Procédé pour la préparation de la vitamine Blz. La présente invention concerne un procédé pour la préparation de la vitamine B1.r (science 107; 396 [1948] ), un facteur re connu efficace dans la thérapeutique de l'anémie pernicieuse, et possédant des pro priétés nutritives (J. Biol. Chem. 174; 1047 [1948] ), particulièrement quand il est utilisé dans une alimentation pour animaux compre nant des protéines végétales.
La. vitamine Bit, comme les agents théra peutiques contre l'anémie pernicieuse em ployés antérieurement (par exemple de l'extrait de foie), a été extraite jusqu'ici des l'oies de mammifères de boucherie. Il est quel quefois difficile de se procurer les quantités nécessaires de cet organe, qui n'est pas une source économique de vitamine B12.
La présente invention prévoit un nouveau procédé simple et avantageux pour la produc tion de la vitamine B1@.
Le procédé selon l'invention est basé sur la découverte que, dans la production de la streptomycine par fermentation, une quantité relativement grande de vitamine 1312 est égale ment produite et que celle-ci peut être écono miquement récupérée du produit de fermen tation soit comme produit primaire, soit comme sous-produit de la streptomycine.
Le procédé selon l'invention est caracté risé en ce qu'on inocule un milieu nutritif liquide avec un micro-organisme susceptible de produire la streptomycine, en ce qu'on laisse se développer ledit micro-organisme en contact avec ledit milieu et en ce qu'on sé pare la vitamine Bit ainsi formée des autres produits contenus dans la culture. De manière préférable, l'organisme utilisé est une souche de streptomyces griseus reconnue comme étant bonne productrice de streptomycine; l'organisme est habituellement développé en culture submergée et sous d'autres conditions connues pour augmenter la production de streptomycine.
Le milieu nutritif liquide peut comprendre essentiellement une farine de soja (ou une source équivalente d'azote et de subs tances activant la croissance, comme décrit dans le brevet suisse N 268688), un hydrate de carbone assimilable par la moisissure (par exemple du dextrose) et éventuellement un sel.
Dans le procédé de concentration etiou de purification de la streptomycine généralement employé, la culture est filtrée et le déchet de mycelium et autres résidus solides écartés, le filtrat est traité sur du charbon activé pour adsorber la streptomycine (le filtrat épuisé étant écarté), la streptomycine adsorbée est extraite du charbon par élution avec une so lution acide aqueuse (et le déchet de charbon écarté), et l'éluat est traité alors. pour concen trer et/ou purifier la streptomycine.
On a trouvé qué, par ce procédé, presque toute la vitamine B12 est séparée de la streptomycine dans la phase du lavage, c'est-à-dire que la vitamine B12 dans la culture passe sous des concentrations relativement élevées dans les diverses fractions écartées dont il a été fait mention et que presque rien n'apparaît dans l'éluat acide riche en streptomycine.
Aussi, au cours des différentes phases de ce procédé de purification de la streptomycine, en partant d'une culture de streptomyces riseus , qui g contient entre 1100 et 1500 unités par emi de vitamine 1312, la" vitamine B12 apparaît dans les fractions écartées dans les proportions sui vantes:
Déchet de mycelium : 1050 à 2400 unités/- (poids net) Filtrat épuisé: 975 à 1550 unités/millilitre Déchet de charbon: 1877 à 7140 unités/- (poids net) La. teneur en vitamine B12 a été mesurée de façon microbiologique, en utilisant le lactoba- cillus lactis Dorner comme organisme témoin (Science 107;
396, 397, 398 [1948] ), l'unité microbiologique de référence ayant une va leur déterminée de<B>100000</B> unités/cm3, soit 15 U.S.P. unités/cm3 d'un concentré de foie injectable choisi comme étalon.
Dans la. pratique de l'invention, la vita mine B12 peut être récupérée de la culture comme produit primaire, mais, du fait que 'Le déchet de mycelium, le filtrat épuisé et le dé chet de charbon contiennent des quantités relativement élevées et rapidement récupéra- bles de vitamine B12, la vitamine est de pré férence récupérée de ces déchets (spécialement du déchet de charbon) comme sous-produit de la streptomycine.
