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PERFECTIONNEMENTS A LA PURIFICATION DES MATIERES CONTENANT DE
L'AUREOMYCINE.
La présente invention concerne la purification des matières contenant de l'auréomycine.
Lauréomycine est un nouvel antibiotique dont la préparation et un procédé d'isolement sont décrits dans le brevet américain n 2.482.055 du 13 septembre 1949.
La demanderesse a trouvé un nouveau procédé grâce auquel on peut séparer 1?auréomycine d'une solution aqueuse en contenant et avec laquelle peuvent être associées certaines impuretés.9 par son interaction avec un dérivé organique anionique de 1?acide sulfurique, de formule gé- nérale R-On-SO2OH, dans laquelle n est un nombre non inférieur à 0 et non supérieur à 1, R est un radical organique hydrophobe, le poids molé- culaire de cette matière nétant pas inférieur à environ 210,pour for- mer un composé du type sel que 1-'on peut ensuite séparer et récupérer tel quel ou transformer en un sel thérapeutiquement désirable d9auréomy- cineo
Le dérivé organique anionique de 1-'acide sulfurique selon 1?invention est du type polaire-non polaire,
ce qui peut partiellement expliquer ses propriétés inhabituelles. Il contient le groupement po- laire hydrophyle dérivé de 1?acide sulfurique comprenant au moins un hy- droxyle ayant un hydrogène ionisable et une partie non polaire hydrophobe tel qu'un groupement alkyles aralkyle, alkaryle, aryle, haloaryle ou azo- aryle qui peut être fixé soit par une liaison carbone-soufre, formant un acide sulfonique, soit par une liaison carbone-oxygène-soufre, formant un ester d9acide sulfurique ou un sulfatée Un seul de ces groupements peut être fixé car le reste acide sulfurique doit converser un hydrogène rempla- gable pour la liaison à la molécule d'auréomycine.
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Dans le but recherché on doit utiliser ces dérivés organiques anioniques de l'acide sulfurique à un pH inférieur à 3. L'acidité peut résulter partiellement de l'utilisation d'acides sulfoniques libres ou de monosulfates et partiellement de l'addition d'autres acides forts tels que l'acide sulfurique ou l'acide chlorhydrique. Lors de l'utilisation, on utilise commodément les sels diacides sulfoniques ou sulfates préci-" tés dans des conditions telles que le sel soit transformé en acide libre.
L'utilisation, par exemple, du sel de sodium de l'acide sulfonique ou du' sel de sodium du sulfate mono-ester avec suffisamment d'acide chlorhydrique pour abaisser le pH au-dessous de 3 donne efficacement en solution l'aci- de sulfonique libre ou le sulfate libre, ce qui pour le but recherché est considéré comme équivalent, car 1?acide sulfonique et le sulfate ester ont le même effet en solution acide.
Les sels de sodium de ces composés sont'la forme commerciale ordinaire, mais on dispose parfois d'autres sels alcalins ou alcalino-terreux que l'on peut utiliser @ Certains des dérivés organiques anioniques de l'acide sulfuri- que selon l'invention sont du type utilisé comme agents mouillants, et d'autres sont du type utilisé comme colorantso On préfère utiliser, pour des raisons économiques, des dérivés organiques anioniques de l'acide sul- furique non toxiques, non colorés, à bon marché,et que l'on peut obtenir industriellement. On peut utiliser des matières colorantes colorées, aussi bien que des sulfates ou des acides sulfoniques toxiques, à condition que l'auréomycine finale soit suffisamment débarrassée de ces matières pour être commercialement acceptable.
Certaines de celles-ci sont ven- dues sous des marques commerciales et on les désignera plus commodément ainsi. .Les sels de sodium sont les plus commercialement répandus. Les produits commerciaux sont fréquemment des mélanges. Par exemple, les sulfates d'alkyle commerciaux ont des chaînes de longueur variable. On peut commodément utiliser des mélanges de plus d'un de ces dérivés, bien qu'il soit préférable d-utiliser les matières disponibles sur le marché.
Parmi les autres matières que l'on a trouvé satisfaisantes se trouvent le sulfate de tétradécyl-sodium connu sous la marque "Tergitol-4"; le sel de sodium de sulfo-succinate de di- (2-éthylhexyle) venducommer- cialement sous la marque "Aérosol-OT"; le sulfate d'heptacédyle; le sul- fonate d'alkaryle vendu sous la marque "Santomerse-1"; le sulfate de lau- ryl-sodium vendu sous la marque "Duponol C"; le sel de sodium du sulfate de 2-éthylheptyle vendu sous la marque "Tergitol 8"; l'un quelconque des sulfates d'alkyle ayant de 10 à 20 atomes de carbone ou leurs mélanges; les acides aryl; aralkyl; ou alkylaryl-sulfoniques ayant de 10 à 25 ato- mes de carbone;
les acides 2,5-dichlorobenzènesulfonique, para-xylènesul- fonique, 4-hydroxyazobenzène-4'-sulfonique, 2,4-dinitronaphtol-7-sulfoni- que, 5-sulfosalicylique, 2,4-dichlorophénol-6-sulfonique., 2-chlorotoluène- 5-sulfonique, 4-nitrochlorobenzène-2-sulfonique, 2-naphtalène sulfonique, 2,4-dihydroxyazobenzène-4'-sulfonique et leurs sels, l'huile de rouge turc, etc..
On a déjà utilisé certains acides sulfoniques et sulfates pour le raffinage d9antibiotiques fortement basiques tels que la Strepto- mycine. Voir en particulier les brevets américains n 2.537.933 et 2.537.934 du 9 janvier 1951. Cependant ces brevets décrivent 1-'utilisa- tion d'un sel d9un acide fort et d9une base et la formation de sels ne peut se produire qu'au voisinage de la neutralité. La demanderesse a trouvé que sous 1-'effet d'un tel traitement 1?auréomycine ne donnait pas un sel satisfaisant.
Au contraire de ces antibiotiques antérieurs, l'auréomycine est un antibiotique à large spectre qui inhibe la croissance des bacté- ries à réaction de Gram positive et négative, de certains "ricksettsia" et de nombreux autres organismes. Il se peut que ses remarquables carac- téristiques telles qu'un large spectre soient liées à sa nature essentiel- lement amphotère. Comme il est amphotère, on ne peut pas le traiter de la même façon qu'un antibiotique basique pour le raffiner.
La demanderesse
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a fait la découverte remarquable qu'en solution fortement acide,à un pH inférieur à 3, la phase acide de la nature amphotère de l'antibiotique est inhibée et ses caractéristiques acides masquées par la nature fortement acide de son entourage, de sorte qu'il présente des caractéristiques suf- fisamment basiques pour former un composé du type sel avec les dérivés or- ganiques.anioniques de l'acide sulfurique précités.
Jusqu'ici, on a séparé 1.9 auréomycine de son milieu de fermen- tation par des processus tels que 1?adsorption chromatographique ou l'ex- traction par un solvant. L9adsorption chromatographique est relativement coûteuse et 1?extraction de l'auréomycine ou de son sel avec un acide miné- ral par un solvant est susceptible de causer des difficultés en raison de la corrosion de 1?appareillage ou des grandes quantités de solvant mises en oeuvre etc...
La demanderesse a trouvé que 1-'on peut récupérer l'auréomycine d'une solution acide en la faisant réagir à un pH inférieur à 3 avec un dérivé organique anionique de l'acide sulfurique. Par le terme "auréomy- cine" on désigne non seulement 1-9 auréomycine sous forme de son sel avec un acidetel que par exemple le chlorhydrate d'auréomycine, mais encore 1?auréomycine neutre,parfois désignée sous le nom de base libre et le sel de 1-'auréomycine avec une base, tel que le sel de sodium. Ceci est en accord avec la pratique pharmaceutique, car les sels d'auréomycine sont thérapeutiquement aussi efficaces sous ces trois formes.
On peut former la solution acide en dissolvant l'auréomycine, sous forme de son sel avec un acide, dans l'eau ou bien on peut la former en dissolvant la base libre auréomycine dans l'eau en présence de suffi- samment diacide pour abaisser le pH au-dessous de 3, ou bien on peut la former en dissolvant un sel d'auréomycine avec une base dans l'eau en pré- sence de suffisamment d'acide pour abaisser le pH au-dessous de 3. Pour le but de l'invention, il n'est pas nécessaire que la totalité de l'auréo- mycine soit dissoute. Le sel acide peut être présent sous forme non dis- soute par exemple en suspension, mais il agit pour le but de l'invention comme solution et on le désignera comme tel.
