<Desc/Clms Page number 1>
PERFECTIONNEMENTS A LA PURIFICATION DE SOLUTIONS AQUEUSES IMPURES
CONTENANT DE LA VITAMINE B12 ET SES VARIANTES.
La présente invention concerne la purification de solution a- queuse impure contenant de la vitamine B12 et ses variantes.
Récemment on a isolé, sous forme cristalline, une substance ayant une activité vitaminique à partir d'extraits de foie et de certaines liqueurs de fermentation. On a caractérisé cette substance d'une façon géné- rale comme un complexe de coordination du cobalt et on l'a désignée sous le nom de vitamine B12. On a poursuivi des efforts pour obtenir cette matière sous forme cristalline depuis la découverte par Minot et Murphy en 1926 (J.
A.M.A. 1926, 87, 470) que le foie contient une substance efficace dans le traitement de l'anémie pernicieuse. De nombreux chercheurs ont obtenu des préparations de pureté et d'efficacité thérapeutique accrues, jusqu'à ce qu'on obtienne la vitamine sous forme cristallisée.
Malheureusement des tentatives d'isolement de la vitamine d'a- vec les impuretés qui lui sont associées ont été compliquées par le fait que la vitamine B12 existe dans les matières naturelles en quantités extrêmement faibles, de 1 ordre d'un mg par litre. De plus, il semble que la vitamine B12 existe sous différentes formes et il est possible qu'elle soit conjuguée avec des matières protéinées. D'autres substances présentes dans le foie pos- sèdent également des propriétés physiologiques semblables, ce qui rend dif- ficile à évaluer les résultats des essais des préparations.
Les procédés de concentration et de purification ont générale- ment fait intervenir des techniques physiques, telles que l'adsorption de la vitamine sur des agents adsorbants tels que le charbon de bois, l'alumine, le gel de silice, les terres siliceuses et analogues, puis une élution par divers solvants. Dans ces processus d'adsorption, la matière active est or- dinairement adsorbée tandis que les impuretés restent en solution. On a employé
<Desc/Clms Page number 2>
avec succès des modifications de ce processus d'adsorption telles que la chromatographie. D'autres techniques qui emploient la solubilité différen- tielle de la vitamine dans des solvants spécifiques ont également été uti- lisées dans une certaine mesure.
On a également essayé la précipitation de la vitamine. En fait, la récupération.de la vitamine sous forme cristalli-'' sée nécessite une combinaison de procédés physiques compliqués et difficiles à employer à une échelle industrielle.
Comme on dispose maintenant de sources relativement illimitées de vitamine B12 dans les liqueurs fermentées produites par divers micro-or- ganismes et comme on accepte la vitamine B12 en tant que facteur anti-anémie pernicieuse, et qu'on l'utilise largement en médecine, il s'est créé un sé- rieux besoin d'un processus simplifié pour l'obtention de plus grandes quan- tités de la vitamine sous une forme convenant à l'utilisation thérapeutique.
Les sources de vitamine B12 utilisées dans la présente inven- tion comprennent de nombreuses solutions aqueuses contenant la vitamine.
Celles-ci comprennent les extraits aqueux de foie. Une source plus abondante est la liqueur de rebut résultant de la préparation d'antibiotique par cer- taines des espèces de Streptomyces comprenant en particulier le S-aureofa- ciens et le S-griseus. D'autres microorganismes tels que S-rimosus. le Clos- tridium butyricum, le Bacillus megatherium, l'Eremothecium. ashbii, le fla- vobacterium solare et beaucoup d'autres bactéries, levure et fongi produi- sent de la vitamine B12 par fermentation et on peut utiliser ici ces li- queurs. On trouve également que les eaux d'égouts contiennent de la vitami- ne B12 et il se peut que ces liqueurs clarifiées se révèlent une source com- mercialement pratique de la vitamine en utilisant le procédé de la présente invention.
