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"Procédé de préparation et de purification des antibiotiques" basiques
L'invention a trait aux antibiotiques/ou alcalins du type de la streptomycine, c'est-à-dire aux éléments du genre se composant de la streptomycine et de composés ba- siques à action antibiotique, qui (comme la streptomycine) peuvent former des sels solubles dans l'eau avec des acides, tels que l'acide sulfurique, et des sels insolubles dans l'eau avec des réactifs organiques précipitant les bases (par exemple les dérivés de streptomycine, tels que la dihydrostreptomyoine et les antibiotiques à action analogue,
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tels que la streptothricine).
En 1944, Schatz, Bogie et Waksman (Proc.Soc.Exp.Biol.
Med. 1944, 57, 244) ont montré qu'un antibiotique puissant appelé "Streptomycine'T se forme au cours de la croissance de l'organisme "Actinomyc6s Grisous", (appelé maintenant "Streptomyces Griseus") et on a constaté depuis que cet an- tibiotique est extrêmement utile en clinique médicale.
On a découvert, ensuite, que plusieurs streptomicines se forment en même temps. La première streptomycine obtenue sous forme cristallisée, pure, (à l'état de reineckate) et complètement caractérisée est appelée maintenant "Streptomy- cine A"; et la seconde streptomycine caractérisée est appe- lée maintenant "Streptomycine B". De plus, on possède des indications d'après lesquelles d'autres streptomycines se forment et/ou peuvent se former en même temps en changeant les conditions de la culture; et il doit être bien entendu que chacun de ces antibiotiques et leurs mélanges (sous for- me de bases libres ou de leurs sels solubles dans l'eau) se- ront désignés par le mot "streptomyoine", à moins d'indica- tions contraires.
La streptomycine a été purifiée jusqu'à présent par di- vers procédés, tous compliqués et/ ou inefficaces (et, par conséquent, coûteux). Par exemple, un procédé appliqué dans une large mesure antérieurement à l'invention comporte, en principe, les opérations suivantes : I - On traite un liqui- avec du charbon de bois activé qui absorbe sélectivement la streptomycine de primaire contenant la streptomycine, 2 - On extrait la streptomycine du charbon de bois par un acide minéral aqueux soluble dans l'eau, de préférence en élévant légèrement la température (par exemple à environ 30-50 0); 3 - On traite l'extrait avec un réactif de précipitation des bases organi- ques, de préférence l'acide phosphetungstique, et 4 - On décompose le précipité.
(L'expression "liquide primaire con- tenant la strptomyoine" doit être considérée comme désignant
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en particulier : a) le liquide de culture obtenu en faisant proliférer le streptomyces griseas dans des conditions et dans un milieu de culture convenant à la formation de la streptomycine et en séparant les matières solides du milieu; b) le liquide de culture de pouvoir amélioré, obtenu par acidification de la culture (par exemple par l'acide chlorhy- drique ou sulfurique), le liquide étant neutralisé, et c) le liquide obtenu par extraction par un acide des matières soli- des séparées de la culture, le liquide étant neutralisé).
Un des objets de l'invention réside en procédés simples, efficaces et avantageux à d'autres points de vue pour purifier des antibiotiques basiques, du type de la streptomycine, et en particulier la streptomycine, et un autre objet de l'inven- tion réside en la formation de certains dérivés du type salin des antibiotiques basiques du type de la streptomycine, pou- vant servir à ces procédés de purification et à d'autres applications et réside aussi dans des procédés de prépara- tion de ces dérivés.
Il a été découvert que des antibiotiques basiques du type de la streptomicyne réagissent avec des agents à aoti- vité superficielle, ou agents de mouillage, du type des aci- des inorganiques, polybasiques, organiquement substitués, en formant certaines combinaisons du type salin, qui sont beau.- coup moins solubles dans l'eau que les antibiotiques et peu- vent être recueillies; et il a encore été découvert que ces dérivés du type salin des antibiotiques peuvent être décom- posés pour recueiller les antibiotiques.
Les procédés suivant l'invention consistent en principe à faire réagir un antibiotique basique, du type de la strep- tomycine,(en particulier la streptomycine) avec un agent de mouillage du type d'un acide inorganique polybasique, onga- niquement substitué, dans un solvant des réactifs (en parti- culier l'eau). La combinaison du type salin ainsi formé de l'antibiotique et de l'agent de mouillage est relativement
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insoluble dans l'eau. et peut être recueillie par filtration, centrifugation ou autre moyen approprié lorsque l'eau sert de solvant des réactifs.
Lorsque le solvant des réactifs est un solvant (tel que le méthanol) dans lequel la combi- naison du type salin est soluble, on recueille cette combi- naison en éliminant le solvant et en purifiant le résidu, par exemple par lavage avec de l'eau., ou en ajoutant un agent miscible, non solvant, de la combinaison du type sa- lin (tel que l'eau).
Les procédés de purification suivant l'invention consistent en principe à traiter un antibioti- que basique impur du type de la streptomycine avec un agent de mouillage du type d'un acide inorganique polybasique, or- ganiquement substitué, dans un solvant des réactifs, en par- ticulier à traiter une solution aqueuse de l'antibiotique impur (par exemple un liquide primaire contenant de la strep- tomycine ou une solution aqueuse d'une streptomycine par- tiellement purifiée, telle que l'extrait dont il a été question précédemment) avec l'agent de mouillage, à recueil- lir la combinaison formée du type salin de l'antibiotique et de l'agent de mouillage et à transformer cette dernière combinaison en un sel soluble dans l'eau, de l'antibiotique.
Cette transformation peut s'effectuer par exemple en dis- solvant la dérivé du type salin dans un de ses solvant (tel que le méthanol), en traitant la solution avec une solution aqueuse d'un acide relativement fortsolable dans
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l'eau, (en partiuulidr avoo ano solution r?quoii±;e d'un ici- de minéral relativement fortsoluble dans l'eau), et en recueillant le sel soluble dans l'eau ainsi formé (de l'an- tibiotique basique, du type de la streptomycine), par exemple en ajoutant un agent miscible, non solvant, du. sel soluble dans l'eau, (tel que l'acétone), et en recueillant le précipité. Le produit ainsi obtenu, est beaucoup plus pur que l'antibiotique traité et la récupération de l'ac- tivité antibiotique, réalisée au cours du traitement de
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purification, est d'un ordre élevé.
Dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, il est possible d'obtenir régulièrement des rendements élevés en streptomycine relati- vement pure, possédant (par exemple) un pouvoir antibiotique supérieur à 400 unités/mg environ.
Parmi les agents de mouillage du type des acides inor- ganiques, polybasiques, organiquement substitués, convenant de au procédé/l'invention, on peut citer ceux qui sont représen- leradical tés par la formule R-0-X-0-Y, dans laquelle R désigne d'un composé hydroxyle organique ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau,-O-X-O- désigne le radical acide divalent d'un acide inorganique, polybasique, soluble dans l'eau, (par exemple un acide sulfurique ou phosphorique), et Y désigne un élément du groupe formé par H et les sels solubles dans l'eau formant des cations avec l'anion R-0-X-O-.
Parmi les agents de mouillage convenant au procédé suivant l'invention, on peut citer particulièrement ceux dans lesquels l'acide inorganique polybasique est l'acide sulfurique, l'acide étant partiellement estérifié avec un alcool aliphatique su- périeur, c'est-à-dire les agents de mouillage du groupe formé par les mono-esters aliphatiques supérieurs d'acide sulfuri- que, et leurs sels solubles dans l'eau.
D'autres agents de mouillage pouvant être choisis de préférence du type des acides inorganiques, polybasiques, organiquement substitués, convenant au procédé suivant l'in- vention sont ceux du groupe formé par les acides sulfoniques aromatiques, les huiles sulfonées, les dérivés d'acides gras supérieurs sulfonés et leurs sels solubles dans l'eau.
Parmi les alkyl esters supérieurs partiels d'acide sulfurique pouvant être utilisée dans la mise en oeuvre pra- tique de l'invention, on peut citer : les groupes des sels de sodium des sulfates des alcools aliphatiques supérieurs
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synthétiques, tels que CH9CH(C2H5) CH4CH(304Na)CH4CH(CH
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(par exemple le Tergitol Penetrant 7), C4H9CH(C2H5)C2H4CH (SO4Na(CH2CH)OH3)2, (par exemple le Tergitol Penetrant 4) et C4H9OH(C2H5)CH2SO4Na, (par exemple le Tergitol Penetrant 08), et la série des esters partiels d'acide sulfurique des alcools aliphatiques supérieurs et leurs sels, tels que le sulfate d'octyl sodium, d'oléyl sodium, de oétyl sodium, de stéaryl sodium et de lauryl sodium (par exemple l'Aurinol, le Weta- nol, les Duponols et les Gardinols).
Parmi les acides sal- foniques aromatiques, les huiles sulfonées et les dérivés d'acides gras supérieurs sulfonés qui peuvent servir dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, on peut citer les salfonates de sodium des esters d'acides gras supérieurs et des amides tels que le sel de sodium d'oléate d'éthyl sal- foné (ou. aatre alkyl oléate) (par exemple l'Igepon AP Extra) et CI7H33CONHC2H4SO3Na (par exemple l'Igepon T); les sul- fonates de sodium des hydrocarbures de pétrole (par exemple l'Ultrawet); le sel de sodium d'un acide polyalkyl benzène sulfonique contenant 10 atomos de carbone (par exemple l'Ultrawet, 40A) et d'autres alkyl aryl salfonates de sodium (par exemple le Nacconol NRSF) et l'haile de rouge turc, (c'est-à-dire l'haile de ricin salfonée).
