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La présente invention a pour objet la récupération de formes thérapeutiquement efficaces de tétracycline à l'état purifié à partir de la matière contenant de la tétracycline.
Le procédé est particulièrement utileo pour convertir des formes impures de tétracycline en formes relativement pures. par suite, la tétra- cycline a une meilleure apparence, elle est plus tolérable du point de vue thérapeutique, et en outre, le produit est moins sujet aux modifications chimiques, par oxydation et autres, qui en causent l'altération.
La tétracycline est un dérivé du naphtacène, et tout en ayant une structure qui suggère fortement des formes tautomères, on croit qu'el- le existe sous la structure probable suivante :
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Un nom aoietdu compose est 4-dimèthylamino-1,4,4a-5,5a,b,11,1a-octahydro- 3,6,10,12,12a-pentahydroxy-6-méthyl-1,11-dioxo-2-naphtacène-carboxamide. Pour plus de commodité, on désigne usuellement le composé par le nom de tétracycline.
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La tétracycline peut être purifée par des moyens de purifàt4.0n ordinaires, par exemple par cristallisation dans des solvants chauds, par chromatographie au moyen d'une adsorption sur des adsorbants ou des résines échangeuses d'ions, mais on trouve que ces moyens sont compliqués, et moins intéressants économiquement que le procédé de la présente invention.
On peut fabriquer la tétracycline par déshalogénation de la chlo- rotétracycline, ou par fermentation directe au moyen de Streptomyces aureo- faciens, à savoir les mutants naturels et provoqués, dans un milieu appro- prié. La tétracycline relativement brute obtenue par ces méthodes de produc- tion radicalement différente est contaminée- par des impuretés de propriétés
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physiques et chimiques largement différentes.Lés-'méthodes de purification courantes, qui peuvent être efficaces quand on les applique sur la tétra-, cycline obtenue par fermentation, échouent souvent quand on les utilise
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pour purifier la tétracycline obtenue à partir de la chloroté:tracycline, et vice versa.
Le procédé de,la présente invention peut, de façon inattendue et avantageuse , s'appliquer à la purification de la tétracycline provenant des deux sources, car il est très sélectif lorsqu'il s'agit de séparer la tétracycline des impuretés associées.
Un autre avantage de la présente invention est que l'efficacité de la purification est indépendante de la forme sous laquelle on isole la tétracycline. Les sels, d'acide, particulièrement les halohydrates, la for-
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me neutre, et les sels alcalins ou alcalino-terreux,peuv.ettêtre facilement obtenus sous une forme pures sans modification importante des conditions de travail et l'utilisation des matières premières. Cela est particuliè- rement avantageux quand on opère à l'échelle industrielle, car on réalise la simplification du matériel de travail, du système d'approvisionnements en matières premières, et des besoins en main-d'oeuvre. Les étapes prélimi- naires de dissolution, filtration, clarification, etc.. peuvent être con- duites dans'des conditions identiques.
La conversion en la forme finale désirée peut être conduite juste avant la séparation finale, de sorte qu'il ne faut aucun changement important dans le processus.
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Actuellement, la profession médicale préfère généralement le chlor- hydrate de tétracycline, et la forme neutre ou amphotère, la tétracycline elle-mêmeo Pour des usages précis et spécialisés, les sels alcalins et al- calino-terreux ont leur utilités
Le mot "tétracycline" est utilisé ici, désignera et comprendra la tétracycline sous la forme amphotère ainsi que les sels formés avec des acides ou des bases, sauf indication contraire/. Les formes précises men-- tionnées ici sont désignées par une expression qui indiquera quelle est la forme envisagée en cet endroit précis.
Le procédé selon l'invention, pour récupérer des formes thérapeu- tiques efficaces de tétracycline, à l'état purifié, à partir d'une matière contenant de la tétracycline, consiste à préparer une solution ayant un pH de 5-10, de la matière contenant la tétracycline, dans un ou plusieurs solvants organiques polaires, à séparer toutes les impuretés insolubles,de cette solution, à transformer le système solvant-produit en un système dans lequel la forme thérapeutique efficace de tétracycline désirée est moins soluble, afin de former un précipité de celle-ci, et à récupérer la forme de tétracycline précipitée ainsi obtenueo Bien que l'on puisse utiliser les bases alcalines, telles que la soude et la potasse, il est généralement préférable d'utiliser des bases azotées pour ajuster le pH de la solution dans l'intervalle en question,
le cas -échéant, car les sels résiduels se sé- parent plus facilement de la forme désirée de tétracycline., De plus, les sles basiques de la tétracycline avec les bases azotées, y compris l'ammonia- que, sont généralement plus solubles dans les solvants que les sels alcalins ce qui permet d'utiliser de plus petites volume de solvant.. Un autre avanta- ge des bases azotées est leur alcalinité plus faible qui évite la suralcali- nation locale.
On trouve que beaucoup des impuretés présentes au moment de la formation première de la tétracycline sont relativement insolubles dans ces conditions et peuventêtre enlevées par filtrationo Mais, en général on trouve expérimentalement que les corps colorants sont maintenus sélec- tivement en solution, tandis que l'antibiotique cristallise ou se sépare du solvant sous une forme relativement pure.
Le procédé conforme à l'invention, pour récupérer un sel d'acide pratiquement pur de la tétracycline, consiste à préparer une solution ayant un pH de 5 à 10 de la matière contenant de la tétrácycline, dans un ou plu- sieurs solvants organiques polaires,à séparer de cette solution toutes les matières insolubles,à traiter cette solution par un acide pour précipiter la tétracycline sous forme du sel d'acide correspondant et à récupérer ce dernier.
