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La présente invention a pour objet l'obtention sous forme pure de deux substances actives qui seront dénommées dans ce qui va suivre substance active 21548/A et substance active 21548/C, ainsi que de leurs dérivés acides et des sels de ces composés. Les nouvelles substances actives peuvent être obtenues à partir de plantes de la famille des mélianthacées, en premier lieu à partir de l'écorce de ces plantes, comme le Melianthus major, le Melianthus comosus, la Bersama paullinioides, la Bersama lucens, la Bersama swinnyi, la Bersama tyso- niana, la Bersama abyssinica, la Bersama kivùensis, de préférence à partir de la Bersama cf. hebecalyx.
Les plantes de la famille des mélianthacées, notamment de la catégorie de la Bersama, sont des arbres, des arbrisseaux ou des arbustes de l'Afrique tropicale qu'on peut trouver de l'Abyssinie à l'Angola et en Afrique du Sud.
Du point de vue chimique, ces plantes n'ont pas encore été examinées. Jusqu'à présent, on n'a pas non plus isolé de substance active pure à partir de ces plantes.
A partir des plantes indiquées, on peut maintenant isoler deux nouvelles substances actives, notamment une substance incolore à faiblement jaunâtre qui cristallise en aiguilles et fond à 320-323 C. On peut la recristal- liser dans un mélange de méthylcellosolve et d'eau ou dans un mélange de chloro- forme et de méthanol, et elle est dénommée substance active 21548/C. L'analyse élémentaire de la substance, qui est exempte d'azote, fournit les valeurs sui- vantes : C = 60,38/60,28 %, H = 3,27/3,38 % et 0 = 35,96/35,76 %.
Son spectre ultra-violet dans le méthanol présente des maxima à 250 mu (El = 1490), 360 mu (E1 = 350) et 375 mu (E1 = 375), ainsi qu'un minimum prononcé à 324 mu (El = 90). Le spectre infra-rouge dans le chlorure de méthylène présente des bandes d'absorption à 5,73; 6,07; 6,16; 8,97; 9,13; 9,48 et 9,77 p.
Dans le nujol, les maxima se situent à 3,24; 5,76; 6,06; 6,15; 6,54; 6,60; 6,76 ; 7,13; 7,42; 8,11; 8,27; 8,40; 8,63, 8,79; 8,96; 9,08; 9,42; 9,78; 9,99; 10,16; 10,46; 10,77; 10,97; Il,32; 13,15; 13,75 et 14,08 p. La nouvelle substance se comporte comme un acide et est bien soluble dans une solution méthanolique d'hydroxyde de sodium. En ce qui concerne la seconde substance active que l'on peut isoler, il s'agit d'une substance faiblement jaunâtre cirstallisant en de petites aiguilles, et elle est dénommée substance active 21548/A,d'un point de fusion approximatif de 267 à 268 (décomposition). L'analyse élémentaire du composé exempt d'azote fournit les valeurs suivantes C = 53,96; H = 4,68 et 0 = 40,64 %.
Son spectre ultra-violet dans le méthanol présente des maxima à 241 mu (E1 =750), 258 mu (E1 = 800), 315 mu (E1 = 390) et 365 mu $(E1 = 345).
Les bandes les plus fortes du spectre infra-rouge dans le nujol (huile hydrocar- bonée) se situent à 2,98 u; 6,05 u; 6,16 p; 6,70 p; 7,72 p; 7,99 p; 8,36 u; 9,14 p et 12,07 p. On peut bien cristalliser ce composé dans un mélange de méthylcellosolve et de méthanol; il se comporte comme un acide organique et est relativement bien soluble dans une solution aqueuse d'un alcali, telle que des solutions de carbonate de sodium ou de bicarbonate de sodium, dans la pyridine et dans un mélange de méthylcellosolve et d'eau.
Il est peu soluble à chaud dans les solvants organiques comme le méthanol, l'acétone, les hydrocarbures halogénés et pratiquement insoluble à froid dans les solvants organiques tels que le métha- nol, l'acétone ou les hydrocarbures halogénés, l'éther, l'hexane ou l'eau.
Les nouvelles substances actives, leurs dérivés d'acide, de préfé- rence leurs esters, et les sels de ces composés sont actifs contre des infections dues à des virus. Cela a pu, par exemple, être montré dans des essais avec 1' Ectromelia. Des souris inoculées avec le virus de la variole de la souris (un virus qui est proche parent du virus de la variole humaine) sont protégées par une administration quotidienne des nouvelles préparations. L'effet thérapeutique
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est atteint avec des doses qui sont bien supportées par les animaux traités.
Les nouvelles préparations peuvent être utilisées dans les cas d'infections intéressant la peau, les viscères et les nerfs et dues à des virus, par exemple la variole, la pneumonie dues à des virus et l'encéphalomyélite.
