Procédé pour la purification de la pénicilline. La présente invention se rapporte à un procédé pour la purification de la pénicilline, dans le but d'obtenir une pénicilline d'un haut degré de pureté.
Des procédés de préparation de sels de la. pénicilline sous une forme pure sont bien connus. Ils comprennent, par exemple, 1e traitement au charbon du 'couillon de culture acidifié et. des traitements d'extraction suc cessifs au rioyen d'un solvant organique et d'eau, des méthodes chromatographiques, la formation de dérivés cristallisables de la péni cilline, par exemple des sels alcalins ou des sels aminés, et la purification de ces composés par cristallisation, la substance pure obtenue étant finalement transformée, si nécessaire, en un sel déterminé pour un usage thérapeutique.
Ces procédés présentent cependant le dés avantage de comprendre un nombre considé rable d'opérations, ordinairement dix ou plus, chaque opération entraînant une perte de pénicilline, ce qui conduit à de très faibles rendements en pénicilline ou en dérivé recherché, généralement de l'ordre de 30 %.
L'invention a pour but. la production de pénicilline d'un haut degré de pureté, par un procédé comprenant un petit nombre d'opé rations et conduisant à un rendement total élevé en pénicilline. La pénicilline purifiée ainsi obtenue peut ensuite être transformée en un sel pur de pénicilline.
Le composé procaïne-pénicilline a une valeur thérapeutique considérable, car il pré- sente cette propriété précieuse d'assurer un niveau élevé de pénicilline dans le courant sanguin, pendant un temps considérable après l'injection. Cette propriété est due à la faible solubilité du composé dans les milieux liqui des de l'organisme. Un procédé approprié de préparation de la procaïne-pénicilline consiste à faire réagir la procaïne et la pénicilline dans un solvant de ces corps dans lequel la procaïne-pénicilline est, insoluble, et à récu pérer de ce solvant le composé qui s'est pré cipité.
On a trouvé maintenant qu'en employant. la procaïne-pénicilline comme produit inter médiaire dans la purification de la pénicilline et en utilisant la propriété de la procaïne- pénicilline d'être pratiquement insoluble dans les solvants usuels, la purification de la péni cilline peut être effectuée simplement et avec peu d'opérations, et qu'on peut obtenir des rendements supérieurs à ceux obtenus par les procédés antérieurs.
Le procédé selon l'invention pour la puri fication de la pénicilline est caractérisé en ce qu'on transforme de la pénicilline impure libre en son sel procaïne-pénicilline à l'aide de procaïne ou d'un sel de celle-ci, en opérant dans un solvant dans lequel la solubilité du sel procaïne-pénicilline est d'au plus 511/o, en ce qu'on sépare la procaïne-pénicilline ainsi précipitée, en ce qu'on suspend cette dernière dans un mélange d'eau et d'un solvant orga- nique pratiquement non miscible à l'eau,
en ce qu'on décompose la procaïne-pénicilline en traitant cette suspension à l'aide d'un agent hydrolysant non neutre, en ce qu'on sépare la phase aqueuse de la phase formée par le sol vant organique, et en ce qu'on recueille la p-NH2. C6H.r . CO . 0. CH@CI-12 . N(C.,H5)@,, . HCl est bien connu comme anesthésique local.
Par sels de procaïne, on entend ici les sels de cette base libre, tels que le chlorhydrate, formés par addition d'un acide à. l'atome d'azote trivalent, qui se transforme alors en azote pentavalent. La procaïne-pénicilline est. un sel de ce type, dans lequel une molécule de pénicilline est fiée à cet atome d'azote.
Cependant, dans la présente description, quand on parle des sels de pro- caïne en tant que produit de départ, on exclut évidemment la procaine-pénicilline. Bien que le sel de procaïne utilisé ordinairement dans la préparation de la procaïne-pénicillirie soit le chlorhydrate, d'autres sels de la procaïne peuvent être utilisés, par exemple le phos phate, le sulfate, l'ascorbate de procaïne, etc.
La procaïne-pénicilline, formée intermé- diairement, peut. être obtenue à. partir de pénicilline impure sous forme acide et, de procaïne sous forme de base libre, ou par double décomposition d'un sel de procaïne et d'un sel de pénicilline préparé d'abord à par tir de la pénicilline impure libre. Par exem ple, le chlorhydrate de procaïne et le sel de sodium de pénicilline peuvent réagir pour donner de la procaïne-pénicilline et du chlo rure de sodium.
Bien qu'on puisse obtenir la procaine-pénieilline par réaction entre tin sel de procaine et. la pénicilline sous forme acide, ou entre la procaïne et un sel de pénicilline, une telle réaction ne se fait pas d'une manière satisfaisante et n'est pas complète. Le procédé selon l'invention peut comprendre la forma tion in situ dans le mélange réactionnel de la procaïne sous forme de base libre par addi tion d'une base.
La procaïne et la pénicilline peuvent être présentes, dans le milieu réactionnel, en pro portions pratiquement équimoléculaires, mais pénicilline purifiée à. l'état libre de celle des phases qui la, contient.