Aussi, la quantité de vita mine B12 contenue dans le déchet de charbon peut. être récupérée avantageusement par le lavage de ce déchet avec un solvant de la vitamine 1312 (particulièrement de l'alcool, de l'acétone ou du phénol), et par concentration de l'éluat par évaporation sous pression ré duite; le produit ainsi obtenu peut, si on le désire, être traité pour concentrer et/ou pour purifier davantage la vitamine B12.
l=ies exemples suivants illustrent l'invention. Exemple <I>1:</I> a) .1164 litres d'un agent, aqueux (eau du robinet) contenant 2,25% de farine de soja et 1,
62% de dextrose sont. placés dans un récipient de fermentation en acier au carbone de 5000 litres équipé d'un agitateur et d'un vaporisateur d'air; le récipient est stérilisé une heure à l20 C.
Quand la température atteint 25 C, on ajoute 189 litres d'un inocu lai de streptomyces griseus et le milieu inoculé est, incubé à 25 C sous une pression de 210 à 420 g par em2 (une moyenne de 7,5 litres d'air par litre de milieu et par heure étant passé à travers le milieu), tandis que l'on agite (à la vitesse de 120 rotations par minute). Pendant l'incubation, 5,6 litres d'huile de saindoux sont ajoutés goutte à goutte comme antimousse. Après une incuba tion de 40 à 50 heures, on atteint. une teneur en streptomycine de 1.50-200 unités/cm3 dans le bouillon de culture (dont. le pH est de 6,7).
On ajuste alors ce pH à. 2,0 avec de l'acide sulfurique concentré et (de préférence après adjonction d'un agent auxiliaire de filtrage) on filtre alors le mélange à, travers un filtre- presse. Le filtrat (I) a une teneur en strepto mycine d'environ 300 à.100 unités/cm3. A la.
fin de la fermentation, la. vitamine B12 est sous une forme telle que seulement une petite quantité (soit environ 10%) est précipitée par l'addition de l'acide à la. culture, ainsi que ce peut, être déterminé par la neutralisation du déchet de mycelium et d'autres corps so lides (II) et. par examen du filtrat résultant.
Le déchet de my celium et d'autres corps so lides peut être traité pour récupérer son con tenu en vitamine B12. Ion variante, on peut omettre la phase de l'addition de l'acide, uti lisée pour faciliter la filtration de la culture, et effectuer la. filtration à un pH d'environ 7.
et ainsi augmenter le taux de streptomycine dans le bouillon de culture, de sorte que la vitamine 1312, au lieu d'être précipitée, soit transportée dans les autres fractions éliminées pendant la purification de la streptomycine. Après la filtration à un PH d'environ 7, on peut, d'une part, récupérer la.
vitamine Bly dans les déchets du myeelium et les autres résidus et, d'autre part., traiter le filtrat avec (lit charbon de bois activé, pour adsorber la streptomycine, et récupérer ia vitamine B12 du filtrat épuisé, par exemple par extraction avec une solution aqueuse concentrée de phénol.
b) Un filtrat de 3785 litres d'une culture contenant la streptomycine obtenue comme il vient d'être décrit, et présentant une teneur en vitamine B12 d'environ 1100 unités/em3, est. ajusté à un pH de 7,5 avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium,_ et agité avec <B>108</B> hg d'un charbon de bois activé (marque Nuchar C-145-A ) pendant 15 minutes à la température ambiante; ensuite le charbon (contenant la streptomycine et une partie de la vitamine B12 adsorbées) est séparé par filtration, de préférence après avoir enduit.
préalablement le filtre avec un agent auxi liaire de filtrage (par exemple le produit marque Célite ). Le filtrat de culture ne contenant plus de streptomycine (III) ren ferme par contre encore environ 975 unités(em3 de vitamine B12.
c) Le charbon de bois est lavé par por tions successives d'une solution aqueuse 0,1 N d'acide nitrique à 50 C pour éluer la strepto mycine adsorbée. Le charbon lavé, qui avait recueilli environ 10 à 15% de la quantité de vitamine B12 du filtrat de la culture, est réutilisé pour adsorber la streptomycine d'une nouvelle portion du filtrat de culture et accumule ainsi une plats grande quantité de vitamine B12. Dans la, purification de la streptomycine, le charbon est réemployé ail moins deux fois avant d'être abandonné.