De plus, il est particulièrement commode de former la solu- tion acide par acidification d'une masse de fermentation dans laquelle l'auréomycine est produite et en séparant les matières insolubles par filtration. On peut également former la solution acide par extraction par Peau acidifiée, d'un gâteau formé par filtration de la masse conte- nant 1-'auréomycine dans des conditions telles que l'auréomycine se pré- sente sous une forme insoluble. L'auréomycine en solution acide prove- nant de 1?une quelconque de ces sources est effectivement la même car, à un pH inférieur à 3 en présence d'eau, elle agit effectivement comme solution aqueuse de son sel avec lracide.
On peut clarifier 1-lune quelconque de ces solutions d'auréomycine en utilisant un charbon déco- lorant ou par tout autre procédé connu. La nécessité de cette décolora- tion dépend évidemment dans une large mesure des matières et départ initiales.
A la solution acide d9auréomycine on peut alors ajouter le dérivé organique anionique d9acide sulfurique avec suffisamment d'acide pour s9assurer que le pH reste au-dessous de 3. L'ordre de 1?addition n'est pas importante car le composé d'auréomycine du type sel et du dé- rivé organique anionique diacide sulfurique forme la matière la moins soluble présente et tend à se séparer.
On peut recueillir le composé du type sel de la solution acide par filtration, centrifugation ou toute autre forme de séparation.
On peut naturellement utiliser les sels diacides sulfoniques tels quels ou sous forme de produit commercial.:, la transformation finale à la forme thérapeutique étant retardée jusqu'à une occasion économiquement favora- ble.
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On peut recristalliser ce composé dans un solvant organique-et l'utiliser thérapeutiquement tel quel. En utilisant un dérive organique anionique non toxique de l'acide sulfurique tel que certains des agents mouillants tensio-actifs qui sont montrés non toxiques en petite quantité, on obtient un produit que l'on peut administrer directement.
Il est pré- férable de'décomposer le composé du type sel, par exemple par double dé- composition, pour obtenir un sel d'auréomycine avec un acide d'administra- tion plus usuel tel que l'acide chlorhydrique ou le soumettre à une double décomposition pour former le chlorhydrate, puis transformer le chlorhydra- te en toute autre forme que l'on peut désirer pour l'administration, telle que la base libre ou le sel avec un métal alcalin ou alcalino-terreux tel que le calcium. Comme certains des sels sulfoniques ou sulfatés tendent à se séparer sous une forme amorphe ou non cristalline, on a trouvé parti- culièrement commode de les extraire de la suspension aqueuse dans laquelle ils se forment par un solvant présentant un coefficient de répartition élevé en faveur du solvant.
On peut réaliser l'extraction sous forme d'une extraction simple, d'une extraction multiple, d'une extraction à contre courant ou dans certaines machines d'extraction liquide-liquide.
Par commodité il est préférable d'utiliser une quantité de 1?acide sulfonique ou de l'ester sulfate permettant un rapport d'auréo- mycine légèrement supérieur à un groupement acide par molécule d'auréomy- cine et on trouve qu'un rapport moléculaire allant jusqu'à environ 3 ou supérieur à 1 en accord avec le faible degré d'action de masse provoque un déplacement d'équilibre en un point donnant une récupération améliorée.
Le type d9impuretés présentes et le prix relatif de diverses matières in- fluent sur le rapport exact économiquement préférable dans des conditions données.
On peut noter que dans une telle extraction, il est possible et parfois préférable de modifier l'ordre d'addition des composés. Par exemple, on peut ajouter 1?acide sulfonique ou le sulfate avec le sol- vant dans lequel on peut le dissoudre, ou l'ajouter avant ou après l'ad- dition du solvant ou avant ou après 1-'acidification de la solution. Il est seulement nécessaire que la solution ait un pH inférieur à 3 quand on met en contact le solvant avec l'auréomycine et l'acide sulfonique ou sulfate pour obtenir 1-'extraction du composé d'auréomycine du type sel avec le sulfate ou l'acide sulfonique dans la couche solvant.
Comme solvant, on a trouvé que les solvants organiques usuels, dans lesquels un résidu organique hydrophile tend à être soluble, forment de bons solvants. Parmi eux, on peut citer les hydrocarbures halogénés, tels que le bichlorure d'éthylène, le trichloro-éthane, le trichloroéthy- lène, le bichlorure de propylène, le chloroforme, 1-'eau, les monoesters de glycol non miscibles à 1?eau tels que le phénylcellosolve, les esters or- ganiques tels que le phtalate de diméthyle, le phtalate acide d'éthyle, l'acétate d'isopropyle, 1-acétate de butyle, les éthers et les éthers substitués tels que l'éther dichloroisopropylique,
les cétones telles que la méthylisobutylcétone ou toute autre des cétones supérieures non misci- bles ou des cétones plus solubles rendues non miscibles à l'eau par l'ad- dition d'un sel à la couche aqueuse. Les alcools ayant 4 atomes de car- bone ou davantage tels que le méthylisobutylcarbinol, les hexanols, le butanol, l'alcool amylique, etc.. sont de bons solvants.
On peut concentrer la solution du composé type sel dans le solvant organique non miscible à Peau par évaporation d'au moins une par- tie du solvant à une température ne dépassant pas environ 60 , On peut évaporer la totalité du solvant et utiliser tel quel le sel ainsi isolé ou le soumettre à une double décomposition ou le transformer d'une autre fa- çon en une forme thérapeutiquement désirée ou plus économiquement on peut le soumettre à une double décomposition dans la solution du solvant or- ganique.
On a trouvé qu'en ajoutant un sel tel que le chlorhydrate de triéthylamine ou le chlorure d'ammonium ou tout autre chlorhydrate de base azotéeou du chlorure de calcium, etc... à la solution, il se forme le
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sel de triéthylamine ou le sel correspondant du sulfate ou de l'acide sul- fonique, qui reste dissous et 1$auréomycine se sépare sous forme de chlor- hydrate que 1?on peut séparer de la solution.
Ou bien, on peut ajouter au solvant un solvant mutuel misci- ble à 1?eau tel quun alcool inférieur¯, comme le méthanol ou le 2-éthoxyétha- nol, puis ajouter à ce solvant mixte un acide minéral tel que l'acide chlor- hydriqueo Ceci provoque une double décomposition du composé d'auréomycine du type sel libérant l'auréomycine sous forme de son chlorhydrate que l'on peut séparer du solvant mixte sous forme d'un précipite.
@ On peut séparer l'auréomycine en ajoutant une base pour élever le pH de la solution, auquel cas 1?auréomycine se sépare sous forme de 1?auréomycine neutre ou du sel avec la base, selon la quantité ajoutée.
La solubilité diminue rapidement après que 1?acidité a diminué jusqu'à un pH supérieur à environ 3.
Les spécialistes de la question trouveront de même tout autre procédé de décomposition et de séparation du composé d9auréomycine du type sel, ainsi que des procédés de transformation du composé à la forme parti- culière dDauréomycine que le praticien peut désirer pour le traitement d'un état pathologique déterminé.
On comprendra mieux l'invention en se référant aux exemples suivants :
EXEMPLE 1.
On prépare une solution contenant 3,5 g d'auréomycine neutre brute donnant aux essais 800 gamma par mg dans 1500 ce d'eau. A cette so- lution on ajoute 1,7 g du sel de sodium de l'acide 2,4-dichlorophénol-6- sulfonique. On agite le mélange et on ajuste le pH à 2 par addition diacide sulfurique à 25%. Quand 1-'équilibre est établi on extrait la so- lution avec 375 cc de méthylisobutylcétone. On ajoute à la phase aqueuse une portion supplémentaire de 1 g de 2,4-dichlorophénol-6-sulfonate de so- dium et on extrait à nouveau par des portions de 150 cc de méthylisobutyl- cétone. On réalise trois fois ces extractions. Le raffinat donne aux essais 51 gamme par cc, ce qui indique une extraction presque complète.
On combine les fractions de solvant séparées pour former une phase sol- vant unique de 774 ce donnant aux essais 3480 gamma par cc. On concentre l'extrait sous pression réduite à une température ne dépassant pas 40 à un volume de 31 ce. Au concentrat on ajoute 0,6 oc d'acide chlorhy- drique concentré, ce qui provoque la précipitation immédiate du chlorhy- drate dauréomyoine sous forme amorphe. On sépare le précipité par fil- tration et on le met en suspension avec 5'cc de 2-éthoxyéthanol (cello- solve)a Le produit amorphe cristallise alors donnant un rendement de ' 2,15 g du chlorhydrate d'auréomycine purifié.
Le produit donne aux,es- sais 994 gamma par mg, ce qui indique un chlorhydrate d9auréomycine pur et représente une récupération de 69% de Inactivité initiale.
On peut noter que le chlorhydrate d'auréomycine peutvenir soit sous forme amorphe,soit sous forme cristalline selon la présence de cristaux d'ensemencement. On peut utiliser le même processus avec 19une ou l'autre forme.