On entend ici par procaïne le p-amino- benzoyl-diéthyl-amino-éthanol sons forme de base libre, dont le chlorhydrate, répondant à la formule on utilise, de préférence, un excès de proeaïne pour éviter toute perte de pénicilline.
La pénicilline peut. être employée directe ment sous forme acide, constituant la pénicil line proprement dite, mais elle peut égalemen, être d'abord transformée en un sel de pénicil line, avant. de la faire réagir avec la procaïne ou un sel de celle-ci. La pénicilline ou son sel peut se trouver en solution dans de l'eau ou dans un solvant organique.
La. procaïne-pénicilline peut être préparée à partir d'une pénicilline partiellement puri fiée. Il faut noter qu'il n'est pas avantageux d'utiliser un bouillon de culture brut conte- Liant de la pénicilline, pour la préparation de la proeaïne-pénieilline, car un tel bouillon cou. tient des impuretés très complexes qui peuvent empêcher une précipitation satisfaisante de la proca:ine-pénicilline, et surtout la pénicilline est trop diluée dans un bouillon de culture brut pour permettre la précipitation.
Il peut être utile de traiter la solution de pénicilline ou de ses sels avec une petite quantité, pal- exemple 1 à 5%, de charbon activé, avant la réaction avec la procaïne. Ce traitement au charbon peut. se faire en agitant la solution avec le charbon et en séparant ce dernier par filtration.
Bien qu'un tel traitement. ne con duise à aucune amélioration notable de la pureté de la pénicilline, il améliore considé rablement la couleur du sel procaïne-pénieil- line obtenu subséquemment.
Parmi les solvants dans lesquels la solu bilité de la. procaïne-pénicilline est. d'au plus 5 % et qui peuvent être utilisés dans le pro- cédé selon l'invention, on peut citer l'eau, les esters d'acides carboxyliques aliphatiques inférieurs, tels que l'acétate d'amyle et l'acé tate de butyle, les alcools aliphatiques, tels que l'éthanol, le propanol,
le butanol et. l'alcool amylique, les hydrocarbures aliphatiques chlorés, tels que le chloroforme, les éthers, tels que l'éther éthylique, l'éther méthyl-éthylique et l'éther éthyl-isopropylique, les cétones ali phatiques inférieures, telles que la méthyl- isobut.yl-eétone et la méthyl-éthyl-cétone, les mélanges de solvants organiques, tels que le mélange acétone-acétate de butyle ou butanol. acétate de butyle, et les mélanges d'eau et de solvants organiques, tels que l'acétone, la méthyl-éthyl-cétone, le butanol,
ete.
Pour assurer une bonne précipitation de la procaïne-pénicilline, il. faut. évidemment que la concentration en pénicilline du solvant réactionnel soit supérieure à la concentration correspondant à la solubilité de- la procaïne- pénicilline dans ce solvant.
Par exemple, la solubilité de la procaïne-pénicilline dans l'eau étant de 0,5 % en poids environ, ce qui cor- respond à une solution aqueuse contenant environ 5000 unités de pénicilline par milli litre, la solution devra contenir, si on utilise de l'eau comme solvant réactionnel, plus de 5000 unités de pénicilline par millilitre, et avantageusement plus de 25 000 unités par millilitre.
Il en est de même avec d'autres sol vants réactionnels, la concentration minimum admissible de la pénicilline dans le mélange réactionnel dépendant de la solubilité de la proeaïne-pénieilline dans le solvant utilisé.
La solubilité de la proca:ine-pénieilline dans le solvant ne doit pas dépasser 5%, et sera de préférence inférieure à 2%.
La séparation de la procaïne-pénicilline précitée peut se faire, par exemple, par filtra tion, par centrifugation ou par tout autre moyen, avant d'être convertie en pénicilline.
La procaïne-pénicilline séparée est ensuite suspendue dans de l'eau, en présence d'un sol vant organique pratiquement non miscible l'eau, et la procaïne-pénicilline est décomposée soit à un pH acide, soit- à uni pH alcalin. Pour la suspension, on utilise, de préférence, un mélange d'eau et de solvant en volumes égaux. En milieu acide, la procaïne-pénicilline est décomposée en pénicilline libre qui passe dan, le solvant organique, et en un sel de procaïne (lui reste en solution dans la phase aqueuse.
Les deux phases sont alors séparées, et la péni cilline libre est isolée à partir de la phase formée par le solvant, le sel de proca:ine pou vant également être isolé à partir de la phase aqueuse. En milieu alcalin, il se forme d'abord un sel de pénicilline et de la procaïne sous forme de base libre. Le sel de pénicilline reste dans la phase aqueuse et est ensuite trans formé en pénicilline libre par adjonction d'un acide. La procaïne-base reste dans le solvant organique et peut en être isolée.
Parmi les solvants pratiquement non mis cibles à l'eau, on peut citer les alcools, tels que le butanol et l'alcool amylique, les esters, tels que l'acétate de butyle et l'acétate d'amyle, les cétones, telles que la méthyl-isobutyl- cétone, les hydrocarbures aliphatiques chlorés, tels que le chloroforme, et les éthers, tels que l'éther di-éthylique et l'éther di-isopropylique.