De préférence, on emploie un mélange de char bons activés (par exemple un mélange de ='/3 du produit marque Nuchar C-145-A et 1/3 du produit marque Darco G-60 ) ; de préférence, on ajoute, à part du charbon réemployé, encore une certaine quantité de charbon frais, pas encore utilisé. La. teneur du charbon résiduel en l'agent auxiliaire de fil trage est comprise entre 10 à 20 /o. (L'éluat contenant la streptomycine est traité pour récupérer la streptomycine y contenue, par exemple par précipitation à l'aide d'un agent tensioactif comme décrit dans le brevet suisse 285944).
Le résidu de charbon (IV) contenant en viron 4860 unités/g (poids du produit humide) de vitamine B12 peut être séché et être utilisé tel quel comme supplément de nourriture pour les animaux, par exemple mélangé à des ali ments contenant des protéines végétales, ou bien la vitamine B12 peut en être récupérée ; par un des procédés décrits ci-après.
Bien que l'adsorption de la vitamine B12 par du charbon activé du type utilisé dans la purification de la streptomycine (plus un agent auxiliaire de filtrage) ne soit pas un , procédé efficace de récupération de la vita mine, en considérant la teneur élevée du fil trat épuisé de la culture en vitamine B12, les grandes quantités d'un tel résidu de char bon qu'on peut se procurer gratuitement dans , le procédé de purification de la streptomycine rend très économique cette récupération de la vitamine B12. Si la vitamine B12 doit être récupérée comme produit primaire,
on em ploiera avantageusement un charbon activé du type utilisé dans la fabrication de pr6pa- rations injectables de foie contre l'anémie per nicieuse (par exemple le charbon activé marque Sutcliffe Speakman N 5 ).
d) On élue 1028 g de déchet de charbon avec deux portions de 900 cm3 de phénol. aqueux à 88 %. Les éluats phénoliques sont combinés avec 1800 em3 d'éther, et on extrait le mélange avec trois portions de 900 cm3 d'eau pour enlever la plus grande partie de la vitamine B12. Les extraits aqueux sont réunis, lavés à l'éther pour enle ver le phénol et concentrés sous pression ré duite pour fournir un concentré de vitamine 1112 utilisable en thérapeutique.
Variante <I>1:</I> 405 g de déchets de charbon activé sont lavés avec un litre d'éthanol absolu (à un pH de 7,0) pendant 15 minutes, à 60 C, et l'éluat obtenu est concentré par évapora tion sous pression réduite pour donner 170 cm d'une solution ayant. une teneur en vitamine B12 de 5330 unités/em3. Le produit peut être utilisé en thérapeutique comme préparation de vitamine B12, sans purification ultérieure.
Variante <I>2:</I> 90 kg de déchet humide de charbon activé (pH 2,9) sont mis en suspen- lion dans de l'eau et la suspension est rapi dement portée a."' pH 6,0 par adjonction d'une solution d'hydroxyde de sodium, le charbon en est séparé par filtrage (pour diminuer la quantité de vitamine B12 retenue dans des conditions fortement acides).
Le charbon est ensuite lavé (dans un récipient muni d'un agitateur) avec 132 litres d'éthanol aqueux à 60 %, à 60 C pendant 30 minutes. L'éluat, après concentration .à 4,5 litres par évapora tion sous pression réduite, a une activité en vitamine B12 d'environ 21500 unités lcm3 (ce qui représente une récupération d'environ 534200 unités par 500 g de charbon humide), et une teneur totale en matières solides de 163 mg/cm3; le concentré peut être utilisé en thérapeutique comme préparation de vitamine B12, sans purification ultérieure.