EXEMPLE 2.
On ajuste 2 litres d'une masse de fermentation d'auréomycine contenant des ions calcium et donnant aux essais 1100 gamma par cc à un pH de 8,5 par addition de soude à 25% en solution. On ajoute au mélange un demi pour cent en poids de terre à diatomées comme adjuvent de filtra- tion et on sépare les solides par filtration. On met le gâteau filtré
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en solution dans un litre d-eau et on l9acidifie à un pH de 1,5 par addi- tion diacide sulfurique à 25%. On chauffe le mélange à 55 , on agite pen- dant 20 minutes et on sépare les solides par filtration. On réalise une seconde extraction du gâteau filtré avec 1 litre supplémentaire d'eau aci- difiéé au même pH. On réunit les deux extraits qui donnent aux essais 960 gamma par ce.
On ajoute 1,5 g diacide 2,4-dichlorophénol-6-sulfonique sous forme du sel de sodium et on extrait la solution par 500 cc de méthyl- isobutylcétoneo On sépare la phase solvant et on traite à nouveau la pha- se aqueuse par 1,5 g supplémentaire de 2,4-dichlorophénol-6-sulfonate de sodium et on l'extrait par 200 ce de méthylisobutylcétone, puis successive- ment par deux portions supplémentaires de 200 cc de méthylisobutylcétone.
Le pH reste au-dessous de 3. Le raffinat final donne aux essais 29 gamma par cc, ce qui indique une extraction pratiquement complète. On réunit les extraits du solvant et on les concentre sous pression réduite, à une température ne dépassant pas 55 , à 27 ce. Au concentrât, on ajoute 0,5 ce diacide chlorhydrique concentré et on refroidit le mélange à 0 . Il se
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forme du chlorhydrate d9auréomycine amorphe que 1-'on filtre et que l'on met en suspension avec 4 cc de 2-éthoxyéthanolo Le chlorhydrate amorphe forme des cristaux dans le 2-éthoxy-éthanpl, ce qui donne 1,27 g de chlorhydrate d9auréomycine donnant aux essais 860 gamma pag mg.
EXEMPLE 3
On acidifie 3 litres d'une masse d'auréomycine provenant di-
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rectement des réservoirs de fermentation et dpnnant aux essais 1000 gam- ma par ce à un pH de 2,0, avec de l'acide sulfurique à 25%. On agite la masse acidifiée pendant 30 minutes et on la filtreo Au filtrat clair on ajoute 1 g de 2,4-dichlorophénol-6-sulfonate de sodium. On extrait ensui-
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te le mélange par 560 cc de méthylisobutylcétoneo On ré-extrait la cou- che aqueuse après addition de 0,8 g de 2,4-dichlorophénol-6-sulfonate de sodium par quatre portions successives de 250 cc de méthylisobutylcétone.
Le pH reste au-dessous de 3- La couche aqueuse usée donne aux essais 47 gamma par ce, ce qui indique une extraction presque complète. On réu- nit les couches solvant et on les traite par 0,7 g de charbon décolorant en utilisant le produit commercial "Darco G 60". Après filtration du carbone, on concentre la solution claire sous pression réduite, à une tem- pérature ne dépassant pas 50 , à un volume de 22 ce. Au concentrat on ajoute alors 0,35 cc diacide chlorhydrique concentréo On sépare par fil-.
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tration le précipité de chlorhydrate d9auréomycîne amorphe et on le met en suspension dans 5 cc d$éthylcellos01ve ce qui provoque la cristalli- sation de 1?auréomycine sous forme de chlorhydrate deaureomyoine.
On obtient 0,72 g de chlorhydrate d2auréomycine jaune clair donnant aux essais 960 gamma par mg.
On peut utiliser d9autres acides que 1?acide chlorhydrique pour cette phase, mais la profession médicale préfère ce sel et par suite il est préférable d'opérer ainsi.
EXEMPLE 4.
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4-hydroxyazobenzène-4$-sulfonate d9auréom.ycineo On prépare une solution de 3 g du sel de sodium de 19 acide ,-hydroxyazobenzène 49-sulfonique dans 300 ce d'eau à 60 . On y ajoute à sec 5 g d9un chlorhydrate deauréomycine impur. On ajoute suffisamment d9acide chlorhydrique pour abaisser le pH à 2,0. On agite le mélange à 60 pendant 45 minutes, temps pendant lequel se forme un précipité de
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4-hydroxy-azobenzène-4'-sulfonate deaureomyoine cristallin. On refroidit le mélangeon le filtre, on lave les cristaux à 1?eau froide et on sèche; On obtient un rendement de 6,77 g sous forme de rosaces orange, ces cris'
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taux donnant aux essais 710 gamma par mg à 1-'essai microbiologique. Les cristaux ont un point de fusion (non corrigé) de 235 avec décomposition.
La liqueur mère donne aux essais 150 gamma par ce. En se basant sur une
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formule empirique supposée de C22H26"2 cio 8* HG1 pour le chlorhydrate d'au- réomycine la formule empirique du produit obtenu est C34H34N4012SCl. Ceci donne une analyse calculée de
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<tb> Calculé <SEP> Trouvé
<tb>
<tb> Carbone <SEP> 53,8 <SEP> 52,4
<tb>
<tb> Hydrogène <SEP> 4,6 <SEP> 5,1
<tb>
<tb> Azote <SEP> 7,4 <SEP> 7,2
<tb>
<tb> Soufre <SEP> 4,2 <SEP> 4,1
<tb>
<tb> Chlore <SEP> 4,7 <SEP> 4,5
<tb>
EXEMPLE 5.
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291-dichlorophénolm6-sulfonate d9aur' cine. On prépare une solution en dissolvant 5 g d-auréomyoine sous forme de la matière libre dans 100 ce d'eau acidifiée par 3 ce d'acide sulfurique à 25%. On y ajoute une solution préalablement préparée de
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2,92 g de 2,L,.-âiehlorophénol-6-sulfonate de sodium dans 50 cc d'eau goutte à goutte et en agitant, Inexpérience étant conduite à la tempéra- ture ambiante. Le pH reste au-dessous de 3. Il se forme un précipité
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de 2,4-4ichlorophénol-6-sulfonate d9auréomcineo On sépare ce précipité par filtration, on le lave à l'eau et on le sèche; le rendement est de 6,73 g- d'un produit cristallin jaune donnant aux essais 730 gamma par
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mg.
Les cristaux fondent à 159-1610 avec décomposation (non corrigé).
Etn se basant sur une formule empirique supposée de C 22 26 N 2 cloe.Hoi pour le chlorhydrate dsauréomycine9 la formule empirique du produit ob- tenu est C2SH2SN20 12SC 13 Ceci donne una analyse calculée de
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<tb> Calculé <SEP> Trouvé
<tb>
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Carbone !6 96 46 6
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<tb> Hydrogène <SEP> 4,0 <SEP> 3,9
<tb>
<tb> Azote <SEP> 3,8 <SEP> 4,1
<tb>
<tb> Soufre <SEP> 4,4 <SEP> 4,6
<tb>
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Chlore 7.1,. 97 13.8 EXEMPLE 6.
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294 dini.tronaphtolm7msulionate d9auréompcinea On dissout 5 g d'auréomycine neutre dans 100 cc d'eau acidifiée par 2 ce dl> aC='rde sulfurique à â5%o On chauffe la solution à 40
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et on la traite goutte à goutte à cette température par une solution prépa-
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rée à -avance contenant 3,3 g diacide 2,4-dinitronaphtol-?-sulfônique en agitant. Le pH reste au-dessous de 3. Un sulfonate cristallin jaune préci- pite. On refroidit le mélange réactionnel à 4 , on sépare le précipité - par filtration, on le lave à l'eau froide et on le sèche sous vide. On ob- tient un rendement de 7,25 g de 2,4-dinitronaphtol-7-sulfonate d'auréomy- cine donnant aux essais 754 gamma par mg. Les cristaux fondent à 206-210 avec décomposition (non corrigé).
EXEMPLE 7.
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2-chlorotoluène-5-sulfonate d9auréomycine.
On prépare une solution contenant 5 g d'auréomycine libre dans 100 cc d'eau acidifiée par 2 ce d'acide sulfurique à 25 %. On y ajoute, en agitant, goutte à goutte, une solution de 2,35 g de 2-chlorotoluène-5sulfonate de sodium dans 85 cc d'eau chaude,ce qui forme un précipité cristallin fin. On refroidit le mélange à 4 et on le laisse reposer jusqu'au lendemain, on sépare par filtration le 2-chlorotoluène-5-sulfonate d'auréomycine résultant, on le lave à l'eau et on le sèche sous vide. On obtient un rendement de 5,82 g donnant aux essais 812 gamma par mg.
EXEMPLE 8.
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225-dichlorobenzène sulfonate d'auréomycine.