Comme on l'a noté ci-dessus, la plupart des procédés antérieurs de purification de la vitamine B12 ont employé des techniques dans lesquelles on l'isole des impuretés qui lui sont associées par adsorption sur des matiè- res actives. On a découvert cependant que l'on peut grandement simplifier le procédé de purification de la vitamine B12 par un processus en une phase dans laquelle sont adsorbées les impuretés ordinairement trouvées avec la vitamine B12 et on laisse en solution la vitamine. Dans ce procédé, les matières indésirables, principalement des pigments de composition inconnue, sont presque complètement adsorbées tandis que l'on récupère la substance vitaminique active inchangée en rendement presque quantitatif dans sa solu- tion aqueuse initiale.
Le procédé selon l'invention de purification de solutions a- queuses impures contenant de la vitamine B12 et ses variantes consiste à mettre en contact la solution aqueuse impure avec un composé de zirconium pratiquement insoluble dans l'eau, de sorte que les impuretés sont adsorbées par celui-ci et à séparer la solution aqueuse purifiée contenant la vitamine B12 d'avec le composé de zirconium et les impuretés adsorbées sur celui-ci.
Bien que l'on ait utilisé depuis de nombreuses années des com- posés de zirconium insolubles dans l'eau comme agents adsorbants, il est en fait étrange que ces matières n'adsorbent pas la vitamine B12 qui est si fa- cilement adsorbée par la plupart des agents adsorbants ordinaires actuelle- ment utilisés. Parmi les composés insolubles de zirconium que l'on peut uti- liser dans ce procédé, se trouvent le bioxyde de zirconium, le carbonate de zirconium, l'hydroxyde de zirconium, le silicate de zirconium et autres com- posés insolubles de zirconium. Par insolubles, on désigne ceux de ces compo- sés qui ne sont pas solubles en solution aqueuse à un degré gênant le proces- sus d'adsorption.
Quand on utilise les diverses techniques applicables, il est préférable que le composé de zirconium ne soit pas soluble à plus d'en- viron 1 % en poids en solution aqueuse aux concentrations en ions hydrogène du procédé exposé ci-après.
On dispose du bioxyde de zirconium sous forme d'un hydrate, de formule ZrO2, xH2O dans laquelle x est une quantité variable continuelle- ment. La matière est une boue blanche à consistance modérée telle qu'on l'ob-
<Desc/Clms Page number 3>
tient chez le fabricant et il ne faut pas non plus laisser 'cette matière 'sé- cher car elle semble perdre sa faculté d'adsorber les impuretés par séchage.
On dispose de carbonate de zirconium sous forme d'un hydrate désigné par le fabricant sous le nom d'hydrate de zirconium (carbonate).'La matière est une boue blanche de consistance modérée et que l'on ne doit pas laisser sécher car elle semble perdre sa faculté d'adsorber les impuretés par séchage. On peut préparer l'hydroxyde de zirconium susceptible d'être utilisé dans le procédé de la présente invention à partir du carbonate de zirconium ci-dessus de la façon suivante : à 105 kg d'hydrate de zirconium (carbonaté) on ajoute 200 litres d'eau, puis on met le mélange en suspen- sion et on l'agite suffisamment pour former un mélange homogène. En conti- nuant l'agitation, on ajoute 61 kg d'acide sulfurique à 93 %. Ce procédé donne une solution de sulfate de zirconium blanche comme l'eau.
On ajoute ensuite 65 kg d'hydroxyde d'ammonium (26-28%) pour obtenir un pH de 8,0, à - la suite de quoi on obtient un précipité blanc gélatineux d'hydroxyde de zir- conium. On filtre le mélange et on recueille le gâteau. On met alors en sus- pension ce gâteau dans 350 litres d'eau et on filtre à nouveau. On considère que le gâteau résultant est l'hydroxyde de zirconium. On ne doit pas laisser sécher l'hydroxyde de zirconium comme dans le cas du carbonate de zirconium.
Le zirconium est un élément tétravalent et comme on le trouve dans les ma- nuels, il est capable de former divers complexes en plus de ceux précités.
On peut employer dans le procédé décrit ceux qui sont insolubles dans les limites de la présente invention.
Dans la mise en pratique de l'invention on peut provoquer l'ad- sorption des impuretés par plusieurs procédés. Dans un procédé, on met en suspension la solution aqueuse contenant la vitamine B12 avec la quantité désirée de composé de zirconium, puis on filtre. Le filtrat contient la vi- tamine B12 car la plupart des impuretés sont retenues dans le gâteau filtré.