Pour obtenir un sel d'acide, on ajoute suffisamment de l'acide dé- siré pour faire passer l'intervalle de pH en dessous de 2,5, l'intervalle préférentiel étant de 1,2 à 2,0. Aux valeurs inférieures, il se produit une certaine destruction d'acide, et il peut en résulter un produit plus ou moins orange
Le procédé conforme à l'invention pour récupérer la tétracycline neutre pratiquement pure, consiste à préparer une solution de la matière contenant la tétracycline, ayant un pH de 5 à 7,5, dans un ou plusieurs sol- vants polaires, à séparer de cette solution toutes les matières insolubles, à ajouter à cette solution de l'eau en quantité suffisante pour -,- précipi- ter la tétracycline neutre et à récuérer cette dernière
Pour obtenir la tétracycline neutre,
l'intervalle préférentiel est compris entre pH 3,5 et 7,5,l'intervalle de 4,5 et 6,0 étant particulière- ment eff cace.Au-desus d'un pH de 7,5,la tétracycline existe principalement ' sous fc-me de sel avec une base,bien qu'une partie appréciable de la tétacycline
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puisse être présente sous la forme neutre en dessous d'un pH de 8 environ.
Le procédé conforme à l'invention pour récupérer des sels alcalins et alcalino-terreux pratiquement purs de la tétracycline, consiste à prépa- rer une solution ayant un pH de 7 à 10, de la matière contenant la tétracy- cline, dans un ou plùsieurs solvants organiques polaires, à séparer de cette solution toutes les matières insolubles, et à traiter cette solution par une substance qui, en solution aqueuse est une source d'ions alcalins ou alcalino-terreux, de manière à précipiter, la tétracycline sous la forme du sel alcalin ou alcalino-terreux correspondant,et à récupérer ce dernier.
Naturellement, la pureté du produit final dépend dans une certaine mesure de la pureté de la matière première, et du degré de perfection des méthodes utilisées pour préparer lâ matière première.
Les concentrations de solvant et de tétracycline utilisées dépen- dent en partie du solvant, de la quantité de base utilisée, et de la forme de tétracycline que l'on purifie.
Parmi les solvants polaires de la tétracycline que l'on peut uti- liser, figurent les alcanols inférieurs, tels que l'alcool méthylique, l'al- cool éthylique, l'alcool isopropylique, l'alcool propylique, et les alcools butyliques, le 2-éthoxyéthanol, le méthylcarbitol, l'éthylène-chlorhydrine la propylènechlorhydrine, le dioxane, l'éthylène-glycol, l'alcool benzylique le nitrométhane, l'acétophénone, les esters d'acides gras inférieurs et d'alcoxyalcanols inférieurs, l'acétone, le diacétonalcool, le tétrahydrofu- rane, la diméthylformamide, et les mélanges de deux ou plusieurs de ces solvants.
Les alcools inférieurs, l'acétone et les ethers mono-alkyliques inférieurs de l'éthylène glycol et du propylène glycol, conviennent parti- culièrement bien par suite de leur bas prix de revient, de leur facilité de récupération, et de leur volatilité', cette dernière caractéristique fa- cilitant le séchage de l'antibiotique pour l'amener à un état exempt de solvant. Si pour une raison quelconque on ne dispose pas de ces solvants préférentiels, on pourra utiliser très efficacement les membres supérieurs des ' séries. Il est normalement avantageux que ces solvants contiennent un peu 'eau; et cela peut aider à augmenter la vitesse de dissolution et la solubilité de l'antibiotique.
Pour la récupération des halohydrates de l'antibiotique, il est important que la quantité d'eau dans les liqueurs de 'cristallisation soit inférieure à 5% environ, faute de quoi on subit des pertes excessives, par suite de la solubilité accrue du produit. Pour réc u- pérer la forme neutre de l'antibiotique, il peut être parfois intéressant, pour obtenir un rendement et une pureté maxima, qu'il y ait des quantités d'eau appréciables, jusqu'à la limite de miscibilité du solvant avec l'eau, ou, pour les solvants miscibles à l'eau, jusqu'à un égal volume d'eau.
La solubilité est l'une des plus obscures parmi toutes les pro- priétés connues d'un corps. L'interaction entre le solvant et le soluté par suite de fixation d'hydrogène et autres phénomènes encore peu connus, empêche toute prédiction précise quant à la solubilité d'une substance.
On constate fréquemment, que, sans raison apparente, de faibles changements dans la structure du produit ou du solvant améneront de grands changements dans la solubilité.
La tétracycline neutre et ses sels sont en général plus solubles que la chlorotétracycline neutre et ses sels, de sorte que dans certains cas il est désirable d'avoir, un système de solvant dans lequel la tétra- cycline soit un peu moins soluble, de sorte que l'on utilise de plus grandes quantités du solvant. L'acétone est un excellent solvant de dilution pour réduire la solubilité-', de sorte que la forme désirée de tétracycline préci- pite plus facilement;
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On peut commodément utiliser comme matière première la forme neu- tre, ou un halohydrate ou autre sel d'acide de la tétracycline, Si l'on uti- lise la forme neutre, la quantité de base utilisée pour la solubilisation est plus petite que si l'on utilise l'halohydrate.
La quantité de base néces- saire est fonction du solvant, de la forme de tétracycline et du volume o De faibles variations dans la, faneur en eau du solvant peuvent causer un plus grand changement dans la quantité de base nécessaire pour la solubili- sation. Pour faciliter le travail en usine, on détermine généralement la quantité de base er - mesurant le @ que lion puisse lévaduser d'appès quantitzs mises en oeuvre, ou par Inexpérience de? opérations précédentes.
Quandon travaille avec des -solvants non aqueux, la notion de pH perd sa signification théorique, mais pour avoir une mesure pratique du travail, on dilue le solvant avec un égal volume d'eau, et on prend comme pH de la solution la valeur obtenue avec un pH-mètre à électrode de verre prolongée dans le mélange, ou dans la phase aqueuse si les solvants ne sont pas miscibles.
