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" Perfectionnements à la purification de sels de, pénicil- line Il.
La présente invention est relative. à des perfection- nements dans la préparation de sels métalliques purifiés de pénicilline .
Le mot "pénicilline" est employé dans un sens quelque peu large, parfois pour désigner la ou les -substances actives acides produites dans la solution de métabolisme, dans laquelle ou sur laquelle certaines moisissures,en particulier le Penicillium ntatum, se développent , et d'autres fois pour désigner un sel métallique, en général le sel sodique ou calcique, de la ou des substances susdi- tes, sol métallique qui constitue la forme sous laquelle la, matière active est préparée et utilisée.
Dans le présent mémoire, le mot "pénicilline" aura la première des deux significations susmentionnées, et les sels de la ou des
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substances actives seront dénommés sels de pénicilline.
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Dans le procédé ordinaire de fabrication, la pénicil- line est entrait:' de la solution de métabolisme à l'aide /approprié/
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d'un solvant 0:',.; aniClu E/, jet la pénicilline ain-1 extraite est convertie en un sel métallique approprié, généralement 1 sel sodique (bu le sel aaiaique , J1!ü vue de la purifica- tio n du sol, la solution aqueuse de celui-ci est souvent acidifiée, la pénicilline est re-extraite et retransfor.me en. sel de pénicilline voulu en solution aqueuse, dont le sel solide est finalement extrait.
Le sel sodique ou ca lci- que de péni ailli "e ainsi prépare est invariablement accom- pagne d'impuretés, dont certaines sont colorées, ce qui don- ne à la préparation non seulement une stabilité faible et variable, mais .Lui confère également d'autres effets se-
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condaires désa2;réaoles, parmi lesquels 1''apparition d'une douleur lors de l'injection. Le sel sodique ou calcique
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de pénicilline pur est un composé blanc de stabilité ù3 aü- coup plus grande que le produit brut susmentionné et pro- duit une douleur moindre que ce dernier au moment de l'in- jection.
La purification de la pénicilline ou et.? sas sels
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métalliques, notac'.meD.t la séparation des matières actives des impuretés qui les accompajnsnt habituellement, constitue une opération difficile et inconmoàe et la préseinte iJ.1vel- tion a pour oujet un procédé nouveau et perfectionné pour la préparation de sels purifiés de pénicilline.
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Dans la demande de brevet bel.:;3 déposée le janvier 1947 sous le n 565.)74, la demanderesse a décrit un pro- cédé pour la préparation de sels métalliques purifiés de pénicilline, dans lequel une solution de pénicilline brute dans un solvanta étéamenée à réagir avecune ou plusieurs
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bases organiques primaires appropriées, telles que défit ives dans la demande susdite, de manière à, former des sels de
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pénicilline de ces bases, pouvant facilement être obtenus 'à un état de pureté très élevé et pouvant facilement être transformés en sels métalliques purs correspondants,par
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exemple, en sels sodique. ou 9a;Lciq,u8";
, Suivant une mé- thode préférée de réalisation du procédé, #'orite dans la demande susmentionnée, une solution aqueuse d'un sel sodi- que ou calcique de pénicilline brute était acidifiée et
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la pénicilline brute résultante était extraite de la s3 lu- tion aqueuse à l'aide'd'un solvant approprié, tel que défi- ni dans la dite demande, le solvant ordinairement employé
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étant la mêthylisobutylsétone . La solution de pénicilline dans le solvant approprié mentionné ci-avant était alors
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utilisée pour préparer le sel de base primaire de enieil- line.
Lors de recherches ultérieures, la demanderesse a
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constaté que les sels métalliques bruts de p,nieilline,par exemple, les sels sodique ou calcique peuvent facilement être transformés en sels sensiblement purs de bases or@3.- niques primaires, telles que définies dans le présent mé- moire, par un procédé simple., qui n'implique pas la libéra-
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tion. de pénicilline libre des sels métalliques et' évite, par conséquent, l'emploi de solvants , tels que la m6,tlyl- isobutylgétone, par exemple .
Les sels de bases organiques primaires de pénicilline ainsi obtenus peuvent facilement $tre transformés en sels métalliques, ,'par exemple, sodique
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ou raloiquei
La demanderesse a constaté que lorsqu'une solution aqueuse d'un sel métallique brut (par exemple, sodique ou
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ca19ique) de pénicilline contenant de préférence mais pas nécessairement une substance @ salifiante , est traitée par un sel approprié, tel que défini dans le présent mé- moire , d'une base organique primaire a,ppropriée, telle
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que définie dans le. présent mémoire, une double d400mpsi-
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tion a lieu et on obtient la précipitation du sel de la base organique primaire correspondance de pénicilline .
