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PROCEDE POUR L'OBTENTION D'UNE SUBSTANCE ACTIVE PURE ET NOUVEAUX PRODUITS AINSI OBTENUS.
La présente ibvention est relative à l'obtention d'une substance active sous forme pure, à partir de plantes du genre Rauwolfia, en particulier à partir des racines de ces plantes, de préférence à partir de Rauwolfia serpentina Bentho, ainsi qu'à partir de Rauwolfia vomitoria Afz.ou de Rauwolfia inebrians.
A partir de Rauwolfia serpentina Benth., on a déjà isolé divers alcaloïdes, tels que l'ajmaline, l'ajmalinine, l'ajmalicine, la serpentine, la serpentinine l'isoajmaline, la néoajmaline et la rauwolfinineo
Il est en outre connu que l'on peut obtenir, à partir de plantes du genre Rauwolfia, en particulier à partir de racines de Rauwolfia serpentina Benth., des produits possédant un effet sédatif et hypotensif , qui peuvent être utilisés comme médicaments. Lorsqu'on sépare les alcalol- des de plantes du genre Rauwolfia, on obtient également des résines neutres que l'on appelle oléorésines, ayant une action sédative. Une substance active pure présentant ces propriétés n'a cependant pas pu être isolée jusqu'à présent.
La présente invention concerne un procédé permettant d'obtenir une substance active sous forme pure, exerçant un effet sédatif et hyonotique et abaissant la pression sanguine, caractérisé par le fait qu'à partir d'extraits de plantes du genre Rauwolfia qui exercent une action sédative et qu'on peut obtenir en utilisant des solvants faiblement ou non polaires miscibles à l'eau en partie seulement, l'on isole l'alcaloïde fondant à environ 263 (avec décomposition) et dont le pouvoir rotatoire spécifique [a]23D est de - 1180 (dans le chloroforme absolu). Cet alcaloïde peut être recristallisé dans l'acétone, dans un mélange de chloroforme et d'éther ou, de préférence, dans le méthanol .
Il est insoluble dans l'eau
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et dans l'éther de pétrole, moyennement soluble dans le benzène et dans l'éther ainsi que dans l'alcool et l'acétobe froids, et facilement soluble, par exemple, dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acide acétique à 10% et l'acide phosphorique.
L'analyse élémentaire fournit les valeurs suivantes : C- 65,07; 65,04; H = 6,62; 6,65; N = 4,64, 4,49% Son spectre d'absorption dans 1-'ultra-violet (dans l'éthanol) possède un maximum aplati à 215 mu (log ¼ environ 4,8), un maximum bien marqué à 269 mu (log . = 4,2 environ) et un épaulement s'y raccordant k 295 mu (logé, = 4,0 environ). Ce spectre présente un minimum à 246 mu (log . = 4,0 environ).
La partie des faibles longueurs d'ondes du spectre infra-roue se caractérise par les fortes bandes suivantes 2.92 ' 5,76 ; 5,83 ; 6,13 ; 6,28 ; 6,67 (dans le nujol) Sur la base des essais qui ont été faits, le composé examiné répond à la formule C33H40O9N2
Ce nouvel alcaloïde est une base faible qui forme des sels, par exemple un chlorhydrate difficilement soluble dans l'eau, d'un point de fusion approximatif de 2210 (avec décomposition), un nitrate d'un point de fusion approximatif de 2350 (avec décomposition) et un picrate d'un point de fusion approximatif de 186 . Il se dissout dans un excès d'acide acétique dilué avec formation de l'acétate.
L'alcaloïde ainsi caractérisé sera désigné dans ce qui va suivre par l'expression "réserpine". Il sera introduit dans le commerce sous la marque déposée "Serpasil". Ce produit peut être utilisé tel quel comme médicament ou peut être employé comme produit intermédiaire pour la préparation d'autres produits précieux.
Son efficacité pharmacologique est complexe. Il est essentiellement caractérisé par une action sédative et hypnotique forte et durable et provoque également un abaissement de la pression sanguine. De faibles doses suffisent pour plonger pour plusieurs heures les animaux dans un sommeil paisible, duquel ils peuvent être momentanément retirés. La réserpine stimule en outre les mouvements péristaltiques.
L'effet sédatif hypnotique et abaissant la pression sanguine font défaut aux alcaloïdes des plantes du genre Rauwolfia connus et isolés jusqu'à présent, par exemple à l'ajmaline, à la serpentine et à la serpen- tinine.
Par rapport aux préparations non unitaires utilisées jusqu'à présent, obtenues à partir de plantes du genre Rauwolfia, l'invention présente le grand avantage qu'avec la réserpine on peut indiquer la dose exactement nécessaire pour exercer une action déterminée. De plus, les préparations obtenues à partir du nouvel alcaloïde possèdent une action unitaire, tandis qu'il est connu, par exemple, que les plantes du genre Rauwolfia renferment aussi des substances ayant pour effet d'augmenter la pression sanguine.
Pour isoler la réserpine, on peut procéder de diverses manières, Il est avantageux de séparer les composants de l'extrait à utiliser conformément à l'invention au moyen d'un agent d'adsorption, de préférence par chromatographie sur un agent d'adsorption de force moyenne, par exemple sur un oxyde d'aluminium modérément actif, sur de l'acide silicique, sur un produit dénommé "Hyflo" (terre de diatomées), ou sur un autre silicate. La réserpine est éluée à l'aide de benzène, de mélanges d'éther de pétrole et de benzène ou de mélanges de benzène et d'acétone.
Elle cristallise spontanément en présence de peu d'acétone ou de méthanol et peut, par exem- ple, être davantage purifiée par recristallisation dans l'acétone chaude, dans l'éthanol, dans un mélange de chloroforme et d'éther ou,de préférence, dans le méthanol. Il est cependant également possible d'obtenir la réserpine sous forme pure en faisant cristalliser les extraits indiqués directement dans des solvants comme les alcools ou les cétones.. par exemple dans l'éthanol ou l'acétone, en premier lieu dans le méthanol.
