique est extraite par de l'eau à un pH de 7, et l'extrait aqueux est acidifié et extrait à nou-veau par de l'acétate de butyle.
On agite la solution résultante avec 11/o en poids de charbon activé, et on sépare ce dernier par filtration. On traite 2000 parties en volume de la solution résultante, contenant 7200 unités de pénicilline par millilitre, avec une solution de 6 parties en poids de procaïne dans de l'acétate de butyle, et on laisse reposer le mélange pendant une nuit. On sépare par filtration la procaïne-pénicilline cristallisée qui s'est précipitée, on la. lave avec de l'acé tone, on filtre à nouveau, on lave le préci pité avec de l'eau et de l'éther et on le sèche à 37 C.
On sépare ainsi 13,70 parties en poids de procaine-pénicilline ayant une activité de 910 unités/mg, le rendement en pénicilline, extraite sous forme de procaïne-pénicilline de sa solution dans l'acétate de butyle traitée au charbon, étant de 871/o.
On suspend 8,25 parties en poids de pro ca:ine-pénicilline dans un mélange d'eau et d'acétate de butyle, et. l'on acidifie avec de l'acide chlorhydrique. La. pénicilline libérée passe dans la couche formée par l'acétate de butyle; on sépare cette couche et on en recueille la pénicilline par évaporation du solvant dans le vide.
<I>Exemple 2:</I> On suspend 0,98 partie en poids de pro- caïne-pénieilline, préparée comme décrit. dans l'exemple 1, dans 20 parties en volume d'eau, on agite vigoureusement avec 30 parties en volume d'acétate de butyle, et on refroidit le mélange à une température inférieure à 5 C. On ajoute goutte à goutte, sur une période d'une heure, 60 parties en volume d'une solu tion aqueuse d'hydroxyde de sodium 0,025 N et, quand l'addition est achevée, on sépare les phases.
On trouve, en déterminant l'activité, que la phase aqueulse contient les 961/o en poids de la pénicilline présente dans la pro- caïne-pénicilline utilisée. On acidifie ensuite la solution aqueuse, et on en extrait la pénicil line libérée à l'aide d'un solvant organique.
Exemple <I>3:</I> On prépare une partie en poids de pro- caïne-pénicilline par le procédé selon l'exem ple 1, on la suspend dans 20 parties en volume d'eau, on agite vigoureusement avec 40 parties en volume d'éther isopropylique, et on refroidit le mélange au-dessous de 5" C. On ajoute goutte â. goutte, pendant une heure environ, 1-1,5 parties en volume d'une solu tion d'hydroxyde de sodium. 0,1 N, et on sépare les phases quand cette addition est achevée.
On trouve, en déterminant l'activité, que la phase aqueuse séparée contient les 81% en poids de la pénicilline présente dans la procaïne-pénieilline utilisée. On acidifie ensuite la solution aqueuse et on en extrait la pénicilline libérée, à l'état purifié, à l'aide d'acétate de butyle.
<I>Exemple</I> On fait réagir Une solution de pénicilline dans l'acétate de butyle, obtenue par extrac tion d'un bouillon de culture, avec une pro portion équimoléculaire de procaïne-base en solution dans de l'acétate de butyle, on sépare par filtration la procaïne-pénicilline précipi tée et. on la lave avec de l'acétate de butyle, puis avec de l'eau.
On suspend 20 parties en poids de la pro- caïne-pénieilline obtenue dans un mélange clé 100 parties en volume d.'eaii et. de 200 parties en volume de chloroforme, on brasse le mélange et on l'acidifie à un pli de ' avec 101/o en poids d'acide sulfurique. On sépare alois las phases, et on recueille la pénicilline purifiée de la phase formée par 1e chloro- forme.
Si l'on veut préparer un sel de la péni- eilline ainsi purifiée, on dissout 1.5 parties en poids de cette dernière dans 200 parties en volume de chloroforme et on extrait la solu tion avec 100 parties en volume d'une solution aqueuse clé Na2C03 à un pll de 6,8. On sépare l'extrait aqueux et le dessèche par congélation pour obtenir le sel sodique clé pénicilïine purifiée.
<I>Exemple 5:</I> On suspend 20 parties en poids de pro- caïne-pénicilline précipitée, préparée comme décrit dans l'exemple 4, dans un mélange de 100 parties en volume d'eau et de 200 parties en volume de inéthyl-isobutyl-cétone, on brasse le mélange et on l'acidifie à un pfl de 1,4 avec 10% en poids d'acide chlorhydrique;
on sépare alors les phases et on recueille la pénicilline purifiée de la phase cétonique par évaporation du solvant dans le vide.