Ce sel peut ê'tre recueilli comme tel. 11 peut, si on le désire, être purifié et il peut être facilement transformé en. sels métalliques (par exemple, en sel sodique ou calcique) de
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pénicilline, dont la pureté sera plus ::;r8;,o.2 que c'2110 du sel métallique originel de pénicilline.
Par L? e==preùsion '?base organique primaire appropriée" telle qu'elle est employée dans le présent filémoire, on entend un composé de formule H..,;:tt, dans laque lis R est un résidu /cyclo nydrocaß âoné%a7,ï p,atiaue, lequel résidu peut contenir de substituants alocyles, dont le nombre total d! sto"le::; de carbone ne dépasse pas 8, qui a un plffi non inférieur à 10,n et qui, dans les conditions du procéda ne détruit pas rapi- denieat la pénicilline . a cyolohexylomine et la 11l'6thyl- cyclohexyl nia6 constituent des exemples de ces bases. bzz présent, la demanderesse préfère utiliser la première des deux bases mentionnées ci-avant.
Par l'expression "sel approprié d'une base organique
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primaire appl'oprié'3" on entend le produit for-né par la com- Dinaison d'une base or,-;sn.iq,ae priraûire appropriée, telle que définie ci-dessus, avec un acide fort ou modérément fort, étant entendu que ni l'acide ni le sel, ne doivent, dans les conditions du procédé, avoir un effet destructif sur la pénicilline ou sur ses sels. La demanderesse préfère utiliser des sels de base organique primaire appropriée diacides minéraux forts, tels que l'acide chlorhydrique.
En conséquence, l'invention est notamment relative à un procédé pour la préparation de sels de pénicilline, dans
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1#quel une solution aqueuse d'un sel métallique (p: r exem- ple, sodique ou calcique) de pénicilline est traitée par un sel approprié d'une case organique primaire appropriée, de manière fi précipiter un. sel de pénicilline de; la dits base.
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Suivant une autre particularité de l'invention,la demanderesse préconise un procédé pour la purification de sels métalliques bruts (par exemple, de sel sodique ou cal- Pique) de pénicilline, dans lequel¯une solution aqueuse, du sel métallique brut est traitée par un sel approprié d'une base organique primaire appropriée, et dans lequel le sel de base organique précipité est purifié,si nécessaire,et re-transformé en sel métallique (par exemple sodique ou calcique) de pénicilline.
Le sel de base organique primaire peut être ajouté à la solution aqueuse soit sous forme de la substance sensible- ment pure, soit sous forme d'une solution aqueuse concen- tréet et le mélange de réaction doit être amené à pH 6-7 par addition d'un acide, tel que l'acide phosphorique.ou d'une base inorganique, telle que la. soude caustique . La demanderesse a constate qu'il est préférable d'effectuer la précipitation du sel de base primaire de pénicilline en présence d'une substance salifiante , comme il sera dé- crit ci-dessous.
Une forme de réalisation préférée de l'invention sera à présent décrite en détail.
Comme matière, de départ, la demanderesse utilise une solution aqueuse refroidie de sel métallique brut (par exemple, sodique ou calcique) de pénicilline. L'activité de la pénicilline est, de préférence, mais pas nécessaire- ment, non inférieure à 400 unités Oxford, par milligramme, et sa concentration dans sa solution aqueuse est, de préfé- rence, de 2-10 % poids/volume.
Il est souhaitable que cette: solution contienne égale- ment une substance salifiante, c'est-à-dire un sel fortement soluble dans l'eau, et dont la solution est, de préférence, mais pas nécessairement, neutre ,La demanderesse préfère utiliser somme substance salifiante, du chlorure sodique, du sulfate sodique, du chlorure potassique et des composés, ana-
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logues, mais les sels d'ammonium ne sont pas appropriés, tandis que les sels qui ont une action destructrice sur la pénicilline ou ses sels ne doivent évidemment pas être em- ployés. La quantité de substance salifiante présente dans la solution doit, de préférence, être telle que la solu- tion soit approximativement saturée.
Si l'on désire utiliser le sel calcique, il est néces- saire d'ajouter d'abord le sel de base avant l'agent sali- fiant, étant donné qu'un précipité contenant la pénicilline est sinon apte à être séparé par salification.
A cette solution on ajoute, tout en agitant et en refroi- dissant, soit sous forme d'une substance sensiblement pure, soit sous forme d'une solution aqueuse concentrée, une quan- tité d'un sel approprié d'une base organique primaire ap- propriée, au moins équivalente à la quantité de pénicilline présente et le mélange est amené à pH 6-7 par addition pru- dente, sous agitation, d'un acide, tel que l'acide phospho- rique, ou d'une base inorganique , telle que la soude caus- tique .