On répète le processus précédent en utilisant 2,59 g de 2,5-di- chlorobenzène sulfonate de sodium, ce qui donne 5,45 g de 2,5-dichloro- benzène sulfonate d'auréomycine dont l'analyse indique 830 gamma par mg
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d-1 aure"oimycine.
EXEMPLE 9.
4-nitrochlorobenzène-2-sulfonate d'auréomycine.
On traite 5 g d9auréomycine neutre avec 130 cc d'acide sulfuri- que dilué pour obtenir une solution ayant un pH de 1,5. A cette solution, on ajoute goutte à goutte en agitant une solution chaude de 3 g de 4-ni- trochlorobenzène-2-sulfonate de sodium dans 120 cc d'eau. Il se forme un précipité brun clair que l'on sépare par filtration après refroidisse- ment et repos, ce qui donne 5,26 g de E,.-nitrochlorobenzène-2-sulfonate d'auréomycine qui donne aux essais 750 gamma par mg. La matière a un point de fusion, non corrigé, de 169-173 .
EXEMPLE 10.
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On traite un échantillon de 2,0 litres d'extrait à l'eau aci- difiée, obtenue par extraction d9un gâteau alcalin, par 7,5 g de sulfate de lauryl-sodium. On extrait la solution par 500 cc d'acétate de n-propy- le divisé en deux portions. La solution aqueuse initiale donne aux es- sais 1250 gamma par cc; le raffinat donne aux essais 240 gamma par cc. On concentre sous vide à une température inférieure à 35 l'extrait par sol- vant à 10% de son volume initial. Pendant la concentration se forme un précipité du sel d'auréomycine du laurylsulfate. On filtre le concentrât et on dissout le sel amorphe dans 10 cc d'alcool éthylique. On filtre la
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solution et on l'acidifie avec 1,0 cc d'acide chlorhydrique 6 N.
Le chlor- hydrate d'auréomycine cristallise dans la solution et on le sépare par fil- tration après repos à la température ambiante pendant 12 heures. On ob- tient un rendement de 1,25 g de chlorhydrate d'auréomycine donnant aux es- sais 940 gamma par mg.
EXEMPLE 11, ----------
On traite un échantillon de 2,5 litres d'extrait par l'eau acidifiée,donnant aux essais 1500 gamma par ces, par 200 cc d'une solu- tion à 25% de 2,9-diéthyl-tricédane-6-sulfate de sodium "Tergitol-7".
On extrait la solution par 600 cc de méthylisobutylcétone divisés en trois portions. Le raffinat donne aux essais 30 gamma par ce, ce qui indique une extraction presque complète. L'extrait par solvant est concentré sous vide à 10% de son volume initial à une température ne dépassant pas 35 . Le concentrat est une suspension de 2,9-diéthyltridécane-6-sulfate d'auréomycine. A cette suspension, on ajoute 2,0 ce d'acide chlorhydrique 6 N. Après agitation pendant 5 heures, on sépare par filtration le chlor- hydrate d'auréomycine amorphe résultant. On met alors en suspension le sel amorphe avec 6,0 cc de cellosolve dissoute. En continuant d'agiter, le chlorhydrate d'auréomycine cristallise dans la solution. On le sépare par filtration, on le lave à la cellosolve et à l'alcool et on le sèche.
On obtient un rendement de 2,6 g de chlorhydrate d'auréomycine ayant un potentiel de 920 gamma par mgo
EXEMPLE' 12.
On ajoute à la température ambiante 400 cc de bichlorure d'é- thylène à 16 litres d'une solution àqueuse d'auréomycine acidifiée donnant aux essais 1560 gamma par ce à un pH de 1,0. On agite le mélange pendant environ 2 minutes,après quoi on y ajoute 100 ce d'Aérosol OT à 70 % en utilisant la suspension aqueuse commerciale. Après agitation pendant 35 minutes, on sépare la couche solvant dans une centrifugeuse . L'analyse de la couche aqueuse résiduelle indique 60 gamma par ce. A 40 cc de l'ex- trait, on ajoute 40 cc de cellosolve, 2 ce d'eau et 4 g de chlorhydrate de riéthylamineo On agite ce mélapge et on y ajoute suffisamment d'aci- de chlorhydrique concentré pour abaisser le pH à 0,75.
On agite le mé- lange pendant 6 heures et on le laisse reposer pendant 10 heures à la température ambiante. On sépare les cristaux formés, par filtration, et on les lave à la cellosolve,à l'eau et trois fois à l'alcool. On recueille 3,92 g de chlorhydrate d'auréomycine qui donne aux essais 980 gamma par mg.
EXEMPLE 13.
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On ajuste 3 litres d'extrait par l'eau acidifiée, ayant un po- tentiel de 810 gamma par cc, à un pH de 2,4 avec de l'alcali dilué et on les extrait par 600 cc d'acétate de n-propyle après addition de 28,0 cc d'une solution aqueuse à 25% du sel de sodium du sulfate de tétradécyle.
On répète l'extraction avec 600 ce supplémentaires d'acétate de n-propyle.
On filtre les extraits à l'acétate de n-propyle combinés, ayant un volu- me de 1100 ce et on élève le pH à 4,75 par addition de 1,5 cc de triéthyl- amine. Après concentration sous vide à 101 ce et dilution par 20 ce d'al- cool et 15 cc de cellosolve, on ajuste le pH à 5,2 avec 0,4 cc de trié- thylamineo On ajuste immédiatement la solution à un pH de 1,0 par addi- tion de 1,5 ce diacide chlorhydrique concentré. On agite la solution pendant 3 heures et on la laisse reposer pendant environ 16 heures à la
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température ambiante. Les cristaux qui se forment sont filtrés et lavés successivement à la cellosolve, à 1-'eau et à l'alcool et séchés. On ob= tient un rendement de 1,61 g de chlorhydrate d'auréomycine donnant aux es- sais 868 gamma par mg.
EXEMPLE 14.
On extrait 2,5 litres d'un extrait par l'eau acidifiée à un pH de 1,5 donnant aux essais 975 gamma par cc, successivement par 20, 15 et 10% en volume de n-butanol à un pH de 1,5, aprés addition de trois équi- valents du sel de sodium de sulfate de tétradécyle "Tergitol 4". On fil- tre les extraits combinés (1032 ce) et on les concentre à environ 5 % de leur volume combiné initial. On traite le concentrat contenant dû sul- fate de tétradécyle d'auréomycine par 2 cc diacide chlorhydrique concen- tré pour ajuster le pH à 0,8. On agite le mélange réactionnel pendant 3 heures et on le laisse reposer 16 heures à la température ambiante. On filtre le chlorhydrate d9auréomycine brut, on le lave par 4 cc de n-buta- nol et on le sèche.
On obtient un rendement de 3,40 g de chlorhydrate d'auréomycine donnant aux essais 730 gamma par mg.
EXEMPLE 15.
On traite 17 litres d'extrait à l'eau acidulée à un pH de 1,35 et donnant aux essais 775 gamma par cc, par 60 g deune pâte aqueuse à 50% de "Tergitol 4" et on 1-'extrait par 1700 ce de bichlorure d'éthy- lène. On répète l'extraction en utilisant 1700 cc supplémentaires de bichlorure d'éthylène et 30 g de la pâte à 50% de "Tergitol 4". On fil- tre 2,-extrait combiné (3200 cc) et on le concentre sous vide à 20-25 jusquà. ce que pratiquement la totalité du bichlorure d'éthylène ait distillé. De l'acide supplémentaire n'est pas nécessaire. On ajoute 85 cc de cellosolve au concentrat. Après filtration, on divise le fil- trat en deux portions égales de 72 ce.
A la première portion on ajoute 2,2 cc d'eau et 2,5 g de chlorhydrate de triéthylamine. On agite le mélange et on ajuste le pH à 1,24 avec 0,8 cc d'acide chlorhydrique con- centré. Après agitation pendant 3 heures, le chlorhydrate d'auréomyci- ne précipite. Après repos pendant 16 heures à la température ambiante, on'filtre le chlorhydrate d'auréomycine brut, on le lave successivement avec de la cellosolve, de l'eau et de l'alcool 2B et on le sèche. On obtient un rendement de 5,58 g de chlorhydrate d'auréomycine jaune clair donnant aux essais 1030 gamma par mg.
EXEMPLE 16.
On extrait 2,5 litres d'extrait à 1-'eau acidulée à un pH de 1,5 et donnant aux essais 975 gamma par oc par 500 ce de méthylisobutyl- cétone après addition de 28 cc d'une solution aqueuse à 25% de "Tergi- tol 7". On extrait à nouveau la couche aqueuse avec 375 ce de la céto- ne, puis avec 250 cc supplémentaires. On concentre l'extrait cétonique combiné sous vide à environ 90 ce. On sépare les solides par filtration.