La décomposition de la proca;ine-pénicil- line se fait de préférence en milieu acide et <B>de</B> préférence à un pH compris entre 1,5 et 2,5. On peut suspendre la procaïne-pénieilline dans de l'eau, en présence d'un solvant. orga nique de la pénicilline pratiquement non miscible à, l'eau, et acidifier la suspension par adjonction d'une substance appropriée, telle qu'un acide minéral ou organique. La, péni cilline libérée reste dans le solvant, organique, d'où elle est isolée, tandis que le sel de pro caïne formé reste dans la phase aqueuse.
On évite évidemment l'emploi d'un acide décom posant la pénicilline, comme l'acide nitrique.
La pénicilline, obtenue sous forme puri fiée, peut servir à la préparation de diffé rents sels purs de la. pénicilline.
Lorsqu'on a décomposé la procaïne-pénicil- fine en milieu acide, on peut isoler la pro- caïne ù. partir de la phase aqueuse, en ajus tant le pH de celle-ci entre 10 et 10,5, par exemple par addition d'hydroxyde de sodium, ce qui entraîne la. précipitation de la pro- caïne. Si un solvant organique est présent, la procaïne passe dans le solvant et peut être isolée par évaporation et cristallisation, ou par addition d'un second solvant dans lequel la procaïne est:
pratiquement insoluble, par exemple l'éther de pétrole, La procaïne-pénicilline peut être décom posée aussi en la suspendant dans de l'eau, en présence d'un solvant organique pratiquement non miscible à l'eau, en ajoutant lui agent hydrolysant alcalin à la suspension et à une température ne dépassant pas la température ordinaire, de préférence entre 0 et. 5 C, la pénicilline risquant d'être décomposée à des températures supérieures, lorsque le milieu est alcalin.
La pénicilline passe alors dans la phase aqueuse, sous forme du sel correspon- clant à l'alcali utilisé - par exemple le sel de sodium si on utilise l'hydroxyde de sodium -, et la procaine-base passe dans la phase organique. Ensuite, la pénicilline est libérée de son sel, dans la phase aqueuse, par adjonction d'un acide.
On veillera à ce que l'addition d'alcali ne conduise, à aucun moment, à un excès d'alcali dans la suspension de la procaïne-pénicilline à. décomposer. On utilise, de préférence, l'alcali sous forme de solution aqueuse diluée, <U>que</U> l'on ajoute très lentement, en agitant, à la suspension de la procaïne-pénicilline. On a trouvé qu'en ajoutant à la suspension une solution de l'alcali d'une normalité d'environ 0,025, goutte à goutte et en agitant, on évite pratiquement complètement une destruction de l'activité de la pénicilline.
La mise en oeuvre du procédé selon l'in vention est illustrée par les exemples suivants. Les parties exprimées en poids et les parties exprimées en volume ont entre elles le même rapport que si elles étaient exprimées en jrammes et en millilitres. <I>Exemple 1:</I> La pénicilline à purifier est isolée comme suit On filtre un bouillon. de culture contenant de la pénicilline, on l'acidifie et on l'extrait avec de l'acétate de butyle. La solution orga nique est extraite par de l'eau à un pH de 7, et l'extrait aqueux est acidifié et extrait à nou-veau par de l'acétate de butyle.
On agite la solution résultante avec 11/o en poids de charbon activé, et on sépare ce dernier par filtration. On traite 2000 parties en volume de la solution résultante, contenant 7200 unités de pénicilline par millilitre, avec une solution de 6 parties en poids de procaïne dans de l'acétate de butyle, et on laisse reposer le mélange pendant une nuit. On sépare par filtration la procaïne-pénicilline cristallisée qui s'est précipitée, on la. lave avec de l'acé tone, on filtre à nouveau, on lave le préci pité avec de l'eau et de l'éther et on le sèche à 37 C.
On sépare ainsi 13,70 parties en poids de procaine-pénicilline ayant une activité de 910 unités/mg, le rendement en pénicilline, extraite sous forme de procaïne-pénicilline de sa solution dans l'acétate de butyle traitée au charbon, étant de 871/o.
On suspend 8,25 parties en poids de pro ca:ine-pénicilline dans un mélange d'eau et d'acétate de butyle, et. l'on acidifie avec de l'acide chlorhydrique. La. pénicilline libérée passe dans la couche formée par l'acétate de butyle; on sépare cette couche et on en recueille la pénicilline par évaporation du solvant dans le vide.
<I>Exemple 2:</I> On suspend 0,98 partie en poids de pro- caïne-pénieilline, préparée comme décrit. dans l'exemple 1, dans 20 parties en volume d'eau, on agite vigoureusement avec 30 parties en volume d'acétate de butyle, et on refroidit le mélange à une température inférieure à 5 C. On ajoute goutte à goutte, sur une période d'une heure, 60 parties en volume d'une solu tion aqueuse d'hydroxyde de sodium 0,025 N et, quand l'addition est achevée, on sépare les phases.