Parmi les esters partiels des acides phosphoriques qui peavent être utilisés dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, on peut citer le phosphate, de dicrésyle, la lécithine et un alcool supérieur phosphoré de représenté par la :formule (capryle) 5Na5P6O2O (par exemple le W.A.58).
Parmi les acides solables dans l'eau, relativement forts, qui peuvent servir à recueillir les antibiotiques dans leurs combinaisons du type salin avec les agents de mouillage, on peut citer les acides sulfurique, chlorhy- drique, phosphorique, oxalique, citrique, sulfamique et nitrique.
Pour réaliser un rendement maximum, il convient que l'agent de mouillage soit sensiblement en excès par rapport à la quantité qui est nécessaire pour combiner la totalité
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de l'antibiotique contenu dans la solution traitée, la pro- portion la plus avantageuse de l'agent de mouillage dépendant par suite de la concentration de la solution traitée et du pouvoir de l'antibiotique. En employant la quantité stoichio- métrique de l'agent de mouillage (par rapport à l'activité antibiotique de la solution traitée), on peut recueillir une proportion pratiquement quantitative de l'antibiotique sous forme de son dérivé du type salin ; etla dérivé du type salin sensiblement par ainsi obtenu permet de recueillir plus faci- lement l'antibiotique sous forme de sel soluble dans l'eau.
Suivant un des modes de mise en oeuvre de l'invention, une solution aqueuse d'un antibiotique impur, du type de la streptomycine, est traitée avec une solution aqueuse de l'a- gent de mouillage, et le précipité formé est recueilli et transformé en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique.
Suivant une variante, l'agent de mouillage peut être ajouté à la solution de l'antibiotique à l'état solide, ou encore l'antibiotique et l'agent de mouillage peuvent être tous deux ajoutés à l'état solide à l'eau (ou autre solvant des réactifs).
La combinaison du type salin de l'antibiotique et de de l'agent/mouillage peut se séparer du solvant des réactifs sous diverses formes ; exemple sous forme de substance huileuse, cireuse ou gélatineuse, ou ne pas se séparer du tout, mais rester à l'état de dispersion dans le solvant, (toutes ces formes insolubles devant être considérées comme désignées par le mot "précipité"); et, suivant sa forme, on sépare le précipité par filtration, centrifugation, traitement à l'aide d'an filtre suivi d'une filtration ou par d'autres moyens ordinaires connus des spécialistes.
La précipitation de la combinaison du type salin de l'antibiotique et de l'agent de mouillage dépend de la con- centration des réactifs et de la valeur du pH du milieu de la réaction, la précipitation étant maximum lorsque la con-
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oontration est forte et la valeur du pH comprise entre environ 5 et environ 8 et, de préférence, voisine de 7.
Suivant une autre variante, la combinaison du type salin de l'antibiotique et de l'agent de mouillage ainsi formée peut aussi servir telle quelle d'agent thérapeutique. Ces dérivés du type salin sont généralement solubles dans l'huile ou. peu- vent s'y disperser et peuvent servir en thérapeutique, par exemple en les administrant par la bouche tels quels ou en milieux huileux pour traiter les maladies intestinales (en ayant recours aux fonctions intestinales pour mettre l'anti- biotique en liberté sous forme soluble dans l'eau) ou en les administrant également en milieux huileux (ou par imprégnation d'une pastille d'une matière solide) pour obtenir une action antibiotique prolongée.
Lorsqu'on se propose de préparer le dérivé du type salin de l'antibiotique au lieu de la purifier, on peut employer une solution aqueuse reconstituée de l'anti- biotique (par exemple une solution aqueuse de l'antibiotique très purifié ou. par.)
La transformation de la combinaison du type salin de l'antibiotique et de l'agent de mouillage en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique peut s'effectuer, entre autres, par les moyens suivants: on dissout la combinaison du type salin dans un solvant de cette combinaison, (par exemple le méthanol), on traite la solution avec un acide relativement fort, soluble dans l'eau, et on recueille le sel soluble dans l'eau ainsi formé de l'antibiotique, (par exemple en ajoutant un agent miscible non solvant du sel soluble dans l'eau, tel que l'acétone);
ou bien on amène la combinaison du type salin (en solution) en contact intime avec un adsorbant (par exemple l'alumine), ou une résine à échange d'anion ayant été anté- rieurement traitée avec l'acide relativement fort, soluble dans l'eau, choisi, et on recueille le sel soluble dans l'eau ainsi formé de l'antibiotique dans la solution traitée,(par
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exemple en éliminant le solvant);
ou bien on dissoat la combinaison du type salin dans an solvant organique des savons ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau,(par exemple le n-butanol ou. l'alcool amylique obtenu par fermen- tation et raffinage), on amène en contact intime la solution avec une solution aqueuse d'un acide relativement fort, so- luble dans l'eau, on recueille la phase aqueuse et on la sèche, (de préférence par congélation, c'est-à-dire qu'on la congèle et on la soumet à un vide poussé poux chasser l'eau par sublimation);
ou bien on dissout la combinaison du type salin dans un solvant de cette combinaison dans le- quel le sel soluble dans l'eau qu'on désire obtenir est in- soluble, (par exemple un mélange de méthanol et d'acétone), on traite la solution avec une solution aqueuse d'un acide relativement fort, soluble dans l'eau et on recueille le sel, soluble dans l'eau, précipité de l'antibiotique; ou. bien on traite une solution de la combinaison du type salin avec une solution aqueuse d'un acide relativement fort, so- luble dans l'eau, en présence d'une résine à échange d'anion, ou par divers autres moyens permettant de réaliser un contact intime et de faire réagir la combinaison du type salin avec l'acide relativement fort, soluble dans l'eau.
L'invention est plus facile à comprendre d'après les exemples suivants (toutes les solutions dont il est question étant des solutions ou des dilutions dans l'eau., à moins que le solvant ou le diluant ne soit spécialement indiqué):
Exemple I a) A 500 cm3 d'un filtrat de culture contenant de la streptomy- cine (obtenu en faisant proliférer le streptomyces griseus en culture submergée en milieux aqueux contenant de la farine de soja, du dextrose, et du chlorure de sodium, en acidifiant la culture ensemencée et en la filtrant) ayant un pouvoir anti- biotique de 259 anités/cm3 et un pH de 6,5, sont ajoutés
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12 OM3 d'une solution à 25 de U4H9UH(G2U2H4UH(S04Na)U2H4 CH(C2H5)2, (par exemple le Tergitol Penetrant 7) en agitant,
et on continue à agiter pendant une demi-heure. L'halle qui se sépare est une combinaison du type salin de streptomycine et de l'agent de mouillage et contient environ 94 % de l'ac- tivité du filtrat de culture. b) La combinaison du type salin ainsi obtenue en partant d'une charge de filtrat de culture d'une activité de 1.245.000 unités est dissoute dans le méthanol, puis repré- cipitée encore ane fois en ajoutant un volume égal d'eau; on la redissoat dans le méthanol à 80 % et on la fait pas- ser dans une colonne d'alumine, antérieurement lavée avec l'acide chlorhydrique jusqu'à an pH de 4,1, puis on la sèche.
On recueille le produit de percolation (environ 250 cm3, y compris le méthanol de lavage) et on recueille le chlorhydrate de streptomycine en ajoutant un volume égal d'eau, on chasse le méthanol par distillation dans le vide, on élimine la combinaison du type salin éventuellement non décomposée, on règle le pH de la solution aqueuse restante à une valeur de 5,5 et on la sèche par congélation. On ob- tient environ 1,55 gr de chlorhydrate de streptomycine ayant un pouvoir de 320 anités/mg (avec un rendement d'environ 40 %).
Exemple 2 On ajoute 0,5 gr d'un ester partiel d'acide sulfurique d'un alcool aliphatique supérieur (par exemple de Duponol C) dans 20 cm3 d'eau à 500 cm3 d'un extrait contenant de la strep- tomycine ayant un pouvoir de 300 unités/6m3 et un pH de 6,5 (obtenu en traitant un filtrat de culture contenant de la. streptomycine avec un charbon de bois activé et en extrayant la streptomycine du charbon de bois par l'acide de chlorhydrique, sulfurique ou nitrique dilué), on agite la solution trouble pendant une heure et on sépare par filtration le précipite floculent formé.
La combinaison
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ainsi obtenue du type salin de streptomycine et de l'agent de mouillage contient environ 76 % de l'activité de l'extrait; on peut l'utiliser telle quelle à titre d'agent thérapeutique ou la transformer en un sel soluble dans l'eau de streptomy- cine, par exemple de la manière décrite dans l'exemple 6 ci- après.
Exemple 3 a) 16 cm3 d'une solution à 25 % de C4H9CH(C2H5)C2H4CH(SO4Na) C2H4CH(C2H5)2, (par exemple le Tergitol Pénétrant 7) sont ajoutés en agitant, en une heure, à 7 litres d'un extrait conè tenant du nitrate de streptomycine, ayant un pouvoir de 195 unités/cm3 et un pH de 7,0; on laisse le précipité formé re- poser pendant 1-2 heures à 5 C environ et on le filtre.