Conformément à l'invention, on part en particulier d'extraits qui ont été obtenus à partir de racines de Rauwolfia serpentina Benth.,
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ainsi que de Rauwolfia vomitoria Afz ou de Rauwolfia inebrians. Comme sol- vants faiblement ou non polaires qui ne sont qu'en partie miscibles à l'eau, on utilise pour leur obtention de préférence des hydrocarbures halogènes, comme le chloroforme, le chlorure d'éthylène, le chlorure de méthylène ou le trichloréthylène, le benzène ou l'acétate d'éthyle, ainsi que leurs mélan- ges. On obtient des extraits précieux en opérant suivant les modes opéra- toires particuliers, décrits ci-après.
L'un de ces modes opératoires est caractérisé par le fait que l'on traite avec un mélange d'un solvant polaire et d'un solvant faiblement ou non polaire qui n'est que partiellement miscible à l'eau, au besoin en ajoutant de l'eau, des matériaux provenant de plantes du genre Rauwolfia ou un extrait obtenu à partir de ces plantes ayant une action sédative, de préférence une fraction résineuse (oléorésine) traitée de manière connue avec un solvant des lipoïdes comme l'éther, de pétrole, et avec un alcool.
On peut également ajouter à l'eau des bases, des acides ou des sels, comme l'ammoniaque, des acides inorganiques ou orgaiques comme l'acide chlorhydrique, l'acide phosphorique ou l'acide acétique, le carbo- nate de sodium, le bicarbonate de sodium, le biphosphate de potassium ou le bisulfate de potassiumo Des solvants polaires sont, par exemple, des alcools comme le méthanol, l'éthanol ou des alcools aliphatiqes supérieurs.
De préférence, on procède en extrayant avec le mélange indiqué, puis en séparant la solution obtenue en deux phases, par addition d'eau. Il est cependant également possible de répartir la substance de départ entre d'une part un mélange d'eau et d'un solvant polaire et d'autre part un solvant faiblement ou non polaire qui n'est miscible qu'en partie avec le mélange employé. De préférence, cette répartition a lieu en plusieurs stades de séparation, au moins en six stades de séparation. Des fractions obtenues avec des solvants faiblement ou non polaires on peut évaporer le solvant, et traiter directement le résidu conformément au procédé pour'obtenir de la réserpine ou le soumettre de nouveau aux opérations ci-dessus.
Pour ce mode opératoire, comme pour ceux qui seront indiqués ci-après, on utilise par exemple des matériaux finement broyés provenant de plantes du genre Rauwolfia, en particulier de racines de Rauwolfia serpentina Benth., ainsi que de Rauwolfia vomitoria Afz ou de Rauwolfia inebrians,ou de l'un de leurs extraits alcooliques bruts évaporés à sec, par exemple d'extraits méthanoliques, ayant été avantageusemert malaxés avec del l'eau qui est ensuite éliminée ou bien encore on utilise un extrait qui n'est que partiellement évaporé, mélangé le cas échéant avec un solvant des lipoïdes, comme 1-'éther, l'éther de pétrole ou l'hexane. Les fractions dites résineuses ("oléorésines")
peuvent être obtenues par exemple de la façon suivante
On évapore à sec un extrait alcoolique brut de matériaux finement broyés de plantes du genre Rauwolfia, puis on malaxe avatageuseement le résidu avec de l'eau; le produit insoluble ainsi obtenu est ensuite traité avec de l'acide chlorhydrique binormal, séché, puis extrait en continu avec un solvant des lipoïdes comme l'éther de pétrole;
le produit brun qui reste est traité avec de l'éthanol à 95%, et la solution brune obtenue par essorage est évaporée à seco
Un autre mode opératoire particulier pour l'obtention d'un extrait à utiliser conformément à l'invention consiste à traiter des maté- riaux de plantes du genre Rauwolfia, ou un extrait à action sédative obtenu à partir de ceux-ci, avec un agent acide aqueux, ce qui donne lieu à la formation d'une solution ayant une action sédative, puis à extraire cette dernière avec un solvant faiblement ou non polaire, qui n'est que partiellement miscible à l'eau.
Suivant ce mode opératoire, on extrait donc la matière de départ avec un agent acide aqueux, en patticulier avec la solution aqueuse d'un acide gras inférieur tel que l'acide formique, l'acide acétique, l'acide propionique, ou un acide phosphorique ou la solution aqueuse d'un sel acide d'un acide polybasique. La solution acide ainsi obtenue ayant une
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action sédative peut, en vue du traitement ultérieur, soit être concentrée à un petit volume ou être diluée à l'eau, ou bien être conservée telle quelle.
Cet extrait est ensuite soumis à plusieurs reprises à une extraction avec un solvant faiblement ou non polaire qui n'est qu'en partie miscible à l'eau, de préférence avec un hydrocarbure halogéné, comme le chloroforme, le chlorure d'éthylène, le chlorure de méthylène ou le trichloréthylène, ou d'autre part avec du benzène ou de l'acétate d'éthyleo L'extrait ainsi obtenu à l'aide du solvant faiblement ou non polaire peut être lavé jusqu'à neutralité et être évaporé à sec. A partir du résidu, on peut alors, conformément au procédé, isoler la réserpine.