La triéthylamine est une base particulièrement appropriée. Outre les bases alcalines, telles que soude, potasse, lithine, etc..., on peut régler le pH avec de l'ammoniaque, ou l'une des autres amines, telles que diéthylamine, tri-n-butylamine, cyclohexylamine, morpholine, di-n-propyla- mine, bêta-phényl-éthylamine, éthanol-amine, isoamylamine, éthylmorpholine diméthylbenzylamine, 2-aminopyridine, iso-butylamine, dicyclohexylamine, diéthanolamine, triéthanolamine, bêta-di-éthylaminoéthanol et triméthylami- ne, et mélanges de ces corps. Il est préférable d'utiliser comme bases des amines ayant une constante d'ionisation de 10-7 ou plus.
Celles qui ont une constante d'ionisation de 10-6 ou plus, sont préférables parce qu'elles agissent plus rapidement et assurent une solubilité plus grandeo
La tétracycline peut être inactivée dans une certaine mesure,parti- culièrement par des bases fortes,en présence de l'eau,la tétracycline est beaucoup plus stable,en présence-de bases,que la chlorotétracycline.
On clarifie de préférence les solutions obtenues pour enlever les traces d'impuretés=S'il y a de la matière colorée,il est commode d'utiliser un charbon décolorant ou autre absorbant pour enlever et faciliter la fil- trationo
Pour plus de commodité dans les exemples suivants,là quantité de tétracycline présente est exprimée en chlorhydrate de tétracyclineoSur une telle base unitaire,la tétracycline neutre peut donner, à l'analyse,plus de 1000 microgrammes par milligramme.
EXEMPLE 1.- Clorhydrate de tétracycline.-
On dissout 10 ge de chlorhydrate de tétracycline dans 50 cm3 de 2-éthoxyéthanol contenant 3% d'eau, en agitant pendant 20 minutes après addition de 5,9 cm3 de triéthylamineo La solution a un pH de 8,48 (lorsqu'el- le est mélangée à un égal volume d'eau comme indiqué plus haut). On filtre la solution, on ajoute 50 cm3 de n-butanol, et on ajuste le mélange @ à 1,8 avec 3,95 am3 d'acide chlorhydrique concentré. Après vieillissement de 48 heures à la température ordinaire, avec agitation, on sépare les cristaux par filtration on lave au butanol et au chloroforme, et on sèche sous vide.
On obtient un rendement de 8,7 g de chlorhydrate de tétracycline, titrant 970 microgrammes par mgo EXEMPLE 2.- Chlorhydrate de tétracycline.-
On prépare une bouillir de 10 g de chlorhydrate de tétracycline titrant 340 microgrammes par mg, dans 50cm3 de n-butanol contenant 3% d'eau.
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En ajoutant 5,9 cm3 de triéthylamine et en agitant pendant 20 min, on obtient une solution claire que l'on traite par 0,5 f g de charbon décolorant pendant
10 min, et que l'on filtre. On acidifie le filtrat clair jusqu'à un pH de
1,7, ce qui nécessite environ 3,9 om3 d'acide chlorhydrique concentré .Des cristaux commencent à se former, et on les laisse vieillir pendant 47 h avec agitation, après quoi on sépare les cristaux du solvant par filtration. A- près avoir lavé avec 10 cm3 de n-butanol et 10 cm3 de chloroforme, et après séchage sous vide on obtient 8,8 g de chlorhydrate de tétracycline, qui don- nent à l'analyse 975 microgrammes par mg.
EXEMPLE 3. -
Chlorhydrate de tétracycline.-
On dissout 20 g de chlorhydrate de tétracycline brut dans 100 cm3 d'éthanol contenant 5% d'eau, en agitant avec 11,7 cm3 de triéthylamine.
On ajoute une petite quantité d'adjuvant de filtration au silicate de magné- sium, et on filtre la solution. On acidifie la solution claire jusqu'à pH
1,6 avec de l'acide chlorhydrique concentré, on introduit un germe, etoun laisse cristalliser pendant 28 h, puis on filtre, On lave avec de l'éthanol, puis avec du chloroforme, les cristaux de chlorhydrate de tétracycline sépa- rés, puis on sèche sous vide? Le produit titre 985 microgrammes par mg.
EXEMPLE 4.- Chlorhydrate de tétracycline.-
On suspend 5 g de chlorhydrate de tétracycline brut dans 50 cm3 de tétrahydrofurane: On réalise la dissolution par addition de 2,9 cm3 de triéthylamine, en agitant pendant 10 mm. On filtre la solution, et on y ajoute 1,75 cm3 d'acide chlorhydrique concentré, et on laisse vieillir pen- dant 75 h. On centrifuge les cristaux, on les lave au tétrahydrofurane, au chloroforme, et on sèche sous vide. On obtient un rendement de 3,2 g de chlorhydrate de tétracycline, ayant une pureté de 950 g microgrammes par mg.
EXEMPLE 5.- Chlorhydrate de tétracycline. -
On dissout 20 g de tétracycline neutre dans 80 cm3 de diméthylfor- mamid.e, en agitant doucement: On filtre la solution et on la divise en deux parties égales. A l'une des portions, on ajoute de l'acide chlorhydrique concentré jusqu'à pH ,5 , et 240 cm3 de chloroforme. Après vieillissement on sépare les cristaux par filtration, on lave au chloroforme et on sèche, le rendement est de 6,1 g de chlorhydrate de tétracycline, titrant 970 mi- crogrammes par mg.
EXEMPLE6. - Chlorhydrate de tétracycline.-
On délaie 10 g de chlorhydrate de tétracycline titrant 890 micro- grammes par mg, avec 50 cm3 de 2-éthoxy-éthanol contenant 5% d'eau. On ajoute 5,9 cm3 de triétylamine, on agite la composition pendant 20 mm et on filtre avec de la terre d'infusoires comme adjuvant de filtration.
A la solution clarifiée, on ajoute suffisamment d'acide chlorhydrique pour ajuster le pH à 1,7, on introduit un germe dans le mélange, et on laisse vieillir avec agitation pendant 46 h. Après filtration, lavage au 2-éthoxy- éthanol et à l'eau on obtient 8,4 g de chlorhydrate de tétracycline, titrant 995 microgrammes par mg.