La combinaison du type salin ainsi obtenue de streptomycine et de l'agent de mouillage contient environ 93 % de l'activité de l'extrait. b) On comprime, ou traite de toute autre manière pour éliminer l'eau entrainée, une combinaison ainsi obtenue en partant d'une charge d'extrait d'une activité de 850.000 unités et on la dissout dans une quantité de méthanol à 90-100 % suffisan- te (suivant la teneur en eau de la combinaison du type salin ment ainsi partielle déshydratée) pour former une solution dans 100 cm3 de méthanol à 90 %; puis on fait passer la solution dans une colonne de 2,5 x 25 cm de résine à échange d'anion (par exemple d'Amberlite IR-4B, of. brevet américain n 2. 402.384 du 18 juin 1946), dont le pH a été antérieurement réglé à une valeur de 2,5 par addition d'acide chlorhydrique dilué.
On recueille le produit de percolation dans deux por- tions de 125 cm3 (y compris le méthanol de lavage) et on traite chaque portion en ajoutant un volume d'eau, égal, on chassant le méthanol par distillation dans le vide, en réglant le pH de la solution aqueuse restante à une valeur de 5,5 par un traitement avec une résine à échange d'anion neutre,
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en la filtrant et en la séchant par congélation.
On obtient, avec la première et avec la seconde portion du produit de per- colation respectivement, environ 0,8 gr de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 679 unités/mg et environ
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0,1 gr d'un pouvoir d'environ 425 unités/, mg avec an rendement total d'environ 73,1 %. b:variante) Une combinaison du type salin ainsi obtenue en partant d'une charge d'extrait d'une activité de 860.000 uni- tés (pesant environ 4 gr. ) est dissoute dans 150 om3 de méthanol à 90 %;
et la solution est agitée avec 50 gr. d'une résine à échange d'anion, dont le pH a été antérieurement réglé par addition d'acide chlorhydrique di lué. Après filtration et séchage par congélation du filtrat, on obtient environ 0,8 gr de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 616 unités/mg et on peut obtenir un sppplément d'environ 0,14 gr de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir de 635 unités/mg dans le méthanol à 90 % de lavage de la résine, avec un rende- ment total de 08 %.
Exemple 4.
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5,5 cm3 d'une solution à 25 y. de C4HgCH(C2H5)C2g4CH(S04Na) C2H4CH(C2H5)2, (par exemple le Tergitol Pénétrant 7) sont ajoutés à une solution de 1 gr de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir de 525 unités/mg dans 100 cm3 d'eau, on agite le mélange pendant une demi-heure dans un agitateur mécanique et on sépare par filtration le précipité cireux formé. La combi- naison du type salin de streptomycine et de l'agent de mouil- lage ainsi obtenue (pesant environ 2,2 gr) contient environ 96,5 de l'activité de la solution de chlorhydrate de strep-
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Lu 111,Y U 1 Ut:I L.L' tt1 L t:I .
Exemple 5.
Une solution de 10 gr d'un ester partiel d'acide sulfuri- que d'un alcool aliphatique supérieur (par exemple le Duponol C) dans 50 cm3 d'eau est ajoutée à une solution de 10 gr. de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir de 580 unités/mg
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dans 20 cm3 d'eau, et le mélange gélatineux épais qui se forme est versé dans 400 cm3 d'eau, froide. Le précipité gé- latineux formé est recueilli par centrifugation, est lavé par une nouvelle suspension dans l'eau, est recueilli par centrifugation et est séché dans le vide.
La combinaison du type salin de streptomycine et de l'agent de mouillage ainsi obtenue a un pouvoir d'environ 350 unités/mg, estin- soluble dans l'eau, est soluble dans les solvants organiques des savons ne se mélangeant sensblement pas avec l'eau (par exemple l'alcool amylique obtenu par fermentation effi- nage) et permet d'obtenir des dispersions satisfaisantes dans les milieux huileux (par exemple l'huile d'arachide ou l'oléate d'éthyle) pouvant être utilisées en clinique mé- dicale.
Exemple 6.
I,5 gr d'une combinaison du type salin de streptomycine et d'un ester partiel d'acide sulfurique d'un alcool alipha- tique supérieur, obtenue par exemple de la manière décrite dans l'exemple 2, (dont la streptomycine a une activité de 376. 000 unités déterminée par un essai chimique) est dissous dans 25 cm3 de méthanol, et on ajoute 25 cm3 d'acétone.
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P-ui-e-- -on--B;-5--cm3--,--e't;--on--a--3 - d'acétone. Puis on ajoute 0,5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré (jusqu'à un pH = environ 1,2) et ensuite 50 cm3 de plus d'acétone. On filtre le précipité obtenu (chlorhy- drate de streptomycine) et on le dissout dans l'eau.
On règle la valeur du pH de la solution à 6,8 par addition d'une résine neutre à échange d'anion et on la sèche par congélation. On obtient ainsi environ 0,7 gr de chlcrhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 425 unités/mg. (Rendement environ 79 %).
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Exemple 7.
280 cm3 d'une solution à 25 % d'un ester partiel d'acide sulfurique d'un alcool aliphatique supérieur (par exemple de Duponol 0) sont ajoutés lentement à une solution de 50 gr de sulfate de streptomycine partiellement purifiée dans 24 litres d'eau distillée, d'an pouvoir de 1.000 unités/cm3; le précipité floculent blanc, qui s'est formé, est isolé par centrifugation et séché dans le vide (10 mm) à la température ambiante pen- dant 12 heures. La combinaison du type salin ainsi obtenue pesant environ 57 gr. a un pouvoir d'environ 224 anités/mg et convient aux applications cliniques telle quelle ou sous diverses formes de produits pharmaceutiques.
En employant 310 cm3 d'une solution clarifiée (traitée par le carbone) à 25 % de l'agent de mouillage C4H9CH(C2H5) C2H4CH(SO4Na)C2H4CH(C2H5)2, (par exemple le Tergitol Penetrant 7) à titre de solution de l'agent de mouillage de l'exemple précédent, on obtient une combinaison du type salin d'un pou- voir d'environ 293 anités/mg avec un rendement d'environ 50 gr.
Exemple 8.
Une solution de 35 gr. d'un ester partiel d'acide sulfuri- que d'un alcool aliphatique supérieur (par exemple le Duponol 0) dans 350 cm3 d'eau., dont le pH est à 9,7, est ajoutée en agitant à une solution de 30 gr de sulfate de streptomycine d'un pouvoir de 490 unités/mg et de pH de 5,2; le solide qui se précipite est séparé par centrifugation et lavé avec de l'eau par centrifugation. On remet en suspension dans 400 om3 d'eau. la combinalson du type salin ainsi obtenue, on sèche la suspension par congélation et on obtient environ 38,5 gr. d'un solide blanc floconneux d'un pouvoir de 320 unités mg. (On élimine les dernières traces de sel organique en lavant avec de l'eau., remettant en suspension dans l'eau et séchant la suspension par congélation).
La combinaison du type salin ainsi obtenue n'est que légèrement soluble dans l'eau et se disperse parfaitement
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dans l'huile d'arachide, l'oléate d'éthyle et d'autres mi- lieux huileux. Une dispersion fine convenant aux injections intra-mascalaires d'un pouvoir de 200.000 unités/cm3, peut être obtenue, par exemple, en ajoutant lentement, tout en agitant, I cm3 d'huile d'arachide (ou d'oléate d'éthyle) à 666 cm3 de la combinaison du type salin.
Exemple 9.
On ajoute en agitant 2,1 cm3 d'une solution à 25 % de
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04HgOH(CZHS)C2H4UH(S04Na)C2H4CH(02H5)2 (par exemple de Tergitol Penetrant 7) &&Bt#a&é-&-e-&-agi-'e-aRt' à une solution de
0,5 gr de sulfato de dihydrostreptomycine dans 250 cm3 d'eau, ayant un pouvoir de 1210 anités/cm3; et on recueille par fil- tration la combinaison du type salin précitée (contenant plus de 83 o de l'activité de la solution traitée).
En traitant de la même manière une solution aqueuse de chlorhydrate de streptothricine d'un pouvoir de 500 unités/mg, on obtient le dérivé du type salin correspondant de streptothri- cine.
Exemple 10.
60 gr d'une combinaison de streptomycine et de l'agent de mouillage obtenue de la manière décrite dans le paragraphe a) de l'exemple I, ayant un pouvoir de 243 unités/mg sont de méthylamyle (acétate-2 de 4-méthylpentyle); on ajoute 40 cm3 d'acide
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dissous dans 400 em3 d'aoêtatehlorhydrique concentré et on agite vigoureusement le mélange. Puis on ajoute 40 cm3 d'eau et on continue à agiter pendant 10 minutes. On recueille la couche aqueuse qui se forme en se séparant, on la neutralise avec une résine neutre à échange d'anion, (par exemple l'Am- berlite IR-4B) et on la filtre. Le filtrat et le liquide de lavage d'un volume total d'environ 190 cm3 ont un pouvoir d'environ 65.000 unités/cm3 (avec un rendement d'environ 85 %).
En lavant la couche d'acétate de méthylamyle avec 60 cm3 d'oau, en neutralisant le liquide de lavage ot on filtrant, on obtient un filtrat supplémentaire d'un pouvoir de 16.000 unités/cm3 (le rendementtotal étant d'environ 97 %). Le
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chlorhydrate de streptomycine solide, obtenu par séchage par congélation a un pouvoir d'environ 575 unités/mg.
Exemple II.