Pour la préparation d'un bon extrait, on peut également, à n'importe quel stade du mode opératoire par lequel il a été obtenu, par exemple suivant les modes opératoires décrits ci-dessus, mélanger un extrait débarrassé du solvant, par exemple un extrait obtenu avec du méthanol à partir de racines, avec une substance de supports par exemple avec les produits connus dans le commerce sous le nom de "Hyflo" ou de "Clarcel DIC" (terre de diatomées) ou avec un autre silicate, ou en adsorbant la réserpine sur une substance de support, à partir d'une solution, par exemple à partir d'un extrait acide obtenu suivant le mode opératoire indiqué ci-dessus, par exemple à partir d'un extrait acétique, de préférence après la formation de ses sels difficilement solubles, par exemple après formation du chlorhydrate ou de l'azotate de réserpine,
puis en exécutant les stades du procédé qui restent encore à effectuer. La substance active peut être ainsi extraite de la substance de support, par exemple avec l'un des agents acides aqueux mentionnés ou alors à l'aide d'un mélange d'un solvant polaire et d'un solvant faiblement ou non polaire.
Suivant le mode opératoire employé, on obtient la réserpine spas forme de base ou sous forme de ses sels. A partir de la base on peut former des sels thérapeutiquement utilisables, comme ceux des hydracides halogénés, des acides sulfurique, azotique, perchlorique, phosphoriques, formique, acétique, propionique, lactique, oxalique, succinique, malique, tartrique, citrique, ascorbique, méthane=sulfonique, éthanesulfonique, hydroxy-éthane-sulfonique, benzoique salicylique, para-amino-salicylique ou toluène-sulfonique, en faisant réagir la réserpine avec de tels acides, en présence ou en l'absence d'agents de dilution. Ces sels peuvent aussi être obtenus par double décomposition.
C'est ainsi, par exemple, qu'à partir d'une solution d'acétate de réserpine, ses sels plus difficilement solubles, par exemple ceux des hydracides halogènes,, précipitent lorsqu'on ajoute les acides correspondants.
L'invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé ci-dessus défini. Ils peuvent aussi être utilisés comme produits intermédiaires.
L'invention sera décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent. Entre chaque partie en poids et chaque partie en volume il y a le même rapport que celui existant entre le gramme et le centimètre cube. Les températures sont indiquées en degrés centigrades,*
Exemple 1.
On soumet 200 parties en poids "d'oléorésine" préalablement purifiée à une répartition suivant le principe du contre-courant, entre un mélange de 50% de méthanol et 50% d'eau comme phase supériere en équilibre avec du chloroforme comme phase inférieure. On a trouvé qu'il se pro- diaisait une séparation suffisante pour des buts pratiques en répartissant 200 parties en poids de l'oléorésine, dans 6 entonnoirs à séparation, entre chaque fois 2000. parties en volume de la phase supérieure et 2000 parties en volume de la phase inférieure. Les 12 phases (pH.) résultant de la répartition dans les 6 entonnoirs à séparation (e.s.
I à VI) peuvent être rassemblées en 6 fractions présentant les propriétés données au tableau ci-dessous
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EMI5.1
<tb>
<tb> Poids <SEP> en <SEP> Action
<tb> Fractions <SEP> moyenne <SEP> en <SEP> Couleur <SEP> sédative
<tb> parties
<tb> en <SEP> poids
<tb> 1 <SEP> (phosupérieure, <SEP> 75 <SEP> à <SEP> 80 <SEP> brun-noir <SEP> très <SEP> faible
<tb> e:s. <SEP> I)
<tb> 2 <SEP> (phosupérieure <SEP> 45 <SEP> à <SEP> 50 <SEP> brun <SEP> faible
<tb> e.s. <SEP> II <SEP> et <SEP> III)
<tb> 3 <SEP> (ph.inférieure;
,
<tb> e.s.I,II <SEP> et <SEP> III) <SEP> 10 <SEP> brun-clair <SEP> faible
<tb> 4 <SEP> (phosupérieure <SEP> et
<tb> inférieure, <SEP> e.s.IV) <SEP> 15 <SEP> à <SEP> 20 <SEP> brun-clair <SEP> faible
<tb> 5 <SEP> (phosupérieure
<tb> e.s. <SEP> V <SEP> et <SEP> VI) <SEP> 15 <SEP> brun-clair <SEP> faible
<tb> 6 <SEP> (ph.inférieure,
<tb> e.s. <SEP> V <SEP> et <SEP> VI <SEP> ) <SEP> 35 <SEP> à <SEP> 40 <SEP> brun-vert <SEP> forte
<tb> 200 <SEP> parties
<tb> en <SEP> poids.
<tb>
La fraction 6 trouvée active est purifiée davantage par chromatographie sur de l'oxyde d'aluminium. On utilise avantageusement, à cet effet, de l'oxyde neutre d'aluminium d'un degré d'activité de II - III (selon Brockmann). On dissout 34 parties en poids de la fraction 6 dans 400 parties en volume de benzène, ajoute 100 parties en volume d'éther de pétrole, ce qui fait qu'une partie de la substance flocule, et fait passer le tout sur une colonne de 800 parties en poids d'oxyde d'aluminium.
On élue ensuite avec un mélange d'éther de pétrole et de benzène dans un rapport volumétrique de l:4, le cas échéant sous pression, ce qui produit tout d'abord l'élution d'une huile jaune-clair inactive, puis celle de 0,6 parties en poids d'une fraction cristalline inactive d'un point de fusion de 238 à 239 , et finalement celle d'une substance présentant une action sédative, accompagnée d'un colorant rouge;, On remplace alors le premier mélange de solvants successivement par du benzène et par un mélange de benzène et d'acétone dans le rapport volumétrique de 2:1; ce qui fait que le dernier reste de la matière active est éliminé de la colonne. Les fractions d'éluats sont, après concentration, additionnées d'un peu d'acétone et donnent en général au bout de peu de temps un produit cristallin.