Variante <I>3:</I> 90 g de déchets humides de charbon activé préalablement traités comme dans la. variante 2 sont lavés avec 132 litres d'acétone aqueuse à 60 %, à 25 C pendant 30 minutes. L'éluat, après concentration à. 4,0 litres par évaporation sous pression ré duite, a une activité en vitamine B12 de 43 000 unitéslcm3 (ce qui représente une récu pération d'environ 945 000 unités par 500 g de charbon humide) et une teneur totale en substances solides de 50 mg(em3; ce concentré peut être utilisé en thérapeutique comme vitamine 1312, sans purification ultérieure.
Exemple <I>?:</I> 100 g de déchets de mycelium et autres solides (II) obtenus comme décrit dans le paragraphe a,) de l'exemple 1 sont mis en suspension dans de l'eau pour donner un vo lume de 1 litre; le pli est ajusté à. 7,0 par adjonction d'une solution d'hydroxyde de sodium, et après agitation pendant 30 minutes le mélange est filtré. Le filtrat, qui contient 105 unitésjem3 de vitamine B12 est ensuite concentré sous faible pression pour fournir une préparation de vitamine B12 utilisable en thérapeutique.
Exennple <I>3:</I> 1 litre de filtrat de culture épuisé de streptomycine (III) obtenu comme décrit au paragraphe b) de l'exemple 1 est ajusté au p1, 6,0 et extrait avec deux portions de 500 cm d'une solution aqueuse de phénol à 88%; l'extrait de phénol est. traité ensuite comme indiqué au paragraphe d) de l'exemple 1 pour donner une vitamine B1-2 utilisable en thérapeutique.
Dans une variante de ce procédé, le filtrat III est ajusté au pH 6-8 et traité avec 0,5 à 4 1/o d'un charbon activé, apte à bien adsorber la vitamine B12 (par exemple le produit marque Sutcliffe Speakman N 5 ) ; le produit d'adsorption est. traité de la même façon que le résidu de charbon de l'exemple 1, pour récupérer la vitamine B1.2 utilisable en thérapeutique.
Exemple 1. litre d'un filtrat de culture contenant de la streptomycine, obtenu comme indiqué au paragraphe cc) de l'exemple 1 et conte nant environ 1100 unités/em3 de vitamine B1, est ajusté au pH 6,0 par une solution diluée d'hydroxyde de sodium et traité selon l'un ou l'autre des procédés de l'exemple 3, pour obtenir la vitamine B12 comme produit pri maire, utilisable en thérapeutique.
Exemple <I>5:</I> Les différentes conditions de culture qui ont été choisies du point de vue de la pro duction optimum de la streptomycine et/ou de la récupération peuvent être modifiées en vue d'une production et(ou d'une récupéra tion optima de la vitamine B12, soit. que eelle-ci doive être le produit primaire, soit 1-11r sous-produit clé la streptomycine.
On a trouvé, par exemple, que certains sels de cobalt non toxiques présents dans le milieu de fermen tation en concentration non toxique augmen- tent considérablement la formation de vita mine 1312 sans affecter sensiblement la pro duction de streptomycine.
a) 0,005% de CoCI .6II20 est incorporé dans le milieu décrit dans le paragraphe a) de l'exemple 1, et le streptomyces griseus est développé dans ce milieu comme indiqué dans ce paragraphe. Après 192 heures d'in cubation, la culture est traitée avec un acide comme indiqué dans ce paragraphe, et filtrée.
lie filtrat de culture a une teneur en strepto mycine d'environ 375 unités/em3 et une teneur cri vitamine B12 d'environ 7000 unités lem3.
b) Le filtrat de culture est traité pour récupérer la vitamine B12 comme produit Pri maire, comme indiqué dans l'exemple 4.
<I>Variante:</I> Le filtrat de culture est traité comme décrit dans les paragraphes b) et sui vants de l'exemple 1 pour récupérer à la fois la streptomycine et la vitamine B12; le rende ment en vitamine B12 est augmenté par la récupération additionnelle de la vitamine 1312 du résidu de mycelium II (voir exemple 2) et/ou du filtrat de culture épuisé de strepto- mj7eine (voir exemple 3).