On trouve, en déterminant l'activité, que la phase aqueulse contient les 961/o en poids de la pénicilline présente dans la pro- caïne-pénicilline utilisée. On acidifie ensuite la solution aqueuse, et on en extrait la pénicil line libérée à l'aide d'un solvant organique.
Exemple <I>3:</I> On prépare une partie en poids de pro- caïne-pénicilline par le procédé selon l'exem ple 1, on la suspend dans 20 parties en volume d'eau, on agite vigoureusement avec 40 parties en volume d'éther isopropylique, et on refroidit le mélange au-dessous de 5" C. On ajoute goutte â. goutte, pendant une heure environ, 1-1,5 parties en volume d'une solu tion d'hydroxyde de sodium. 0,1 N, et on sépare les phases quand cette addition est achevée.
On trouve, en déterminant l'activité, que la phase aqueuse séparée contient les 81% en poids de la pénicilline présente dans la procaïne-pénieilline utilisée. On acidifie ensuite la solution aqueuse et on en extrait la pénicilline libérée, à l'état purifié, à l'aide d'acétate de butyle.
<I>Exemple</I> On fait réagir Une solution de pénicilline dans l'acétate de butyle, obtenue par extrac tion d'un bouillon de culture, avec une pro portion équimoléculaire de procaïne-base en solution dans de l'acétate de butyle, on sépare par filtration la procaïne-pénicilline précipi tée et. on la lave avec de l'acétate de butyle, puis avec de l'eau.
On suspend 20 parties en poids de la pro- caïne-pénieilline obtenue dans un mélange clé 100 parties en volume d.'eaii et. de 200 parties en volume de chloroforme, on brasse le mélange et on l'acidifie à un pli de ' avec 101/o en poids d'acide sulfurique. On sépare alois las phases, et on recueille la pénicilline purifiée de la phase formée par 1e chloro- forme.
Si l'on veut préparer un sel de la péni- eilline ainsi purifiée, on dissout 1.5 parties en poids de cette dernière dans 200 parties en volume de chloroforme et on extrait la solu tion avec 100 parties en volume d'une solution aqueuse clé Na2C03 à un pll de 6,8. On sépare l'extrait aqueux et le dessèche par congélation pour obtenir le sel sodique clé pénicilïine purifiée.
<I>Exemple 5:</I> On suspend 20 parties en poids de pro- caïne-pénicilline précipitée, préparée comme décrit dans l'exemple 4, dans un mélange de 100 parties en volume d'eau et de 200 parties en volume de inéthyl-isobutyl-cétone, on brasse le mélange et on l'acidifie à un pfl de 1,4 avec 10% en poids d'acide chlorhydrique;
on sépare alors les phases et on recueille la pénicilline purifiée de la phase cétonique par évaporation du solvant dans le vide.
Exemple <I>6:</I> On suspend 20 parties en poids de pro- caïne-pénicilline, préparée comme décrit dans F exemple 4, dans un mélange de 100 parties en volume d'eau et de<B>'</B>00 parties en volume d'éther, on brasse le mélange et on l'acidifie à un pi, de 1,4 avec 1.0 % en poids d'acide phosphorique;
on sépare alors les phases, et on reeüeille la pénieillïne purifiée de la phase éthérique.
Exemple <I>i:</I> On filtre 81600 litres d'un bouillon de culture contenant de la pénicilline, on acidi fie le filtrat et on l'extrait avec de l'acétate de butyle. On extrait à nouveau l'extrait butylique avec de l'eau à un pH de 7, on acidi fie l'extrait aqueux et. on l'extrait: avec 1640 litres d.'aeétate de butyle. Cet extrait buty lique (désigné par N dans le tableau ci- après) contient 17 000 millions d'unités de pénicilline, l'activité des substances solides qu'il contient étant de 796 unités de pénicil- fine par mg.
On traite cet extrait avec 36,3 kg de procaïne-base en solution dans 81,7 litres d'acétone. La procaine-pénieilline précipitée est. séparée par filtration, lavée avec 109 litres d'acétate de butyle et 6,8 litres d'acé tone, et séparée à nouveau par filtration. La procaïne-pénieilline est alors mise en suspen sion clans 227 litres d'eau et<B>725</B> litres d'acé tate de butyle et décomposée par adjonction de 90,8 litres d'un tampon au phosphate à un pH de 1,1. La. phase d'acétate de butyle, désimnée par Y dans le tableau ci-après, qui contient, la pénicilline, est. séparée et lavée avec de l'eau.
On trouve, en déterminant son activité, qu'elle contient. les 100% de la péni- cilline contenue dans la solution butylique originale traitée avec la procaïne, l'activité des substances solidés qu'elle contient étant de 1.612 unités de pénicilline par mg. On recueille ensuite la pénicilline purifiée libre de la phase d'acétate de butyle par évaporation de ce dernier dans le vide.