On ajoute au filtrat 2 ce diacide chlorhydrique 6 N éthanolique pour porter le pH à 0,75 %. On filtre le précipité amorphe et on le cristal- lise par suspension dans 2,5 ce de cellosolve. On filtre les cristaux, on les lave à la cellosolve et on les sèche. On obtient un rendement de 1,41 g de chlorhydrate d'auréomycine brute donnant aux essais 980 gamma par mg.
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EXEMPLE 17.
On extrait 6 litres d'une solution de chlorhydrate d'auréomy- cine à un pH de 1,5 donnant aux essais 1130 gamma par ce par 600 cc de bichlorure d9éthylène en présence de 20 ce d'une solution aqueuse à 70 % du sel de sodium du sulfosuccinate de di-2-éthylhexyle (Aërosol-OT). On- extrait à nouveau la couche aqueuse par 600 cc de bichlorure d'éthylène en utilisant 10 cc supplémentaires d9Aérosol - OT à 70%. On agite l'extrait combiné au bichlorure d'éthylène pendant 30 minutes avec 5,9 g de charbon de bois. On filtre ensuite l'extrait et on le concentre sous vide à 20-25 à environ 110 ce. Après dilution avec 42 cc de cellosolve, on traite à nouveau le concentrat par 1% (en poids par volume) de charbon de bois et on le filtre.
On ajoute au filtrat de la triéthylamine jusqu'à ce que le pH.soit de 5,6. On ajuste alors le mélange avec de l'acide chlor- hydrique concentré à un pH de 1,72. Les cristaux commencent à se déposer.
Après agitation pendant 3 heures à la température ambiante, on filtre le chlorhydrate d'auréomycine, on le lave successivement à la cellosolve, à l'eau, à 1-alcool 2 B et on le sèche. On obtient un rendement de 4,68 g de chlorhydrate d'aéromycine donnant aux essais 900 gamma par mg.
EXEMPLE 18.
On extrait un échantillon de 100 litres de l'extrait à l'eau acidulée donnant aux essais 1000 gamma par deux portions de 500 cc d'axé- tate d'isopropyle, après addition de 30 ce d'Aérosol-OT à 70%. On com- bine les couches de solvant. Après concentration sous vidé à 50 oc on di- lue le concentrat avec 50 cc de cellosolve et on le filtre. Au filtrat on ajoute 4,0 ce d'eau et 4,0 g de chlorure de triéthylammonium solide.
Quand on 19 acidifie à un pH de 1,28, par 1.9 acide chlorhydrique concentré et qu'on 1?agit jusque au lendemain, on obtient 8,61 g de chlorhydrate d'auréomycine jaune clair donnant aux essais 930 gamma par mg.
Dans certains des exemples précédents on a trouvé que la so- lution était suffisamment acide dans les conditions indiquées,de sorte qu'il n'était pas nécessaire d'ajouter de 1-'acide pour maintenir un pH inférieur à 3. Il est préférable que l'extraction ait lieu approximati- vement entre pH 1 et pH 2 ou qu9elle se produise également dans cet in- tervalle si le sel est séparé.
REVENDICATIONS.
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1. Procédé de purification de matières contenant de l'auréo- mycine, caractérisé en ce qu'on fait réagir la matière dans 1?eau, à un pH ne dépassant pas 3, avec un dérivé organique anionique de l'acide sul- furique de formule ROnSO2OH dans laquelle n est un nombre entier non in- férieur à 0 et non supérieur à 1 et R est un radical organique de nature essentiëllement hydrophobe dans lequel la liaison de valence est fixée à un atome de carbonele poids moléculaire n'étant pas inférieur à 210, on recueille le composé du type sel d'auréomycine et de ce dérivé diacide sulfurique résultant, et, si on le désire, on le transforme en une autre forme d'auréomycine.
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IMPROVEMENTS IN THE PURIFICATION OF MATERIALS CONTAINING
AUREOMYCIN.
The present invention relates to the purification of materials containing aureomycin.
Laureomycin is a new antibiotic, the preparation and method of isolation of which are described in U.S. Patent No. 2,482,055 dated September 13, 1949.
The Applicant has found a new process by which aureomycin can be separated from an aqueous solution containing it and with which certain impurities can be associated by its interaction with an anionic organic derivative of sulfuric acid, of general formula. neral R-On-SO2OH, wherein n is a number not less than 0 and not greater than 1, R is a hydrophobic organic radical, the molecular weight of this material being not less than about 210, to form a salt-like compound which can then be separated and recovered as is or converted into a therapeutically desirable salt of aureomycino
The anionic organic derivative of 1-sulfuric acid according to the invention is of the polar-non-polar type,
which may partially explain its unusual properties. It contains the hydrophilic polar group derived from sulfuric acid comprising at least one hydroxyl having ionizable hydrogen and a hydrophobic non-polar moiety such as an alkyl aralkyl, alkaryl, aryl, haloaryl or azaryl group which may be fixed either by a carbon-sulfur bond, forming a sulphonic acid, or by a carbon-oxygen-sulfur bond, forming a sulfuric acid ester or a sulphate Only one of these groups can be fixed because the sulfuric acid residue must convert a hydrogen replaceable for binding to aureomycin molecule.
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For the desired purpose, these anionic organic derivatives of sulfuric acid must be used at a pH below 3. The acidity may result partially from the use of free sulfonic acids or monosulfates and partially from the addition of other strong acids such as sulfuric acid or hydrochloric acid. In use, the aforementioned dibasic sulfonic acid or sulfate salts are conveniently used under conditions such that the salt is converted to the free acid.
Using, for example, the sodium salt of sulfonic acid or the sodium salt of sulfate mono-ester with sufficient hydrochloric acid to lower the pH below 3 effectively gives the acid in solution. sulfonic acid or free sulfate, which for the purpose is considered equivalent, since sulfonic acid and sulfate ester have the same effect in acidic solution.
The sodium salts of these compounds are in the ordinary commercial form, but other alkali or alkaline earth salts are sometimes available which can be used. Some of the anionic organic derivatives of sulfuric acid according to the invention. are of the type used as wetting agents, and others are of the type used as dyestuffs o For economic reasons, it is preferred to use inexpensive, non-toxic, non-colored anionic organic sulfuric acid derivatives and one can obtain industrially. Colored dyestuffs can be used, as well as sulfates or toxic sulfonic acids, provided that the final aureomycin is sufficiently free of such materials to be commercially acceptable.
Some of these are sold under trademarks and will be more conveniently referred to as such. Sodium salts are the most commercially common. Commercial products are frequently mixtures. For example, commercial alkyl sulfates have chains of varying length. Mixtures of more than one of these derivatives can conveniently be used, although it is preferable to use commercially available materials.
Other materials which have been found to be satisfactory include tetradecyl sodium sulfate known under the trademark "Tergitol-4"; di- (2-ethylhexyl) sulfosuccinate sodium salt sold commercially under the trademark "Aerosol-OT"; heptacedyl sulfate; alkaryl sulphonate sold under the trademark "Santomerse-1"; lauryl sodium sulfate sold under the trademark "Duponol C"; the sodium salt of 2-ethylheptyl sulfate sold under the trademark "Tergitol 8"; any of the alkyl sulfates having 10 to 20 carbon atoms or mixtures thereof; aryl acids; aralkyl; or alkylaryl sulfonates having 10 to 25 carbon atoms;
2,5-dichlorobenzenesulfonic, para-xylenesulfonic, 4-hydroxyazobenzene-4'-sulfonic, 2,4-dinitronaphthol-7-sulfonic, 5-sulfosalicylic, 2,4-dichlorophenol-6-sulfonic acids., 2-chlorotoluene-5-sulfonic acid, 4-nitrochlorobenzene-2-sulfonic acid, 2-naphthalene sulfonic acid, 2,4-dihydroxyazobenzene-4'-sulfonic acid and their salts, Turkish red oil, etc.
Certain sulfonic acids and sulfates have already been used for the refining of strongly basic antibiotics such as streptomycin. See in particular US Patents 2,537,933 and 2,537,934 of January 9, 1951. However, these patents disclose the use of a salt of a strong acid and a base and the formation of salts can only occur. in the vicinity of neutrality. The Applicant has found that under the effect of such treatment, aureomycin does not give a satisfactory salt.
Unlike these earlier antibiotics, aureomycin is a broad spectrum antibiotic which inhibits the growth of Gram positive and negative reacting bacteria, certain "ricksettsia" and many other organisms. Its remarkable characteristics such as broad spectrum may be related to its predominantly amphoteric nature. Since it is amphoteric, it cannot be treated the same way as a basic antibiotic to refine it.
