Procédé pour la préparation de la vitamine Blz. La présente invention concerne un procédé pour la préparation de la vitamine B1.r (science 107; 396 [1948] ), un facteur re connu efficace dans la thérapeutique de l'anémie pernicieuse, et possédant des pro priétés nutritives (J. Biol. Chem. 174; 1047 [1948] ), particulièrement quand il est utilisé dans une alimentation pour animaux compre nant des protéines végétales.
La. vitamine Bit, comme les agents théra peutiques contre l'anémie pernicieuse em ployés antérieurement (par exemple de l'extrait de foie), a été extraite jusqu'ici des l'oies de mammifères de boucherie. Il est quel quefois difficile de se procurer les quantités nécessaires de cet organe, qui n'est pas une source économique de vitamine B12.
La présente invention prévoit un nouveau procédé simple et avantageux pour la produc tion de la vitamine B1@.
Le procédé selon l'invention est basé sur la découverte que, dans la production de la streptomycine par fermentation, une quantité relativement grande de vitamine 1312 est égale ment produite et que celle-ci peut être écono miquement récupérée du produit de fermen tation soit comme produit primaire, soit comme sous-produit de la streptomycine.
Le procédé selon l'invention est caracté risé en ce qu'on inocule un milieu nutritif liquide avec un micro-organisme susceptible de produire la streptomycine, en ce qu'on laisse se développer ledit micro-organisme en contact avec ledit milieu et en ce qu'on sé pare la vitamine Bit ainsi formée des autres produits contenus dans la culture. De manière préférable, l'organisme utilisé est une souche de streptomyces griseus reconnue comme étant bonne productrice de streptomycine; l'organisme est habituellement développé en culture submergée et sous d'autres conditions connues pour augmenter la production de streptomycine.
Le milieu nutritif liquide peut comprendre essentiellement une farine de soja (ou une source équivalente d'azote et de subs tances activant la croissance, comme décrit dans le brevet suisse N 268688), un hydrate de carbone assimilable par la moisissure (par exemple du dextrose) et éventuellement un sel.
Dans le procédé de concentration etiou de purification de la streptomycine généralement employé, la culture est filtrée et le déchet de mycelium et autres résidus solides écartés, le filtrat est traité sur du charbon activé pour adsorber la streptomycine (le filtrat épuisé étant écarté), la streptomycine adsorbée est extraite du charbon par élution avec une so lution acide aqueuse (et le déchet de charbon écarté), et l'éluat est traité alors. pour concen trer et/ou purifier la streptomycine.
On a trouvé qué, par ce procédé, presque toute la vitamine B12 est séparée de la streptomycine dans la phase du lavage, c'est-à-dire que la vitamine B12 dans la culture passe sous des concentrations relativement élevées dans les diverses fractions écartées dont il a été fait mention et que presque rien n'apparaît dans l'éluat acide riche en streptomycine.
Aussi, au cours des différentes phases de ce procédé de purification de la streptomycine, en partant d'une culture de streptomyces riseus , qui g contient entre 1100 et 1500 unités par emi de vitamine 1312, la" vitamine B12 apparaît dans les fractions écartées dans les proportions sui vantes:
Déchet de mycelium : 1050 à 2400 unités/- (poids net) Filtrat épuisé: 975 à 1550 unités/millilitre Déchet de charbon: 1877 à 7140 unités/- (poids net) La. teneur en vitamine B12 a été mesurée de façon microbiologique, en utilisant le lactoba- cillus lactis Dorner comme organisme témoin (Science 107;
396, 397, 398 [1948] ), l'unité microbiologique de référence ayant une va leur déterminée de<B>100000</B> unités/cm3, soit 15 U.S.P. unités/cm3 d'un concentré de foie injectable choisi comme étalon.
Dans la. pratique de l'invention, la vita mine B12 peut être récupérée de la culture comme produit primaire, mais, du fait que 'Le déchet de mycelium, le filtrat épuisé et le dé chet de charbon contiennent des quantités relativement élevées et rapidement récupéra- bles de vitamine B12, la vitamine est de pré férence récupérée de ces déchets (spécialement du déchet de charbon) comme sous-produit de la streptomycine.
