Procédé de production de vitamine B12. La présente invention a pour objet un procédé de production de vitamine B12.
On sait maintenant, que le foie contient une ou plusieurs substances efficaces pour combattre l'anémie pernicieuse. On a obtenu des concentrés actifs par absorption du prin cipe actif d'un extrait de foie sur du charbon, élution avec de l'éthanol à. 65 1/o et purifica tion par séparation chromatographiqae sur des colonnes de silice, d'amidon ou de char bon, les chromatogrammes étant développés avec des solvants alcooliques contenant de l'eau.
L'isolement à partir d'extraits de foie d'une substance rouge cristallisée fortement active, â laquelle on a donné le nom de vita mine B12 et qui produit des réponses hémato logiques positives<I>cher.</I> des patients atteints d'anémie pernicieuse d'Addison, a été décrit. dans la revue Science , 1948, vol.<B>1.07,</B> pages 396 et suivantes. On a trouvé que la vitamine B12 est largement répartie dans la nature et qu'elle se rencontre dans le digéré à la pa païne d'un précipité acide formé à partir de farine de poisson/ . la pancréatine, la papaïne, le blanc d'oeuf, le jaune d'oeuf, l'extrait.
alcoolique de céréale, la farine de soya, la, gélatine, la zéine, le lait en poudre, l'extrait de baeuf, les bouillons de culture du Mylase smegmatis , du Lactobaeillus Arabinosus , du Bacillus subtilis et de nombreux organismes du type streptomyces tels que S. roseochro- niogenes , S. ;riseus et S. antibioticus , ainsi que dans les muscles du boeuf et du porc.
On a trouvé maintenant que la vitamine B12 est contenue en quantités notables dans le mycelium du Streptomyces griseus et d'autres organismes producteurs de vitamine B12 du type Streptomyces et peut en être extraite d'une manière simple et économique.
Le procédé selon l'invention pour la pro duction de vitamine B12 est caractérisé en ce qu'on fait croître un organisme capable de produire la vitamine B12 dans un milieu de culture propre à cette croissance, en ce qu'on arrête la fermentation avant qu'il se soit pro duit pratiquement une autolyse de la struc ture cellulaire, en ce qu'on sépare le mycé- lium obtenu du bouillon de culture et en ce qu'on extrait à chaud ce mycélium avec de l'eau, à un pH compris entre 6 et 9.
L'organisme capable de produire la vita mine B12 peut être du type Streptomy ces , tel que le S. griseus .
La vitamine B12 a une utilité considérable pour compléter les compositions alimentaires animales, et J'extrait préparé selon l'invention peut être utilisé dans ce but, comme dans d'autres buts. Un extrait tel qu'obtenu par ladite extraction à chaud, par de l'eau., peut être utilisé tel quel si la teneur en vitamine B12 est adéquate; il. peut aussi être concen tré, par exemple par évaporation dans un évaporateur à. couche mince ou par extrac tion au moyen d'un solvant organique suivie d'une extraction à l'eau, afin d'obtenir un extrait aqueux d'une teneur appropriée en vitamine B12.
Le milieu de culture employé pour la fer mentation peut être tout milieu aqueux connu comme favorable à la croissance des orga nismes. Dans le cas du Streptomyces griseus par exemple, les milieux de culture utilisés pour la production de streptomycine et des produits correspondants se montrent favora bles. Ces milieux contiennent une source de carbone, une source d'azote et des sels miné raux nutritifs. La source de carbone peut être un hydrate de carbone, et la source d'azote un aminoacide, un sel d'ammonium ou encore une substance azotée complexe, telle qu'une protéine.
Le carbone et l'azote peuvent être avantageusement fournis par une même subs tance, telle que la. levure, la viande, les pep tones, les farines végétales, par exemple (le fève, d'arachide, de semences de coton ou de lin, les farines ou les extraits de poisson ainsi que les infusions de ces substances ou des mélanges de ces substances. La fermen tation peut être conduite de la manière habi tuelle en culture submergée ou en culture superficielle selon tout procédé de fermenta tion connu et utilisé dans la pratique.