Dans un autre procédé, on prépare une colonne du composé de zirconium géné- ralement en mélange avec un adjuvant de filtration et on fait passer à tra- vers la colonne la solution aqueuse à traiter. On peut purifier le composé de zirconium utilisé dans l'un ou l'autre procédé par des moyens classiques et le recycler. On illustrera ci-après ces deux procédés.
Evidemment, la quantité de composé de zirconium varie avec la quantité d'impuretés contenues dans la solution de vitamine B12. Comme la vitamine B12 n'est pas adsorbée dans une mesure notable par le composé de zirconium dans les conditions du procédé, l'excès est sans importance. D'au- tre part, si la quantité d'impuretés est élevée, et que la totalité n'est pas adsorbée, on peut facilement les déceler dans le filtrat et on peut les éliminer par un nouveau contact avec le composé de zirconium dans une secon- de opération.
On peut modifier la température du processus d'adsorption dans un large intervalle de 0 à 75 C, mais on le conduit de préférence à la tem- pérature ambiante. Le pH pendant le processus d'adsorption peut varier entre 5 et 9. On doit maintenir la solution aqueuse de B12 avant traitement, dans l'intervalle de pH 2,5-8,5, de préférence à pH 4,5, ceci en raison du fait que la vitamine B12 n'est pas stable sous de fortes concentrations en acide ou en alcali.
Il est bien entendu que le terme "vitamine B12" utilisé ici est générique et désigne les diverses formes physiologiquement actives de la vitamine B12 décrites dans la littérature. Il semble que la vitamine B12, telle qu'on l'a initialement décrite contient un radical cyano. On remplace facilement ce groupement par d'autres radicaux tels que les radicaux hydro- xydes et sulfates et on a ainsi chimiquement modifié la vitamine B12 de di- verses façons sans affecter sérieusement son activité physiologique. En fait, il semble que la vitamine B12 se rencontre dans la nature sous diverses de ses formes et certaines liqueurs de fermentation contiennent un mélange des différentes formes de la vitamine B12.
Les chercheurs ont désigné de fagon variée ces dernières, sous les noms de vitamine B12a, B12b, B12c, cobalami- ne, hydroxyde de cobalamine, sulfate de cobalamine et analogues Par chance,
<Desc/Clms Page number 4>
ces modifications de la molécule de la vitamine B12 se comportent de façon semblable dans le procédé de la présente invention et ne sont pas adsorbees sur la zircone hydratée, ni n'affectent sur celle-ci l'adsorptiôn des diver- ses impuretés. Par suite, le terme "vitamine B12" est utilisé ici pour dési- gner toutes ces formes connues voisines, physiologiquement actives et adsor- bables que l'on vient de citer.
On donne les exemples suivants pour illustrer plus particuliè- rement l'invention. Il est bien entendu naturellement qu'il ne s'agit que des techniques préférées actuellement et que les spécialistes de la question pourront y apporter des modifications et améliorations évidentes. L'inven- tion n'est pas limitée au traitement d'aucune solution particulière conte- nant de la vitamine B12 sauf en ce qui concerne les limites de pH précitées, pas plus qu'aux quantités ou aux concentrations particulières indiquées ci- dessous.
Exemple 1.
On obtient une solution aqueuse contenant de la vitamine B12 à partir de liqueur de fermentation produite par le S. Aureofaciens dans la préparation de l'auréomycine. On traite la liqueur de fermentation, de pré- férence après l'extraction de l'auréomycine par le butanol, et contenant en- viron 200 gammas de vitamine B12 par litre, par du charbon de bois activé (2 à 4 g. de charbon par litre de liqueur de fermentation). On lave le char- bon de bois à l'eau du robinet pour éliminer les sels solubles dans la li- queur de fermentation, après quoi on soumet à une élution l'activité vitami- nique B12. Ceci s'effectue par traitement de 1053 kg du charbon de bois par 15. 000 litres d'une solution aqueuse contenant environ 7 % en volume d'al- cool amylique et 5 % d'alcool isopropylique.