Un filtrat de culture contenant de la streptomycine d'un pouvoir de 2II unités/cm3 et d'un pH de 1,5, est traité avec 1 gr. de charbon activé (par exemple Darco 3-51) par 20.000 unités et filtré; pais on règle le pH du filtrat à une valeur de 6,5 à 7,0. On ajoute au filtrat une solution
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à 25 % de C4H9CH(C2H5)C2H4CH(S04Na)C2H4CH(2H5)2 (par exem- ple le Torgitol Pénétrant 7), en proportion de I em3 de la solution de l'agent de mouillage pour 66. 400 unités de streptomycine ; on laisse reposer le précipité formé pendant 12 à 16 heures et on le filtre. La combinaison du type salin ainsi obtenue par la décomposition, telle qu'elle est décrite dans le paragraphe b) de l'exemple 3, fournit un chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 416 unités/mg avec un rendement d'environ 54 %.
Exemple 12.
Un chlorhydrate de streptomycine contenant 0,I mg d'hista- mine pour 207 unités d'activité de streptomycine est trans- formé en une combinaison du type salin avec un agent de mouil- lage de la manière décrite dans le paragraphe a) de l'exemple 3 ; et la combinaison du type salin est décomposée de la ma- nière décrite dans le paragraphe b) de cet exemple. La te- neur en histamine du chlorhydrate de streptomycine ainsi ob- tenu est de 0,1 mg pour chaque fois 610 unités d'activité de streptomycine.
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t4é-âlae44é-âe-epee4ae .
Exemple 13.
20 gr. d'une combinaison du type salin de streptomycine et de l'agent de mouillage obtenue de la manière décrite dans le paragraphe a) de l'exemple I (la streptomycine de cette combinaison ayant une activité de 4.240.000 unités
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sont dissous dans 100 cm3 de méthanol; et on ajoute une bouillie de 40 gr. d'une résine à échange d'anion (par exem- ple d'Amberlite IR-4B) dans 300 cm3 d'eau, avec an pH de 6,5.
Puis, tout en agitant et maintenant le mélange à une tempéra- ture de 50 à 55 C, on y ajoute de l'acide chlorhydrique con- centré goutte à goutte dans des conditions de nature à main- tenir le pH à une valeur de 3,0 à 3,5.
(On peut déterminer le moment où la décomposition est terminée en observant l'augmentation du précurseur de maltol dans la solution aqueuse). Au bout d'une heure, pendant la- quelle on a ajouté environ 3,5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré, on laisse le pH atteindre une valeur de 5,0 à 5,5, on filtre la solution, on élimine le méthanol du fil- trat par évapora.tion dans le vide et on sèche par congélation la solution résiduelle en obtenant environ 6,5 gr. de chlorhy- drate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 578 unités/mg avec un rendement d'environ 90 %.
Exemple 14.
15 gr. d'une combinaison du type salin de streptomycine et d'un agent de mouillage obtenue de la manière décrite dans le paragraphe a) de l'exemple I (la streptomycine de la oom- binaison ayant une activité de 2.960.000 unités sont dissous dans 100 om3 de méthanol et on fait passer HCl sec dans la so- lution, jusqu'à ce qu'il ne se forme plus de précipité. Puis on dilue le mélange avec 500 cm3 d'acétone; et le précipité est séparé par filtration et dissous dans 100 cm3 d'eau. On règle le pH de la solution à une valeur de 5,5 par addition d'une résine neutre à échange d'anion (par exemple d'Amber- lite IR-4B), on filtre la solution et on sèche le filtrat par congélation en obtenant environ 4,96 gr. de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 385 anités/mg avec un rendement de 64,5 %.
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Exemple 15. a) 3785 litres d'un filtrat de culture contenant de la streptomycine d'un pouvoir de 400 unités/cm3 et dont le pH a une valeur comprise entre 3 et 4 sont chauffés à 20 C et neutralisés à une valeur du pH de 7,5 ¯ 0,2 par addition d'une solution de soude caustique à 10 %, (17,0 litres envi- ron étant nécessaires à cet effet); et on traite la solution neutralisée avec 113,7 kg de charbon activé (par exemple Dar- co G-60) et 9,0 kg de matière filtrante (par exemple Hyflo).
On agite la bouillie pendant une heure et on la filtre. On lave le tourteau de carbone avec au moins 378 litres d'eau et on le sèche par un courant d'air.
950 litres du second extrait provenant d'une extraction antérieure, ainsi qu'il est décrit ci-après, sont amenés à un volume de 2850 litres par addition de l'eau de ville. On ajoate le tourteau de carbone du paragraphe précédent, on maintient la bouillie à une température de 35 à 40 C en l'agitant et on règle le pH de la suspension à une valeur de 2,2 0,2 par l'addition d'acide nitrique à 10 %, (une quan- tité d'environ 6,39 kg étant nécessaire à cet effet). Après avoir agité pendant une heure, on élimine le carbone par fil- tration et séchage par un courant d'air et on recueille le filtrat (ou. premier extrait).
On introduit le carbone ainsi extrait dans 950 litres d'eau fraîche de ville, en vue d'une seconde extraction, que l'on erfectue de la manière décrite dans le paragraphe pré- cédent en ajoutant une faible quantité d'acide nitrique à 10 % (s'il y a lieu) pour régler de nouveau lo pH à une va- laur de 2,2 + 0,2. Le second extrait ainsi obtenu sert à la première extraction décrite dans le paragraphe précédent.
Le rendement total fourni par le filtrat de culture est d'en- viron 82 %.
On règle le pH du premier extrait à une valeur de 7,5 + 0,1 par addition d'une solution de soude caustique à 10 %, (15,9 litres étant nécessaires à cet effet), tout en main-
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tenant la température à IO C ou au-dessous. On ajoute 3,40 kg d'une matière filtrante (par exemple Hyflo) et on filtre la bouillie. On ajoute au filtrat incolore (exempt de fer) à une température de 10 à 15 C, la moitié du volume total d'une
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solution à 25 ;b de CE9CE(C2E5)C2E4CE(S04fla)C2E4CE(C2H5)2 (par exemple le Tergitol Pénétrant 7) nécessaire à la préci- pitation de la streptomycine (cette quantité étant basée sur l'activité de l'extrait, déterminée par un essai chimique en proportion de Icm3 par 92.400 unités de streptomycine).
Une fois cette portion de l'agent de mouillage ajoutée on commence l'essai de la détermination de la fin de la précipitation.
(On filtre à cet effet un échantillon de la bouillie et on re- cueille environ 2 cm3 du filtrat, puis on ajoute au filtrat une à deux gouttes d'acide phosphotungstique à 50 % qui forme un précipité, si la précipitation par l'agent de mouillage est incomplète). On ajoute alors un complément de la solution de l'agent de mouillage par portions d'un litre, jusqu'à ce que l'essai indique que la précipitation est terminée, (environ 13,0 kg ou 22,8 litres d'une solution à 25 o de l'agent de mouillage étant nécessaire à cet effet). On agite la charge pendant une demi-heure et on recueille la matière solide (qui est de la combinaison du type salin) par centrifugation.
Le rendement fourni par le filtrat de oulture est d'environ 73,8 %, le rendement de la précipitation étant d'environ 90 %. b) La combinaison du type sa.lin à l'état hydraté est dissou- te dans le méthanol à 90 %; à une température de 20 à 25 C, en proportion de 15 gr. pour 100 cm3 de solvant, (plus de 22,7 li- tres de méthanol étant nécessaires à cet effet); on filtre la solution, on ajoute lentement au filtrat une quantité d'acide chlorhydrique concentrée suffisante pour décomposer la combi- naison du type salin et abaisser le pH à une valeur de 0,8 + 0,I, (0,408 kg d'acide étant nécessaire à cet effet); et on verse le mélange dans 87,9 kg d'acétone et on le laisse reposer pendant une heure à une température de 5 à IO C.
Le précipité (chlorhy- drnto de streptomycine) est filtré à l'état aussi sec que par-
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sible, sur un filtre à vide, puis est dissous dans l'eau avec une proportion de 100 cm3 d'eau pour 10 gr. de la combi- naison du type salin traitée, (22,7 litres d'eau environ étant nécessaire à cet effet). On neutralise la solution en l'agitant avec environ 0,49 kg de résine neutre à échange d' d'anion (par exemple d'Amberlite IR-4B) dont le pH est 6,5 pour régler le pH du chlorhydrate de streptomycine à une va- leur comprise dans l'intervalle de 6,0 à 6,5, entre les li- mites duquel il est le plus stable. On filtre le mélange ainsi obtenu.; on distille le filtrat pour le débarrasser du méthanol et de l'acétone sous une pression de 15 à 20 mm et on le filtre, puis on le sèche par congélation.
Le rendement en chlorhydrate de streptomycine ainsi fourni par le filtrat de culture est d'environ 51,8 % et le rendement de la décom- position d'environ 70 %.
La résine neutre à échange d'anion peut être préparée de la manière suivante: on introduit 4,53 kg d'une résine à échange d'anion (par exemple d'Amberlite IR-4B) dans 37,85 litres d'eau de ville. On ajoute une quantité suffisante d'une solution de carbonate de sodium à IO % pour régler le pH à une valeur de IO,5 ¯ 0,2, et on lave la résine alcaline avec de l'eau distillée jusqu'à ce que le pH du milieu.'aqueux atteigne 6,5.
On conserve la résine neutre dans le milieu aqueux jusqu'à ce qu'on s'en serve à la neutralisation, c'est- à-dire qu'on la filtre dans le milieu aqueux un. instant avant de s'en servir. kg b : variante) 6,88/de la combinaison du type salin déshy- dratée sont dissous dans le méthanol absolu à une température de 20 à 25 C en proportions de 20 gr. de la combinaison du type salin pour 100 cm3 de méthanol à 100 %, (34 litres au moins de méthenol étant nécessaires à cet effet).