Par essorage et lavage avec un mélange de parties égales en volume d'acétone et d'éther, et avec de l'acétone, on peut facilement isoler la substance cristallisée. On obtient de 4,5 à 5 parties en poids d'un cristallisât brut d'un point de fusion d'environ 250 . La purification qui suit consiste à recristalliser le produit dans de l'acétone chaude ou dans un mélange de chloroforme et d'éther; on obtient ainsi une réserpine presque incolore, d'un point de fusion de 262 à 2630 (avec décomposition); [[alpha]]23D = -118 (dans le chloroforme ).
L'obtention de la réserpine cristallisée à partir de la fraction 6 peut aussi avoir lieu par une nouvelle répartition à contre-courant.
On peut ainsi répartir à contre-courant par exemple 29,7 parties en poids du résidu obtenu à partir de la fraction 6, dans huit entonnoirs à séparation, entre chaque fois 500 parties en volume d'un mélange de 60% de benzène et de 40% d'hexane comme phase supérieure, en équilibre avec chaque fois 500 parties en volume d'un mélange de 80% d'éthanol et de 20% d'eau comme phase inférieure. A partir de la fraction obtenue par réunion des phases supérieures des entonnoirs à séparation No. 2,3 et 4. on peut isoler la réserpine cristallisée, en opérant d'une manière analogue à celle donnée ci-dessus.
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On obtient la matière de départ de la façon suivante
Avec 20000 parties en volume environ de méthanol ou d'éthanol, on percole 4000 parties en poids d'écorce de racines finement broyée de Rauwolfia serpentina Benth. Jusqu'à ce que le réactif de Mayer pour les alcaloïdes ne fournisse plus qu'une indication faiblement positive. L'extrait méthanolique est alors évaporé à sec sous vide et le résidu pesant de 500 à 600 parties en poids est malaxé à plusieurs reprises avec de l'eau, pour éliminer les fractions solubles dans l'eau.
Le résidu insoluble est ensuite malaxé à plusieurs reprises avec de l'acide chlorhydrique dilué pour éliminer les fractions basiques résiduelles, puis lavé à l'eau et séchéo La fraction insoluble qui reste, dénommée "oléorésine", est ensuite, en vue d'une purification préalable, extraite avec de l'éther de pétrole Jusqu'à épuisement puis la poudre brune qui reste est agitée pendant plusieurs heures avec 2000 parties en volume environ d'éthanol à 95% 80 à 90% de la matière passent en solution. Après essorage, la solution brunfoncé est évaporée à sec et l'on obtient environ 200 parties d'oléorésine préalablement purifiée.
Exemple 20
On extrait à trois'reprises 1000 parties en poids de racines broyées de Rauwolfia serpentina Benth. avec 3000 parties en volume d'un mélange de 2100 parties en volume de chloroforme et de 900 parties en volume de méthanol, en agitant (et à la. troisième reprise en chauffant à 60 ), et sépare chaque fois la solution d'extraction de la poudre de racines par essorage et lavage du résidu avec 500 parties en volume du mélange indiqué ci-dessus.
Les solutions d'extraction sont ensuite traitées séparément ou en combinaison. On ajoute, à cet effet, à 1000 parties en volume de solution d'extraction, 600 parties en volume d'eau et une quantité suffisante d'une solution saturée de bicarbonate de sodium pour que le pH soit de 8,5 à 9, puis agite le tout soigneusement. On sépare les deux phases dans l'entonnoir à séparation. Les phases inférieures réunies (chloroforme) sont lavées avec 300 à 400 parties en volume d'une solution à 2 - 3% de chlorure de sodium. Les phases supérieures réunies (eau/méthanol) sont encore extraites avec 200 parties en volume de chloroforme, cette seconde solution chloroformique d'extraction étant traitée par la solution à 2 - 3% de chlorure de sodium mentionnée ci-dessus.
Les solutions chloroformiques d'extraction réunies sont séchées sur du sulfate de sodium et évaporées sous vide à sec.
On dissout à chaud, dans 100 parties en volume de méthanol sec, le produit obtenu par extraction au chloroforme, pesant de 25 à 30 parties en poids, laisse reposer quelque temps, essore le produit cristallin qui s'est séparé et lave avec un peu de méthanol le gâteau cristallin.
Les filtrats méthanoliques réunis sont concentrés à un volume de 50 à 60 parties. S'il s'est séparé un peu d'un produit visqueux, on le remet en solution en chauffant légèrement, puis on laisse reposer plusieurs jours en vue de la cristallisation.
On essore ensuite le cristallisât et le lave avec du méthanol.
En vue de sa purification, on extrait à plusieurs reprises le cristallisât avec chaque fois 10 à 20 parties en volume d'acide acétique binormal. Après avoir refroidi avec de la glace à environ 5 les solutions d'extraction réunies, claires, on précipite le chlorhydrate, en ajoutant un dixième du volume d'acide chlorhydrique concentré que l'on introduit lentement dans la solution, en agitant vigoureusement. On continue à agiter pendant 30 à 40 minutes environ, essore, lave avec de l'eau et élimine le liquide aussi complètement que possible, en faisant passer de l'air.
On met le résidu en suspension dans 15 parties en volume d'acétone, essore, lave avec peu d'acétone puis avec de l'éther et sèche en faisant passer de l'air; on obtient le chlorhydrate de la réserpine presque incolore sous une forme très fine.
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Pour libérer la base, on dissout le chlorhydrate dans la quantité minimum d'un mélange de 7 parties- en volume de chloroforme et de 3 parties en volu- me de méthanol. A la solution, on ajoute 6 parties en volume d'eau et une solution de bicarbonate jusqu'à ce que le pH soit de 9 environ, agite, sé- pare les phases, lave ensuite de la manière décrite ci-dessus, sèche et évapore. Le résidu amorphe d'évaporation est dissout par chauffage dans une quantiré égale à double de méthanol, la réserpine cristallisant alors presque instantanémento Après avoir laissé reposer pendant plusieurs heures, on sépare la base pure par essorage.