Les nouvelles substances actives sont obtenues en extrayant des plan- tes de la famille des mélianthacées, notamment de Bersama cf. hebecalyx, de préférence les écorces de ces plantes, comme l'écorce de la tige ou l'écorce des racines, en isolant les nouvelles substances actives indiquées à partir des ex- traits obtenus et, si on le désire, en transformant les composés obtenus en leurs dérivés d'acide et/ou en préparant les sels de ces dérivés et/ou 'en transformant les sels obtenus en composés libres.
L'extraction, de même que l'isolement des nouveaux composés, peuvent être effectués de différentes manières, suivant des méthodes connues en elles- mêmes. C'est ainsi qu'il est avantageux d'extraire les plantes indiquées, no- tamment l'écorce de ces plantes, en premier lien l'écorce des racines de Bersama cf. hebecalyx, avec des alcools comme le méthanol, l'éthanol, le propanol, ou avec des hydrocarbures halogénés comme le chloroforme, le chlorure d'éthylène, le chlorure de méthylène ou le trichloréthylène, avec le benzène ou le dioxane ou leurs mélanges, le cas échéant en présence d'eau,d'acides aqueux comme l'acide acétique aqueux, ou bien avec des agents alcalins tels que des bases inorganiques ou organiques, par exemple avec du carbonate ou du bicarbonate de sodium.
Pour isoler les nouveaux composés, on peut alors décomposer l'extrait obtenu en pro- cédant à une cristallisation fractionnée. C'est ainsi qu'on peut le reprendre dans des mélanges de méthylcellosolve et d'eau et isoler les nouveaux composés par évaporation, cristallisation et recristallisation. En outre, les nouveaux composés peuvent aussi être séparas des extraits indiqués ci-dessus*par réparti- tion à contr.e-courant ou par chromatographie, par exemple sur de l'oxyde d'alu- minium de force moyenne par exemple sur de l'alumine modérément active, sur de l'acide silicique, sur de l'Hyflo (terre de diatomées), ou sur un autre silicate.
Une méthode opératoire préférée consiste à mettre en pâte les écorces des racines ou des tiges avec du méthanol aqueux, à extraire ensuite à reflux pendant plusieurs heures avec du méthanol technique et à concentrer la solution sous vide jusqu'à environ 10 % de son volume. On laisse alors cristalliser pendant une nuit, essore le cristallisat obtenu et le reprend dans un mélange de méthylcellosolve et d'eau (2: 1) à 40 . Le cristallisât obtenu après refroi- dissement est séparé par filtration et il constitue la substance active 21548/C.
Les lessives-mères sont évaporées jusqu'à la moitié ou le tiers de leur volume, puis additionnées de deux volumes de méthanol après quoi on sépare la substance active 21548/A après refroidissement et repos. Le filtrat obtenu est à nouveau additionné de deux volumes de méthanol environ, ce qui fait qu'après avoir laissé reposer et avoir laissé refroidir, on obtient à nouveau des cristaux de la sub- stance active A 21548/A.
Suivant le mode opératoire choisi, on obtient les nouveaux composés sous la forme des acides ou sous la forme de leurs sels. A partir des acides, on peut former des sels utilisables en thérapeutique, comme ceux des métaux alcalins ou alcalino-terreux, comme le sodium, le potassium, le magnésium ou le calcium, en faisant réagir les nouveaux composés sur les hydroxydes ou les car- bonates de ces métaux, en présence ou en l'absence d'agents de dilution. Ces composés peuvent aussi, d'une manière connue en elle-même, par exemple par estérification avec des alcools, être transformés en leurs dérivés fonctionnels d'acides.
Les nouvelles substances actives, leurs dérivés d'acides et leurs sels peuvent être utilisés comme médicaments, par exemple sous la forme de pré- parations pharmaceutiques les renfermant en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, appropriée pour une application enté- rale, parentérale ou topique. Pour la formation de cette matière de support,
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on envisage les substances ne réagissant pas sur les nouveaux composés, comme par exemple l'eau, la gélatine,le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des gommes, des polyalcoylèneglycols, la vaseline, la cholestérine ou d'autres excipients connus.
Les préparations pharmaceutiques peuvent se présenter, par exemple, à l'état de comprimés, de dragées, d'onguents, de crèmes ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émul- sions. Le cas échéant, elle sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants ou émulsifiants, des sels servant à faire varier la pression osmotique, ou des tampons. Elles peuvent aussi renfermer encore d'autres substances thérapeu- tiquement précieuses.
La présente invention concerne également, à titre de produits indus- triels nouveaux, les produits conformes à ceux définis ci-dessus.
L'invention est dévrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centigrades.