On filtre la solution; on ajoute au filtrat 20,63 kg d'une résine neutre à échange d'anion dont le pH est 6,5 (par exemple d'amberlite IR-4B) et on ajoute une quantité d'eau à la bouillie ainsi
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obtenue, suffisante pour abaisser la concentration du mé- thanol à 25 % (I02,2 litres d'eau environ étant nécessaires à cet effet). La bouillie, dont le volume est d'environ 159 litres, est chauffée à une température de 50 à 55 C et est maintenue à cette température pendant qu'on y ajoute 1,89 litre d'acide chlorhydrique concentré dans des conditions de nature à maintenir le pH du mélange à une valeur comprise entre 3,0 et 3,5.
Puis on agite le mélange jusqu'à ce que le pH atteigne sa valeur maximum comprise entre 5,6 et 6,2, (si le pH est inférieur à 6, on ajoute de faibles quantités de résine neutre à échange d'anion jusqu'à ce que la valeur finale du pH soit comprise entre 6 et 6,5). Puis on filtre 1;:: bouillie et on lave la résine avec une quantité d'eau. suffisante pour éliminer le chlorhydrate de streptomycine qui y adhère éventuellement; le filtrat et l'eau de lavage combinés, dont le volume est d'environ 179,8 litres et le pouvoir d'environ 6.500 unités cm3, sont alors concentrés à un volume d'environ II,35 litres et on recueille le chlorhy- drate de streptomycine par séchage par congélation. Le rende- ment de la décomposition est de 60 à 80 %.
Les agents de mouillage des exemple qui précèdent peuvent être remplacés par des quantités équivalentes d'autres agents de mouillage du type des acides inorganiques polybasiques, organiquement substitués (dont des sous genres et catégories ont été énumérés précédemment à titre d'exemple). Parmi d'autres dérivés du type salin de streptomycine qu'on peut obtenir suivant l'invention et qui conviennent particulière- ment aux applications thérapeutiques telles quelles (et sous diverses formes pharmaceutiques) on peut citer ceux qu'on
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peut obtenir avec le CECE(C?E)CECE(s0Na)CECE(cE) (par exemple le Tergitol Penetrant 4) et avec des esters par- tiels d'acide sulfurique des alcools aliphatiques supérieurs de différents poids moléculaires et leurs sels (par exemple les divers Daponols).
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Parmi d'autres antibiotiques basiques du type de la streptomycine, qui peuvent servir à la préparation de combi- naison du type salin avec les agents de mouillage suivant l'invention, on peut citer la streptomycine A, la streptomy- cine B, la dihydrostreptomycine A, la dihydrostreptomycine B et la streptothricine pures ou. sensiblement pures.
Les antibiotiques basiques du type de la streptomycine pu- rifiés par le procédé suivant l'invention peuvent être purifiés davantage en appliquant de nouveau le même procédé de purifica- tion. De même, ils peuvent subir une purification préliminaire ou ultérieure par d'autres procédés, en particulier par un des procédés suivants : I) On amène en contact intime une solu- tion aqueuse de l'antibiotique avec un acide carboxylique sen- siblement insoluble dans l'eau et un solvant organique de l'aci- de carboxylique ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau, on recueille la phase du solvant organique et on transforme le dérivé du type salin de l'antibiotique qu'elle contient en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique (Voir la demande do brevet déposée aux Etats-Unis le 19 juillet 1947 sous le n 762.205);
II) On traite une solution aqueuse de l'antibiotique avec un sel soluble dans l'eau d'un acide carboxylique sensi- blement insoluble dans l'eau; on recueille la combinaison pré- cipitée du type salin de l'antibiotique et de l'acide carboxy- lique et on la transforme en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique (Voir demande de brevet déposée aux Etats-Unis le 19 juillet 1947 sous le n 762.206); et III) On amène en contact intime une solution aqueuse de l'antibiotique avec un agent de mouillage du type d'un acide inorganique polybasique organiquement substitué et un solvant organique des savons ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau;
on recueille la phase du solvant organique et on transforme le dérivé du type salin de l'antibiotique qu'elle contient en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique (voir la demande de brevet belge déposée par la demanderesse le $ août 1948 sous le n 376. 546).
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L'invention ne doit pas être considérée comme limitée aux formes de réalisation décrites ci-dessus qui n'ont été choissies qu'à titre d'exemple.
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"Process for the preparation and purification of basic" antibiotics
The invention relates to antibiotics / or alkalis of the streptomycin type, that is to say to the elements of the genus consisting of streptomycin and basic compounds with antibiotic action, which (like streptomycin) can form water-soluble salts with acids, such as sulfuric acid, and water-insoluble salts with organic base-precipitating reagents (for example streptomycin derivatives, such as dihydrostreptomyoine and active antibiotics similar,
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such as streptothricin).
In 1944, Schatz, Bogie and Waksman (Proc.Soc.Exp.Biol.
Med. 1944, 57, 244) have shown that a potent antibiotic called "Streptomycin'T is formed during the growth of the organism" Actinomyc6s Grisous ", (now called" Streptomyces Griseus ") and it has since been found that this year - tibiotic is extremely useful in medical clinic.
It was then discovered that several streptomicins are formed at the same time. The first streptomycin obtained in crystalline, pure (as reineckate) form and fully characterized is now called "Streptomycin A"; and the second characterized streptomycin is now referred to as "Streptomycin B". In addition, there is evidence that other streptomycins are formed and / or may be formed at the same time by changing the conditions of the culture; and it should be understood that each of these antibiotics and their mixtures (in the form of free bases or of their soluble salts in water) will be designated by the word "streptomyoine", unless otherwise indicated. opposites.
Streptomycin has heretofore been purified by various methods, all of which are complicated and / or inefficient (and, therefore, expensive). For example, a process applied to a large extent prior to the invention comprises, in principle, the following operations: I - A liquid is treated with activated charcoal which selectively absorbs the primary streptomycin containing streptomycin, 2 - Streptomycin is extracted from charcoal with a water soluble aqueous mineral acid, preferably by slightly raising the temperature (eg to about 30-50 ° C); 3 - The extract is treated with an organic base precipitation reagent, preferably phosphetungstic acid, and 4 - The precipitate is decomposed.
(The expression "primary liquid containing strptomyoine" should be taken to mean
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in particular: a) the culture liquid obtained by proliferating streptomyces griseas under conditions and in a culture medium suitable for the formation of streptomycin and by separating the solids from the medium; b) the culture liquid of enhanced potency, obtained by acidifying the culture (for example by hydrochloric or sulfuric acid), the liquid being neutralized, and c) the liquid obtained by acid extraction of the solids. separated from the culture, the liquid being neutralized).
One of the objects of the invention resides in simple, efficient and advantageous methods from other points of view for purifying basic antibiotics, of the streptomycin type, and in particular streptomycin, and another object of the invention. resides in the formation of certain saline-like derivatives of basic streptomycin-type antibiotics, which can be used in these purification methods and other applications, and also resides in methods of preparing these derivatives.
It has been found that basic antibiotics of the streptomicyne type react with surface active agents, or wetting agents, of the inorganic, polybasic, organically substituted acid type, forming certain combinations of the salt type, which are much less soluble in water than antibiotics and can be collected; and it has further been discovered that these salt-like derivatives of antibiotics can be decomposed to collect the antibiotics.
The methods according to the invention consist in principle in reacting a basic antibiotic, of the type streptomycin, (in particular streptomycin) with a wetting agent of the type of an inorganic polybasic acid, inorganically substituted, in. a solvent for the reagents (in particular water). The combination of the saline type thus formed of the antibiotic and the wetting agent is relatively
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insoluble in water. and can be collected by filtration, centrifugation or other suitable means when water serves as the solvent for the reagents.
When the solvent for the reagents is a solvent (such as methanol) in which the salt-type combination is soluble, this combination is collected by removing the solvent and purifying the residue, for example by washing with water. water., or by adding a miscible, non-solvent, salt-type combination (such as water).
The purification methods according to the invention consist in principle of treating an impure basic antibiotic of the streptomycin type with a wetting agent of the polybasic, organically substituted inorganic acid type in a solvent for the reagents, by particular to treating an aqueous solution of the impure antibiotic (for example a primary liquid containing streptomycin or an aqueous solution of a partially purified streptomycin, such as the extract discussed above) with the wetting agent, collecting the salt-like combination of the antibiotic and the wetting agent and converting the latter combination into a water soluble salt of the antibiotic.
This transformation can be carried out, for example, by dissolving the salt-type derivative in one of its solvents (such as methanol), by treating the solution with an aqueous solution of a relatively strong-soluble acid in
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water, (in partuulidr avoo ano solution r? whati ±; e of a here- mineral relatively strong soluble in water), and collecting the water-soluble salt thus formed (of the antibiotic basic, of the streptomycin type), for example by adding a miscible, non-solvent,. water soluble salt, (such as acetone), and collecting the precipitate. The product thus obtained is much purer than the treated antibiotic and the recovery of the antibiotic activity, achieved during the treatment of
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purification, is of a high order.
In the practical implementation of the invention, it is possible to regularly obtain high yields of relatively pure streptomycin, possessing (for example) an antibiotic potency of greater than about 400 units / mg.