Aussi, la quantité de vita mine B12 contenue dans le déchet de charbon peut. être récupérée avantageusement par le lavage de ce déchet avec un solvant de la vitamine 1312 (particulièrement de l'alcool, de l'acétone ou du phénol), et par concentration de l'éluat par évaporation sous pression ré duite; le produit ainsi obtenu peut, si on le désire, être traité pour concentrer et/ou pour purifier davantage la vitamine B12.
l=ies exemples suivants illustrent l'invention. Exemple <I>1:</I> a) .1164 litres d'un agent, aqueux (eau du robinet) contenant 2,25% de farine de soja et 1,
62% de dextrose sont. placés dans un récipient de fermentation en acier au carbone de 5000 litres équipé d'un agitateur et d'un vaporisateur d'air; le récipient est stérilisé une heure à l20 C.
Quand la température atteint 25 C, on ajoute 189 litres d'un inocu lai de streptomyces griseus et le milieu inoculé est, incubé à 25 C sous une pression de 210 à 420 g par em2 (une moyenne de 7,5 litres d'air par litre de milieu et par heure étant passé à travers le milieu), tandis que l'on agite (à la vitesse de 120 rotations par minute). Pendant l'incubation, 5,6 litres d'huile de saindoux sont ajoutés goutte à goutte comme antimousse. Après une incuba tion de 40 à 50 heures, on atteint. une teneur en streptomycine de 1.50-200 unités/cm3 dans le bouillon de culture (dont. le pH est de 6,7).
On ajuste alors ce pH à. 2,0 avec de l'acide sulfurique concentré et (de préférence après adjonction d'un agent auxiliaire de filtrage) on filtre alors le mélange à, travers un filtre- presse. Le filtrat (I) a une teneur en strepto mycine d'environ 300 à.100 unités/cm3. A la.
fin de la fermentation, la. vitamine B12 est sous une forme telle que seulement une petite quantité (soit environ 10%) est précipitée par l'addition de l'acide à la. culture, ainsi que ce peut, être déterminé par la neutralisation du déchet de mycelium et d'autres corps so lides (II) et. par examen du filtrat résultant.
Le déchet de my celium et d'autres corps so lides peut être traité pour récupérer son con tenu en vitamine B12. Ion variante, on peut omettre la phase de l'addition de l'acide, uti lisée pour faciliter la filtration de la culture, et effectuer la. filtration à un pH d'environ 7.
et ainsi augmenter le taux de streptomycine dans le bouillon de culture, de sorte que la vitamine 1312, au lieu d'être précipitée, soit transportée dans les autres fractions éliminées pendant la purification de la streptomycine. Après la filtration à un PH d'environ 7, on peut, d'une part, récupérer la.
vitamine Bly dans les déchets du myeelium et les autres résidus et, d'autre part., traiter le filtrat avec (lit charbon de bois activé, pour adsorber la streptomycine, et récupérer ia vitamine B12 du filtrat épuisé, par exemple par extraction avec une solution aqueuse concentrée de phénol.
b) Un filtrat de 3785 litres d'une culture contenant la streptomycine obtenue comme il vient d'être décrit, et présentant une teneur en vitamine B12 d'environ 1100 unités/em3, est. ajusté à un pH de 7,5 avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium,_ et agité avec <B>108</B> hg d'un charbon de bois activé (marque Nuchar C-145-A ) pendant 15 minutes à la température ambiante; ensuite le charbon (contenant la streptomycine et une partie de la vitamine B12 adsorbées) est séparé par filtration, de préférence après avoir enduit.
préalablement le filtre avec un agent auxi liaire de filtrage (par exemple le produit marque Célite ). Le filtrat de culture ne contenant plus de streptomycine (III) ren ferme par contre encore environ 975 unités(em3 de vitamine B12.
c) Le charbon de bois est lavé par por tions successives d'une solution aqueuse 0,1 N d'acide nitrique à 50 C pour éluer la strepto mycine adsorbée. Le charbon lavé, qui avait recueilli environ 10 à 15% de la quantité de vitamine B12 du filtrat de la culture, est réutilisé pour adsorber la streptomycine d'une nouvelle portion du filtrat de culture et accumule ainsi une plats grande quantité de vitamine B12. Dans la, purification de la streptomycine, le charbon est réemployé ail moins deux fois avant d'être abandonné.
De préférence, on emploie un mélange de char bons activés (par exemple un mélange de ='/3 du produit marque Nuchar C-145-A et 1/3 du produit marque Darco G-60 ) ; de préférence, on ajoute, à part du charbon réemployé, encore une certaine quantité de charbon frais, pas encore utilisé. La. teneur du charbon résiduel en l'agent auxiliaire de fil trage est comprise entre 10 à 20 /o. (L'éluat contenant la streptomycine est traité pour récupérer la streptomycine y contenue, par exemple par précipitation à l'aide d'un agent tensioactif comme décrit dans le brevet suisse 285944).