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EXEMPLE 7 Bromhydrate de tétracycline.
On répète l'exemple 6 en utilisant de l'acide bromhydrique 10N au lieu de l'acide chlorhydrique. On obtient 5,2 g de bromhydrate de tétra- cycline titrant 870 microgrammes par mg.
EXEMPLE 8.
Chlorhydrate de tétracycline.
On répète l'exemple 6 en utilisant deux équivalents d'éthylmorpho- line au lieu de la triéthylamine. On obtient un rendement de 8,1 g de chlor- hydrate de tétracycline, titrant 985 microgrammes par mg.
EXEMPLE 9.
Chlorhydrate de tétracycline.
On répète l'exemple 6 en utilisant deux équivalents d'éthanolami- ne au lieu de triéthylamine. On obtient un rendement de 7,6 g de chlorhy- drate de tétracycline, titrant 950 microgrammes par mg.
EXEMPLE 10.
Chlorhydrate de tétracycline.
On répète l'exemple 6 en utilisant deux équivalents de bêta-phé- nyléthylamine au lieu de la triéthylamine. On obtient un rendement de 6,3 gr titrant 990 microgrammes par mg de chlorhydrate de tétracycline.
EXEMPLE 11.
Chlorhydrate de tétracycline.
On répète l'exemple 6 en utilisant deux équivalents de tri-n-bu- tylamine au lieu de triéthylamine. On obtient un rendement de 8,4 g titrant 985 microgrammes par mg de chlorhydrate de tétracycline.
EXEMPLE 12.
Chlorhydrate de tétracycline.
On répète l'exemple 6 en utilisant deux équivalents de triéthano- lamine au lieu de triéthylamine. On obtient un rendement de 7,0 g titrant 960 microgrammes par mg de chlorhydrate de tétracycline.
EXEMPLE 13.
Tétracycline neutre.
On prépare une solution de 25 g de chlorhydrate de tétracycline brut dans 150 cm3 de méthanol sec, en ajoutant 14,6 cm3 de triéthylamine et en agitant pendant 10 mno Après filtration, on ajoute 30 cm3 d'eau et on ajuste le pH à 5,6 avec de l'acide chlorhydrique concentré. La tétracycline neutre commence à oristalliser, mais on laisse vieillir la bouillie pendant 20 h avant filtrationo 'On lave les cristaux de tétracycline neutre avec un mélange de méthanol et d'eau, puis avec de l'eau, puis avec de l'alcool iso- propylique, Les cristaux de tétracycline (neutre) représentent 17,3 g et titrent 985 microgrammes par mg.
EXEMPLE 14.
Tétracycline neutre.
On mélange la deuxième portion de l'exemple 5 avec 250 cm3 d'eau.
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La tétracycline commence à cristalliser presque immédiatement. On laisse reposer le mélange pendant 5 h, on filtre, on lave les cristaux à l'eau, au chloroforme, et on sèche sous vide. On obtient un rendement de 4,0 g de tétracycline neutre, titrant 940 microgrammes par mg.
EXEMPLE15.
Tétracycline neutre.
On délaie 10 g de chlorhydrate de tétracycline brut dans une so- lution contenant 1,98 de tétraborate de sodium décahydraté dans 100 cm3 d'eau. On ajoute de la soude ION jusqu'au pH 9, et le chlorhydrate de té- tracycline se dissout rapidement. Après filtration, on ajuste le pH à 5,6 avec de l'acide chlorhydrique concentré. La tétracycline neutre précipite, et on la laisse reposer, avec agitation, pendant 5 h. On lave le produit à l'eau et au chloroforme, et on sèche sous vide à la température ordinaire.
On obtient'un rendement de 5,6 g de tétracycline neutre, titrant 1005 micro- grammes par mg.
EXEMPLE 16.
Tétracycline neutre.
On dissout 10 g de chlorhydrate de tétracycline brut dans 50 cm3 de 2-éthoxyéthanol contenant 5% d'eau, en agitant pendant 15 mn avec 5,9 cm3 de triéthylamine. Après avoir filtré pour séparer les impuretés, on ajoute 100 cm3 d'eau et on ajuste le pH à 5,6 avec de l'acide chlorhydrique concen- tré. On laisse vieillir le mélange pendant 17 h, tout en agitant, on sépa- re les cristaux par filtration, on les lave au 2-éthoxyéthanol et au chloro- forme: Après séchage sous vide, on obtient 6,7 g de tétracycline neutre ti- trant 965 microgrammes par mg.
EXEMPLE 17.
Tétracycline de sodium.
On met en suspension 5 g de chlorhydrate de tétracycline dans 35 cm3 de méthanol. A la suspension, on ajoute suffisamment de soude aqueuse à 50% pour élever le pH à 8,5. Il se forme une solution claire que l'on fil- tre pour éliminer les traces d'impuretés. On ajoute 35 cm3 d'acétone. Au repos, la tétracycline de sodium précipite sous forme de cristaux en aiguil- les. On récupère 4 g de tétracycline de sodium.
EXEMPLE 18.
Tétracyline de sodium.
On met en suspension 25 g de tétracycline neutre dans 100 cm3 de méthanol. A la suspension, on ajoute suffisamment de soude aqueuse à 50 % pour élever le pH à 9,2, Il en résulte une solution claire. On filtre la solution pour éliminer les traces d'impuretés, et on ajoute 100 cm3 d'acé- tone. Au repos, la tétracycline de sodium précipite sous forme de cristaux en aiguilles. On lave les cristaux au méthanol, puis à l'éther ,et on sè- che sur de l'anhydride phosphorique. On obtient 25 g de tétracycline de so- dium qui titrent 873 microgrammes par mg.