La vitamine B12 obtenue par le pro- eédé selon l'invention est utilisée en théra peutique dans les mêmes buts et de la même manière que la vitamine B12 obte nue selon des procédés antérieurs par extraction de foie. Elle sert contre l'anémie pernicieuse ou comme facteur protéinique pour les animaux.
Par exemple, la prépara tion clé vitamine B12 décrite au paragraphe (1), variante 3, de l'exemple 1 est obtenue dans une solution stérile, aqueuse, très con- centrée, conservée par 0,5% de phénol, et vendue dans des fioles munies d'un bouchon de caoutchouc; cette préparation est utilisée pour le traitement de l'anémie pernicieuse par injection journalière intramusculaire d'une quantité équivalente à 15 unités U. S. P. d'extrait de foie.
Bien que la quantité des produits solides dans les préparations de vitamine B12 obte nues comme décrit ci-dessus soit du même ordre que celle de beaucoup des agents théra peutiques contre l'anémie pernicieuse utilisés jusqu'ici, ces préparations de vitamine B1_, peuvent être purifiées davantage si on le dé sire; par exemple:
1 par addition d'éthanol absolu au con centrai de vitamine B12 en quantité suffi sante pour obtenir une concentration en étha- nol (le $0%, par séparation des produits so- lides inactifs précipités et par évaporation de l'alcool sous pression réduite, 2 par réadsorption de la vitamine BIL,
du concentrat sur du charbon activé et nou velle élution avec un. solvant de la vitamine 1312 (par exemple l'alcool, l'acétone ou le phénol), 3 par extraction de la vitamine 1312 du concentrat à l'aide de phénol, , 4 par une combinaison des traitements susmentionnés.
Process for the preparation of vitamin Blz. The present invention relates to a process for the preparation of vitamin B1.r (science 107; 396 [1948]), a factor known to be effective in the therapy of pernicious anemia, and having nutritive properties (J. Biol. Chem. 174; 1047 [1948]), particularly when used in animal feed comprising vegetable proteins.
Vitamin Bit, like the therapeutic agents against pernicious anemia previously used (eg from liver extract), has heretofore been extracted from the geese of slaughter mammals. It is sometimes difficult to obtain the necessary quantities of this organ, which is not an economical source of vitamin B12.
The present invention provides a novel, simple and advantageous process for the production of vitamin B1 @.
The process according to the invention is based on the discovery that in the production of streptomycin by fermentation a relatively large amount of vitamin 1312 is also produced and that this can be economically recovered from the fermentation product either as primary product or as a by-product of streptomycin.
The method according to the invention is characterized in that a liquid nutrient medium is inoculated with a microorganism capable of producing streptomycin, in that said microorganism is allowed to grow in contact with said medium and in that that the vitamin Bit thus formed is separated from the other products contained in the culture. Preferably, the organism used is a strain of Streptomyces griseus recognized as being a good producer of streptomycin; the organism is usually grown in submerged culture and under other conditions known to increase the production of streptomycin.
The liquid nutrient medium can essentially comprise a soybean flour (or an equivalent source of nitrogen and growth-promoting substances, as described in Swiss Patent No. 268688), a carbohydrate which can be assimilated by mold (for example dextrose ) and optionally a salt.
In the method of concentration and / or purification of streptomycin generally employed, the culture is filtered and the waste of mycelium and other solid residues discarded, the filtrate is treated on activated charcoal to adsorb streptomycin (the spent filtrate being discarded), the filtrate being discarded. Adsorbed streptomycin is extracted from the charcoal by elution with an aqueous acid solution (and the charcoal waste discarded), and the eluate is then processed. to concentrate and / or purify streptomycin.
It has been found that by this process almost all vitamin B12 is separated from streptomycin in the washing phase, i.e. vitamin B12 in culture passes under relatively high concentrations in the various fractions discarded. mentioned and almost nothing appears in the streptomycin-rich acid eluate.