Si l'on veut transformer la pénicilline ainsi purifiée en procaïne-pénicilline propre à un usage thérapeutique, on peut dissoudre la pénicilline pure dans de l'acétate de butyle, et traiter la solution avec de la procaïne, à. raison de 130 g de procaïne-base pour 100 millions d'unités de pénicilline, la procaïne étant utilisée en solution dans de l'acétone. On peut séparer la procaïne-pénicilline for mée, la laver, la sécher et la mettre finale ment en emballages.
Le procédé ci-dessus (exemple 7) est effec tué cinq fois, les résultats obtenus étant. don nés dans le tableau ci-dessous.
EMI0006.0006
Extrait <SEP> butylique <SEP> brut <SEP> (X) <SEP> traité <SEP> avec
<tb> la <SEP> procaïne-base <SEP> Extrait <SEP> butylique <SEP> purifié <SEP> (V)
<tb> Exemple <SEP> Activité <SEP> des <SEP> Activité <SEP> des
<tb> Nombre <SEP> Rendement <SEP> en
<tb> volume <SEP> substances <SEP> solides <SEP> substances <SEP> solides
<tb> litres <SEP> en <SEP> unités <SEP> de <SEP> péni- <SEP> total <SEP> d'unités <SEP> en <SEP> unités <SEP> de <SEP> péni- <SEP> pénicilline <SEP> à <SEP> partir
<tb> cilline <SEP> par <SEP> mg <SEP> (en <SEP> millions)
<SEP> cilline <SEP> par <SEP> mg <SEP> de <SEP> l'extrait <SEP> X <SEP> en
<tb> 8 <SEP> 1640 <SEP> 655 <SEP> 24000 <SEP> 1530 <SEP> 90
<tb> 9 <SEP> 1640 <SEP> 734 <SEP> <B>25370</B> <SEP> 1680 <SEP> 85
<tb> 10 <SEP> 1640 <SEP> 833 <SEP> <B>18000</B> <SEP> 1.612 <SEP> 100
<tb> 11 <SEP> 1640 <SEP> 976 <SEP> <B>30000</B> <SEP> 1670 <SEP> 91
<tb> 12 <SEP> 1640 <SEP> 1073 <SEP> <B>25700</B> <SEP> 1640 <SEP> 91.,.5 Exemple <I>13:
</I> On suspend 20 parties en poids de pro- eaïne-pénicilline, préparée comme décrit dans l'exemple 4, dans un mélange de 100 parties en volume d'eau et de 200 parties en volume d'acétate de butyle, on brasse le mélange et on l'acidifie à un pH de 1,5 avec 10% en poids d'acide chlorhydrique; on sépare alors les pha ses et on recueille la pénicilline purifiée de la phase d'acétate de butyle.
Process for the purification of penicillin. The present invention relates to a process for the purification of penicillin, with the aim of obtaining a penicillin of a high degree of purity.
Methods of preparing salts of the. penicillin in pure form are well known. They include, for example, charcoal treatment of the acidified culture slug and. successive extraction treatments using an organic solvent and water, chromatographic methods, the formation of crystallizable derivatives of penicillin, for example alkali metal salts or amino salts, and the purification of these compounds by crystallization, the pure substance obtained being finally transformed, if necessary, into a salt determined for therapeutic use.
However, these methods have the disadvantage of comprising a considerable number of operations, usually ten or more, each operation resulting in a loss of penicillin, which leads to very low yields of penicillin or of the desired derivative, generally of the order of by 30%.
The object of the invention is. the production of penicillin of a high degree of purity, by a process comprising a small number of operations and resulting in a high total yield of penicillin. The purified penicillin thus obtained can then be converted into a pure salt of penicillin.
The procaine-penicillin compound has considerable therapeutic value because it exhibits this valuable property of ensuring a high level of penicillin in the blood stream for a considerable time after injection. This property is due to the low solubility of the compound in the liquid media of the organism. A suitable method of preparing procaine penicillin is to react procaine and penicillin in a solvent for these substances in which procaine penicillin is insoluble and to recover from this solvent the compound which precipitated. .
It has now been found that by using. procaine-penicillin as an intermediate in the purification of penicillin and by using the property of procaine-penicillin of being practically insoluble in the usual solvents, the purification of penicillin can be carried out simply and with few operations , and that higher yields can be obtained than those obtained by the prior processes.
The process according to the invention for the purification of penicillin is characterized in that free impure penicillin is converted into its procaine-penicillin salt using procaine or a salt thereof, by operating in a solvent in which the solubility of the procaine-penicillin salt is at most 511 / o, in that the procaine-penicillin thus precipitated is separated, in that the latter is suspended in a mixture of water and d an organic solvent practically immiscible with water,
in that procaine-penicillin is decomposed by treating this suspension with a non-neutral hydrolyzing agent, in that the aqueous phase is separated from the phase formed by the organic solvent, and in that p-NH2 is collected. C6H.r. CO. 0. CH @ CI-12. N (C., H5) @ ,,. HCl is well known as a local anesthetic.