On évapore l'éluat jusqu'à 280 litres sous vide pour concen- trer l'activité à environ 100 gammas de vitamine B12 par cc. A 500 cc du goudron brun foncé épais ainsi obtenu, on ajoute 2.000 cc d'une solution a- queuse saturée de sulfate d'ammonium et 10 g d'adjuvant de filtratIon. A- près agitation à la température ambiante pendant 1 heure, on laisse repo- ser le mélange jusqu'au lendemain à 4 C. On sépare le précipité quise for- me et on l'extrait par 2.000 cc d'alcool éthylique à 65 %. On ajuste alors l'extrait à pH 1,5 par de l'acide chlorhydrique et on laisse reposer jus-- qu'au lendemain. On ajuste ensuite la solution à pH 4,5 et on la concentre pour éliminer l'alcool éthylique. On traite par le processus suivant la so- lution aqueuse qui en résulte.
On mélange 350 parties de zircone hydratée en volume (25-30 % ZrO2, x H2O) avec 350 parties en volume d'adjuvant de filtration et suffisamment d eau, 3 parties en volume, pour former une suspension. On place ce mélange dans une colonne chromatographique et on le laisse déposer à la pression atmosphérique pendant 30 minutes. On applique le vide à l'extrémité inférieure de la colonne, après quoi on lave avec un peu d'eau.
On fait passer à travers la colonne de zircone 700 cc de l'ex- trait à l'alcool éthylique concentré contenant environ 70 gammas de vitamine B12 par cc, après quoi on la lave à l'eau jusqu'à élimination de toute la couleur rose qu'elle avait retenue. La solution rose clair contient environ 30 gammas de vitamine B12 par cc; on la trouve exempte de la plupart des im- puretés qui lui étaient initialement associées et elle convient pour de nom- breuses applications pharmaceutiques sans autre concentration ou purifica- tion.
Exemple 2.
Dans ce processus, on met en suspension la même quantité de zircone hydratée qu'à l'exemple 1 avec une quantité égale de l'extrait à l'al- cool éthylique concentré pendant 20 minutes, puis on filtre. On lave le ga- teau brun avec un peu d'eau pour éliminer la vitamine B12 qu'il contient.
On trouve de même que ce filtrat a une pureté très améliorée.
<Desc/Clms Page number 5>
Exemple 3.
On extrait un adsorbat sur charbon de bois obtenu par le trai- tement d'une liqueur de fermentation de S. Aureofaciens en le traitant par une solution aqueuse d'alcools inférieurs mixtes comme il est décrit à l'e- xemple 1 et on concentre l'extrait. On fait ensuite passer cette solution concentrée contenant environ 100 gammas de vitamine B12 par cc à travers une colonne de zircone et on obtient une solution rose qui est propre et convient pour l'application pharmaceutique. Ce processus élimine les phases de préci- pitation au sulfate d'ammonium et d'extraction alcoolique de l'exemple 1 que l'on n'utilise que quand on estime nécessaire d'éliminer des quantités excessives de substances peptoniques et autres impuretés solubles dans le sulfate d'ammonium saturé qui peut être présent.
Exemple 4.
A 480 litres de l'extrait de B12 hydrolysé par l'alcool éthy- lique à 65 %, décrit à l'exemple 1, on ajoute 200 litres d'eau et 175 kg (poids humide) d'hydroxyde de zirconium. On ajuste le pH de ce mélange à
8,7 par de l'hydroxyde d'ammonium (26-28 %). On agite ensuite le mélange pendant 1 heure, on le laisse reposer pendant approximativement 14 heures, puis on le filtre. On lave le gâteau filtré par 100 litres d'eau. On combi- ne alors les eaux de lavage et le filtrat, ce qui donne une solution rose claire d'un volume de 850 litres, et contenant 50 gammas de vitamine B12 par cc. On concentre cette solution de vitamine B12 pour éliminer le solvant.
La solution résultante convient aux nombreuses applications pharmaceutiques sans autre concentration ou purification.