EXEMPLE 1
Avec 3 litres d'un mélange à parties égales de méthanol et d'eau, on met en pâte 4,23 kg d'écorce finement broyée de tiges de Bersama cf. hebecalyx, puis extrait pendant 2 heures à reflux avec 6 litres de méthanol. La solution d'extrait est ensuite concentrée sous pression réduite jusqu'à un volume d'environ 1/2 litre, ce qui fait que des cristaux se séparent sur la paroi du ballon. On laisse reposer pendant une nuit, filtre et lave le résidu de filtration avec du méthanol. On obtient ainsi 29,5 g d'un cristallisat brut qui présente un point de fusion d'environ 250 .
Le résidu de drogue restant dans l'extracteur est à nouveau extrait pendant 4 heures avec 6 litres de méthanol. Après avoir été concentrée sous vide à un volume de 0,2 à 0,3 litre, la solution d'extrait fournit encore 8,8 g de cristallisat brut. En soumettant le résidu de la drogue à une troisième extrac- tion à reflux pendant 6 heures avec 5 litres de méthanol, on n'obtient plus que des traces de matière cristalilisée.
Le cristallisat brut est soumis en deux portions à une cristallisa- tion fractionnée. Dans un mélange de deux parties en volume de méthylcellulosolve et d'une partie en volume d'eau, on dissout en majeure partie 18,7 g de substance brute, en chauffant à 35-40 et en agitant fortement. On sépare alors, par fil- tration à travers un filtre en verre fritté FG 4, les fins cristaux qui sont encore en suspension dans la solution, et l'on obtient 6,3 g de cristallisat brut de la substance active 21548/C. On peut recristalliser ce cristallisât brut dans un grand volume d'un mélange de méthylcellosolve et d'eau (2:1), et il forme alors de petites aiguilles incolores qui fondent à 320 environ.
La lessive-mère de ces cristaux est concentrée sous vide jusqu'à un volume de 150 cm3 ce qui fait qu'il commence à se séparer des cristaux sur les parois; on ajoute alors à la solution 400 cm3 de méthanol et laisse le mélange reposer pendant une nuit à 4 . On filtre et obtient 9,06 g de cristallisat brut de la substance active 21548/A qui fond à 262-264 en se décomposant et qui, par une autre recristàllisation dans le mélange solvant décrit ci-dessus et par une cristallisation subséquente dans le méthanol, peut être purifié davantage et fournit des aiguilles jaune-pâle qui fondent à 267-268 en se décomposant.
La lessive-mère du cristallisat brut est concentrée sous vide jusqu'à un volume de 30 cm3 environ et on la laisse reposer pendant une nuit après y avoir ajouté 60 cm3 de méthanol. Dans ce cas, il cristallise encore à l'état impur 2,1 g de la substance 21548/A, qu'od peut isoler par filtration.
EXEMPLE 2
On extrait pendant 4 heures à reflux avec 750 cm3 de méthanol,
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100 g d'écorce de racines finement broyée de Bersama cf. hebecalyx. Le résidu renfermant la drogue est extrait une seconde fois pendant trois heures avec 300 cm3 de méthanol. Après avoir réuni les solutions d'extrait, on les concentre sous vide jusqu'à un volume de 80 cm3 environ, puis laisse reposer pendant plusieurs semaines à 4 . Il se forme alors sur le fond du ballon une quantité de fines petites aiguilles microscopiques des substances actives A1548/A et 21548/C et de gros prismes de sucre de canne mesurant jusqu'à 6 mm d'arête.
Les cristaux obtenus après filtration sont repris dans de l'eau, la fraction insoluble est séparée par filtration et lavée ensuite à l'eau. Après séchage, le résidu finement cristallin pèse 2,76 g ; peut, comme décrit dans l'exemple 1, par dissolution dans un mélange de méthylcellosolve et d'eau (2:1), le séparer facilement en les substances actives 21548/A et 21548/C.
EXEMPLE 3
Avec 0,5 litre d'un mélange de 90 parties de méthanol et de 10 parties d'eau, on humidifie 500 g d'écorce de racines finement broyée de Bersama cf. hebecalyx,puis percole avec 4,5 litres de méthanol. En concentrant la solu- tion d'extrait sous vide jusqu'à 0,5 litre environ, on peut obtenir 5,26 g de cristallisat brut. Pour isoler la substance active 21548/A que l'extrait renferme en plus grande quantité, on fait bouillir le mélange cristallin à reflux dans un grand volume de méthanol jusqu'à ce qu'il soit presque complètement passé en solution. On filtre alors à chaud. Le résidu de filtration est constitué en majeu- re partie par la substance 21548/C et peut être purifié comme dans l'exemple 1.
On concentre le filtrat sous vide jusqu'à cristallisation commençante, puis laisse reposer à 0 pendant une nuit. Le cristallisat de la substance active 21548/A qui se sépare alors peut être purifié davantage par des cristallisations répétées dans du méthanol chaud.