By procaine salts is meant here the salts of this free base, such as the hydrochloride, formed by adding an acid to. the trivalent nitrogen atom, which then turns into pentavalent nitrogen. Procaine-penicillin is. a salt of this type, in which a penicillin molecule is bound to this nitrogen atom.
However, in the present description, when talking about the salts of procaine as a starting material, obviously procaine-penicillin is excluded. Although the procaine salt ordinarily used in the preparation of procaine penicilliris is hydrochloride, other salts of procaine can be used, for example phos phate, sulfate, procaine ascorbate, etc.
Intermedially formed procaine-penicillin can. be obtained at. from impure penicillin in acid form and procaine in free base form, or by double decomposition of a procaine salt and a penicillin salt prepared first from free impure penicillin. For example, procaine hydrochloride and the sodium salt of penicillin can react to give procaine-penicillin and sodium chloride.
Although procaine-penieillin can be obtained by reaction between procaine salt and. penicillin in acid form, or between procaine and a salt of penicillin, such a reaction does not proceed satisfactorily and is not complete. The process according to the invention can comprise the formation in situ in the reaction mixture of procaine in the form of free base by addition of a base.
Procaine and penicillin may be present in the reaction medium in substantially equimolecular portions, but purified penicillin. the free state of that of the phases which contains it.
Procaine is understood here to mean p-amino-benzoyl-diethyl-amino-ethanol in its free base form, including the hydrochloride, corresponding to the formula, an excess of prean is preferably used in order to avoid any loss of penicillin.
Penicillin can. can be used directly in the acid form, constituting the penicil line itself, but it can also be converted first into a salt of penicil line, before. to make it react with procaine or a salt thereof. Penicillin or its salt may be in solution in water or in an organic solvent.
Procaine-penicillin can be prepared from partially purified penicillin. It should be noted that it is not advantageous to use a raw culture broth containing penicillin, for the preparation of prean-penieillin, because such a neck broth. holds very complex impurities which can prevent satisfactory precipitation of proca: ine-penicillin, and especially penicillin is too diluted in crude culture broth to allow precipitation.
It may be useful to treat the solution of penicillin or its salts with a small amount, eg 1-5%, of activated charcoal, before the reaction with procaine. This charcoal treatment can. be done by stirring the solution with the charcoal and separating the latter by filtration.
Although such a treatment. does not lead to any notable improvement in penicillin purity, it considerably improves the color of the procaine-penieillin salt obtained subsequently.
Among the solvents in which the solu bility of the. procaine-penicillin is. of at most 5% and which can be used in the process according to the invention, mention may be made of water, esters of lower aliphatic carboxylic acids, such as amyl acetate and acetate butyl, aliphatic alcohols, such as ethanol, propanol,
butanol and. amyl alcohol, chlorinated aliphatic hydrocarbons, such as chloroform, ethers, such as ethyl ether, methyl-ethyl ether and ethyl-isopropyl ether, lower aliphatic ketones, such as methyl- isobut.yl-eetone and methyl-ethyl-ketone, mixtures of organic solvents, such as acetone-butyl acetate or butanol. butyl acetate, and mixtures of water and organic solvents, such as acetone, methyl ethyl ketone, butanol,
summer.
To ensure proper precipitation of procaine-penicillin, it. should. obviously that the penicillin concentration of the reaction solvent is greater than the concentration corresponding to the solubility of procaine-penicillin in this solvent.
For example, the solubility of procaine-penicillin in water being about 0.5% by weight, which corresponds to an aqueous solution containing about 5000 units of penicillin per milli liter, the solution should contain, if one uses water as the reaction solvent, more than 5000 units of penicillin per milliliter, and preferably more than 25,000 units per milliliter.
The same is true with other reaction solvents, the minimum allowable concentration of penicillin in the reaction mixture depending on the solubility of the proeain-penillin in the solvent used.
The solubility of proca: ine-penieillin in the solvent should not exceed 5%, and will preferably be less than 2%.
The separation of the aforementioned procaine-penicillin can be done, for example, by filtration, by centrifugation or by any other means, before being converted into penicillin.
The separated procaine-penicillin is then suspended in water, in the presence of a substantially water-immiscible organic solvent, and the procaine-penicillin is decomposed either at acidic pH or at alkaline pH. For the suspension, a mixture of water and solvent in equal volumes is preferably used. In an acidic medium, procaine-penicillin is decomposed into free penicillin which passes into, the organic solvent, and into a procaine salt (it remains in solution in the aqueous phase.
The two phases are then separated, and the free penillin is isolated from the phase formed by the solvent, the proca: ine salt can also be isolated from the aqueous phase. In an alkaline medium, a salt of penicillin and procaine are first formed as the free base. The penicillin salt remains in the aqueous phase and is then transformed into free penicillin by addition of an acid. The procaine-base remains in the organic solvent and can be isolated therefrom.
Among the practically non-target solvents in water, mention may be made of alcohols, such as butanol and amyl alcohol, esters, such as butyl acetate and amyl acetate, ketones, such as as methyl isobutyl ketone, chlorinated aliphatic hydrocarbons, such as chloroform, and ethers, such as diethyl ether and di-isopropyl ether.