EXEMPLE 3.
Avec environ 35000 parties en volume de méthanol, on percole
7000 parties en poids de poudre d'écorce de racines de Rauwolfia serpentina
Bentho Après évaporation de l'extrait méthanolique, on obtient environ 1050 parties en poids d'un produit pulvérulent foncé que l'on traite à plusieurs reprises avec de l'eau pour éliminer les fractions solubles. Le résidu insoluble est malaxé à cinq reprises avec chaque fois 1500 parties en volu- me d'une solution aqueuse à 10% d'acide acétàque, la solution étant séparée du résidu visqueux avantageusement par centrifugation. La solution acéti- que brune qui, pour son traitement ultérieur, peut être réduite à basse température à un volume plus petit ou bien être diluée avec la moitié de son volume d'eau, possède un pH d'environ, 3,9.
Cette solution est agitée avec 3500 à 4000 parties en volume de chloroforme, divisées en 3 à 4 portionso Les extraits chloroformiques sont lavés une fois avec une solution de carbonate de potassium et deux fois avec de l'eau, séchés sur du sulfate de sodium et évaporés à sec sous vide. Le résidu pesant de 70 à 80 parties en poids est une poudre colorée en brun verto Pour purifier se produit davantage il est dissous dans du benzène et la solution est daromatographiée sur 1000 à 1200 parties en poids d'oxyde neutre d'aluminium (activité IIIII selon Brockmann). Lors de l'élution avec du benzène, on obtient tout d'abord une petite quantité d'une huile jaune et 0,9 partie en poids d'un produit cristallin inactif, d'un point de fusion de 238 à 239 ; la substance ayant une action sédative est séparée ensuite.
Après avoir élue la quantité principale de la substance active, on continue d'éluer avec un mélange de 2 parties en volume de benzène et de 1 partie en volume d'acétone. De cette manière on obtient encore le reste du principe sédatif, puis un autre cristallisât inactif, d'un point de fusion de 141 à 143 . Les fractions d'éluat renfermant la substance à action sédative sont évaporées à sec.
En faisant recristalliser le résidu dans de l'acétone chaude ou dans unmmélange de chloroforme et d'éther, on obtient 6,5 à 7 parties en poids de réserpine sous la forme de cristaux presque incolores, d'un point de fusion de 262 à 2630 (avec décomposition); [a] 23=- 1180 (chloroforme)
Dans l'exemple ci-dessus, l'acide acétique à 10% peut être remplacé par exemple par de l'acide phosphorique à 2%.
EXEMPLE 4.
On percole avec du méthanol, comme il a été décrit à l'exemple 1, 7000 parties en poids de poudre d'écorce de racines de Rauwolfia serpentina Benth, évapore la solution à sec et malaxe le résidu avec de l'eauo Le produit qui reste alors est malaxé à trois reprises avec chaque fois 1100 parties en volume d'une solution aqueuse à 15% d'acide acétique, puis on sépare la solution du produit visqueux insoluble, par centrifugation ou filtration. Les extraits acétiques réunis sont ensuite dilués avec la moitié de leur volume d'eau et agités avec 3000 à 3500 parties en volume de chloroforme divisées en 3 à 4 fractionso Les extraits chloroformiques sont ensuite traités comme indiqué à l'exemple 1. On obtient ainsi environ 7à 7,5 parties en poids de réserpine cristallisée.
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EXEMPLE 5.
Dans 12000 parties en volume d'acide acétique à 15%, on met en suspension 2000 parties en poids de poudre d'écorce de racines de Rauwolfia serpentina Benth et agite intensément pendant 15 heures. On sépare ensuite la solution acide d'extraction du résidu,, avantageusement au moyen d'une centrifuge appropriée. On obtient de cette façon environ, 8000 parties en volume d'une solution brun-foncé (extrait A). On répète encore deux fois l'extraction de la même manière, en utilisant chaque fois 9000 parties en volume d'une solution aqueuse à 15% d'acide acétique, ce qui donne chaque fois 8000 à 9000 parties en volume de solution d'extrait (extrait B et C).
Chacune des trois solutions d'extrait de 8000 parties en volume environ est diluée avec 4000 parties d'eau et avantageusement agitée séparément avec environ 8000 parties en volume de chloroforme, divisées en 3 à 4 fractions. La quantité de chloroforme utilisée pour l'extraction peut être notablement diminuée si par exemple le second extrait chloroformique de l'extrait A est encore utilisé pour la première extraction de l'extrait B, ou bien si le troisième extrait chloroformique de l'extrait A est utilisé pour la seconde extraction de l'extrait B et ensuite pour la première extraction de l'extrait C. Les extraits chlorofôrmiques sont lavés avec du carbonate de potassium ou avec une solution de carbonate de sodium et avec de l'eau, séchés sur du sulfate de sodium et évaporés à sec sous vide.
Le résidu pesant de 45 à 50 parties en poids est, en vue d'une nouvelle purification et comme décrit à l'exemple 1, chromatographié sur 700 à 800 parties en poids d'oxyde d'aluminium. On obtient ainsi environ 2,5 parties en poids de réserpine cristallisée.
EXEMPLE 6.
On humecte avec 1000 parties en volumede méthanol 1000 parties en poids de racines broyées de :Rauwolfia serpentina Benth et on procède à trois ou quatre reprises à leur extraction avec chaque fois 2000 parties en volume de méthanol, en agitant pendant 10 à 16 heures,, et en essorant chaque fois. A partir de la seconde extraction, on chauffe avantageusement à une température d'environ 65 .