Le résidu de charbon (IV) contenant en viron 4860 unités/g (poids du produit humide) de vitamine B12 peut être séché et être utilisé tel quel comme supplément de nourriture pour les animaux, par exemple mélangé à des ali ments contenant des protéines végétales, ou bien la vitamine B12 peut en être récupérée ; par un des procédés décrits ci-après.
Bien que l'adsorption de la vitamine B12 par du charbon activé du type utilisé dans la purification de la streptomycine (plus un agent auxiliaire de filtrage) ne soit pas un , procédé efficace de récupération de la vita mine, en considérant la teneur élevée du fil trat épuisé de la culture en vitamine B12, les grandes quantités d'un tel résidu de char bon qu'on peut se procurer gratuitement dans , le procédé de purification de la streptomycine rend très économique cette récupération de la vitamine B12. Si la vitamine B12 doit être récupérée comme produit primaire,
on em ploiera avantageusement un charbon activé du type utilisé dans la fabrication de pr6pa- rations injectables de foie contre l'anémie per nicieuse (par exemple le charbon activé marque Sutcliffe Speakman N 5 ).
d) On élue 1028 g de déchet de charbon avec deux portions de 900 cm3 de phénol. aqueux à 88 %. Les éluats phénoliques sont combinés avec 1800 em3 d'éther, et on extrait le mélange avec trois portions de 900 cm3 d'eau pour enlever la plus grande partie de la vitamine B12. Les extraits aqueux sont réunis, lavés à l'éther pour enle ver le phénol et concentrés sous pression ré duite pour fournir un concentré de vitamine 1112 utilisable en thérapeutique.
Variante <I>1:</I> 405 g de déchets de charbon activé sont lavés avec un litre d'éthanol absolu (à un pH de 7,0) pendant 15 minutes, à 60 C, et l'éluat obtenu est concentré par évapora tion sous pression réduite pour donner 170 cm d'une solution ayant. une teneur en vitamine B12 de 5330 unités/em3. Le produit peut être utilisé en thérapeutique comme préparation de vitamine B12, sans purification ultérieure.
Variante <I>2:</I> 90 kg de déchet humide de charbon activé (pH 2,9) sont mis en suspen- lion dans de l'eau et la suspension est rapi dement portée a."' pH 6,0 par adjonction d'une solution d'hydroxyde de sodium, le charbon en est séparé par filtrage (pour diminuer la quantité de vitamine B12 retenue dans des conditions fortement acides).
Le charbon est ensuite lavé (dans un récipient muni d'un agitateur) avec 132 litres d'éthanol aqueux à 60 %, à 60 C pendant 30 minutes. L'éluat, après concentration .à 4,5 litres par évapora tion sous pression réduite, a une activité en vitamine B12 d'environ 21500 unités lcm3 (ce qui représente une récupération d'environ 534200 unités par 500 g de charbon humide), et une teneur totale en matières solides de 163 mg/cm3; le concentré peut être utilisé en thérapeutique comme préparation de vitamine B12, sans purification ultérieure.
Variante <I>3:</I> 90 g de déchets humides de charbon activé préalablement traités comme dans la. variante 2 sont lavés avec 132 litres d'acétone aqueuse à 60 %, à 25 C pendant 30 minutes. L'éluat, après concentration à. 4,0 litres par évaporation sous pression ré duite, a une activité en vitamine B12 de 43 000 unitéslcm3 (ce qui représente une récu pération d'environ 945 000 unités par 500 g de charbon humide) et une teneur totale en substances solides de 50 mg(em3; ce concentré peut être utilisé en thérapeutique comme vitamine 1312, sans purification ultérieure.
Exemple <I>?:</I> 100 g de déchets de mycelium et autres solides (II) obtenus comme décrit dans le paragraphe a,) de l'exemple 1 sont mis en suspension dans de l'eau pour donner un vo lume de 1 litre; le pli est ajusté à. 7,0 par adjonction d'une solution d'hydroxyde de sodium, et après agitation pendant 30 minutes le mélange est filtré. Le filtrat, qui contient 105 unitésjem3 de vitamine B12 est ensuite concentré sous faible pression pour fournir une préparation de vitamine B12 utilisable en thérapeutique.