Le temps de fermentation nécessaire pour produire ce résultat dépend des conditions de fermentation particulières, par exemple de l'organisme, de l'espèce et de la souche utili sés, de la composition du milieu de culture, du pg, de la température, de la pression, de la. vitesse d'aération, etc.
Pour chaque condi tion particulière utilisée, le temps de fermen tation optimum peut être facilement déter miné en effectuant une fermentation d'essai, en prélevant des échantillons de la. culture qui doivent être aussi uniformes et représentatifs que possible, à des intervalles déterminés, en séparant le mycêlium des échantillons préle vés et en isolant la vitamine B12 de ce my cé- lium. L'examen de ces mycéliums montre facilement quand l'autolyse commence à se produire,
et l'estimation de la teneur en vita mine B12 de chaque échantillon de mycélium indique le temps de fermentation optimu:a pour le procédé.
Le mycélium peut être séparé du bouillon de culture par tout moyen approprié, tel que centrifugation, filtration, etc. et le niy céliuiii séparé est extrait à chaud avec de l'eau. On ajoute au mycélium de i'eau chaude ou froide, et cette extraction peut se faire par exemple en brassant le mélange, en chauffant la masse directement ou indirectement avec de la va peur jusqu'à porter la température à 100 C environ et en maintenant cette température pendant 10 minutes environ. Le my célium est.
ensuite séparé de la solution aqueuse, et cette dernière peut être concentrée, si nécessaire, pour obtenir un extrait aqueux concentré de vitamine B12, de teneur voulue en vitamine B12. Elle peut aussi servir à la préparation de vitamine B12 à l'état. pur.
Le bouillon de culture obtenu après fer mentation peut aussi être traité pour en iso ler la vitamine B12 et d'autres produits utiles qu'il peut contenir.
L'extrait aqueux obtenu par ladite extrac tion peut être traité, en vue de l'obtention d'un extrait purifié, par une enzyme pro téolytique pour digérer la substance pro téique présente, la solution étant alors extraite avec un solvant organique pratiquement non miscible avec l'eau, l'extrait organique étant mis en contact avec une colonne d'un adsor bant approprié, et la substance active, éluée de la colonne au moyen d'un solvant orga nique en solution aqueuse.
On obtient ainsi un extrait aqueux, qui peut être utilisé pour l.'isoleinent de la subs tance active. L'extrait aqueux et/ou l'extrait par solvant organique sont. avantageusement concentrés par évaporation, de préférence sous pression réduite, afin de réduire les vo lumes de solution traitée. Parmi les solvants organiques qui peuvent être utilisés pour l'extraction de la vitamine B12 à. partir de sa solution aqueuse, on peut citer l'alcool butylique normal, l'alcool isobutylique et l'alcool amylique.
Par exemple, une masse de Streptomy ces griseus , obtenue par une fermentation des- tinée à la production de streptomycine, est réduite en petites particules et extraite avec de l'eau chaude. La solution obtenue est con centrée à un dixième de son volume, par éva poration sous pression réduite, et ce con centré aqueux est digéré avec une enzyme protéolytique, telle que la papaïne, la tryp sine, le pancréatine, etc. Après filtration, la solution résultante est extraite avec du buta- nol normal aqueux dans un appareil d'extrac tion à contre-courant.
L'extrait butylique après concentration à un petit volume par évaporation sous pression réduite est mis en contact avec une colonne d'alumine et le chro- matol-raznme est développé avec de l'éthanol aqueux. La traction active obtenue à partir de la colonne constitue un extrait purifié, qui peut servir à l'obtention de vitamine pure, par exemple en l'évaporant jusqu'à siccité sous pression réduite et recristallisant le résidu solide dans de l'acétone aqueux.
Dans ces traitements, les solutions aqueuses contenant les substances actives sont mainte nues à des valeurs de pH comprises entre 6 et 9.