Le gâteau filtré résultant contenant les impuretés brunes est régénéré de la fagon suivante; on le met en suspension avec 200 litres d'eau; et à ce mélange on ajoute lentement 95 kg d'acide sulfurique à 93 % en agi- tant. On agite le mélange pendant 1 heure. A cette solution acide de zirco- nium, on ajoute 34 kg de charbon de bois activé, on poursuit l'agitation pendant 1 heure, puis on filtre et on lave le gâteau pressé par 50 litres d'eau. On rejette le gâteau filtré. On transforme le filtrat, sulfate de zirconium blanc comme l'eau, en hydroxyde de zirconium en ajoutant lentement en agitant une solution à 40 % de soude (61 kg de NaOH ajusté à 154 litres par de l'eau). On sépare par filtration le précipité gélatineux blanc d'hy- droxyde de zirconium, on le met en suspension avec 350 litres d'eau et on le filtre.
Le gâteau pressé d'hydroxyde de zirconium est prêt à être recy- clé.
Exemple 5.
A 444 gr. d'hydrate de zirconium (carbonaté) on ajoute 1 litre de l'extrait à l'alcool éthylique concentré décrit à l'exemple 1 et on pour- suit l'agitation pendant 1 heure, à pH 6,1. On filtre ensuite le mélange et on lave le gâteau filtré à l'eau jusqu'à élimination de toute la couleur rose, comme le montre l'obtention d'un filtrat incolore. On combine et on concen- tre le filtrat et les eaux de lavage pour éliminer le solvant à un volume de 250 ce et un essai en vitamine B12 de 116 gammas par cc.
Comme on l'a noté ci-dessus le processus d'adsorption utili- sant le composé de zirconium est applicable aux solutions aqueuses contenant de la vitamine B12 et ayant un pH compris entre 2,5 et 8,5. La quantité de vitamine B12 en solution aqueuse peut aller de quelques gammas de vitamine B12 par cc jusqu'à des solutions relativement concentrées. Par suite, l'in- vention est utilisable dans la purification de solutions de vitamine B12 ob- tenues à partir de la liqueur de fermentation initiale jusqu'à des phases précédant juste le processus de cristallisation si celui-ci est désiré.
En raison de l'efficacité extrêmement élevée des composés de zirconium pour l'élimination des impuretés, la cristallisation finale n'est généralement pas nécessaire ni désirable. Le produit de l'invention après les essais pharmacologiques usuels pour sa puissance, sa pureté, sa teneur
<Desc/Clms Page number 6>
en produits pyrogènes et analogues quand ils sont indiqués, peut être u- tilisé tel qu'il est obtenu.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de purification de solutions aqueuses impures con- tenant de la vitamine B12 et ses variantes, caractérisé en ce qu'on met en contact la solution impure avec un composé de zirconium pratiquement inso- luble dans l'eau, de sorte que les impuretés sont adsorbées sur celui-ci et on sépare la solution aqueuse purifiée contenant la vitamine B12 d'avec le composé de zirconium et les impuretés adsorbées sur celui-ci.
<Desc / Clms Page number 1>
IMPROVEMENTS IN PURIFICATION OF IMPURE AQUEOUS SOLUTIONS
CONTAINING VITAMIN B12 AND ITS VARIANTS.
The present invention relates to the purification of an impure aqueous solution containing vitamin B12 and its variants.
Recently, a substance having vitamin activity has been isolated in crystalline form from liver extracts and certain fermentation liquors. This substance has been characterized generally as a cobalt coordination complex and has been referred to as vitamin B12. Efforts to obtain this material in crystalline form have continued since the discovery by Minot and Murphy in 1926 (J.
A.M.A. 1926, 87, 470) that the liver contains an effective substance in the treatment of pernicious anemia. Many researchers have obtained preparations of increased purity and therapeutic efficacy, until the vitamin is obtained in crystallized form.
Unfortunately attempts to isolate the vitamin from the impurities associated with it have been complicated by the fact that vitamin B12 exists in natural materials in extremely low amounts, of the order of one mg per liter. In addition, it seems that vitamin B12 exists in different forms and it is possible that it is conjugated with protein materials. Other substances present in the liver also have similar physiological properties, making it difficult to assess the results of testing the preparations.
Concentration and purification processes have generally involved physical techniques, such as adsorption of the vitamin to adsorbing agents such as charcoal, alumina, silica gel, siliceous earths and the like. , followed by elution with various solvents. In these adsorption processes, the active material is usually adsorbed while the impurities remain in solution. We used
<Desc / Clms Page number 2>
successful modifications of this adsorption process such as chromatography. Other techniques which employ the differential solubility of the vitamin in specific solvents have also been used to some extent.