EXEMPLE 19 Tétracycline de calcium
On met en suspension 9,61 g (0,02 mole) de chlorhydrate de tétra- cycline ,ristallisé dans 50 cm3 de méthanol anhydre, et on traite lentement
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avec 8,4 cm3 (0,06 mole)de triéthylamine redistillée. Une agitation conti-. nue donne une solution claire de tétracycline-tri-éthylamine. A cette solu- tion clairequi a un pH d'environ 9,0, on ajoute, avec vigoureuse agita- tion 6,20 g (0,02 mole) de lactate de calcium pentahydraté dissous dans 25 cm3 de méthanol chaud. L1 tétracycline de calcium précipite immédiatement.
On continue d'agiter pendant 120 min encore, en refroidissant à 2 C. Le sel de calcium précipité est filtré facilement, on le lave au méthanol, puis à l'éther, et finalement on le sèche à l'air pendant une nuit. On ob- tient 7,0 g de matière titrante 950 microgrammes par mgo EXEMPLE 20.- Tétracycline de calcium.-
On suspend 9,61 g (0,02 mole) de chlorhydrate de tétracycline dans 50 cm3 de méthanol , et on traite par 2,8 cm3 (0,02 mole) de triéthylamine.
Après agitation, on obtient une solution ayant un pH de 5,7, que l'on trai- te par 1,0 g de charbon actif, puis on filtre. A cette solution claire, on ajoute une solution de 6,20 g de lactate de calcium pentahydraté dans 50 cm3 de méthanol chaud contenant 5,6 cm3 de triéthylamine. La tétracycline de cal- cium précipite, et on la filtre après agitation de 20 min. Après lavage au méthanol, on sèche le produit et il itre 920 microgrammes par mg.
EXEMPLE 21.- Tétracycline de magnésium.-
On suspend 9,61 g (0,02 mole) de chlorhydrate de tétracycline cris- tallin dans 50 cm3 de méthanol anhydre et on traite lentement par 8,4 cm3 (0,06 mole) de triéthylamine redistillé.En agitant continuellement , on ob- tient une solution claire de tétracycline-triéthylamine. A cette solution claire, qui a un pH de 9,0 environ, on ajoute, tout en agitant, 4,06 g (0,02 mole) de chlorure de magnésium hexahydraté dissous dans 15 cm3 de méthanol chaud. La tétracycline de magnésium précipite immédiatement. On continue d'a- giter pendant 120 min encore, en refroidissant à 2 C. Le sel de calcium précipite filtre facilement.,on le lave au méthanol, puis à l'éther, et fina- lement on le sèche à l'air pendant une nuit. On obtient 6,4 g de matière titrant 930 microgrammes par mg.
REVENDICATIONS
1. - Procédé pour récupérer des formes thérapeutiques efficaces de tétracycline à l'état purifié à partir d'une matière contenant de la tétracycline, caractérisé en ce qu'on prépare une solution de la matière première dans un ou plusisurs solvants polaires, le pH de la solution étant de 5 à 10, on sépare toutes les impuretés insolubles, on transforme le systè- me en un système dans lequel la forme désirée de tétracycline est moins solu- ble pour obtenir un précipité, et on récupère la forme de tétracycline pré- cipitée.
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The present invention relates to the recovery of therapeutically effective forms of tetracycline in a purified state from the tetracycline-containing material.
The method is particularly useful for converting impure forms of tetracycline to relatively pure forms. as a result, tetracyclin looks better, is more therapeutically tolerable, and furthermore, the product is less subject to chemical, oxidative and other changes which cause spoilage.
Tetracycline is a derivative of naphtacene, and while having a structure which strongly suggests tautomeric forms, it is believed to exist under the following probable structure:
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A common name for the compound is 4-dimethylamino-1,4,4a-5,5a, b, 11,1a-octahydro- 3,6,10,12,12a-pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-2 -naphtacene-carboxamide. For convenience, the compound is usually referred to as tetracycline.
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Tetracycline can be purified by ordinary purifying means, for example by crystallization from hot solvents, by chromatography by means of adsorption on adsorbents or ion exchange resins, but these means are found to be complicated. , and less economically advantageous than the process of the present invention.
Tetracycline can be made by dehalogenation of chlorotetracycline, or by direct fermentation using Streptomyces aureofaciens, i.e., the natural and induced mutants, in a suitable medium. The relatively crude tetracycline obtained by these radically different production methods is contaminated with impurities of properties
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widely different physical and chemical methods. Common purification methods, which may be effective when applied to fermented tetra- cyclin, often fail when used.
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to purify tetracycline obtained from chlorotate: tracycline, and vice versa.
The process of the present invention can, unexpectedly and advantageously, be applied to the purification of tetracycline from both sources, since it is very selective when it comes to separating the tetracycline from the associated impurities.
Another advantage of the present invention is that the efficiency of the purification is independent of the form in which the tetracycline is isolated. The salts, of acid, particularly the hydrohalides, the
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me neutral, and alkali or alkaline earth salts, can easily be obtained in pure form without significant modification of working conditions and the use of raw materials. This is particularly advantageous when operating on an industrial scale, as it achieves the simplification of the working equipment, the raw material supply system, and the manpower requirements. The preliminary steps of dissolution, filtration, clarification, etc. can be carried out under identical conditions.
The conversion to the desired final shape can be carried out just before the final separation, so that no significant change is required in the process.
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Currently, the medical profession generally prefers tetracycline hydrochloride, and the neutral or amphoteric form, tetracycline itselfo For specific and specialized uses, alkali and alkaline earth salts are useful.
The word "tetracycline" is used herein, will refer to and include tetracycline in amphoteric form as well as salts formed with acids or bases, unless otherwise specified. The precise shapes mentioned here are designated by an expression which will indicate which shape is envisaged in that precise place.