The plaintiff
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made the remarkable discovery that in strongly acidic solution, at pH less than 3, the acid phase of the amphoteric nature of the antibiotic is inhibited and its acidic characteristics masked by the strongly acidic nature of its surroundings, so that it exhibits sufficiently basic characteristics to form a salt-type compound with the above-mentioned organic anionic derivatives of sulfuric acid.
Heretofore, aureomycin has been separated from its fermentation medium by procedures such as chromatographic adsorption or solvent extraction. Chromatographic adsorption is relatively expensive and the extraction of aureomycin or its salt with mineral acid with a solvent is likely to cause difficulties due to corrosion of the equipment or the large amounts of solvent involved. etc ...
The Applicant has found that aureomycin can be recovered from an acid solution by reacting it at a pH of less than 3 with an anionic organic derivative of sulfuric acid. By the term "aureomycin" is meant not only 1-9 aureomycin in the form of its salt with an acid such as, for example, aureomycin hydrochloride, but also neutral aureomycin, sometimes referred to as the free base and salt of 1-aureomycin with a base, such as sodium salt. This is in accordance with pharmaceutical practice, since aureomycin salts are therapeutically equally effective in all three forms.
The acidic solution can be formed by dissolving aureomycin, as its salt with an acid, in water, or it can be formed by dissolving the free aureomycin base in water in the presence of sufficient diacid to lower pH below 3, or it can be formed by dissolving a aureomycin salt with base in water in the presence of sufficient acid to lower the pH below 3. For the purpose of the invention, it is not necessary that all of the aureomycin be dissolved. The acidic salt can be present in undissolved form, for example in suspension, but for the purpose of the invention it acts as a solution and will be referred to as such.
In addition, it is particularly convenient to form the acidic solution by acidifying a fermentation mass in which aureomycin is produced and separating the insoluble matters by filtration. The acidic solution can also be formed by extraction with acidified water of a cake formed by filtration of the mass containing 1-aureomycin under conditions such that the aureomycin is in an insoluble form. Aureomycin in acid solution from any of these sources is effectively the same because at pH less than 3 in the presence of water it effectively acts as an aqueous solution of its salt with the acid.
Any of these aureomycin solutions can be clarified using decolourizing charcoal or by any other known method. The necessity of this discoloration obviously depends to a large extent on the original materials and starting points.
To the acidic aureomycin solution one can then add the anionic organic derivative of sulfuric acid with sufficient acid to ensure that the pH remains below 3. The order of addition is not important because the aureomycin compound. of the salt type and the anionic organic derivative of sulfuric acid form the least soluble material present and tend to separate.
The salt-like compound can be collected from the acid solution by filtration, centrifugation or any other form of separation.
The dibasic sulfonic acid salts may of course be used as such or in the form of a commercial product, the final conversion to the therapeutic form being delayed until an economically favorable opportunity.
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This compound can be recrystallized from an organic solvent and used therapeutically as is. Using a non-toxic anionic organic derivative of sulfuric acid such as some of the surfactant wetting agents which are shown to be non-toxic in small amounts provides a product which can be administered directly.
It is preferable to decompose the salt-type compound, for example by double decomposition, to obtain a salt of aureomycin with a more usual acid of administration such as hydrochloric acid or to subject it to an aureomycin salt. double decomposition to form the hydrochloride, then convert the hydrochloride to any other form desired for administration, such as the free base or the salt with an alkali or alkaline earth metal such as calcium. Since some of the sulfonic or sulfated salts tend to separate in an amorphous or non-crystalline form, it has been found particularly convenient to extract them from the aqueous suspension in which they are formed by a solvent having a high partition coefficient in favor of the salt. solvent.
The extraction can be carried out as a single extraction, a multiple extraction, a counter-current extraction or in certain liquid-liquid extraction machines.
For convenience it is preferable to use an amount of the sulfonic acid or the sulfate ester allowing a ratio of aureomycin slightly greater than one acid group per aureomycin molecule, and a molecular ratio is found to be going up to about 3 or greater than 1 in accordance with the low degree of mass action causes a shift in balance to a point giving improved recovery.
The type of impurities present and the relative price of various materials influence the exact ratio economically preferable under given conditions.
It can be noted that in such an extraction, it is possible and sometimes preferable to modify the order of addition of the compounds. For example, the sulfonic acid or the sulfate can be added with the solvent in which it can be dissolved, or added before or after the addition of the solvent or before or after the acidification of the solution. . It is only necessary that the solution have a pH below 3 when the solvent is contacted with aureomycin and sulfonic acid or sulfate to obtain 1-extraction of the salt-type aureomycin compound with sulfate or sulfonic acid in the solvent layer.
As the solvent, it has been found that the usual organic solvents, in which a hydrophilic organic residue tends to be soluble, form good solvents. Among them, mention may be made of halogenated hydrocarbons, such as ethylene bichloride, trichloroethane, trichloroethylene, propylene bichloride, chloroform, 1-water, glycol monoesters immiscible with 1? water such as phenylcellosolve, organic esters such as dimethyl phthalate, ethyl acid phthalate, isopropyl acetate, butyl 1-acetate, ethers and substituted ethers such as dichloroisopropyl ether ,
ketones such as methyl isobutyl ketone or any of the higher immiscible ketones or more soluble ketones made immiscible with water by the addition of a salt to the aqueous layer. Alcohols having 4 or more carbon atoms such as methyl isobutylcarbinol, hexanols, butanol, amyl alcohol, etc. are good solvents.
The solution of the salt-type compound in the water-immiscible organic solvent can be concentrated by evaporating at least part of the solvent at a temperature not exceeding about 60. All of the solvent can be evaporated and used as is. salt thus isolated or subject to double decomposition or otherwise transform into a therapeutically desired form or more economically it may be double decomposed in the solution of the organic solvent.
It has been found that by adding a salt such as triethylamine hydrochloride or ammonium chloride or any other nitrogenous base hydrochloride or calcium chloride, etc. to the solution, the
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triethylamine salt or the corresponding sulphate or sulphonic acid salt, which remains dissolved and aureomycin separates out as the hydrochloride which can be separated from solution.
Alternatively, a mutual water-miscible solvent such as a lower alcohol, such as methanol or 2-ethoxyethanol, such as methanol or 2-ethoxyethanol, can be added to the solvent, and then added to this mixed solvent a mineral acid such as chlorine acid. - hydriqueo This causes a double decomposition of the aureomycin compound of the salt type releasing aureomycin in the form of its hydrochloride which can be separated from the mixed solvent in the form of a precipitate.
@ Aureomycin can be separated by adding a base to raise the pH of the solution, in which case aureomycin separates as neutral aureomycin or as the salt with the base, depending on the amount added.
The solubility decreases rapidly after the acidity has decreased to a pH above about 3.
Those skilled in the art will likewise find any other method of decomposing and separating the aureomycin compound of the salt type, as well as methods of converting the compound to the particular form of dureomycin that the practitioner may desire for the treatment of a condition. pathological determined.
The invention will be better understood by referring to the following examples:
EXAMPLE 1.
A solution is prepared containing 3.5 g of crude neutral aureomycin giving the tests 800 gamma per mg in 1500 cc of water. To this solution is added 1.7 g of the sodium salt of 2,4-dichlorophenol-6-sulfonic acid. The mixture is stirred and the pH is adjusted to 2 by adding 25% sulfuric acid. When equilibrium is established the solution is extracted with 375 cc of methyl isobutyl ketone. An additional 1 g portion of sodium 2,4-dichlorophenol-6-sulfonate was added to the aqueous phase and again extracted with 150 cc portions of methyl isobutyl ketone. These extractions are carried out three times. The raffinate gives the tests 51 range per cc, indicating almost complete extraction.
The separated solvent fractions were combined to form a single 774 solvent phase giving the tests 3480 gamma per cc. The extract is concentrated under reduced pressure at a temperature not exceeding 40 to a volume of 31 cc. To the concentrate 0.6% of concentrated hydrochloric acid is added, which causes the immediate precipitation of aureomyony hydrochloride in amorphous form. The precipitate is filtered off and suspended with 5 cc of 2-ethoxyethanol (cellosolve). The amorphous product then crystallizes giving a yield of 2.15 g of the purified aureomycin hydrochloride.
The product gave the assays 994 gamma per mg, indicating pure aureomycin hydrochloride and representing a 69% recovery of the initial inactivity.
It can be noted that aureomycin hydrochloride can come either in amorphous form or in crystalline form depending on the presence of seed crystals. You can use the same process with either form.
EXAMPLE 2.
2 liters of aureomycin fermentation mass containing calcium ions and giving the tests 1100 gamma per cc at a pH of 8.5 are adjusted by adding 25% sodium hydroxide in solution. One-half weight percent of diatomaceous earth is added to the mixture as a filter aid and the solids are separated by filtration. We put the filter cake
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dissolved in one liter of water and acidified to a pH of 1.5 by addition of 25% sulfuric acid. The mixture is heated to 55, stirred for 20 minutes, and the solids filtered off. A second extraction of the filter cake is carried out with an additional 1 liter of water acidified to the same pH. The two extracts are combined which give the tests 960 gamma by this.