Also, during the different phases of this streptomycin purification process, starting from a culture of streptomyces riseus, which contains between 1100 and 1500 units per emi of vitamin 1312, "vitamin B12 appears in the fractions discarded in the following proportions:
Mycelium waste: 1050 to 2400 units / - (net weight) Exhausted filter: 975 to 1550 units / milliliter Carbon waste: 1877 to 7140 units / - (net weight) The vitamin B12 content was measured microbiologically, using lactobacillus lactis Dorner as a control organism (Science 107;
396, 397, 398 [1948]), the reference microbiological unit having a determined value of <B> 100,000 </B> units / cm3, or 15 U.S.P. units / cm3 of an injectable liver concentrate chosen as a standard.
In the. In practice of the invention, the vitamin B12 can be recovered from the culture as a primary product, but because the mycelium waste, the spent filtrate and the carbon waste contain relatively high and rapidly recoverable amounts. of vitamin B12, the vitamin is preferably recovered from these wastes (especially coal waste) as a by-product of streptomycin.
Also, the amount of Vitamin B12 contained in the waste coal can. be recovered advantageously by washing this waste with a solvent for vitamin 1312 (particularly alcohol, acetone or phenol), and by concentrating the eluate by evaporation under reduced pressure; the product thus obtained can, if desired, be treated to concentrate and / or to further purify the vitamin B12.
The following examples illustrate the invention. Example <I> 1: </I> a) .1164 liters of an agent, aqueous (tap water) containing 2.25% soybean meal and 1,
62% dextrose are. placed in a 5000 liter carbon steel fermentation vessel equipped with stirrer and air vaporizer; the container is sterilized for one hour at 120 C.
When the temperature reaches 25 C, 189 liters of an inoculum of streptomyces griseus are added and the inoculated medium is incubated at 25 C under a pressure of 210 to 420 g per em2 (an average of 7.5 liters of air per liter of medium and per hour having passed through the medium), while stirring (at the speed of 120 rotations per minute). During the incubation, 5.6 liters of lard oil are added dropwise as a defoamer. After an incubation of 40 to 50 hours, one reaches. a streptomycin content of 1.50-200 units / cm3 in the culture broth (the pH of which is 6.7).
This pH is then adjusted to. 2.0 with concentrated sulfuric acid and (preferably after addition of a filter aid) the mixture is then filtered through a filter press. The filtrate (I) has a streptomycin content of about 300-100 units / cm3. To the.
end of fermentation, the. Vitamin B12 is in such a form that only a small amount (or about 10%) is precipitated by the addition of acid to it. culture, as can be determined by neutralization of the waste mycelium and other solid bodies (II) and. by examination of the resulting filtrate.
The waste of my celium and other solid bodies can be processed to recover its content of vitamin B12. As a variant, the phase of the addition of the acid, used to facilitate the filtration of the culture, can be omitted and carried out. filtration at a pH of about 7.
and thereby increase the level of streptomycin in the culture broth, so that vitamin 1312, instead of being precipitated, is transported to the other fractions removed during the purification of streptomycin. After filtration at a pH of about 7, it is possible, on the one hand, to recover the.
vitamin Bly in the myeelium waste and other residues and, on the other hand., treat the filtrate with (activated charcoal bed, to adsorb streptomycin, and recover vitamin B12 from the spent filtrate, for example by extraction with a concentrated aqueous solution of phenol.
b) A filtrate of 3785 liters of a culture containing streptomycin obtained as just described, and having a vitamin B12 content of about 1100 units / em3, est. adjusted to pH 7.5 with dilute sodium hydroxide solution, _ and stirred with <B> 108 </B> hg of activated charcoal (Nuchar brand C-145-A) for 15 minutes at room temperature; then the charcoal (containing the streptomycin and part of the adsorbed vitamin B12) is separated by filtration, preferably after coating.
the filter first with an auxiliary filtering agent (for example the Celite brand product). The culture filtrate no longer containing streptomycin (III), on the other hand, still contains around 975 units (em3 of vitamin B12.
c) The charcoal is washed in successive portions of a 0.1 N aqueous solution of nitric acid at 50 ° C. to elute the adsorbed streptomycin. The washed charcoal, which had collected about 10 to 15% of the amount of vitamin B12 from the culture filtrate, is reused to adsorb streptomycin from a new portion of the culture filtrate and thereby accumulates a large amount of vitamin B12. In the purification of streptomycin, the charcoal is reused at least twice before being discarded.