Vitamin rush was also tried. In fact, the recovery of the vitamin in crystallized form requires a combination of complicated physical methods and difficult to employ on an industrial scale.
As relatively unlimited sources of vitamin B12 are now available in fermented liquors produced by various microorganisms, and as vitamin B12 is accepted as a pernicious anti-anemia factor, and is widely used in medicine, There has been a serious need for a simplified process for obtaining greater amounts of the vitamin in a form suitable for therapeutic use.
The sources of vitamin B12 used in the present invention include many aqueous solutions containing the vitamin.
These include the aqueous extracts of liver. A more abundant source is the waste liquor resulting from the preparation of antibiotics by some of the species of Streptomyces including in particular S-aureofaciens and S-griseus. Other microorganisms such as S-rimosus. Clostridium butyricum, Bacillus megatherium, Eremothecium. ashbii, flavobacterium solare and many other bacteria, yeast and fungus produce vitamin B12 through fermentation and these liquors can be used here. Sewage is also found to contain vitamin B12, and these clarified liquors may prove to be a commercially practical source of the vitamin using the process of the present invention.
As noted above, most of the prior methods of purifying vitamin B12 have employed techniques in which it is isolated from the impurities associated with it by adsorption to active materials. It has been found, however, that the process of purifying vitamin B12 can be greatly simplified by a one-phase process in which the impurities commonly found with vitamin B12 are adsorbed and the vitamin is left in solution. In this process, unwanted materials, mainly pigments of unknown composition, are almost completely adsorbed while the active vitamin substance is recovered unchanged in almost quantitative yield in its initial aqueous solution.
The process according to the invention for the purification of impure aqueous solutions containing vitamin B12 and its variants consists in bringing the impure aqueous solution into contact with a zirconium compound which is practically insoluble in water, so that the impurities are adsorbed. therewith and separating the purified aqueous solution containing vitamin B12 from the zirconium compound and the impurities adsorbed thereon.
Although water insoluble zirconium compounds have been used for many years as adsorbents, it is in fact strange that these materials do not adsorb the vitamin B12 which is so readily adsorbed by Most of the common adsorbents in use today. Among the insoluble zirconium compounds which can be used in this process are zirconium dioxide, zirconium carbonate, zirconium hydroxide, zirconium silicate and other insoluble zirconium compounds. By insoluble is meant those of these compounds which are not soluble in aqueous solution to a degree which interferes with the adsorption process.
When using the various applicable techniques, it is preferable that the zirconium compound is not soluble to more than about 1% by weight in aqueous solution at the hydrogen ion concentrations of the process set forth below.
Zirconium dioxide is available in the form of a hydrate, of the formula ZrO2, xH2O in which x is a continuously varying amount. The matter is a white sludge of moderate consistency such as
<Desc / Clms Page number 3>
holds with the manufacturer and neither should 'this material' be allowed to dry, as it seems to lose its ability to adsorb impurities upon drying.
Zirconium carbonate is available in the form of a hydrate designated by the manufacturer as zirconium hydrate (carbonate). 'The material is a white sludge of moderate consistency and should not be allowed to dry because it seems to lose its ability to adsorb impurities upon drying. The zirconium hydroxide capable of being used in the process of the present invention can be prepared from the above zirconium carbonate as follows: to 105 kg of zirconium hydrate (carbonate) is added 200 liters of water, then the mixture is suspended and stirred sufficiently to form a homogeneous mixture. With continued stirring, 61 kg of 93% sulfuric acid are added. This process gives a solution of zirconium sulfate white like water.
65 kg of ammonium hydroxide (26-28%) are then added to obtain a pH of 8.0, following which a gelatinous white precipitate of zirconium hydroxide is obtained. The mixture is filtered and the cake is collected. This cake is then suspended in 350 liters of water and filtered again. The resulting cake is considered to be zirconium hydroxide. Zirconium hydroxide should not be allowed to dry as in the case of zirconium carbonate.
Zirconium is a tetravalent element and as found in manuals it is capable of forming various complexes in addition to those mentioned above.
Those which are insoluble within the limits of the present invention may be employed in the process described.