On mélange 100 parties en poids de l'extrait méthanolique éva- poré avec 70 parties en poids d" "Hyflo" Super Cel et humidifie avec 100 parties en volume d'acide acétique à 15%. On extrait ensuite le mélange, à trois ou quatre reprises;, avec chaque fois 150 parties en volume d'acide acétique à 15%, en triturant, en essorant et en lavant le résidl avec 100 parties en volume diacide acétique à 15%. Les extraits acétiques réunis sont extraits avec au total 750 parties en volume de chlorofome, la solution d'extraction est lavée à l'eau, séchée sur du sulfate de sodium et évaporée à sec sous vide; on obtient ainsi 20 parties en poids de résidu. Le résidu chloroformique ci-dessus est dissous à 30 à 40 dans 200 parties en volume de benzène, et le résidu insoluble est séparé par filtration.
Le filtrat est directement chromatographié comme on l'a indiqué dans les exemples 1 et 3, ou il est évaporé à sec sous vide et le résidu (5,2 parties en poids) est cristallisé dans une quantité égale à double de méthanol, en laissant reposer la solution chaude assez longtemps, pour que la cristallisation se produise complètement. On obtient ainsi la réserpine sous forme pure.
EXEMPLE 7.
On extrait, en remuant, 100 parties en poids de l'extrait méthanolique sec décrit à l'exemple 6 avec un mélange de 210 parties en volume de chloroforme et de 90 parties en volume de méthanol. On extrait ensuite une seconde fois en triturant avec la moitié du volume du mélange indiqué ci-=dessus. Les solutions d'extraction réunies sont agitées avec 270 parties en volume d'eau et une quantité suffisante d'une solution saturée de bicarbonate de sodium pour que le pH soit de 8,5 à 9; le mélange se sépare en deux phases. Si l'on continue à procéder de la manière décrite à l'exem-
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ple 2, on obtient à partir de la solution chloroformique 28 parties en poids d'extrait sec. 'On fait cristalliser ce dernier dans le méthanol et obtient ainsi la réserpine sous forme pure.
EXEMPLE 80
On extrait de la manière indiquée à l'exemple 5, 1000 parties en poids de racines broyées de Rauwolfia serpentina Benth. avec 10000 par- ties en volume d'acide acétique à 15%. A 8500 parties en volume de la solution acétique d'extraction, on ajoute en agitant bien, tout d'abord 60 parties en poids d' "Hyflo" Super Cel et ensuite successivement 70 parties en poids de nitrate de sodium et 700 parties en poids de chocrure de sodium.
On éteint 160 parties en poids de chaux vive et ajoute la chaux éteinte par petites portions à la solution. Finalement on continue d'agiter pendant une heure, puis on essore le mélange à travers un tissu à filtrer. Le gâ- teau de filtration essoré est lavé avec 200 à 300 parties en volume d'une solution saturée de chlorure de sodium et avec 100 parties en volume d'eau, puis séché sous vide sur du pentoxyde de phosphore.
On extrait, en remuant, 160 parties en poids du résidu sec avec un mélange de 350 parties en volume de chloroforme et de 150 parties en volume de méthanol, essore et lave le résidu avec 400 parties en volume du même mélange. Le résidu est ensuite extrait une seconde fois avec 400 parties en volume du mélange et lavé avec 100 parties en volume de ce mélan- geo A chaque portion de 500 parties en volume de la solution d'extraction, on ajoute chaque fois 300 parties en volume d'eau et une quantité suffisante d'une solution saturée de bicarbonate de sodium pour que le pH soit de 8, 5 à 9, agite et sépare les deux phases. Les phases inférieures réunies (chloroforme) sont encore lavées avec 200 parties en volume d'une solution à 2-3% de chlorure de sodium.
Les phases supérieures réunies (eau/méthanol) sont ensuite extraites avec 100 parties en volume de chlorofame, cette se- conde phase chloroformique étant ensuite également traitée par la solution précitée à 2-3% de chlorure de sodium. Les extraits chlorofarmiques réunis sont sèches sur du sulfate de sodium et évaporés à sec sous vide. On fait cristalliser le résidu dans le méthanolde la manière décrite à l'exemple 2 ou 60 La réserpine brute peut être transformée en base pure en passant par le chlorhydrate.
EXEMPLE 9.
On percole 20000 parties en poids d'écorce broyée de racines de Rauwolfia inebrians avec 1000000 parties en volume de méthanol. Après évaporation de l'agent d'extraction, on obtient une poudre brune que l'on malaxe à plusieurs reprises avec de l'eau pour éliminer les fractions solubles dans l'eau. On malaxe ensuite le résidu insoluble avec de l'acide chlorhydrique dilué, pour éliminer les fractions basiques, lave à l'eau et sèche. La fraction insoluble qui reste, finement broyée, est tout d'abord purifiée par extraction avec de l'éther de pétrole jusqdà épuisement, puis on agite la poudre brune qui reste pendant plusieurs heures avec environ 3000 parties en volume d'alcool à 95%. Dans cette opération, 80 à 90% de la matière passent en solution.
Après essorage, la solution brun-foncé est évaporée à sec et l'on obtient 710 parties en poids d'un extrait préalablement purifié. Cet extrait est soumis à une réparation entre un mélange de 50% de méthanol et de 50% d'eau comme phase supérieure, en équilibre avec du chlorforme comme phase inférieure. On obtient une séparation satisfaisant à des buts pratiques lorsqu'on répartit 200 parties en poids de l'extrait en 6 entonnoirs à séparation, entre chaque fois 2000 parties en volume de la phase supérieure et 2000 parties en volume de la phase inférieure. Les phases obtenues de cette manière sont, conformément au schéma indiqué à l'exemple 1, rassemblées en 6 fractions.