Preferably, a mixture of activated chars is used (for example a mixture of = 1/3 of the product brand Nuchar C-145-A and 1/3 of the product brand Darco G-60); preferably, apart from the re-used charcoal, a further quantity of fresh charcoal, not yet used, is added. The content of the residual carbon in the auxiliary filtering agent is between 10 to 20%. (The eluate containing streptomycin is treated to recover the streptomycin contained therein, for example by precipitation with the aid of a surfactant as described in Swiss patent 285944).
The charcoal residue (IV) containing about 4860 units / g (wet product weight) of vitamin B12 can be dried and used as such as a feed supplement for animals, for example mixed with feed containing vegetable protein. , or the vitamin B12 can be recovered; by one of the methods described below.
Although the adsorption of vitamin B12 by activated charcoal of the type used in the purification of streptomycin (plus an auxiliary filtering agent) is not an efficient method of recovering the vitamin, considering the high content of the vitamin B12. As a result of the culture depleted of vitamin B12, the large amounts of such a good char residue which can be obtained free of charge in the streptomycin purification process makes this recovery of vitamin B12 very economical. If vitamin B12 is to be recovered as a primary product,
Advantageously, an activated charcoal of the type used in the manufacture of injectable liver preparations against harmful anemia (eg activated charcoal brand Sutcliffe Speakman No. 5) will be employed.
d) 1028 g of waste carbon are eluted with two 900 cm3 portions of phenol. 88% aqueous. The phenolic eluates are combined with 1800 em3 of ether, and the mixture is extracted with three 900cc portions of water to remove most of the vitamin B12. The aqueous extracts are combined, washed with ether to remove the phenol and concentrated under reduced pressure to provide a vitamin 1112 concentrate which can be used in therapy.
Variant <I> 1: </I> 405 g of activated carbon waste are washed with one liter of absolute ethanol (at a pH of 7.0) for 15 minutes, at 60 ° C., and the eluate obtained is concentrated by evaporation under reduced pressure to give 170 cm of a solution having. a vitamin B12 content of 5330 units / em3. The product can be used therapeutically as a preparation of vitamin B12, without subsequent purification.
Variant <I> 2: </I> 90 kg of wet waste activated charcoal (pH 2.9) are suspended in water and the suspension is rapidly brought to pH 6.0. by adding a sodium hydroxide solution, the charcoal is separated from it by filtering (to reduce the amount of vitamin B12 retained under strongly acidic conditions).
The charcoal is then washed (in a container fitted with a stirrer) with 132 liters of 60% aqueous ethanol at 60 ° C. for 30 minutes. The eluate, after concentration to 4.5 liters by evaporation under reduced pressure, has a vitamin B12 activity of approximately 21,500 lcm3 units (which represents a recovery of approximately 534,200 units per 500 g of wet charcoal), and a total solids content of 163 mg / cm3; the concentrate can be used therapeutically as a preparation of vitamin B12, without subsequent purification.
Variant <I> 3: </I> 90 g of wet waste of activated carbon previously treated as in. variant 2 are washed with 132 liters of 60% aqueous acetone at 25 ° C. for 30 minutes. The eluate, after concentration at. 4.0 liters by evaporation under reduced pressure, has a vitamin B12 activity of 43,000 unitslcm3 (which represents a recovery of about 945,000 units per 500 g of wet charcoal) and a total solids content of 50 mg (em3; this concentrate can be used therapeutically as vitamin 1312, without subsequent purification.