In the practice of the invention, the adsorption of impurities can be caused by several methods. In one process, the aqueous solution containing vitamin B12 is suspended with the desired amount of zirconium compound and then filtered. The filtrate contains vitamin B12 because most of the impurities are retained in the filter cake.
In another process, a column of the zirconium compound generally mixed with a filter aid is prepared and the aqueous solution to be treated is passed through the column. The zirconium compound used in either process can be purified by conventional means and recycled. These two methods will be illustrated below.
Obviously, the amount of zirconium compound varies with the amount of impurities contained in the vitamin B12 solution. Since vitamin B12 is not adsorbed to any appreciable extent by the zirconium compound under the process conditions, the excess is immaterial. On the other hand, if the amount of impurities is high, and all of it is not adsorbed, they can easily be detected in the filtrate and can be removed by further contact with the zirconium compound in a medium. second of operation.
The temperature of the adsorption process can be varied over a wide range from 0 to 75 ° C., but it is preferably carried out at room temperature. The pH during the adsorption process can vary between 5 and 9. The aqueous solution of B12 should be kept before treatment in the range of pH 2.5-8.5, preferably pH 4.5, in this way. due to the fact that vitamin B12 is not stable under high concentrations of acid or alkali.
It is understood that the term "vitamin B12" used here is generic and designates the various physiologically active forms of vitamin B12 described in the literature. Vitamin B12, as originally described, appears to contain a cyano radical. This group is easily replaced by other radicals such as the hydroxide and sulfate radicals, and thus vitamin B12 has been chemically modified in various ways without seriously affecting its physiological activity. In fact, it seems that vitamin B12 is found in nature in various forms and some fermentation liquors contain a mixture of different forms of vitamin B12.
Researchers have variously referred to these as vitamin B12a, B12b, B12c, cobalamin, cobalamin hydroxide, cobalamin sulfate and the like.
<Desc / Clms Page number 4>
these modifications of the vitamin B12 molecule behave similarly in the process of the present invention and do not adsorb onto hydrated zirconia, nor affect adsorption thereon of various impurities. Consequently, the term "vitamin B12" is used here to designate all of these related known physiologically active and adsorbable forms which have just been mentioned.
The following examples are given to more specifically illustrate the invention. Of course, these are only the currently preferred techniques and that those skilled in the art can make obvious modifications and improvements. The invention is not limited to the treatment of any particular solution containing vitamin B12 except with regard to the above pH limits, nor to the particular amounts or concentrations indicated below.
Example 1.
An aqueous solution containing vitamin B12 is obtained from fermentation liquor produced by S. Aureofaciens in the preparation of aureomycin. The fermentation liquor, preferably after the extraction of aureomycin with butanol, and containing about 200 gammas of vitamin B12 per liter, is treated with activated charcoal (2 to 4 g. Of charcoal). per liter of fermentation liquor). The charcoal is washed with tap water to remove salts soluble in the fermentation liquor, after which vitamin B12 activity is eluted. This is done by treating 1053 kg of the charcoal with 15,000 liters of an aqueous solution containing about 7% by volume of amyl alcohol and 5% isopropyl alcohol.
The eluate is evaporated to 280 liters in vacuo to concentrate the activity at about 100 gammas of vitamin B12 per cc. To 500 cc of the thick dark brown tar thus obtained are added 2,000 cc of a saturated aqueous solution of ammonium sulfate and 10 g of filter aid. After stirring at room temperature for 1 hour, the mixture is left to stand overnight at 4 ° C. The precipitate which forms is separated off and extracted with 2000 cc of 65% ethyl alcohol. . The extract is then adjusted to pH 1.5 with hydrochloric acid and left to stand overnight. The solution is then adjusted to pH 4.5 and concentrated to remove ethyl alcohol. The resulting aqueous solution is treated by the following process.
350 parts of hydrated zirconia by volume (25-30% ZrO2, x H2O) are mixed with 350 parts by volume of filter aid and sufficient water, 3 parts by volume, to form a suspension. This mixture is placed in a chromatographic column and allowed to settle at atmospheric pressure for 30 minutes. Vacuum is applied to the lower end of the column, after which it is washed with a little water.