Ce mélange est agité et refroidi jusqu'à ce que plus aucune précipitation ne se produise - Le produit, qui est le sel de pénicilline brute de la base organique pri- ou maire employée, est recueilli par filtration centrifuga- tion. il peut être lavé à l'aide d'une faible quantité d'une solution aqueuse presque saturée d'une substance salificante, ette dernière doit dans ce cas, donner lieu à l'obtention d'une solution aqueuse neutre et le produit est rendu aussi exempt d'eau que possible en continuant à filtrer ou à centri- fuger.
Le produit humide peut être traité de diverses manière s.
L'eau restante peut, autant que possible, être extraite de la matière ainsi obtenue, en la laissant séjourner pendant plusieurs heures au-dessus d'un agent de dessiccation, tel que le pentoxyde de phosphore, dans un exsiccateur mis sous
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vide. Lorsque la matière est sèche,elle. peut être layée à l'acétone ou à la méthyléthylcétone. Le produit, ayant subi ou n'en l'opération de lavage mentionné ci-avant,, peut alors être recristallisé de manière appropriée comme suit :
Le produit séché est chauffé en présence d'une quanti- té de chloroforme légèrement supérieure à celle suffisante pour dissoudre, à environ 30 C, la matière organique. Le mélange çhaud est filtre rapidement de manière à séparer la matière inorganique non dissoute .
Au filtrat , on ajou- te suffisamment d'acétone ou de méthyléthylcétone pour pré- cipiter, par refroidissement,le sel de base organique pri- maire de pénicilline purifié.
En variante, la màtière humide peut être recristalli- sée immédiatement sans séchage. Elle peut être dissoute directement dans du chloroforme et la solution peut être séparée par filtration des quelques gouttes de phase aqueu- se présente . Par dilution au moyen de deux ou trois volu- mes d'acétone ou de méthyléthylcétone, le sel de base pri- maire purifié se sépare par cristallisation. Il est évidem- ment à noter que les combinaisons particulières de solvants, décrits dans le présent mémoire, à des fins de cristalli- sation, ne sont évidemment en aucune façon le seul mêlant possible. Il est facile de déterminer au laboratoire si un autre solvant quelconque ou un mélange, de solvants donna satisfaction .
Si le produit résultant n'est pas aussi pur qu'on désire qu'il soit, le traitement de purification pré- cité peut être répété.
Un autre mode opératoire consiste, encore à dissoudre la matière humide dans un faible volume d'alcool éthylique, par exemple, 3-5 ml pour chaque mega-unité de pénicilline utilisée originellement . Après séparation par filtration des traces d'un agent salifiant quelconque, qui peut avoir été utilisé, le sel de base organique de pénicilline suri- fié peut être précipité par addition à la solution alcool! -
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que d'environ trois à cinq fois son volume d'éther diéthyli- que , diisopropylique ou dioutylique.
Le produit purifié peut facilement: être transformé par plusieurs méthodes en sels métalliques pure (par exem- ple en sels sodique ou calcique ) de pénicilline,par exem- ple, en ajoutait, sous agitation vigoureuse, un mêlant? d'éther ou de chloroforme et d'acide phosphorique aqueux contenant une quantité d'acide phosphorique au moins équi- valente à la quantité de base organique contenue dans le sel à traiter, en séparant l'extrait organique, en ajustant le pH de la solution aqueuse à 2,5, en extrayant à, l'aide d'une nouvelle quantité de solvant organique, en mélangeant les extraits,
en extrayant ce mélange à l'aide d'une solu- tion aqueuse d'un hydroxyde métallique (par exemple l'hydroxyde sodique), qui Contient une quantité d'hydroxyde métallique équivalente à la quantité de pénicilline (acide libre) présente dans la base organique, et en séchant l'ex- trait aqueux par congélation, suivie de sublimation sous vide.
Les exemples suivants, qui sont uniquement donnés à ti- tre d'illustrations,et dans lesquels "m.u." désigne une "mege-unité" c'est-à-dire 1.000.000 unités oxford, tandis que "u.o" désigne des unités Oxford, montrent comment un sel, de base organique primaire sensiblement pur de péni- cilline peut être préparé suivant l'invention..
EXEMPLE 1.