Example <I>?: </I> 100 g of mycelium waste and other solids (II) obtained as described in paragraph a,) of Example 1 are suspended in water to give a volume of 1 liter; the fold is adjusted to. 7.0 by addition of sodium hydroxide solution, and after stirring for 30 minutes the mixture is filtered. The filtrate, which contains 105 unitsjem3 of vitamin B12 is then concentrated under low pressure to provide a vitamin B12 preparation for use in therapy.
Example <I> 3: </I> 1 liter of depleted culture filtrate of streptomycin (III) obtained as described in paragraph b) of Example 1 is adjusted to p1, 6.0 and extracted with two portions of 500 cm an 88% aqueous solution of phenol; the phenol extract is. then treated as indicated in paragraph d) of Example 1 to give a vitamin B1-2 which can be used in therapy.
In a variant of this process, the filtrate III is adjusted to pH 6-8 and treated with 0.5 to 4 1 / o of an activated charcoal capable of adsorbing vitamin B12 well (for example the product brand Sutcliffe Speakman N 5); the adsorption product is. treated in the same way as the charcoal residue of Example 1, to recover vitamin B1.2 which can be used in therapy.
Example 1 liter of a culture filtrate containing streptomycin, obtained as indicated in paragraph cc) of Example 1 and containing approximately 1100 units / em3 of vitamin B1, is adjusted to pH 6.0 with a dilute solution of sodium hydroxide and treated according to one or the other of the processes of Example 3, to obtain vitamin B12 as a primary product, which can be used in therapy.
Example <I> 5: </I> The different culture conditions which have been chosen from the point of view of the optimum production of streptomycin and / or of the recovery can be modified with a view to production and (or Optimal recovery of vitamin B12, either that this should be the primary product or 1-11 a key by-product streptomycin.
It has been found, for example, that certain non-toxic cobalt salts present in the fermentation medium at a non-toxic concentration considerably increase the formation of vitamin 1312 without appreciably affecting the production of streptomycin.
a) 0.005% of CoCl .6II20 is incorporated into the medium described in paragraph a) of Example 1, and streptomyces griseus is grown in this medium as indicated in this paragraph. After 192 hours of incubation, the culture is treated with an acid as indicated in this paragraph, and filtered.
The cultured filtrate has a streptomycin content of about 375 units / em3 and a vitamin B12 content of about 7000 lem3 units.
b) The culture filtrate is treated to recover vitamin B12 as the primary product, as indicated in Example 4.
<I> Variant: </I> The culture filtrate is treated as described in paragraphs b) and following of Example 1 to recover both streptomycin and vitamin B12; the vitamin B12 yield is increased by the additional recovery of vitamin 1312 from the mycelium II residue (see Example 2) and / or the spent culture filtrate of streptomycin (see Example 3).
The vitamin B12 obtained by the process according to the invention is used therapeutically for the same purposes and in the same way as the vitamin B12 obtained according to previous processes by liver extraction. It is used against pernicious anemia or as a protein factor for animals.
For example, the key vitamin B12 preparation described in paragraph (1), variant 3, of example 1 is obtained in a sterile, aqueous, highly concentrated solution, preserved with 0.5% phenol, and sold in vials with a rubber stopper; this preparation is used for the treatment of pernicious anemia by daily intramuscular injection of an amount equivalent to 15 U. S. P. units of liver extract.
Although the amount of the solids in the vitamin B12 preparations obtained as described above is of the same order as that of many of the therapeutic agents against pernicious anemia used heretofore, these vitamin B1 preparations can be used. purified further if desired; for example:
1 by adding absolute ethanol to the concentrate of vitamin B12 in a sufficient quantity to obtain an ethanol concentration (the $ 0%, by separation of the precipitated inactive solid products and by evaporation of the alcohol under reduced pressure, 2 by reabsorption of vitamin BIL,
concentrate on activated charcoal and elution again with a. solvent for vitamin 1312 (for example alcohol, acetone or phenol), 3 by extracting vitamin 1312 from the concentrate with phenol, 4 by a combination of the aforementioned treatments.