Concentrated ethyl alcohol extract containing about 70 gammas of vitamin B12 per cc is passed through the zirconia column 700 cc, after which it is washed with water until all color is removed. rose that she had retained. The light pink solution contains about 30 gammas of vitamin B12 per cc; it is found free from most of the impurities initially associated with it and is suitable for many pharmaceutical applications without further concentration or purification.
Example 2.
In this process, the same amount of hydrated zirconia as in Example 1 is suspended with an equal amount of the concentrated ethyl alcohol extract for 20 minutes, then filtered. The brown cake is washed with a little water to remove the vitamin B12 it contains.
This filtrate is also found to have a much improved purity.
<Desc / Clms Page number 5>
Example 3.
A charcoal adsorbate obtained by treating a fermentation liquor of S. Aureofaciens is extracted by treating it with an aqueous solution of mixed lower alcohols as described in Example 1 and concentrated. the extract. This concentrated solution containing about 100 gammas of vitamin B12 per cc is then passed through a zirconia column to obtain a pink solution which is clean and suitable for pharmaceutical application. This process eliminates the ammonium sulphate precipitation and alcohol extraction phases of Example 1 which are used only when it is considered necessary to remove excessive amounts of peptones and other soluble impurities. saturated ammonium sulfate which may be present.
Example 4.
To 480 liters of the extract of B12 hydrolyzed with 65% ethyl alcohol, described in Example 1, are added 200 liters of water and 175 kg (wet weight) of zirconium hydroxide. The pH of this mixture is adjusted to
8.7 with ammonium hydroxide (26-28%). The mixture is then stirred for 1 hour, allowed to stand for approximately 14 hours, then filtered. The filtered cake is washed with 100 liters of water. The washings and the filtrate are then combined to give a light pink solution with a volume of 850 liters, and containing 50 gammas of vitamin B12 per cc. This vitamin B12 solution is concentrated to remove the solvent.
The resulting solution is suitable for many pharmaceutical applications without further concentration or purification.
The resulting filter cake containing the brown impurities is regenerated in the following way; it is suspended with 200 liters of water; and to this mixture was slowly added 95 kg of 93% sulfuric acid with stirring. The mixture is stirred for 1 hour. 34 kg of activated charcoal are added to this acid solution of zirconium, stirring is continued for 1 hour, then the mixture is filtered and the pressed cake is washed with 50 liters of water. The filtered cake is discarded. The filtrate, zirconium sulphate white like water, is converted into zirconium hydroxide by slowly adding with stirring a 40% sodium hydroxide solution (61 kg of NaOH adjusted to 154 liters with water). The white gelatinous precipitate of zirconium hydroxide is filtered off, suspended with 350 liters of water and filtered.
The zirconium hydroxide pressed cake is ready to be recycled.
Example 5.
At 444 gr. of zirconium hydrate (carbonate), 1 liter of the concentrated ethyl alcohol extract described in Example 1 is added and stirring is continued for 1 hour, at pH 6.1. The mixture is then filtered and the filter cake washed with water until all the pink color has been removed, as shown in the production of a colorless filtrate. The filtrate and washings were combined and concentrated to remove the solvent to a volume of 250 cc and a vitamin B12 test of 116 gammas per cc.
As noted above, the adsorption process using the zirconium compound is applicable to aqueous solutions containing vitamin B12 and having a pH between 2.5 and 8.5. The amount of vitamin B12 in aqueous solution can range from a few gammas of vitamin B12 per cc to relatively concentrated solutions. Hence, the invention is useful in the purification of solutions of vitamin B12 obtained from the initial fermentation liquor to phases just preceding the crystallization process if this is desired.
Due to the extremely high efficiency of zirconium compounds for removing impurities, final crystallization is generally not necessary or desirable. The product of the invention after the usual pharmacological tests for its potency, its purity, its content
<Desc / Clms Page number 6>
into pyrogens and the like when indicated, can be used as obtained.
CLAIMS.
1. Process for the purification of impure aqueous solutions containing vitamin B12 and its variants, characterized in that the impure solution is brought into contact with a zirconium compound which is practically insoluble in water, so that the Impurities are adsorbed thereon and the purified aqueous solution containing vitamin B12 is separated from the zirconium compound and the impurities adsorbed thereon.