2,5 m.u de sel sodique de pénicilline titrant 910 u.o/mg ont été dissoutes dans 32 ml d'eau saturée à 0 C de nitrate sodique Du chlorhydrate de cyclohexylamine en solution aqueuse à 50 % a ét ; additionné en quantité équivalents au double de la quantité de pénicilline présente . Le pH de la solution a été ajusté à 6 et la dite solution a été laissée au repos pendant une demi-heure avant d'être fil- trée. Le solide obtenu a été lavé à. l'aide de quelques mls
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d'une solution de nitrate sodique saturée.
Le solide humide a été chauffé légèrement avec 5 ml de chloroforme et la solution a été filtrée à travers un @ filtre ses, de manière à éliminer les quelques gout- tes de solution aqueuse présente , Au filtrat, on a ajouté 75 ml d'acétone. Après repos pendant une heuret dans un réfrigérateur, le mélange a été filtré . Une seconde récol- te a été récupérée en concentrant le filtrat sous pression; réduite et en le laissant cristalliser.
Le rendement était de 1,53 gr (première récolte) et de 0,1 gr (seconde récolte) de sel de cyclohexylamine de pénicilline sensiblement pur, Ce sel a été converti en sel modique de pénicilline , en l'agitant dans de l'eau glacée ( 1 partie par volume) et du chloroforme (2 parties) et en additionnant suffisamment d'acide phosphorique à 10 %, sous agitation, pour amene r le pH à 2,1. L'extrait au chloroforme a ét'é agité avec de l'eau et une solution N/I d'hydroxyde sodique pour amener le pH à 5,9 . Après séparation, le chloroforme a été agité en présente d'une nouvelle petite quantité d'eau et de solu- tion d'hydroxyde sodique, pour amener le pH à 7,4.
/ont/
Les solutions aqueuses / été séparée et séchée par congé- lation suivie de sublimation sous vide, le, solide résultant étant recristallisé dans l'acétone, dans lequel le sel so- dique de pénicilline pur a rapidement été séparé @en cristal- lisation EXEMPLE 2.
2 m.u de pénicilline ( 1.100 u.o/mg) dans 21,5 ml d'eau ont été sâturées de nitrate sodique à environ 0 C. A cette solution on a ajouté 1 ml de méthylcyclohexylamine préalable- ment neutralisée à l'aide d'acide chlorhydrique concentré.
Le mélange, qui avait un pH de 6,3 , a été laissé au repas pendant deux heures dans un réfrigérateur, avant d'être filtré . Le solide a été séché en le laissant séjourner une nuit dans un exsiccateur sous vide et a ensuite été lavé à
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l'aide d'acétone et à nouveau séché. Le poids de ce produit
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était de ,,b5 gr. produit a été dissous dans 15 ml de chloroforme chaud. La solution ainsi obtenue a été filtrée et .i5 ml de méthyléthylcét10ne ont été ajoutés. Apre:: re- froidissement pendant une demi-heure dans le ; éfr i3;érat E'ur , le mêlasse a été filtre et le solide a été levé à l'aide d'un peu de mévàiyléthylcétone et sé Qïié .
Lao sel de râét IV Icy- clohexylaar,ine de pénicilline recristallisé pesait 0,45 61'.
.-..MPLE 3.
20 m.u. de sa! sodique de pénicilline (1.100 u.o,/m ) dans 215 ml d'eau ont été saturées de chlorure sodique
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à environ 0 0. 20 mis de solution aqueuse à 50 % de chlorhydrate de oyclohexylemine gnt été ajoutés au mélange, qui avait un pH de 6.2. Ce mélange a été laissé au repas pendant 1 heure à environ 0 C. Il a ensuite été filtré sous vide et le solide a été soumis, au vide jusqu'à être aussi sec que possible. Le produit a été dissous dans 100 ml d'alcool éthylique et séparé par filtration des tracesjde chlorure sodique . 400 ml d'éther µ isopropylique ont été
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ajoutés, et le sel de cyçloàexylemine de pénicilline a rapi- dement cristallisé en aiguilles fines. Ce sel de pénicilline cristallisé a été filtré après être resté au repos pendant une demi-heure à environ -10 C.
Le filtrat a été évaporé sous vide jusqu'à siccité , le résidu a été dissous dans 30 ml
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de chloroforme et 80 ml de méthyléthyloétone ont été ajoutas.
Après refroidissement dans un mélange réfrigérant, on a filtré et le sel a été lavé à l'aide de méthyléthyloêtoae.
Les ^e.rr3em,eia.ts en sel de cyclohexylamine de pénicilline pur étaient de Ilt2 gr pour la première récolte et de ,8 gr pour la seconde récolte . ,24 de la pénicilline de départ restait dans la liqueur-mère aqueuse.