Exemple <I>6:</I> On suspend 20 parties en poids de pro- caïne-pénicilline, préparée comme décrit dans F exemple 4, dans un mélange de 100 parties en volume d'eau et de<B>'</B>00 parties en volume d'éther, on brasse le mélange et on l'acidifie à un pi, de 1,4 avec 1.0 % en poids d'acide phosphorique;
on sépare alors les phases, et on reeüeille la pénieillïne purifiée de la phase éthérique.
Exemple <I>i:</I> On filtre 81600 litres d'un bouillon de culture contenant de la pénicilline, on acidi fie le filtrat et on l'extrait avec de l'acétate de butyle. On extrait à nouveau l'extrait butylique avec de l'eau à un pH de 7, on acidi fie l'extrait aqueux et. on l'extrait: avec 1640 litres d.'aeétate de butyle. Cet extrait buty lique (désigné par N dans le tableau ci- après) contient 17 000 millions d'unités de pénicilline, l'activité des substances solides qu'il contient étant de 796 unités de pénicil- fine par mg.
On traite cet extrait avec 36,3 kg de procaïne-base en solution dans 81,7 litres d'acétone. La procaine-pénieilline précipitée est. séparée par filtration, lavée avec 109 litres d'acétate de butyle et 6,8 litres d'acé tone, et séparée à nouveau par filtration. La procaïne-pénieilline est alors mise en suspen sion clans 227 litres d'eau et<B>725</B> litres d'acé tate de butyle et décomposée par adjonction de 90,8 litres d'un tampon au phosphate à un pH de 1,1. La. phase d'acétate de butyle, désimnée par Y dans le tableau ci-après, qui contient, la pénicilline, est. séparée et lavée avec de l'eau.
On trouve, en déterminant son activité, qu'elle contient. les 100% de la péni- cilline contenue dans la solution butylique originale traitée avec la procaïne, l'activité des substances solidés qu'elle contient étant de 1.612 unités de pénicilline par mg. On recueille ensuite la pénicilline purifiée libre de la phase d'acétate de butyle par évaporation de ce dernier dans le vide.
Si l'on veut transformer la pénicilline ainsi purifiée en procaïne-pénicilline propre à un usage thérapeutique, on peut dissoudre la pénicilline pure dans de l'acétate de butyle, et traiter la solution avec de la procaïne, à. raison de 130 g de procaïne-base pour 100 millions d'unités de pénicilline, la procaïne étant utilisée en solution dans de l'acétone. On peut séparer la procaïne-pénicilline for mée, la laver, la sécher et la mettre finale ment en emballages.
Le procédé ci-dessus (exemple 7) est effec tué cinq fois, les résultats obtenus étant. don nés dans le tableau ci-dessous.
EMI0006.0006
Extrait <SEP> butylique <SEP> brut <SEP> (X) <SEP> traité <SEP> avec
<tb> la <SEP> procaïne-base <SEP> Extrait <SEP> butylique <SEP> purifié <SEP> (V)
<tb> Exemple <SEP> Activité <SEP> des <SEP> Activité <SEP> des
<tb> Nombre <SEP> Rendement <SEP> en
<tb> volume <SEP> substances <SEP> solides <SEP> substances <SEP> solides
<tb> litres <SEP> en <SEP> unités <SEP> de <SEP> péni- <SEP> total <SEP> d'unités <SEP> en <SEP> unités <SEP> de <SEP> péni- <SEP> pénicilline <SEP> à <SEP> partir
<tb> cilline <SEP> par <SEP> mg <SEP> (en <SEP> millions)
<SEP> cilline <SEP> par <SEP> mg <SEP> de <SEP> l'extrait <SEP> X <SEP> en
<tb> 8 <SEP> 1640 <SEP> 655 <SEP> 24000 <SEP> 1530 <SEP> 90
<tb> 9 <SEP> 1640 <SEP> 734 <SEP> <B>25370</B> <SEP> 1680 <SEP> 85
<tb> 10 <SEP> 1640 <SEP> 833 <SEP> <B>18000</B> <SEP> 1.612 <SEP> 100
<tb> 11 <SEP> 1640 <SEP> 976 <SEP> <B>30000</B> <SEP> 1670 <SEP> 91
<tb> 12 <SEP> 1640 <SEP> 1073 <SEP> <B>25700</B> <SEP> 1640 <SEP> 91.,.5 Exemple <I>13:
</I> On suspend 20 parties en poids de pro- eaïne-pénicilline, préparée comme décrit dans l'exemple 4, dans un mélange de 100 parties en volume d'eau et de 200 parties en volume d'acétate de butyle, on brasse le mélange et on l'acidifie à un pH de 1,5 avec 10% en poids d'acide chlorhydrique; on sépare alors les pha ses et on recueille la pénicilline purifiée de la phase d'acétate de butyle.