Les extraits aqueux contenant la vitamine B12 peuvent être purifiés et concentrés comme déjà dit par extraction dans un sol vant organique pratiquement non miscible avec l'eau, comme ci-dessus, avec ou sans nou velle extraction subséquente par de l'eau, à volonté. Une nouvelle purification des solu tions contenant la vitamine B12 peut être effectuée aussi en faisant passer ces solutions à travers des côlonnes de matières du type à échange d'anions et/ou de cations, ces colonnes n'absorbant pas la vitamine de la solution, mais éliminant les impuretés acides et basi ques associées à la vitamine.
Les exemples suivants illustrent des mises en aeuvre du procédé selon l'invention. Les quantités de vitamine B12 sont déterminées par la croissance du microorganisme Lacto- bacillus lactis Dorner, clans les conditions d'essai décrites par Shorb, -Journal of Biolo- gical Chemistry, Vol. 169, p.<B>455-6.</B> Sauf indi cation contraire, les pourcentages sont don nés en poids.
Exemple j: Un milieu aqueux contenant 0,71/o de farine de poisson, 0,3 % de levure autolysée sèche, 1% de glucose, 0,51/o de chlorure de sodium, 0,02511/o de sulfate de magnésium,
0,001% de sulfate ferreux, 0,002% de ni- trate de cobalt est stérilisé et inoculé avec un inoculai végétatif à 1011/o de Streptomyces griseus . La fermentation est effectuée à 82 C en culture submergée et en aérobiose sous agitation vigoureuse et aération à raison d'un volume d'air stérile par volume de milieu de culture et par minute. La fermentation est arrêtée après 44 h.
On filtre approximative ment l820 litres de bouillon total, qui con tient 0,28 millimierogramme de vitamine B72 par millilitre et auquel on a ajouté 29,51 kg d'un agent favorisant la filtration, par exem ple une terre à. diatomées, la filtration se fai sant à travers des copeaux de bois pressés, recouverts au préalable de 22.,7 kg de terre à diatomées, par exemple le produit marque Dicalite . Le gâteau, après séchage, est délayé dans de l'eau, de manière que le volume total du mélange soit de l.365 litres; le tout est chauffé en 2 heures jusqu'à 100 C au moyen de vapeur, et la température est maintenue à cette valeur pendant encore 10 minutes.
Le mélange est filtré à nouveau sur des copeaux de bois. On obtient 1073,8 litres d'un filtrat riche en vitamine B12, qui est concentré dans un évaporateur à couche mince à un volume de 113,75 litres. On trouve que ce concentré contient 180 millimicrogramm.es de vitamine B12 par millilitre. Exemple <I>2:</I> On filtre, comme décrit dans l'exemple 1, 3185 litres d'un bouillon total obtenu lors d'une fermentation effectuée exactement comme décrit dans l'exemple 1, ce bouillon contenant 9,5 millimicrogrammes de vitamine B12 par millilitre, après avoir ajouté au bouillon 47,67 kg d'une terre à diatomées, par exemple le produit. marque Celite 535 , pour favoriser la filtration.
Le gâteau pressé obtenu, auquel on ajoute de l'eau jusqu'à un volume total de<B>1365</B> 5 litres, est chauffé à 100 C au moyen de vapeur. Le filtrat est. filtré à nouveau, ce qui donne 709,80 litres de filtrat qui sont concentrés dans un 6vapo- rateur à couche mince jusqu'à un volume de 68,25 litres. Ce concentré contient 1,2 micro gramme de vitamine Bl2 par millilitre.
Exemple <I>3:</I> Un milieu aqueux contenant 0,7 % de farine de poisson, 0,3 % de levure autolysée, sèche, 1% de glucose, 0,
5 % de chlorure de sodium, 0,025 % de sulfate de magnésium, 0,001% de sulfate ferreux, 0,
002 % de nitrate de cobalt est stérilisé et inoculé avec un inoculai végétatif à 10 % de Streptomyces griseus . La fermentation est effectuée â. une température de 82 C en culture submergée et en aérobiose, sous agitation vigoureuse et aération à raison d'un volume d'air stérile par volume de milieu de culture et par minute.