EREMFLE 4
On soumet à une répartition à contre-courant, dans un système solvant constitué par du butanol secondaire (saturé d'eau) comme couche supérieure et par de l'eau (saturée de butanol secondaire) comme couche inférieure, 400 mg d'un cristallisat brut de la substance active 21548/A, obtenu de la manière décrite dans l'exemple 3 par recristallisation à une reprise dans du méthanol bouillant. La substance est dissoute dans les cinq premiers tubes d'un appareil- lage en verre (suivant Craig) dans chaque fois 25 cm3 de la couche supérieure et inférieure, puis répartie en 50 stades. Le contenu des tubes N 30 à 33 qui renferment les fractions de pointe, est réuni et fournit, à l'état pur, par cristallisation dans le méthanol, 125 mg de la substance active 21548/A, d'un point de fusion de 267-268 .
EXEMPLE 5
On broie finement 11 kg d'écorce de racines de Bersama cf. hebecalyx, divise en deux parties égales et extrait comme suit. On humecte chaque fois 5,5 kg de matière avec 550 cm3 d'une solution aqueuse binormale d'acide acétique, mélange bien, place dans un extracteur à reflux et extrait pendant 5 heures après avoir ajouté 10 litres de benzène. On enlève alors la solution d'extrait,place 5 litres de benzène frais et extrait pendant 5 heures de plus à reflux. On répète la même opération à deux reprises pendant 3 à 4 heures avec chaque fois 3 litres de benzène.
On réunit les solutions d'extrait et les concentre sous vide jusqu'à ce qu'il reste un résidu résineux. On reprend ce dernier dans un litre de chloroforme, la majeure partie passant en solution par secouage. Les particules adhérant à la paroi du ballon et celles en suspension dans la solution forment un cristallisat qui est relativement difficilement soluble dans le chloroforme froid et qu'on peut séparer par filtration. Le rendement en cristallisat brut de couleur brun-clair obtenu à partir des deux charges (11 kg de racines) est au total de 8 g environ.
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La purification a lieu en passant par le sel de sodium, en malaxant le cristallisat brut avec 200 cm3 d'une solùtion méthanolique binormale d'hydroxyde de sodium, en filtrant la suspension à travers un entonnoir filtrant à filtre de verre (G 3) et en acidifiant le filtrat avec une solution méthanolique concentrée d'acide chlorhydrique, ce qui fait que la substance précipite sous la forme d'un cristallisat faiblement jaunâtre. En extrayant ensuite à plusieurs reprises le résidu d'essorage et en acidifiant ensuite, on obtient finalement à l'état pur un total de 3,9 g de cristaux jaune-pâle fondant à 315-321 .
Pour purifier davantage la substance, on la dissout dans du chlores- forme chaud, filtre la solution et, après avoir ajouté 1/lOème du volume de métha- nol, on concentre sous pression légèrement réduite jusqu'à un petit volume. Si l'on répète cette opération, on obtient la substance pure sous la forme de petites aiguilles de couleur faiblement jaunâtre, qui fondent à 320-323 (Koflerblock).
Lorsqu'on augmente lentement la température, la substance commence déjà à se sublimer lentement à partir de 260 environ.
REVENDICATIONS.
I. Un procédé de préparation de deux substances actives, de leurs esters et des sels de ces composés, ledit procédé étant caractérisé par le fait qu'on obtient les substances actives 21548/C et 21548/A à partir de plantes de la famille des mélianthacées et, si on le désire, qu'on transforme les compo- sés obtenus en leurs dérivés d'acide et/ou qu'on prépare les sels de ces composés et/ou qu'on transforme les sels obtenus en les composés libres.
Les présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants :
1) On extrait des plantes de la famille des mélianthacées, et, à partir des extraits obtenus, on obtient les substances actives 21548/C et 21548/A.
2) On part d'écorces de mélianthacées.
3) On part de la Bersama cf. hebecalyx.
4) On extrait les plantes avec des alcools.
5) On extrait les plantes avec du méthanol.
6) On extrait les plantes avec du méthanol aqueux.
7) On extrait les plantes avec du benzène.
8) On extrait les plantes avec du benzène en présence d'un acide aqueux.
9) On isole les substances actives 21548/C et 21548/A par cristal- lisation fractionnée.
10) On effectue la cristallisation fractionnée dans un mélange de méthylcellosolve et d'eau.
Il) On effectue la cristallisation fractionné dans un mélange de 2 parties en volume de méthylcellosolve et d'une partie en volume d'eau.
12) On isole les substances actives 21548/0 et 21548/A par une ré- partition à contre-courant.
13) La répartition à contre-courant est effectuée dans un mélange de butanol et d'eau.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.