La fraction 6 trouvée active est encore purifiée par chromatographie sur de l'oxyde d'aluminiumo A cet effet, on en dissout 91 parties en poids dans du benzène et chromatographie la solution sur une colonne de 1500 parties en poids d'oxyde d'aluminiumo On élue alors avec du benzène et des
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mélanges de benzène et d'acétone, évapore les éluats et cristallise les réaidus dans de 19 acétone La base ainsi obtenue est identique à la résêr- pine isolée à partir'de Rauwolfia serpentina Benth. Les chiffres d'analy- se par combustion sont les suivants :
C = 65,00 H = 6,82 N = 4,63%
EXEMPLE 10
On percole avec 70000 parties en volume de méthanol 9500 parties en poids de racines broyées de Rauwolfia vomitoria Afz.
Ares distillation de l'agent d'extraction, on obtient 800 parties en poids d'une poudre brune, que l'on mélange intimement avec 600 parties en poids d'"Hyflo" (Super Cel) et que l'on extrait à plusieurs reprises à l'eau pour éliminer les fractions solubles dans l'eauo Le résidu insoluble est alors humidifié avec 1000 parties en volume d'acide acétique à. 15% et extrait à trois reprises avec chaque fois 1500 parties en volume diacide acétique à 15%.
Dans cette opération, on essore chaque fois et lave ensuite le résidu avec 500 parties en volume d'acide acétique à 15% On réunit les solutions acétiques puis on traite le tout une fois avec 2500 parties en volume de chlorure d'éthylène et à deux autres reprises avec chaque fois 1500 parties en volume de chlorure d'éthylène)) puis on lave les solutions d'extaction réunies avec une solution de carbonate de potassium et deux fois avec de l'eauo On sèche ensuite sur du sulfate de sodium et évapore à sec sous vide; le résidu ainsi obtenu est de 45 parties en poids.
A partir de ce dernier,, en opérant comme on l'a indiqué à l'exemple 4, on obtient, par chromatographie sur de l'oxyde d'aluminium et par cristallisation dans le méthanol, une base qui s'avère identique à la réserpine obtenue à partir de Rauwolfia serpentina Benth. Les valeurs de l'analyse par combustion sont les suivantes C = 65,24 ; H = 6,55; N=4,66%.
EXEMPLE 11.
On extrait 1000 parties en poids de racines broyées de Rauwolfia serpentina Benth, comme on l'a décrit à l'exemple 1,avec 7000 parties en volume d9éthanol à 95%, traite avec de l'eau et de l'acide chlorhydrique dilué, sèche, extrait dans un appareil Soxhlet avec de l'éther de pétrole et reprend finalement dans 400 à 500 parties en volume d'éthanol chaud à 95% A la fraction soluble dans l'alcool, on ajoute 5 partie en .-'poids de sciure de bois, concentre le mélange sous vide et finalement le sèche sous un vide poussé pendant assez longtemps.
Dans un appareil de Saxhlet, on extrait pendant 8 heures, avec de l'éther, 12 parties en poids du produit sec obtenu-ci-dessus (jusqu'à ce que la solution soit incolore). On évapore la solution d'extraction ce quifournit 0,5 Dartie en poids d'un résidu qui cristallise dans 33 méthanol et présente un point de fusion de 81 à 83 , c'est-à-dire n'est pas identi- que à la réserpine. Le résidu de ce qui reste après cette première extraction est ensuite extrait au chloroforme pendant 38 heures, dans le même appareil (jusqu'à ce que la solution soit incolore), le solvant étant renouvelé deux fois. Après évaporation de la solution d'extraction, on obtient un résidu de 3,3 parties en poids.
Ce résidu est chromatographié, comme décrit dans l'exemple 3, sur de l'oxyde d'aluminium. A partir des éluats (mélanges de benzène et d'acétone), on obtient alors une faible quantité de réserpine. Le résidu d'extraction est ensuite extrait, de la même manière, pendant 38 heures, avec de l'acétate d'éthyle, le solvant étant renouvelé deux foiso Après évaporation de la solution d'extraction, on obtient un résidu de 1,2 partie en poids. Ce résidu est chromatographie, d'une manière analogue, sur de l'oxyde d'aluminium, de sorte qu'à partir des éluats on isole de la réserpine.
EXEMPLE 12.
Avec 8500 parties en volume de méthanol, on percole 1750 par-
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ties en poids d'écorce de racines de Rauwolfia serpentina Benth. Après é- vaporation de la solution d'extraction, on obtient 264 parties en poids d'une résine brun-foncé que 1'on malaxe à plusieurs reprises avec de l'eau pour éliminer la fraction soluble. Le résidu ainsi obtenu est alors-- malaxé à cinq reprises avec chaque fois 350 parties en volume d'acide phosphori- que demi=normal et les extraits acides réunis sont extraits 4 fois avec chaque fois 400 parties en volume de chloroforme. La solution chloroformi- que est lavée avec une solution de carbonate de potassium et avec de l'eau, séchée sur du sulfate de sodium et évaporée sous vide jusqu'à dessication.
Le résidu de 8 parties en poids est chromatographié sur 100 parties en poids d'oxyde d'aluminium et l'on fait cristalliser la réserpine obtenue à partir des éluats, dans de l'acétone.
EXEMPLE 13.
On extrait pendant 24 heures, à reflux,, 1000 parties en poids de racine broyées de Rauwàlfia serpentina Benth avec 4000 parties en volume de chlorure d'éthylèneo On réduit la solution d'extraction à un volume de 500 parties, sous pression réduite, et y ajoute 100 parties en poids d'"Hyflo" (Super Cel) et 300 parties en volume d'eauo On élimine ensuite complètement, sous vide, le chlorure d'éthylène, essore le mélange résiduel et le lave encore à l'eauo Le résidu insoluble est à nouveau malaxé avec de l'acide acétique binormal et les solutions acétiques réunies sont extrai- tes avec du chloroforme à trois reprises.