Exennple <I>3:</I> 1 litre de filtrat de culture épuisé de streptomycine (III) obtenu comme décrit au paragraphe b) de l'exemple 1 est ajusté au p1, 6,0 et extrait avec deux portions de 500 cm d'une solution aqueuse de phénol à 88%; l'extrait de phénol est. traité ensuite comme indiqué au paragraphe d) de l'exemple 1 pour donner une vitamine B1-2 utilisable en thérapeutique.
Dans une variante de ce procédé, le filtrat III est ajusté au pH 6-8 et traité avec 0,5 à 4 1/o d'un charbon activé, apte à bien adsorber la vitamine B12 (par exemple le produit marque Sutcliffe Speakman N 5 ) ; le produit d'adsorption est. traité de la même façon que le résidu de charbon de l'exemple 1, pour récupérer la vitamine B1.2 utilisable en thérapeutique.
Exemple 1. litre d'un filtrat de culture contenant de la streptomycine, obtenu comme indiqué au paragraphe cc) de l'exemple 1 et conte nant environ 1100 unités/em3 de vitamine B1, est ajusté au pH 6,0 par une solution diluée d'hydroxyde de sodium et traité selon l'un ou l'autre des procédés de l'exemple 3, pour obtenir la vitamine B12 comme produit pri maire, utilisable en thérapeutique.
Exemple <I>5:</I> Les différentes conditions de culture qui ont été choisies du point de vue de la pro duction optimum de la streptomycine et/ou de la récupération peuvent être modifiées en vue d'une production et(ou d'une récupéra tion optima de la vitamine B12, soit. que eelle-ci doive être le produit primaire, soit 1-11r sous-produit clé la streptomycine.
On a trouvé, par exemple, que certains sels de cobalt non toxiques présents dans le milieu de fermen tation en concentration non toxique augmen- tent considérablement la formation de vita mine 1312 sans affecter sensiblement la pro duction de streptomycine.
a) 0,005% de CoCI .6II20 est incorporé dans le milieu décrit dans le paragraphe a) de l'exemple 1, et le streptomyces griseus est développé dans ce milieu comme indiqué dans ce paragraphe. Après 192 heures d'in cubation, la culture est traitée avec un acide comme indiqué dans ce paragraphe, et filtrée.
lie filtrat de culture a une teneur en strepto mycine d'environ 375 unités/em3 et une teneur cri vitamine B12 d'environ 7000 unités lem3.
b) Le filtrat de culture est traité pour récupérer la vitamine B12 comme produit Pri maire, comme indiqué dans l'exemple 4.
<I>Variante:</I> Le filtrat de culture est traité comme décrit dans les paragraphes b) et sui vants de l'exemple 1 pour récupérer à la fois la streptomycine et la vitamine B12; le rende ment en vitamine B12 est augmenté par la récupération additionnelle de la vitamine 1312 du résidu de mycelium II (voir exemple 2) et/ou du filtrat de culture épuisé de strepto- mj7eine (voir exemple 3).
La vitamine B12 obtenue par le pro- eédé selon l'invention est utilisée en théra peutique dans les mêmes buts et de la même manière que la vitamine B12 obte nue selon des procédés antérieurs par extraction de foie. Elle sert contre l'anémie pernicieuse ou comme facteur protéinique pour les animaux.
Par exemple, la prépara tion clé vitamine B12 décrite au paragraphe (1), variante 3, de l'exemple 1 est obtenue dans une solution stérile, aqueuse, très con- centrée, conservée par 0,5% de phénol, et vendue dans des fioles munies d'un bouchon de caoutchouc; cette préparation est utilisée pour le traitement de l'anémie pernicieuse par injection journalière intramusculaire d'une quantité équivalente à 15 unités U. S. P. d'extrait de foie.
Bien que la quantité des produits solides dans les préparations de vitamine B12 obte nues comme décrit ci-dessus soit du même ordre que celle de beaucoup des agents théra peutiques contre l'anémie pernicieuse utilisés jusqu'ici, ces préparations de vitamine B1_, peuvent être purifiées davantage si on le dé sire; par exemple:
1 par addition d'éthanol absolu au con centrai de vitamine B12 en quantité suffi sante pour obtenir une concentration en étha- nol (le $0%, par séparation des produits so- lides inactifs précipités et par évaporation de l'alcool sous pression réduite, 2 par réadsorption de la vitamine BIL,
du concentrat sur du charbon activé et nou velle élution avec un. solvant de la vitamine 1312 (par exemple l'alcool, l'acétone ou le phénol), 3 par extraction de la vitamine 1312 du concentrat à l'aide de phénol, , 4 par une combinaison des traitements susmentionnés.