The decomposition of proca; ine-penicillin takes place preferably in an acidic medium and <B> de </B> preferably at a pH between 1.5 and 2.5. Procaine-penieillin can be suspended in water, in the presence of a solvent. penicillin organism practically immiscible with water, and acidifying the suspension by adding a suitable substance, such as a mineral or organic acid. The released penicillin remains in the organic solvent from where it is isolated, while the pro caine salt formed remains in the aqueous phase.
Obviously, the use of an acid decomposing penicillin, such as nitric acid, is avoided.
Penicillin, obtained in purified form, can be used in the preparation of various pure salts of. penicillin.
When procaine-penicillin has been decomposed in an acidic medium, procaine ù can be isolated. from the aqueous phase, by adjusting the pH thereof to between 10 and 10.5, for example by adding sodium hydroxide, which results in the. precipitation of procaine. If an organic solvent is present, the procaine passes into the solvent and can be isolated by evaporation and crystallization, or by adding a second solvent in which the procaine is:
practically insoluble, for example petroleum ether, Procaine-penicillin can be decomposed also by suspending it in water, in the presence of an organic solvent practically immiscible with water, adding to it an alkaline hydrolyzing agent in suspension and at a temperature not exceeding ordinary temperature, preferably between 0 and. 5 C, penicillin may be decomposed at higher temperatures, when the medium is alkaline.
The penicillin then passes into the aqueous phase, in the form of the salt corresponding to the alkali used - for example the sodium salt if sodium hydroxide is used - and the procaine-base passes into the organic phase. Then, penicillin is released from its salt, in the aqueous phase, by adding an acid.
Care should be taken that the addition of alkali does not lead, at any time, to an excess of alkali in the suspension of procaine-penicillin. break down. The alkali is preferably used in the form of a dilute aqueous solution, which is added very slowly, with stirring, to the procaine-penicillin suspension. It has been found that by adding a solution of the alkali of a normality of about 0.025 to the suspension, dropwise and with stirring, destruction of penicillin activity is practically completely avoided.
The implementation of the method according to the invention is illustrated by the following examples. The parts expressed by weight and the parts expressed by volume have the same relationship to each other as if they were expressed in jrams and milliliters. <I> Example 1: </I> The penicillin to be purified is isolated as follows A broth is filtered. culture containing penicillin, acidified and extracted with butyl acetate. The organic solution is extracted with water at a pH of 7, and the aqueous extract is acidified and extracted again with butyl acetate.
The resulting solution is stirred with 11% by weight of activated charcoal, and the latter is filtered off. 2000 parts by volume of the resulting solution, containing 7200 units of penicillin per milliliter, is treated with a solution of 6 parts by weight of procaine in butyl acetate, and the mixture is allowed to stand overnight. The crystallized procaine-penicillin which has precipitated is filtered off, and it is added. washed with acetone, filtered again, the precipitate washed with water and ether and dried at 37 ° C.
13.70 parts by weight of procaine-penicillin having an activity of 910 units / mg are thus separated, the yield of penicillin, extracted in the form of procaine-penicillin from its solution in butyl acetate treated with charcoal, being 871 / o.
8.25 parts by weight of pro ca: ine-penicillin are suspended in a mixture of water and butyl acetate, and. it is acidified with hydrochloric acid. The released penicillin passes into the layer formed by butyl acetate; this layer is separated and the penicillin is collected therefrom by evaporation of the solvent in a vacuum.
<I> Example 2: </I> 0.98 part by weight of procaine-penieillin, prepared as described, is suspended. in Example 1, in 20 parts by volume of water, stirred vigorously with 30 parts by volume of butyl acetate, and the mixture is cooled to a temperature below 5 C. It is added dropwise, on a period of one hour, 60 parts by volume of a 0.025 N aqueous sodium hydroxide solution and, when the addition is complete, the phases are separated.
By determining the activity, it is found that the aqueous phase contains the 961% by weight of the penicillin present in the procaine-penicillin used. The aqueous solution is then acidified, and the liberated penicillin is extracted therefrom with an organic solvent.
Example <I> 3: </I> One part by weight of procaine-penicillin is prepared by the process according to Example 1, it is suspended in 20 parts by volume of water, it is stirred vigorously with 40 parts. by volume of isopropyl ether, and the mixture is cooled to below 5 ° C. 1-1.5 parts by volume of a sodium hydroxide solution are added dropwise over about an hour. 0.1 N, and the phases are separated when this addition is complete.
It is found, by determining the activity, that the separated aqueous phase contains the 81% by weight of the penicillin present in the procaine-penieillin used. The aqueous solution is then acidified and the released penicillin is extracted therefrom, in the purified state, with the aid of butyl acetate.
<I> Example </I> A solution of penicillin in butyl acetate, obtained by extraction from a culture broth, is reacted with an equimolecular proportion of procaine-base in solution in acetate. butyl, the precipitated procaine-penicillin is filtered off and. it is washed with butyl acetate and then with water.