1.5 g of 2,4-dichlorophenol-6-sulfonic acid are added in the form of the sodium salt and the solution is extracted with 500 cc of methyl-isobutyl ketone. The solvent phase is separated off and the aqueous phase is treated again with 1.5 g of additional sodium 2,4-dichlorophenol-6-sulfonate and extracted with 200 cc of methyl isobutyl ketone, then successively with two additional 200 cc portions of methyl isobutyl ketone.
The pH remains below 3. The final raffinate tested 29 gamma per cc, indicating almost complete extraction. The solvent extracts are combined and concentrated under reduced pressure, at a temperature not exceeding 55, to 27 ° C. To the concentrate, 0.5 this concentrated hydrochloric acid is added and the mixture is cooled to 0. It is
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Forms amorphous aureomycin hydrochloride which is filtered and suspended with 4 cc of 2-ethoxyethanol The amorphous hydrochloride forms crystals in 2-ethoxy-ethanpl to give 1.27 g of aureomycin hydrochloride giving the tests 860 gamma pag mg.
EXAMPLE 3
3 liters of aureomycin mass from di-
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directly from the fermentation tanks and test 1000 gamma per cc at a pH of 2.0, with 25% sulfuric acid. The acidified mass is stirred for 30 minutes and filtered. To the clear filtrate is added 1 g of sodium 2,4-dichlorophenol-6-sulfonate. We then extract
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Mixing it with 560 cc of methyl isobutyl ketone. The aqueous layer is re-extracted after addition of 0.8 g of sodium 2,4-dichlorophenol-6-sulfonate with four successive portions of 250 cc of methyl isobutyl ketone.
The pH remains below 3- The spent aqueous layer gives the tests 47 gamma by this, indicating almost complete extraction. The solvent layers are combined and treated with 0.7 g of decolorizing charcoal using the commercial product "Darco G 60". After filtration of the carbon, the clear solution is concentrated under reduced pressure, at a temperature not exceeding 50, to a volume of 22 cc. 0.35 cc of concentrated hydrochloric acid is then added to the concentrate. The mixture is separated by fil-.
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The precipitate of amorphous aureomycin hydrochloride is treated and suspended in 5 cc of ethyl cellosolve, which crystallizes aureomycin as aureomyoine hydrochloride.
0.72 g of light yellow aureomycin hydrochloride is obtained, giving the tests 960 gamma per mg.
Acids other than hydrochloric acid can be used for this phase, but the medical profession prefers this salt and hence it is preferable to operate so.
EXAMPLE 4.
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Aureom.ycino 4-hydroxyazobenzene-4 $ -sulfonate A solution of 3 g of the sodium salt of 19, -hydroxyazobenzene 49-sulfonic acid in 300 cc of water at 60 is prepared. 5 g of an impure aureomycin hydrochloride is added thereto dry. Sufficient hydrochloric acid is added to lower the pH to 2.0. The mixture is stirred at 60 for 45 minutes, during which time a precipitate of
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Crystalline 4-hydroxy-azobenzene-4'-sulfonate aureomyoine. The mixture is cooled and filtered, the crystals washed with cold water and dried; A yield of 6.77 g is obtained in the form of orange rosettes, these cries'
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rate giving tests 710 gamma per mg in 1-microbiological test. The crystals have a melting point (uncorrected) of 235 with decomposition.
The mother liquor gives tests 150 gamma per ce. Based on a
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putative empirical formula of C22H26 "2 cio 8 * HG1 for au-reomycin hydrochloride The empirical formula of the product obtained is C34H34N4012SCl. This gives a calculated analysis of
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<tb> Calculated <SEP> Found
<tb>
<tb> Carbon <SEP> 53.8 <SEP> 52.4
<tb>
<tb> Hydrogen <SEP> 4.6 <SEP> 5.1
<tb>
<tb> Nitrogen <SEP> 7.4 <SEP> 7.2
<tb>
<tb> Sulfur <SEP> 4.2 <SEP> 4.1
<tb>
<tb> Chlorine <SEP> 4.7 <SEP> 4.5
<tb>
EXAMPLE 5.
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EMI7.3
Cine 291-dichlorophenolm6-sulfonate. A solution is prepared by dissolving 5 g of aureomyoine in the form of the free matter in 100 cc of water acidified with 3 cc of 25% sulfuric acid. A previously prepared solution of
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2.92 g of sodium 2, L, -αiehlorophenol-6-sulfonate in 50 cc of water dropwise and with stirring, the experiment being carried out at room temperature. The pH remains below 3. A precipitate forms
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aureomcineo 2,4-4ichlorophenol-6-sulfonate This precipitate is filtered off, washed with water and dried; the yield is 6.73 g of a yellow crystalline product, giving in tests 730 gamma by
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mg.
Crystals melt at 159-1610 with decomposition (uncorrected).
Etn based on a supposed empirical formula of C 22 26 N 2 cloe.Hoi for dsureomycin hydrochloride9 the empirical formula of the product obtained is C2SH2SN20 12SC 13 This gives a calculated analysis of
EMI7.7
<tb> Calculated <SEP> Found
<tb>
EMI7.8
Carbon! 6 96 46 6
EMI7.9
<tb> Hydrogen <SEP> 4.0 <SEP> 3.9
<tb>
<tb> Nitrogen <SEP> 3.8 <SEP> 4.1
<tb>
<tb> Sulfur <SEP> 4.4 <SEP> 4.6
<tb>
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Chlorine 7.1 ,. 97 13.8 EXAMPLE 6.
---------
EMI7.11
294 dini.tronaphtholm7msulionate d9auréompcinea 5 g of neutral aureomycin are dissolved in 100 cc of water acidified with 2 cc of dl> aC = 5% sulfuric acid o The solution is heated to 40
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and it is treated dropwise at this temperature with a prepared solution.
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prepared in advance containing 3.3 g of 2,4-dinitronaphthol -? - sulfonic acid with stirring. The pH remains below 3. A yellow crystalline sulfonate precipitates. The reaction mixture is cooled to 4, the precipitate is filtered off, washed with cold water and dried in vacuo. A yield of 7.25 g of aureomycin 2,4-dinitronaphthol-7-sulfonate was obtained giving the assays 754 gamma per mg. Crystals melt at 206-210 with decomposition (uncorrected).
EXAMPLE 7.
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Aureomycin 2-chlorotoluene-5-sulfonate.
A solution is prepared containing 5 g of free aureomycin in 100 cc of water acidified with 2 cc of 25% sulfuric acid. To this was added, with stirring, dropwise, a solution of 2.35 g of sodium 2-chlorotoluene-5sulfonate in 85 cc of hot water, which formed a fine crystalline precipitate. The mixture was cooled to 4 and allowed to stand overnight, the resulting aureomycin 2-chlorotoluene-5-sulfonate filtered off, washed with water and dried in vacuo. A yield of 5.82 g is obtained, giving the tests 812 gamma per mg.
EXAMPLE 8.
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Aureomycin 225-dichlorobenzene sulfonate.
The previous procedure is repeated using 2.59 g of sodium 2,5-dichlorobenzenesulphonate, which gives 5.45 g of aureomycin 2,5-dichlorobenzene sulphonate, the analysis of which indicates 830 gamma per mg
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d-1 aure "oimycin.
EXAMPLE 9.
Aureomycin 4-nitrochlorobenzene-2-sulfonate.
5 g of neutral aureomycin are treated with 130 cc of dilute sulfuric acid to give a solution having a pH of 1.5. To this solution is added dropwise with stirring a hot solution of 3 g of sodium 4-ni-trochlorobenzene-2-sulfonate in 120 cc of water. A light brown precipitate formed which was filtered off after cooling and standing to give 5.26 g of aureomycin E, -nitrochlorobenzene-2-sulfonate which tested 750 gamma per mg. The material has an uncorrected melting point of 169-173.
EXAMPLE 10.
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A 2.0 liter sample of acidified water extract, obtained by extracting an alkaline cake, was treated with 7.5 g of sodium lauryl sulfate. The solution is extracted with 500 cc of n-propyl acetate divided into two portions. The initial aqueous solution gives the tests 1250 gamma per cc; the raffinate gave 240 gamma per cc on tests. Concentrate in vacuo at a temperature below the solvent extract to 10% of its original volume. During concentration, a precipitate of the aureomycin salt of lauryl sulfate is formed. The concentrate is filtered and the amorphous salt is dissolved in 10 cc of ethyl alcohol. We filter the
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solution and acidified with 1.0 cc of 6 N hydrochloric acid.