The process according to the invention for recovering effective therapeutic forms of tetracycline, in a purified state, from a material containing tetracycline, comprises preparing a solution having a pH of 5-10, material containing tetracycline, in one or more polar organic solvents, to separate all insoluble impurities, from this solution, to transform the solvent-product system into a system in which the desired therapeutically effective form of tetracycline is less soluble, in order to form a precipitate thereof, and recovering the precipitated form of tetracycline thus obtained. Although alkaline bases, such as soda and potash, can be used, it is generally preferable to use nitrogenous bases to adjust the pH of the solution in the interval in question,
this is because the residual salts separate more easily from the desired form of tetracycline., In addition, the basic salts of tetracycline with nitrogenous bases, including ammonia, are generally more soluble in solvents than alkali salts, which allows smaller volumes of solvent to be used. Another advantage of nitrogenous bases is their lower alkalinity which prevents local over-alkalization.
It has been found that many of the impurities present at the time of the first formation of tetracycline are relatively insoluble under these conditions and can be removed by filtration. However, in general it is found experimentally that the coloring bodies are maintained selectively in solution, while antibiotic crystallizes or separates from the solvent in a relatively pure form.
The process according to the invention for recovering a substantially pure acid salt of tetracycline consists of preparing a solution having a pH of 5 to 10 of the material containing tetracycline, in one or more polar organic solvents. , in separating from this solution all the insoluble matters, in treating this solution with an acid to precipitate the tetracycline in the form of the corresponding acid salt and to recover the latter.
To obtain an acid salt, enough of the desired acid is added to bring the pH range below 2.5, the preferred range being 1.2 to 2.0. At lower values, some acid destruction occurs, and a more or less orange product may result
The process according to the invention for recovering substantially pure neutral tetracycline consists of preparing a solution of the tetracycline-containing material, having a pH of 5 to 7.5, in one or more polar solvents, to be separated therefrom. solution of all insoluble matters, adding to this solution sufficient water to -, - precipitate the neutral tetracycline and recover the latter
To obtain neutral tetracycline,
the preferred range is between pH 3.5 and 7.5, the range 4.5 to 6.0 being particularly effective. Above pH 7.5, tetracycline predominantly exists 'under salt with a base, although an appreciable part of the tetacycline
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may be present in neutral form below a pH of about 8.
The process according to the invention for recovering substantially pure alkali and alkaline earth salts of tetracycline consists in preparing a solution having a pH of 7 to 10 of the material containing the tetracycline in one or more polar organic solvents, to separate from this solution all insoluble matter, and to treat this solution with a substance which, in aqueous solution is a source of alkaline or alkaline-earth ions, so as to precipitate the tetracycline in the form of corresponding alkali or alkaline earth salt, and recovering the latter.
Of course, the purity of the final product depends to some extent on the purity of the raw material, and the degree of perfection of the methods used to prepare the raw material.
The concentrations of solvent and tetracycline used depend in part on the solvent, the amount of base used, and the form of tetracycline being purified.
Among the polar solvents for tetracycline which can be used are lower alkanols, such as methyl alcohol, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, propyl alcohol, and butyl alcohols, 2-ethoxyethanol, methylcarbitol, ethylene chlorohydrin, propylenechlorhydrin, dioxane, ethylene glycol, benzyl alcohol, nitromethane, acetophenone, esters of lower fatty acids and lower alkoxyalkanols, l acetone, diacetonalcohol, tetrahydrofuran, dimethylformamide, and mixtures of two or more of these solvents.
Lower alcohols, acetone and lower mono-alkyl ethers of ethylene glycol and propylene glycol, are particularly suitable because of their low cost, ease of recovery, and volatility. the latter characteristic facilitating the drying of the antibiotic to bring it to a solvent-free state. If for some reason these preferred solvents are not available, the upper members of the series can be used very effectively. It is normally advantageous that these solvents contain some water; and it can help to increase the dissolution rate and the solubility of the antibiotic.
For the recovery of the hydrohalides from the antibiotic it is important that the amount of water in the crystallization liquors is less than about 5%, otherwise excessive losses are incurred due to the increased solubility of the product. In order to recover the neutral form of the antibiotic, it may sometimes be advantageous, in order to obtain maximum yield and purity, that there be appreciable quantities of water, up to the limit of miscibility of the solvent with water, or, for water-miscible solvents, up to an equal volume of water.
Solubility is one of the most obscure of all known properties of a body. The interaction between the solvent and the solute as a result of hydrogen uptake and other phenomena still little known, prevents any precise prediction as to the solubility of a substance.
It is frequently found that, for no apparent reason, small changes in the structure of the product or solvent will cause large changes in solubility.
Neutral tetracycline and its salts are in general more soluble than neutral chlorotetracycline and its salts, so that in some cases it is desirable to have a solvent system in which the tetracycline is somewhat less soluble, so that larger amounts of the solvent are used. Acetone is an excellent dilution solvent for reducing solubility, so that the desired form of tetracycline precipitates more easily;
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The neutral form, or a hydrohalide or other acid salt of tetracycline can conveniently be used as the raw material. If the neutral form is used, the amount of base used for solubilization is smaller than if the halohydrate is used.
The amount of base needed is a function of the solvent, the form of tetracycline and the volume. Small variations in the water content of the solvent can cause a greater change in the amount of base needed for solubilization. To facilitate the work in the factory, one generally determines the basic quantity er - measuring the @ that lion can evade it from excess quantities implemented, or by inexperience of? previous operations.
When working with non-aqueous solvents, the notion of pH loses its theoretical meaning, but to have a practical measure of the work, the solvent is diluted with an equal volume of water, and the value obtained is taken as the pH of the solution. with a glass electrode pH meter extended in the mixture, or in the aqueous phase if the solvents are not miscible.
Triethylamine is a particularly suitable base. In addition to alkaline bases, such as soda, potash, lithine, etc., the pH can be adjusted with ammonia, or one of the other amines, such as diethylamine, tri-n-butylamine, cyclohexylamine, morpholine , di-n-propylamine, beta-phenyl-ethylamine, ethanol-amine, isoamylamine, ethylmorpholine dimethylbenzylamine, 2-aminopyridine, iso-butylamine, dicyclohexylamine, diethanolamine, triethanolamine, beta-di-ethylaminoethanol and trimethylamine, mixtures of these bodies. It is preferable to use as the bases amines having an ionization constant of 10-7 or more.