Among the wetting agents of the type of inorganic, polybasic, organically substituted acids suitable for the process / invention, there may be mentioned those which are represented by the radical represented by the formula R-0-X-0-Y, in which R denotes an organic hydroxyl compound which does not substantially mix with water, -OXO- denotes the divalent acid radical of an inorganic, polybasic, water-soluble acid (for example a sulfuric or phosphoric acid ), and Y denotes an element of the group formed by H and the water-soluble salts forming cations with the anion R-0-XO-.
Among the wetting agents suitable for the process according to the invention, there may be mentioned in particular those in which the polybasic inorganic acid is sulfuric acid, the acid being partially esterified with a higher aliphatic alcohol, that is to say - say wetting agents from the group formed by higher aliphatic monoesters of sulfuric acid, and their water-soluble salts.
Other wetting agents which may be preferably chosen from the type of inorganic, polybasic, organically substituted acids suitable for the process according to the invention are those from the group formed by aromatic sulphonic acids, sulphonated oils, derivatives of. sulfonated higher fatty acids and their water soluble salts.
Among the partial higher alkyl esters of sulfuric acid which may be used in the practical implementation of the invention, there may be mentioned: the groups of the sodium salts of the sulfates of the higher aliphatic alcohols
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synthetic, such as CH9CH (C2H5) CH4CH (304Na) CH4CH (CH
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(eg Tergitol Penetrant 7), C4H9CH (C2H5) C2H4CH (SO4Na (CH2CH) OH3) 2, (eg Tergitol Penetrant 4) and C4H9OH (C2H5) CH2SO4Na, (eg Tergitol Penetrant 08), and the series sulfuric acid partial esters of higher aliphatic alcohols and their salts, such as octyl sodium, oleyl sodium, oetyl sodium, stearyl sodium and lauryl sodium sulfate (for example Aurinol, Weta- nol, Duponols and Gardinols).
Among the aromatic salfonic acids, sulphonated oils and sulphonated higher fatty acid derivatives which can be used in the practical implementation of the invention, there may be mentioned sodium salfonates of higher fatty acid esters and amides such as the sodium salt of ethyl salfonate (or an alkyl oleate) (eg Igepon AP Extra) and CI7H33CONHC2H4SO3Na (eg Igepon T); the sodium sulphonates of petroleum hydrocarbons (eg Ultrawet); the sodium salt of a polyalkylbenzenesulfonic acid containing 10 carbon atoms (for example Ultrawet, 40A) and other sodium alkyl aryl salfonates (for example Nacconol NRSF) and Turkish red hail, ( that is to say the salfonée castor hail).
Among the partial esters of phosphoric acids which can be used in the practical implementation of the invention, there may be mentioned phosphate, dicresyl, lecithin and a higher phosphorus alcohol represented by the formula (capryl) 5Na5P6O2O (for example the WA58).
Among the relatively strong water-soluble acids which can be used to collect antibiotics in their salt-like combinations with wetting agents are sulfuric, hydrochloric, phosphoric, oxalic, citric, sulfamic and acidic acids. nitric.
To achieve maximum yield, the wetting agent should be substantially in excess of the amount which is required to combine all
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of the antibiotic contained in the treated solution, the most advantageous proportion of the wetting agent depending on the concentration of the treated solution and the potency of the antibiotic. By employing the stoichiometric amount of the wetting agent (relative to the antibiotic activity of the treated solution), a substantially quantitative proportion of the antibiotic can be recovered as its saline derivative; andthe essentially saline derivative thus obtained enables the antibiotic to be collected more easily as a water soluble salt.
According to one of the embodiments of the invention, an aqueous solution of an impure antibiotic, of the streptomycin type, is treated with an aqueous solution of the wetting agent, and the precipitate formed is collected and transformed into a water soluble salt of the antibiotic.
Alternatively, the wetting agent can be added to the solution of the antibiotic in the solid state, or alternatively the antibiotic and the wetting agent can both be added in the solid state to the water. (or other solvent for the reagents).
The combination of the saline type of the antibiotic and the agent / wetting agent can separate from the solvent of the reagents in various forms; example in the form of an oily, waxy or gelatinous substance, or not to separate at all, but to remain in the state of dispersion in the solvent, (all these insoluble forms to be considered as designated by the word "precipitate"); and, depending on its form, the precipitate is separated by filtration, centrifugation, treatment using a filter followed by filtration or by other ordinary means known to those skilled in the art.
The precipitation of the salt-like combination of the antibiotic and the wetting agent depends on the concentration of the reagents and the pH value of the reaction medium, the precipitation being maximum when the concentration of the reaction medium.
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oontration is strong and the pH value between about 5 and about 8 and, preferably, close to 7.
According to another variant, the combination of the saline type of the antibiotic and the wetting agent thus formed can also serve as such as a therapeutic agent. These salt-type derivatives are generally soluble in oil or. can disperse therein and can be used therapeutically, for example by administering them by mouth as they are or in oily media to treat intestinal diseases (by having recourse to the intestinal functions to release the antibiotic in the form of soluble in water) or by also administering them in oily media (or by impregnating a pellet with a solid material) to obtain a prolonged antibiotic action.
When it is proposed to prepare the salt-like derivative of the antibiotic instead of purifying it, a reconstituted aqueous solution of the antibiotic (for example an aqueous solution of the highly purified antibiotic or otherwise) can be employed. .)
The transformation of the salt-type combination of the antibiotic and the wetting agent into a water-soluble salt of the antibiotic can be carried out, among others, by the following means: the combination of the type is dissolved saline in a solvent of this combination, (for example methanol), the solution is treated with a relatively strong, water-soluble acid, and the water-soluble salt thus formed of the antibiotic is collected, (e.g. example by adding a miscible non-solvent for the water soluble salt, such as acetone);
or the salt-like combination (in solution) is brought into intimate contact with an adsorbent (eg alumina), or an anion exchange resin which has previously been treated with the relatively strong acid soluble in water. water, chosen, and the water-soluble salt thus formed of the antibiotic is collected in the treated solution, (for
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example by removing the solvent);
or else the combination of the salt type is dissolved in an organic solvent of soaps which do not substantially mix with water (for example n-butanol or amyl alcohol obtained by fermentation and refining), it is brought to Intimate contact of the solution with an aqueous solution of a relatively strong, water-soluble acid, the aqueous phase is collected and dried, (preferably by freezing, i.e. freezes and is subjected to a high vacuum lice drive away the water by sublimation);
or the combination of the salt type is dissolved in a solvent of this combination in which the water-soluble salt which is desired to be obtained is insoluble (for example a mixture of methanol and acetone), the solution is treated with an aqueous solution of a relatively strong acid, soluble in water, and the salt, soluble in water, precipitated from the antibiotic is collected; or. well, a solution of the combination of the salt type is treated with an aqueous solution of a relatively strong acid, soluble in water, in the presence of an anion exchange resin, or by various other means to achieve intimate contact and reacting the salt-type combination with the relatively strong, water-soluble acid.
The invention is easier to understand from the following examples (all the solutions in question being solutions or dilutions in water, unless the solvent or diluent is specially indicated):
Example I a) At 500 cm3 of a culture filtrate containing streptomycin (obtained by proliferating streptomyces griseus in submerged culture in aqueous media containing soybean meal, dextrose, and sodium chloride, in acidifying the seeded culture and filtering it) having an antibiotic power of 259 anities / cm3 and a pH of 6.5, are added
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12 OM3 of a 25% solution of U4H9UH (G2U2H4UH (S04Na) U2H4 CH (C2H5) 2, (for example Tergitol Penetrant 7) while stirring,
and we continue to stir for half an hour. The halle which separates is a combination of the salt type streptomycin and the wetting agent and contains about 94% of the activity of the culture filtrate. b) The combination of the salt type thus obtained starting from a load of culture filtrate with an activity of 1,245,000 units is dissolved in methanol, then reprecipitated again by adding an equal volume of water; it is redissolved in 80% methanol and passed through an alumina column, previously washed with hydrochloric acid to pH 4.1, then dried.
The percolate (about 250 cm3 including the wash methanol) is collected and the streptomycin hydrochloride is collected by adding an equal volume of water, the methanol is removed by vacuum distillation, the combination of type is removed. salt optionally not decomposed, the pH of the remaining aqueous solution is adjusted to a value of 5.5 and dried by freezing. Approximately 1.55 g of streptomycin hydrochloride are obtained having a potency of 320 anit / mg (with a yield of approximately 40%).
Example 2 0.5 g of a partial ester of sulfuric acid of a higher aliphatic alcohol (for example Duponol C) in 20 cm3 of water is added to 500 cm3 of an extract containing streptomycin having a power of 300 units / 6m3 and a pH of 6.5 (obtained by treating a culture filtrate containing streptomycin with activated charcoal and extracting streptomycin from the charcoal with hydrochloric acid, sulfuric acid or dilute nitric), the cloudy solution is stirred for one hour and the flocculent precipitate formed is separated by filtration.
The combination
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thus obtained of the saline type of streptomycin and the wetting agent contains about 76% of the activity of the extract; it can be used as such as a therapeutic agent or converted to a water soluble salt of streptomycin, for example as described in Example 6 below.
Example 3 a) 16 cm3 of a 25% solution of C4H9CH (C2H5) C2H4CH (SO4Na) C2H4CH (C2H5) 2, (for example Tergitol Penetrant 7) are added while stirring, over one hour, to 7 liters of an extract containing streptomycin nitrate, having a potency of 195 units / cm3 and a pH of 7.0; the precipitate formed is left to stand for 1-2 hours at about 5 ° C. and filtered.