Après 42 heures, on retire de la cuve de fer mentation 2457 litres de bouillon total conte nant 35 millimicrogrammes de vitamine B12 par millilitre, et on filtre ce bouillon après addition de 36,32 kg de Celite pour favo riser la filtration. Le gâteau sec est chauffé à 100 C après addition de 1355 litres d'eau environ, et la température est maintenue à 100 C pendant 30 minutes. La filtration subséquente donne 1001 litres de filtrat qui est concentré à un volume de 7.13,75 litres dans un évaporateur à couche mince. Ce con centré contient 1,2 microgramme de vitamine B12 par millilitre.
On retire de la cuve 3094 litres de bouil lon total de cette même fermentation après un temps de fermentation de 67 heures. Ce bouillon, qui contient 25 millimicrogrammes de vitamine par millilitre, est filtré après addition de 61,29 kg de Celite . Le gâteau filtré humide est chauffé à 100 C en le fai sant traverser par de la vapeur, sans addition d'eau autre que celle qui se condense de la vapeur utilisée. La température est mainte nue à 100 C pendant 10 minutes.
Le gâteau se brise rapidement en une boue humide et, quand le chauffage est achevé, on clarifie par centrifugation sur un centrifugeur à bol so- lide, par portions de 68,25 litres, la e.laril.'i- eation finale étant effectuée également par centrifugation. On obtient de cette manière 204,75 litres d'un concentré aqueux de vita mine B12, qui contient 6,0 microgrammes de vitamine B12 par millilitre.
Un échantillon. du gâteau enlevé du cent.ri- fugeur est chauffé à 100 C avec de la va peur: la liqueur surnageante contient 0,2 mi- crogi-amme de vitamine B12 par millilitre.
On voit, d'après les exemples ci-dessus, que la quantité de vitamine B12 dans l'ex trait est nettement supérieure à. la. quantité totale contenue dans le bouillon de culture total original.
Le Streptomyces griseus utilisé dans ces exemples peut être remplacé par d'autres organismes producteurs de vitamine B12 du type Streptomyces , avec des résultats tout à fait similaires, en procédant par ailleurs d'une manière analogue.
Les substances favorisant la filtration utilisées ici: la Dicalite (exemple 1) et la Celite (exemples 2 et 3), sont des diato mées siliceuses très finement divisées.
Les concentrés aqueux de vitamine BI2 obtenus comme ixidiqué dans les exemples peu vent être traités comme il a été décrit ici ou de toute autre manière connue dans la pra tique pour les purifier.
Le produit obtenu par le procédé selon l'invention peut servir comme supplément aux fourrages. Une solution aqueuse, telle que celles obtenues dans les exemples ci-dessus, pourvu qu'elle ait une concentration adé quate et. qu'elle soit exempte de substances toxiques ou nuisibles, peut être mélangée avec le fourrage par toute méthode utilisée dans la pratique.
II peut aussi être utilisé par administra tion orale chez l'homme; il suffit de s'assurer que le produit est exempt d'impuretés toxi ques ou nuisibles. Ainsi, les solutions aqueuses de vitamine B7.2 obtenues selon les exemples précédents peuvent être concentrées à la teneur voulue pour que la dose nécessaire soit contenue dans un volume approprié de liquide en vue de l'administration. De telles solutions peuvent aussi être employées, en les dessé chant en présence de substances destinées à constituer des tablettes, pour obtenir des ta blettes à administrer par voie buccale.
On peut aussi, à partir de telles solutions, obtenir la vitamine B12 à l'état pur. Ainsi, une solution contenant la vitamine B12 peut être soumise à un traitement de purification tel que celui décrit plus haut, de préférence par adsorption chromatographique sur Lin adsorbant tel que l'alumine, le bel de silice, l'amidon ou le charbon activé, suivie par une élution au moyen d'un solvant organique aqueux tel que l'alcool propylique normal, l'alcool isopropylique ou l'alcool butylique, et d'une cristallisation dans des solvants orga niques appropriés.