Les extraits chloroformiques réu- nis sont lavés avec une solution de bicarbonate de sodium étalée de l'eau, séchés sur du sulfate de sodium et évaporée à sec sous vide. On fait cristalliser dans le méthanol les 6,9 parties en poids du résidu que l'on obtient ainsi, purifie la base en passant par le chlorhydrate, et obtient ainsi la réserpine sous forme pure.
EXEMPLE 14
On chauffe pendant 20 heures@à reflux 1000 parties en poids de racines broyées de Rauwolfia serpentina Benth avec 2000 parties en volume d'un mélange azéotropique bouillant à 61 formé de 57,1% en volume de chlorure d'éthylène et de 42,9% en volume de méthanol. On ajoute à la solutioh d'extraction 1600 parties en volume d'eau et une quantité suffisante d'une solution saturée de bicarbonate de sodium pour que le pH soit de 8 environ. On sépare les deux phases qui se forment et les lave ensuite comme on l'a décrit à l'exemple 2. On sèche alors la phase chlorure d'éthylè- ne sur du sulfate de sodium et l'évapore sous vide jusqu'à dessicationo On fait cristalliser le résidu , 29,8 parties en poids, dans 45 parties en volume de méthanol.
On peut transformer le cristallisât brut en la base pure en passant par le chlorhydrate.
A partir de la réserpine obtenue suivant ce mode opératoire, on peut préparer ses sels, par exemple le nitrate, de la façon suivante
On dissout 1 partie en poids de réserpine dans 80 à 100 parties en volume d'acide acétique binormal, et, tout en refroidissant à la glace et en agitant bien, on ajoute par portions 8 à 10 partis en volume d'acide azotique à 30% On agite encore un certain temps à froid, puis on essore le cristallisât. Le résidu de filtration est lavé tout d'abord à l'eau, puis avec de l'acétone, et séché dans un dessicateur à vide sur de l'hydroxyde de potassiumo En dissolvant le produit sec dans beaucoup de méthanol chaud et en ajoutant une quantité triple à quinbaple d'éther, on peut faire recristalliser l'azotate de réserpine.
Il se présente sous la forme d'aiguilles incolores et fond en se décomposant, à environ 235 .
On peut cependant parvenir également au même sel en partant directement de la base, en dissolvant par exemple 1 partie en poids de réserpine dans 5 à 7 parties en volume de chloroforme exempt d'acide et en préparant une fine écume de réserpine en évaporant aussitôt sous vide.
Si 1'on ajoute à cette écume une quantité d'acide azotique correspondant
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à la quantité calculée ou un excès, par exemple en solution alcoolique, et que l'on chauffe brièvement le mélanges, on obtient alors l'azotate de réserpine sous forme cristalline.
De la même façon, on peut obtenir aussi les sels de l'acide chlorhydrique (fondant à 2210 environ, avec décomposition), de l'acide sulfurique (fondant à 244 environ, avec décomposition), de l'acide perchlorique (fondant à 239 environ, avec décomposition) de l'acide méthane-sulfonique (d'un point de fusion peu net commengant à 190 ), de l'acide picrique (fondant à 1860 environ) et de l'acide oxalique (fondant à 2060 environ, avec décomposition)o
Les sels d'acides faibles, par exemple de l'acide salicylique, de l'acide ascorbique, de l'acide citrique, de l'acide maliqu de l'acide succinique ou de l'acide tartrique sont obtenus par exemple en dissolvant des quantités équimoléculaires de la base et de l'acide, séparément, dans un solvant faiblement polaire, comme le chloroforme ou l'acétone,
en réunissant les solutions et en évaporant à sec. On fait cristalliser les sels dans un mélange d'éther avec un peu d'acétate d'éthyleo
La réserpine obtenue suivant les exemples ci-dessus ainsi que ses sels peuvent être traités de manière usuelle pour obtenir des préparations pharmaceutiques pour applications buccales ou parentérales. C'est ainsi qu'on peut préparer, par exemple, une tablette de la composition suivante g
EMI12.1
<tb>
<tb> 1. <SEP> réserpine <SEP> 0,5 <SEP> mg
<tb> 2. <SEP> lactose <SEP> 53,0 <SEP> mg
<tb> 3. <SEP> gélatine <SEP> 1,0 <SEP> mg
<tb> 40 <SEP> amidon <SEP> 40,0 <SEP> mg
<tb> 5. <SEP> stéarate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 0,3 <SEP> mg
<tb> 6. <SEP> talc., <SEP> 5,2 <SEP> mg
<tb> 100,0mg
<tb>
A cet effet, on forme un mélange homogène avec les produits indiqués sous 1 et 2.
Avec une partie du produit indiqué sous 4 et avec le produit indiqué sous 3, on prépare un empois d'amidono On mélange ce dernier avec le mélange de 1 et de 2 et avec le reste de 4 pour obtenir une masse homogène humide, la granule et la sèche. Ensuite on ajoute les produits 4 et 6 et fabrique des tablettes avec le mélange ainsi obtenu.
REVENDICATIONS.
1) Un procédé pour l'obtention d'une substance active pure, caractérisé par le fait qu'à partir d'extraits exerçant une action sédati- ve, obtenus à partir de plantes du genre Rauwolfia en utilisant des solvants faiblement ou non polaires qui ne sont qu'en partie miscibles à. l'eau, on isole l'alcaloïde d'un point de fusion approximatif de 263 (avec décomposition) et d'un pouvoir rotatoire spécifique [[alpha]]23D= -118 environ (dans le chloroforme absolu).
1 ) On isole l'alcaloïde en utilisant un agent d'adsorption.
2 ) On isole l'alcaloïde par cristallisation.
3 ) On isole l'alcaloïde en utilisant un agent dadsorption et en procédant à une cristallisation ultérieure.
4 ) On isole l'alcaloïde par chromatographie, en particulier sur de l'oxyde d'aluminium, puis en procédant à une cristallisation ultérieure.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.