The resulting salt-like combination of streptomycin and the wetting agent contains about 93% of the activity of the extract. b) Compressed, or treated in any other way to remove entrained water, a combination thus obtained starting from an extract charge with an activity of 850,000 units and dissolved in an amount of methanol at 90- 100% sufficient (depending on the water content of the salt-type combination thus partially dehydrated) to form a solution in 100 cm3 of 90% methanol; then the solution is passed through a 2.5 x 25 cm column of anion exchange resin (for example, Amberlite IR-4B, of. US Pat. No. 2,402,384 of June 18, 1946), the pH of which is was previously set to a value of 2.5 by addition of dilute hydrochloric acid.
The percolation product is collected in two portions of 125 cm3 (including the wash methanol) and each portion is treated by adding an equal volume of water, the methanol distilling off in vacuum, adjusting the temperature. pH of the remaining aqueous solution to a value of 5.5 by treatment with a neutral anion exchange resin,
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by filtering and drying by freezing.
With the first and second portions of the infusion product, respectively, approximately 0.8 g of streptomycin hydrochloride with a potency of approximately 679 units / mg and approximately
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0.1 gr with a potency of approximately 425 units / mg with a total yield of approximately 73.1%. b: variant) A combination of the salt type thus obtained, starting from an extract load with an activity of 860,000 units (weighing approximately 4 g.) is dissolved in 150 ounces of 90% methanol;
and the solution is stirred with 50 gr. an anion exchange resin, the pH of which has previously been adjusted by the addition of dilute hydrochloric acid. After filtration and freeze-drying the filtrate, about 0.8 g of streptomycin hydrochloride with a potency of about 616 units / mg is obtained and a supplement of about 0.14 g of streptomycin hydrochloride can be obtained. a power of 635 units / mg in 90% methanol to wash the resin, with a total yield of 08%.
Example 4.
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5.5 cm3 of a 25 y solution. of C4HgCH (C2H5) C2g4CH (S04Na) C2H4CH (C2H5) 2, (for example Tergitol Penetrant 7) are added to a solution of 1 gr of streptomycin hydrochloride with a power of 525 units / mg in 100 cm3 of water , the mixture is stirred for half an hour in a mechanical stirrer and the waxy precipitate formed is filtered off. The combination of the streptomycin saline type and the wetting agent thus obtained (weighing about 2.2 g) contains about 96.5 of the activity of the strep hydrochloride solution.
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Lu 111, Y U 1 Ut: I L. L 'tt1 L t: I.
Example 5.
A solution of 10 g of a partial ester of sulfuric acid of a higher aliphatic alcohol (for example Duponol C) in 50 cm3 of water is added to a solution of 10 g. streptomycin hydrochloride with a potency of 580 units / mg
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in 20 cm3 of water, and the thick gelatinous mixture which forms is poured into 400 cm3 of cold water. The gelatinous precipitate formed is collected by centrifugation, is washed with a further suspension in water, is collected by centrifugation and is dried in vacuo.
The combination of the saline type of streptomycin and the wetting agent thus obtained has a potency of about 350 units / mg, is insoluble in water, is soluble in organic solvents of soaps not substantially mixing with water. water (for example amyl alcohol obtained by fine fermentation) and makes it possible to obtain satisfactory dispersions in oily media (for example peanut oil or ethyl oleate) which can be used clinically medical.
Example 6.
I, 5 g of a combination of the saline type of streptomycin and of a partial ester of sulfuric acid of a higher aliphatic alcohol, obtained for example as described in example 2, (of which streptomycin has an activity of 376,000 units determined by a chemical test) is dissolved in 25 cm3 of methanol, and 25 cm3 of acetone is added.
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P-ui-e-- -on - B; -5 - cm3 -, - e't; - on - a - 3 - acetone. Then 0.5 cm3 of concentrated hydrochloric acid (up to a pH = about 1.2) is added and then 50 cm3 more acetone. The resulting precipitate (streptomycin hydrochloride) is filtered off and dissolved in water.
The pH value of the solution is adjusted to 6.8 by addition of a neutral anion exchange resin and freeze dried. There is thus obtained approximately 0.7 g of streptomycin hydrochloride with a potency of approximately 425 units / mg. (Yield about 79%).
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Example 7.
280 cm3 of a 25% solution of a partial ester of sulfuric acid of a higher aliphatic alcohol (for example of Duponol 0) are slowly added to a solution of 50 g of partially purified streptomycin sulfate in 24 liters of distilled water, with a capacity of 1,000 units / cm3; the white flocculent precipitate which formed was isolated by centrifugation and dried in vacuum (10 mm) at room temperature for 12 hours. The combination of the salt type thus obtained weighing about 57 gr. has a potency of approximately 224 anit / mg and is suitable for clinical applications as such or in various forms of pharmaceuticals.
By employing 310 cm3 of a 25% clarified (carbon treated) solution of the wetting agent C4H9CH (C2H5) C2H4CH (SO4Na) C2H4CH (C2H5) 2, (e.g. Tergitol Penetrant 7) as the solution of the wetting agent of the previous example, a combination of the salt type with a potency of about 293 anities / mg is obtained with a yield of about 50 g.
Example 8.
A solution of 35 gr. of a partial ester of sulfuric acid of a higher aliphatic alcohol (for example Duponol 0) in 350 cm3 of water, the pH of which is 9.7, is added with stirring to a solution of 30 gr of streptomycin sulfate with a potency of 490 units / mg and a pH of 5.2; the solid which precipitates is separated by centrifugation and washed with water by centrifugation. It is resuspended in 400 om3 of water. The salt-type combinalson thus obtained, the suspension is dried by freezing and approximately 38.5 g are obtained. of a fluffy white solid with a potency of 320 mg units. (The last traces of organic salt are removed by washing with water, resuspending in water and drying the suspension by freezing).
The resulting salt-type combination is only slightly soluble in water and disperses perfectly
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in peanut oil, ethyl oleate and other oily media. A fine dispersion suitable for intra-mascalar injections with a potency of 200,000 units / cm3, can be obtained, for example, by slowly adding, while stirring, 1 cm3 of peanut oil (or ethyl oleate ) to 666 cm3 of the salt type combination.
Example 9.
2.1 cm3 of a 25% solution of
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04HgOH (CZHS) C2H4UH (S04Na) C2H4CH (02H5) 2 (e.g. from Tergitol Penetrant 7) && Bt # a & é - & - e - & - agi-'e-aRt 'to a solution of
0.5 gr of dihydrostreptomycin sulphate in 250 cm3 of water, having a power of 1210 anities / cm3; and the above salt-type combination (containing more than 83% of the activity of the treated solution) is collected by filtration.
By treating in the same manner an aqueous solution of streptothricin hydrochloride with a potency of 500 units / mg, the corresponding salt derivative of streptothricin is obtained.
Example 10.
60 gr of a combination of streptomycin and the wetting agent obtained as described in paragraph a) of Example I, having a potency of 243 units / mg are methylamyl (2-acetate of 4-methylpentyl ); 40 cm3 of acid are added
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dissolved in 400 em3 of concentrated hydrochloric acid and the mixture is stirred vigorously. Then 40 cm3 of water are added and stirring is continued for 10 minutes. The aqueous layer which forms on separation is collected, neutralized with a neutral anion exchange resin, (eg, Amberlite IR-4B) and filtered. The filtrate and the washing liquid with a total volume of about 190 cm3 have a power of about 65,000 units / cm3 (with a yield of about 85%).
By washing the methylamyl acetate layer with 60 cm3 of water, neutralizing the washing liquid and filtering, an additional filtrate is obtained with a power of 16,000 units / cm3 (the total yield being about 97%). . The
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Streptomycin hydrochloride, solid, obtained by freeze drying has a potency of about 575 units / mg.
Example II.
A culture filtrate containing streptomycin with a potency of 2II units / cm3 and a pH of 1.5 is treated with 1 g. activated carbon (eg Darco 3-51) by 20,000 units and filtered; Then the pH of the filtrate is adjusted to a value of 6.5 to 7.0. A solution is added to the filtrate
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25% C4H9CH (C2H5) C2H4CH (S04Na) C2H4CH (2H5) 2 (for example Torgitol Penetrant 7), in a proportion of I em3 of the solution of the wetting agent for 66,400 units of streptomycin; the precipitate formed is left to stand for 12 to 16 hours and filtered. The salt-type combination thus obtained by the decomposition, as described in paragraph b) of Example 3, provides streptomycin hydrochloride with a potency of about 416 units / mg with a yield of about 54%.
Example 12.
Streptomycin hydrochloride containing 0.1 mg of histamine per 207 units of streptomycin activity is converted into a salt-like combination with a wetting agent as described in paragraph a) of 1. example 3; and the salt type combination is decomposed as described in paragraph b) of this example. The histamine content of the streptomycin hydrochloride thus obtained is 0.1 mg for each time 610 units of streptomycin activity.
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t4é-âlae44é-âe-epee4ae.
Example 13.
20 gr. a combination of the saline type of streptomycin and the wetting agent obtained as described in paragraph a) of Example I (the streptomycin of this combination having an activity of 4,240,000 units
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are dissolved in 100 cm3 of methanol; and add a slurry of 40 gr. of an anion exchange resin (eg Amberlite IR-4B) in 300 cc of water, with a pH of 6.5.
Then, while stirring and maintaining the mixture at a temperature of 50 to 55 ° C., concentrated hydrochloric acid is added dropwise thereto under conditions such as to maintain the pH at a value of 3. , 0 to 3.5.