Those which have an ionization constant of 10-6 or more are preferable because they act faster and provide greater solubility.
Tetracycline can be inactivated to some extent, especially by strong bases, in the presence of water, tetracycline is much more stable, in the presence of bases, than chlorotetracycline.
Preferably, the solutions obtained are clarified to remove traces of impurities = If there is colored matter, it is convenient to use a bleaching charcoal or other absorbent to remove and facilitate filtration.
For convenience in the following examples, the amount of tetracycline present is expressed as tetracycline hydrochloride. On such a unit basis, neutral tetracycline can give, on analysis, more than 1000 micrograms per milligram.
EXAMPLE 1. Tetracycline hydrochloride.
10 g of tetracycline hydrochloride are dissolved in 50 cm3 of 2-ethoxyethanol containing 3% water, with stirring for 20 minutes after addition of 5.9 cm3 of triethylamineo The solution has a pH of 8.48 (when the is mixed with an equal volume of water as indicated above). The solution is filtered, 50 cm3 of n-butanol are added, and the mixture is adjusted to 1.8 with 3.95 am3 of concentrated hydrochloric acid. After aging for 48 hours at room temperature, with stirring, the crystals are filtered off, washed with butanol and chloroform, and dried in vacuo.
A yield of 8.7 g of tetracycline hydrochloride is obtained, assaying 970 micrograms per mgo EXAMPLE 2 - Tetracycline hydrochloride.
A boil of 10 g of tetracycline hydrochloride titrating 340 micrograms per mg is prepared in 50 cm3 of n-butanol containing 3% of water.
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By adding 5.9 cm3 of triethylamine and stirring for 20 min, a clear solution is obtained which is treated with 0.5 g of decolorizing carbon for
10 min, and filtered. The clear filtrate is acidified to a pH of
1.7, which requires about 3.9 m 3 of concentrated hydrochloric acid. Crystals start to form, and they are allowed to age for 47 h with stirring, after which the crystals are separated from the solvent by filtration. After washing with 10 cm3 of n-butanol and 10 cm3 of chloroform, and after drying under vacuum, 8.8 g of tetracycline hydrochloride are obtained, which on analysis gives 975 micrograms per mg.
EXAMPLE 3. -
Tetracycline hydrochloride.
20 g of crude tetracycline hydrochloride are dissolved in 100 cm3 of ethanol containing 5% water, stirring with 11.7 cm3 of triethylamine.
A small amount of magnesium silicate filter aid is added, and the solution is filtered. The clear solution is acidified to pH
1.6 with concentrated hydrochloric acid, a seed is introduced, and then allowed to crystallize for 28 h, then filtered, washed with ethanol, then with chloroform, the crystals of tetracycline hydrochloride separated, then we vacuum dry? The product titrated 985 micrograms per mg.
EXAMPLE 4. Tetracycline hydrochloride.
5 g of crude tetracycline hydrochloride is suspended in 50 cm3 of tetrahydrofuran: Dissolution is carried out by adding 2.9 cm3 of triethylamine, with stirring for 10 mm. The solution is filtered, and 1.75 cm3 of concentrated hydrochloric acid are added thereto, and the mixture is allowed to age for 75 hours. The crystals are centrifuged, washed with tetrahydrofuran, chloroform, and dried in vacuo. A yield of 3.2 g of tetracycline hydrochloride is obtained, having a purity of 950 g micrograms per mg.
EXAMPLE 5. Tetracycline hydrochloride. -
20 g of neutral tetracycline are dissolved in 80 cm3 of dimethylformamid.e, with gentle stirring: The solution is filtered and divided into two equal parts. To one of the portions, concentrated hydrochloric acid is added to pH, 5, and 240 cm3 of chloroform. After aging, the crystals are filtered off, washed with chloroform and dried, the yield is 6.1 g of tetracycline hydrochloride, assaying 970 micrograms per mg.
EXAMPLE 6. - Tetracycline hydrochloride.
10 g of tetracycline hydrochloride titrating 890 micrograms per mg are mixed with 50 cm3 of 2-ethoxy-ethanol containing 5% water. Add 5.9 cc of trietylamine, stir the composition for 20 mm and filter with diatomaceous earth as a filter aid.
To the clarified solution, enough hydrochloric acid is added to adjust the pH to 1.7, a seed is introduced into the mixture, and the mixture is allowed to age with stirring for 46 h. After filtration, washing with 2-ethoxyethanol and with water, 8.4 g of tetracycline hydrochloride are obtained, assaying 995 micrograms per mg.
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EXAMPLE 7 Tetracycline hydrobromide.
Example 6 is repeated using 10N hydrobromic acid instead of hydrochloric acid. 5.2 g of tetracyclin hydrobromide are obtained, assaying 870 micrograms per mg.
EXAMPLE 8.
Tetracycline hydrochloride.
Example 6 is repeated using two equivalents of ethyl morpholine instead of triethylamine. A yield of 8.1 g of tetracycline hydrochloride is obtained, assaying 985 micrograms per mg.
EXAMPLE 9.
Tetracycline hydrochloride.
Example 6 is repeated using two equivalents of ethanolamine instead of triethylamine. A yield of 7.6 g of tetracycline hydrochloride is obtained, assaying 950 micrograms per mg.
EXAMPLE 10.
Tetracycline hydrochloride.
Example 6 is repeated using two equivalents of beta-phenylethylamine instead of triethylamine. A yield of 6.3 g is obtained assaying 990 micrograms per mg of tetracycline hydrochloride.
EXAMPLE 11.
Tetracycline hydrochloride.
Example 6 is repeated using two equivalents of tri-n-butylamine instead of triethylamine. A yield of 8.4 g is obtained assaying 985 micrograms per mg of tetracycline hydrochloride.
EXAMPLE 12.
Tetracycline hydrochloride.
Example 6 is repeated using two equivalents of triethanolamine instead of triethylamine. A yield of 7.0 g is obtained assaying 960 micrograms per mg of tetracycline hydrochloride.