20 parts by weight of the procaine-penillin obtained are suspended in a 100 parts by volume mixture of water and. of 200 parts by volume of chloroform, the mixture is stirred and acidified to a fold of 1% with 101% by weight of sulfuric acid. The phases are separated, and the purified penicillin is collected from the phase formed by the chloroform.
If it is desired to prepare a salt of the thus purified penileillin, 1.5 parts by weight of the latter are dissolved in 200 parts by volume of chloroform and the solution is extracted with 100 parts by volume of a key aqueous solution Na2CO3. at a pll of 6.8. The aqueous extract is separated and dried by freezing to obtain the purified penicillin sodium salt.
<I> Example 5: </I> 20 parts by weight of precipitated procaine-penicillin, prepared as described in Example 4, are suspended in a mixture of 100 parts by volume of water and 200 parts by volume of ethyl-isobutyl-ketone, the mixture is stirred and acidified to a mp of 1.4 with 10% by weight of hydrochloric acid;
the phases are then separated and the purified penicillin is collected from the ketone phase by evaporation of the solvent in vacuo.
Example <I> 6: </I> 20 parts by weight of procaine-penicillin, prepared as described in Example 4, are suspended in a mixture of 100 parts by volume of water and <B> '</ B> 00 parts by volume of ether, the mixture is stirred and acidified to a µl of 1.4 with 1.0% by weight of phosphoric acid;
the phases are then separated, and the purified penillin is collected from the etheric phase.
Example <I> i: </I> 81600 liters of a culture broth containing penicillin are filtered, the filtrate is acidified and extracted with butyl acetate. The butyl extract is again extracted with water at pH 7, the aqueous extract is acidified and. it is extracted: with 1640 liters of butyl etate. This butyl extract (denoted by N in the table below) contains 17,000 million units of penicillin, the activity of the solid substances which it contains being 796 units of penicillin per mg.
This extract is treated with 36.3 kg of procaine-base dissolved in 81.7 liters of acetone. The precipitated procaine-penieillin is. separated by filtration, washed with 109 liters of butyl acetate and 6.8 liters of acetone, and separated by filtration again. The procaine-penieillin is then suspended in 227 liters of water and <B> 725 </B> liters of butyl acetate and decomposed by adding 90.8 liters of a phosphate buffer at pH from 1.1. The butyl acetate phase, desiminated by Y in the table below, which contains penicillin, is. separated and washed with water.
We find, by determining its activity, that it contains. the 100% of the penicillin contained in the original butyl solution treated with procaine, the activity of the solid substances which it contains being 1,612 units of penicillin per mg. The free purified penicillin is then collected from the butyl acetate phase by evaporation of the latter in a vacuum.
If one wants to convert the penicillin thus purified into procaine-penicillin suitable for therapeutic use, one can dissolve the pure penicillin in butyl acetate, and treat the solution with procaine, at. at the rate of 130 g of procaine-base per 100 million units of penicillin, procaine being used in solution in acetone. The procaine-penicillin formed can be separated, washed, dried and finally packaged.
The above process (Example 7) is carried out five times, the results obtained being. donation born in the table below.
EMI0006.0006
Raw <SEP> butyl <SEP> <SEP> (X) <SEP> extract <SEP> with
<tb> the <SEP> procaine-base <SEP> Purified <SEP> butyl <SEP> <SEP> <SEP> (V)
<tb> Example <SEP> <SEP> activity of <SEP> <SEP> activity of
<tb> Number <SEP> Efficiency <SEP> in
<tb> volume <SEP> solid <SEP> substances <SEP> solid <SEP> substances
<tb> liters <SEP> in <SEP> units <SEP> of <SEP> peni- <SEP> total <SEP> of units <SEP> in <SEP> units <SEP> of <SEP> peni- <SEP > penicillin <SEP> to <SEP> from
<tb> cilline <SEP> by <SEP> mg <SEP> (in <SEP> millions)
<SEP> cilline <SEP> by <SEP> mg <SEP> from <SEP> the extract <SEP> X <SEP> in
<tb> 8 <SEP> 1640 <SEP> 655 <SEP> 24000 <SEP> 1530 <SEP> 90
<tb> 9 <SEP> 1640 <SEP> 734 <SEP> <B> 25370 </B> <SEP> 1680 <SEP> 85
<tb> 10 <SEP> 1640 <SEP> 833 <SEP> <B> 18000 </B> <SEP> 1.612 <SEP> 100
<tb> 11 <SEP> 1640 <SEP> 976 <SEP> <B> 30000 </B> <SEP> 1670 <SEP> 91
<tb> 12 <SEP> 1640 <SEP> 1073 <SEP> <B> 25700 </B> <SEP> 1640 <SEP> 91.,. 5 Example <I> 13:
</I> 20 parts by weight of pro-water-penicillin, prepared as described in Example 4, are suspended in a mixture of 100 parts by volume of water and 200 parts by volume of butyl acetate, then the mixture is stirred and acidified to a pH of 1.5 with 10% by weight of hydrochloric acid; the phases are then separated and the purified penicillin is collected from the butyl acetate phase.