(The point at which decomposition is complete can be determined by observing the increase in maltol precursor in the aqueous solution). After one hour, during which approximately 3.5 cm3 of concentrated hydrochloric acid has been added, the pH is allowed to reach a value of 5.0 to 5.5, the solution is filtered, the methanol is removed. of the filtrate by evaporation in vacuo and the residual solution is dried by freezing to obtain approximately 6.5 g. of streptomycin hydrochloride with a potency of about 578 units / mg with a yield of about 90%.
Example 14.
15 gr. a combination of the saline type of streptomycin and a wetting agent obtained as described in paragraph a) of Example I (the streptomycin of the combination having an activity of 2,960,000 units are dissolved in 100 m 3 of methanol and dry HCl pass through the solution until no more precipitate is formed, then the mixture is diluted with 500 cm 3 of acetone, and the precipitate is filtered off and dissolved in 100 cm3 of water The pH of the solution is adjusted to a value of 5.5 by adding a neutral anion exchange resin (for example Amberlite IR-4B), the mixture is filtered. solution and the filtrate is dried by freezing, obtaining approximately 4.96 g of streptomycin hydrochloride with a potency of approximately 385 anit / mg with a yield of 64.5%.
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Example 15. a) 3785 liters of a culture filtrate containing streptomycin with a capacity of 400 units / cm3 and whose pH has a value between 3 and 4 are heated to 20 C and neutralized to a pH value 7.5 ¯ 0.2 by addition of a 10% caustic soda solution, (about 17.0 liters being required for this purpose); and treating the neutralized solution with 113.7 kg of activated charcoal (eg Darco G-60) and 9.0 kg of filter material (eg Hyflo).
The slurry is stirred for one hour and filtered. The carbon cake is washed with at least 378 liters of water and dried in a stream of air.
950 liters of the second extract from a previous extraction, as described below, are brought to a volume of 2850 liters by adding tap water. The carbon cake from the previous paragraph is added, the slurry is maintained at a temperature of 35 to 40 ° C. with stirring and the pH of the suspension is adjusted to a value of 2.2 0.2 by the addition of 10% nitric acid, (a quantity of about 6.39 kg being required for this purpose). After stirring for one hour, the carbon is removed by filtration and drying with a stream of air and the filtrate (or first extract) is collected.
The carbon thus extracted is introduced into 950 liters of fresh tap water, with a view to a second extraction, which is carried out in the manner described in the previous paragraph by adding a small quantity of nitric acid to 10. % (if necessary) to re-adjust the pH to a value of 2.2 + 0.2. The second extract thus obtained is used for the first extraction described in the previous paragraph.
The total yield provided by the culture filtrate is about 82%.
The pH of the first extract is adjusted to a value of 7.5 + 0.1 by adding a 10% caustic soda solution (15.9 liters being necessary for this purpose), while maintaining
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holding the temperature at IO C or below. 3.40 kg of filter material (eg Hyflo) is added and the slurry is filtered. To the colorless (iron-free) filtrate is added at a temperature of 10 to 15 C, half the total volume of a
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25; b solution of CE9CE (C2E5) C2E4CE (S04fla) C2E4CE (C2H5) 2 (for example Tergitol Penetrant 7) necessary for the precipitation of streptomycin (this quantity being based on the activity of the extract, determined by a chemical test in proportion of Icm3 per 92,400 units of streptomycin).
Once this portion of the wetting agent has been added, the test for determining the end of precipitation is started.
(A sample of the slurry is filtered for this purpose and about 2 cm3 of the filtrate is collected, then one to two drops of 50% phosphotungstic acid is added to the filtrate which forms a precipitate, if precipitation by the agent is wetting is incomplete). Additional wetting agent solution is then added in one-liter portions, until the test indicates that precipitation is complete, (about 13.0 kg or 22.8 liters of a 25 ° solution of the wetting agent being necessary for this purpose). The charge is stirred for half an hour and the solid material (which is of the salt type combination) is collected by centrifugation.
The yield provided by the opening filtrate is about 73.8%, the yield of the precipitation being about 90%. b) The combination of the sa.lin type in the hydrated state is dissolved in 90% methanol; at a temperature of 20 to 25 C, in a proportion of 15 gr. per 100 cm3 of solvent, (more than 22.7 liters of methanol being necessary for this purpose); the solution is filtered, a quantity of concentrated hydrochloric acid is slowly added to the filtrate sufficient to decompose the salt-type combination and to lower the pH to a value of 0.8 + 0.1, (0.408 kg of acid being necessary for this purpose); and the mixture is poured into 87.9 kg of acetone and allowed to stand for one hour at a temperature of 5-10 C.
The precipitate (streptomycin hydrochloride) is filtered off as dry as
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sible, on a vacuum filter, then dissolved in water with a proportion of 100 cm3 of water per 10 gr. of the combination of the treated saline type (approximately 22.7 liters of water being required for this purpose). The solution is neutralized by stirring it with about 0.49 kg of neutral anion exchange resin (e.g. Amberlite IR-4B) having a pH of 6.5 to adjust the pH of streptomycin hydrochloride to a value in the range of 6.0 to 6.5, between the limits of which it is most stable. The mixture thus obtained is filtered .; the filtrate is distilled to free it from methanol and acetone under a pressure of 15 to 20 mm and filtered, then dried by freezing.
The yield of streptomycin hydrochloride thus provided by the culture filtrate is about 51.8% and the yield of decomposition is about 70%.
The neutral anion exchange resin can be prepared as follows: 4.53 kg of an anion exchange resin (for example Amberlite IR-4B) are introduced into 37.85 liters of water. city. A sufficient quantity of 10% sodium carbonate solution is added to adjust the pH to a value of 10.5 ¯ 0.2, and the alkaline resin is washed with distilled water until the The pH of the aqueous medium reaches 6.5.
The neutral resin is stored in the aqueous medium until used for neutralization, that is, filtered through the aqueous medium one. moment before using it. kg b: variant) 6.88 / of the dehydrated salt-type combination are dissolved in absolute methanol at a temperature of 20 to 25 C in proportions of 20 g. of the combination of the salt type for 100 cm3 of 100% methanol, (at least 34 liters of methenol being necessary for this purpose).
The solution is filtered; 20.63 kg of a neutral anion exchange resin with a pH of 6.5 (for example amberlite IR-4B) is added to the filtrate and a quantity of water is added to the slurry as well
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obtained, sufficient to lower the methanol concentration to 25% (approximately 10,2 liters of water being required for this purpose). The slurry, the volume of which is about 159 liters, is heated to a temperature of 50 to 55 C and is maintained at this temperature while 1.89 liters of concentrated hydrochloric acid are added thereto under conditions such as maintain the pH of the mixture at a value between 3.0 and 3.5.
Then the mixture is stirred until the pH reaches its maximum value between 5.6 and 6.2, (if the pH is less than 6, small amounts of neutral anion exchange resin are added until that the final pH value is between 6 and 6.5). Then 1; :: slurry is filtered and the resin is washed with a quantity of water. sufficient to remove streptomycin hydrochloride which may adhere thereto; the combined filtrate and wash water, the volume of which is about 179.8 liters and the power of about 6,500 units cm3, are then concentrated to a volume of about 11.35 liters and the chlorhy- streptomycin drate by freeze drying. The decomposition yield is 60 to 80%.
The wetting agents of the preceding examples can be replaced by equivalent amounts of other wetting agents of the type of polybasic inorganic acids, organically substituted (of which sub-types and categories have been listed above by way of example). Among other derivatives of the saline type of streptomycin which can be obtained according to the invention and which are particularly suitable for therapeutic applications as such (and in various pharmaceutical forms), there may be mentioned those which may be mentioned.
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can obtain with CECE (C? E) CECE (s0Na) CECE (cE) (for example Tergitol Penetrant 4) and with partial esters of sulfuric acid higher aliphatic alcohols of different molecular weights and their salts (for example example the various Daponols).
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Among other basic antibiotics of the streptomycin type which can be used for the preparation of a combination of the saline type with the wetting agents according to the invention, there may be mentioned streptomycin A, streptomycin B, dihydrostreptomycin. A, pure dihydrostreptomycin B and streptothricin or. substantially pure.
Basic streptomycin-type antibiotics purified by the method of the invention can be further purified by applying the same method of purification again. Likewise, they can undergo preliminary or subsequent purification by other methods, in particular by one of the following methods: I) An aqueous solution of the antibiotic is brought into intimate contact with a substantially insoluble carboxylic acid in the antibiotic. water and an organic solvent for the carboxylic acid not substantially mixing with water, the organic solvent phase is collected and the salt-like derivative of the antibiotic it contains is converted into a salt water soluble antibiotic (See US patent application July 19, 1947 under No. 762,205);
II) An aqueous solution of the antibiotic is treated with a water soluble salt of a substantially water insoluble carboxylic acid; the precipitated salt-like combination of the antibiotic and the carboxylic acid is collected and converted to a water soluble salt of the antibiotic (See US patent application 19 July 1947 under No. 762.206); and III) An aqueous solution of the antibiotic is brought into intimate contact with a wetting agent of the type of an organically substituted polybasic inorganic acid and an organic solvent for the soaps which do not substantially mix with water;
the phase of the organic solvent is collected and the derivative of the saline type of the antibiotic which it contains is converted into a water-soluble salt of the antibiotic (see the Belgian patent application filed by the applicant on August 1948 under no.376.546).
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The invention should not be considered as limited to the embodiments described above which have been chosen only by way of example.