EXAMPLE 13.
Neutral tetracycline.
Preparing a solution of 25 g of crude tetracycline hydrochloride in 150 cm3 of dry methanol, adding 14.6 cm3 of triethylamine and stirring for 10 minutes. After filtration, 30 cm3 of water are added and the pH is adjusted to 5 , 6 with concentrated hydrochloric acid. The neutral tetracycline begins to oristallize, but the slurry is allowed to age for 20 h before filtration. The crystals of neutral tetracycline are washed with a mixture of methanol and water, then with water, then with iso alcohol. - propyl, tetracycline crystals (neutral) represent 17.3 g and titrate 985 micrograms per mg.
EXAMPLE 14.
Neutral tetracycline.
The second portion of Example 5 is mixed with 250 cm3 of water.
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Tetracycline begins to crystallize almost immediately. The mixture is left to stand for 5 h, filtered, the crystals washed with water, chloroform, and dried in vacuo. A yield of 4.0 g of neutral tetracycline is obtained, assaying 940 micrograms per mg.
EXAMPLE 15.
Neutral tetracycline.
10 g of crude tetracycline hydrochloride are stirred in a solution containing 1.98 sodium tetraborate decahydrate in 100 cm 3 of water. ION sodium hydroxide is added to pH 9, and the tetracycline hydrochloride dissolves rapidly. After filtration, the pH is adjusted to 5.6 with concentrated hydrochloric acid. Neutral tetracycline precipitates, and is allowed to stand, with stirring, for 5 h. The product is washed with water and chloroform, and dried in vacuo at room temperature.
A yield of 5.6 g of neutral tetracycline is obtained, assaying 1005 micrograms per mg.
EXAMPLE 16.
Neutral tetracycline.
10 g of crude tetracycline hydrochloride is dissolved in 50 cm3 of 2-ethoxyethanol containing 5% water, while stirring for 15 min with 5.9 cm3 of triethylamine. After filtering to separate the impurities, 100 cm3 of water are added and the pH adjusted to 5.6 with concentrated hydrochloric acid. The mixture is allowed to age for 17 h, while stirring, the crystals are filtered off, washed with 2-ethoxyethanol and chloroform: After drying under vacuum, 6.7 g of neutral tetracycline are obtained. - trant 965 micrograms per mg.
EXAMPLE 17.
Sodium tetracycline.
5 g of tetracycline hydrochloride are suspended in 35 cm3 of methanol. To the suspension, sufficient 50% aqueous sodium hydroxide is added to raise the pH to 8.5. A clear solution forms which is filtered to remove traces of impurities. 35 cm3 of acetone are added. On standing, sodium tetracycline precipitates as needle crystals. 4 g of sodium tetracycline are recovered.
EXAMPLE 18.
Sodium tetracyline.
25 g of neutral tetracycline are suspended in 100 cm3 of methanol. To the suspension, enough 50% aqueous sodium hydroxide is added to raise the pH to 9.2. A clear solution results. The solution is filtered to remove traces of impurities, and 100 cm3 of acetone is added. On standing, sodium tetracycline precipitates in the form of needle crystals. The crystals are washed with methanol, then with ether, and dried over phosphorus pentoxide. 25 g of sodium tetracycline are obtained which assay 873 micrograms per mg.
EXAMPLE 19 Calcium Tetracycline
9.61 g (0.02 mole) of tetracyclin hydrochloride, ristallized in 50 cm3 of anhydrous methanol, are suspended and the mixture is slowly treated.
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with 8.4 cm3 (0.06 mol) of redistilled triethylamine. Continued agitation. naked gives a clear solution of tetracycline-tri-ethylamine. To this clear solution, which has a pH of about 9.0, is added with vigorous stirring 6.20 g (0.02 mole) of calcium lactate pentahydrate dissolved in 25 cm 3 of hot methanol. Calcium tetracycline immediately precipitates.
Stirring is continued for a further 120 min, while cooling to 2 ° C. The precipitated calcium salt is easily filtered off, washed with methanol, then with ether, and finally dried in air overnight. 7.0 g of titrating material are obtained 950 micrograms per mgo EXAMPLE 20 - Calcium tetracycline.
9.61 g (0.02 mole) of tetracycline hydrochloride are suspended in 50 cm3 of methanol, and treated with 2.8 cm3 (0.02 mole) of triethylamine.
After stirring, a solution having a pH of 5.7 is obtained, which is treated with 1.0 g of activated carbon, and then filtered. To this clear solution is added a solution of 6.20 g of calcium lactate pentahydrate in 50 cm3 of hot methanol containing 5.6 cm3 of triethylamine. Calcium tetracycline precipitates, and is filtered after stirring for 20 min. After washing with methanol, the product is dried and it is 920 micrograms per mg.
EXAMPLE 21 Magnesium Tetracycline
9.61 g (0.02 mole) of crystalline tetracycline hydrochloride is suspended in 50 cm3 of anhydrous methanol and slowly treated with 8.4 cm3 (0.06 mole) of redistilled triethylamine. - holds a clear solution of tetracycline-triethylamine. To this clear solution, which has a pH of about 9.0, 4.06 g (0.02 mole) of magnesium chloride hexahydrate dissolved in 15 cm3 of hot methanol is added with stirring. Magnesium tetracycline precipitates immediately. Stirring is continued for a further 120 min, while cooling to 2 ° C. The calcium salt precipitates easily filtered off, washed with methanol, then with ether, and finally dried in air. overnight. 6.4 g of material titrating 930 micrograms per mg are obtained.
CLAIMS
1. - Process for recovering effective therapeutic forms of tetracycline in the purified state from a material containing tetracycline, characterized in that a solution of the raw material in one or more polar solvents, pH is prepared from the solution being 5 to 10, all insoluble impurities are separated, the system is converted to a system in which the desired form of tetracycline is less soluble to obtain a precipitate, and the pre-tetracycline form is recovered. - rushed.