Aureomycin hydrochloride crystallizes from solution and is filtered off after standing at room temperature for 12 hours. A yield of 1.25 g of aureomycin hydrochloride was obtained giving the tests 940 gamma per mg.
EXAMPLE 11, ----------
A sample of 2.5 liters of extract is treated with acidified water, giving in the tests 1500 gamma by these, per 200 cc of a 25% solution of 2,9-diethyl-tricedan-6-sulfate. of sodium "Tergitol-7".
The solution is extracted with 600 cc of methyl isobutyl ketone divided into three portions. The raffinate gives on tests 30 gamma by ce, indicating almost complete extraction. The solvent extract is concentrated in vacuo to 10% of its initial volume at a temperature not exceeding 35. The concentrate is a suspension of aureomycin 2,9-diethyltridecane-6-sulfate. To this suspension was added 2.0 cc of 6N hydrochloric acid. After stirring for 5 hours, the resulting amorphous aureomycin hydrochloride was filtered off. The amorphous salt is then suspended with 6.0 cc of dissolved cellosolve. With continued stirring, aureomycin hydrochloride crystallizes from solution. It is separated by filtration, washed with cellosolve and alcohol and dried.
A yield of 2.6 g of aureomycin hydrochloride having a potential of 920 gamma per mgo is obtained.
EXAMPLE '12.
400 cc of ethylene dichloride was added at room temperature to 16 liters of an acidified aureomycin aqueous solution to test 1560 gamma per cc at a pH of 1.0. The mixture is stirred for about 2 minutes, after which 100 cc of 70% OT Aerosol is added thereto using the commercial aqueous suspension. After stirring for 35 minutes, the solvent layer is separated in a centrifuge. Analysis of the residual aqueous layer indicates 60 gamma per cc. 40 cc of the extract are added 40 cc of cellosolve, 2 cc of water and 4 g of riethylamine hydrochloride. This mixture is stirred and sufficient concentrated hydrochloric acid is added to it to lower the pH to 0.75.
The mixture is stirred for 6 hours and allowed to stand for 10 hours at room temperature. The crystals formed are separated by filtration and washed with cellosolve, with water and three times with alcohol. 3.92 g of aureomycin hydrochloride are collected which gives the tests 980 gamma per mg.
EXAMPLE 13.
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3 liters of extract are adjusted with acidified water, having a potential of 810 gamma per cc, to pH 2.4 with dilute alkali and extracted with 600 cc of n- acetate. propyl after addition of 28.0 cc of a 25% aqueous solution of the sodium salt of tetradecyl sulfate.
The extraction is repeated with an additional 600 cc of n-propyl acetate.
The combined n-propyl acetate extracts, having a volume of 1100 cc were filtered and the pH raised to 4.75 by the addition of 1.5 cc of triethylamine. After concentration in vacuo to 101 cc and dilution with 20 cc of alcohol and 15 cc of cellosolve, the pH is adjusted to 5.2 with 0.4 cc of triethylamine. The solution is immediately adjusted to a pH of 1. 0.0 per addition of 1.5 cc concentrated hydrochloric acid. The solution is stirred for 3 hours and allowed to stand for about 16 hours at the
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ambient temperature. The crystals which form are filtered and washed successively with cellosolve, with 1-water and with alcohol and dried. A yield of 1.61 g of aureomycin hydrochloride was obtained giving the tests 868 gamma per mg.
EXAMPLE 14.
2.5 liters of an extract are extracted with water acidified to a pH of 1.5 giving the tests 975 gamma per cc, successively with 20, 15 and 10% by volume of n-butanol at a pH of 1, 5, after addition of three equivalents of the sodium salt of tetradecyl sulfate "Tergitol 4". The combined extracts are filtered (1032 cc) and concentrated to about 5% of their original combined volume. The concentrate containing aureomycin tetradecyl sulfate is treated with 2 cc of concentrated hydrochloric acid to adjust the pH to 0.8. The reaction mixture is stirred for 3 hours and allowed to stand for 16 hours at room temperature. The crude aureomycin hydrochloride is filtered off, washed with 4 cc of n-butanol and dried.
A yield of 3.40 g of aureomycin hydrochloride is obtained, giving the tests 730 gamma per mg.
EXAMPLE 15.
17 liters of extract are treated with acidulated water at a pH of 1.35 and giving the tests 775 gamma per cc, with 60 g of an aqueous paste at 50% of "Tergitol 4" and one 1-'extracted with 1700 that of ethylene dichloride. The extraction is repeated using an additional 1700 cc of ethylene dichloride and 30 g of the 50% "Tergitol 4" paste. Filter 2, -combined extract (3200 cc) and concentrate in vacuo to 20-25 until. that virtually all of the ethylene dichloride has distilled off. Additional acid is not necessary. 85 cc of cellosolve are added to the concentrate. After filtration, the filtrate is divided into two equal 72 cc portions.
To the first portion are added 2.2 cc of water and 2.5 g of triethylamine hydrochloride. The mixture is stirred and the pH is adjusted to 1.24 with 0.8 cc of concentrated hydrochloric acid. After stirring for 3 hours, aureomycin hydrochloride precipitates. After standing for 16 hours at room temperature, the crude aureomycin hydrochloride is filtered off, washed successively with cellosolve, water and 2B alcohol and dried. A yield of 5.58 g of light yellow aureomycin hydrochloride is obtained, giving the tests 1030 gamma per mg.
EXAMPLE 16.
2.5 liters of extract are extracted with 1-acidulated water to a pH of 1.5 and giving the tests 975 gamma per oc per 500 cc of methyl isobutyl ketone after addition of 28 cc of a 25% aqueous solution. of "Tergitol 7". The aqueous layer was extracted again with 375 cc of keto, followed by an additional 250 cc. The combined ketone extract is concentrated in vacuo to about 90 cc. The solids are separated by filtration.
This 6 N ethanolic dihydrochloric acid is added to the filtrate 2 to bring the pH to 0.75%. The amorphous precipitate is filtered off and crystallized by suspension in 2.5 cc of cellosolve. The crystals are filtered, washed with cellosolve and dried. A yield of 1.41 g of crude aureomycin hydrochloride is obtained, giving the tests 980 gamma per mg.
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EXAMPLE 17.
6 liters of aureomycin hydrochloride solution are extracted at a pH of 1.5 giving in tests 1130 gamma per cc per 600 cc of ethylene bichloride in the presence of 20 cc of a 70% aqueous solution of the salt. sodium di-2-ethylhexyl sulfosuccinate (Aerosol-OT). The aqueous layer was again extracted with 600 cc of ethylene dichloride using an additional 10 cc of 70% Aerosol - OT. The combined ethylene dichloride extract was stirred for 30 minutes with 5.9 g of charcoal. The extract is then filtered and concentrated in vacuo at 20-25 to about 110 cc. After dilution with 42 cc of cellosolve, the concentrate is again treated with 1% (w / v) charcoal and filtered.
Triethylamine is added to the filtrate until the pH is 5.6. The mixture is then adjusted with concentrated hydrochloric acid to a pH of 1.72. The crystals start to settle.
After stirring for 3 hours at room temperature, the aureomycin hydrochloride is filtered off, washed successively with cellosolve, with water, with 1-alcohol 2 B and dried. A yield of 4.68 g of aeromycin hydrochloride is obtained, giving the tests 900 gamma per mg.
EXAMPLE 18.
A 100 liter sample of the acidulated water extract yielding 1000 gamma in the tests was extracted with two 500 cc portions of isopropyl axetate, after addition of 30 cc of 70% Aerosol-OT. The layers of solvent are combined. After concentration under vacuum at 50 ° C., the concentrate is diluted with 50 cc of cellosolve and filtered. To the filtrate are added 4.0 cc of water and 4.0 g of solid triethylammonium chloride.
When acidified to a pH of 1.28 with 1.9 concentrated hydrochloric acid and stirred overnight, 8.61 g of light yellow aureomycin hydrochloride were obtained, giving in tests 930 gamma per mg.
In some of the preceding examples it has been found that the solution is sufficiently acidic under the conditions indicated, so that it is not necessary to add 1-acid to maintain a pH below 3. It is preferable. whether the extraction takes place approximately between pH 1 and pH 2 or whether it also occurs in this interval if the salt is separated.
CLAIMS.
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1. A method of purifying materials containing aureomycin, characterized in that the material is reacted in water, at a pH not exceeding 3, with an anionic organic derivative of sulfuric acid. of formula ROnSO2OH in which n is an integer not less than 0 and not greater than 1 and R is an organic radical of essentially hydrophobic nature in which the valence bond is attached to a carbon atom, the molecular weight not being less than 210, the aureomycin salt-like compound and this resulting sulfuric diacid derivative is collected, and if desired, converted to another form of aureomycin.