LU86418A1

LU86418A1 - Polysaccharides azotes et leur procede d'obtention

Info

Publication number: LU86418A1
Application number: LU86418A
Authority: LU
Inventors: Rafael De Lacy Sureda
Original assignee: Corlay Sl
Priority date: 1985-06-03
Filing date: 1986-05-02
Publication date: 1986-12-02
Also published as: DE3617368C2; DE3617368A1; ES8701229A1; FR2582672B1; BE904716A; NL8601154A; IT8619689A0; IT1204830B; FR2582672A1; ES543855A0

Description

- * ' r "Polysaccharides azotés et leur procédé d'obtention"

La présente invention est relative, d'une manière générale, à des polysaccharides azotés et à leur procédé d'obtention. Elle se réfère en particulier à un procédé d'obtention de tels polysaccharides azotés, qui consiste en un procédé de fermentation durant lequel 5 un composé polysaccharide azoté se forme dans le bouillon de culture, ce composé étant ensuite isolé du bouillon de culture sous la forme d'un produit d'adsorption, et ce comme on le décrira de façon plus complète ci-après.

La fermentation est menée à bien d'une manière 10 originale, en utilisant d'abord, comme inoculum du milieu de culture, un micro-organisme du genre Zymomonas durant les premiers jours de la fermentation, et en réalisant ensuite un autre ensemencement dans le même bouillon de culture qui en est ainsi modifié, et ce en utilisant le Pediococcus acidilactici, puis en poursuivant le procédé 15 jusqu'à obtention, dans le bouillon de culture, du composé recherché et en séparant ensuite celui-ci grâce à la formation d'un produit d'adsorption qui contient la quasi totalité de ce composé.

? Par conséquent, on utilise une fermentation que l'on pourrait appeler "à cultures associées", que le Dr. 3. Risler définit 20 dans son ouvrage "Les complexes antibiotiques d'adaptation" (PACOMHY Editeurs, 7 rue Gustave-Nadaud, Paris (16e), ou à culture mixte ("fermentation à culture mixte"), dénomination due à C.W. Hesseltine (Ann. Rev. Microbiol. 37,575-601-1983), travail dans lequel on étudie l'obtention de différents aliments grâce à une fermentation en utilisant des 25 cultures mixtes.

Le procédé de fermen ation suivant la présente invention diffère de la technique que le dernier auteur mentionné appelle "polyculture", en ce sens que bien que l'on utilise plus d'un micro-organis- V » 2 me pour la fermentation et l'obtention du composé final désiré, ces micro-organismes sont inconnus, tandis que, dans le présent cas, on inocule le bouillon par des cultures pures des deux micro-organismes - mentionnés antérieurement, en prévoyant un déphasage entre les addi- 5 tions de ces micro-organismes. Le mode opératoire est original et v présente divers avantages, comme par exemple de permettre une vitesse plus grande de croissance des deux germes, une association stable de ceux-ci, une résistance beaucoup plus grande à l'action des phagocytes et un meilleur rendement du composé désiré, ainsi que la possibilité 10 d'employer des substrats mixtes dans la préparation du milieu de culture.

L'exemple suivant illustre suffisamment l'invention.

Dans un récipient métallique (de préférence en acier inoxydable), on place 90 kg de graines de soja et on lave deux fois à l'eau, on élimine les liquides de lavage et on ajoute ensuite de l'eau 15 en une quantité suffisante pour que les graines soient totalement recouvertes par cette eau. On obture le récipient et on laisse tremper à la température de 10 à Ô'C environ (cette température n’est pas critique) durant environ 18 heures. Ce temps de macération étant écoulé, on procède à une mouture grossière, à l'état humide, des semences 20 qui formeront ensuite une partie du bouillon de culture. Dans le cas présent, le procédé représente une modification importante comparativement aux techniques normales de fermentation, dans lesquelles, dans la préparation du bouillon de culture en vue de sa fermentation ultérieure, dans le but d'obtenir des composés ayant une action thérapeu-* 25 tique, on utilise toujours des ingrédients moulus finement ("farinesi'), en procédant, dès que le bouillon a été préparé, à sa stérilisation avant l'ensemencement du micro-organisme producteur de la fermentation. Dans le cas de l'invention, lorsque le processus de mouture grossière à l'état humide est terminé, on décante l'eau, en récupérant de celle-ci 30 la partie solide constituée par les graines de soja subdivisées qui, sans stérilisation, sont placées dans un fermentateur d'un volume utile de travail d'environ 14.000 à 15.000 litres, appareil pourvu d'un système d'agitation et dans lequel on a ajouté précédemment environ 3.000 litre d'eau à une température de 39-40°C (cette température 35 n'est pas critique). En entretenant une agitation modérée, on ajoute 3 les composants suivants du milieu de culture, ces composants ayant été préalablement pulvérisés finement. L'addition se fait dans l'ordre suivant : camphre cristallisé : 65 kg ; soufre micronisé : 65 kg ; colopha-- ne : 40 kg ; extrait sec de levure : 75 kg ; bioxyde de manganèse : 5 2,5 kg ; et sulfate de manganèse : 75 kg. Lorsque l'addition de ces composants est terminée, on ajoute dans le fermentateur, sans arrêter l'agitation, de l'eau à une température de 39°C +_ 2°C environ, jusqu'à atteindre un volume final de 13.000 litres, la préparation du bouillon de culture étant ainsi terminée.

10 Lorsque le mélange a été préparé et homogénéisé, on vérifie sa température qui devra être maintenue de préférence à 39°C durant le processus de fermentation.

Ensemencement du bouillon de culture - Ensuite, on inocule le bouillon de culture par une souche de Zymomonas movilis. 15 La quantité d'inoculum que l'on utilise est de 10 cellules par litre de bouillon de culture, inoculum avec lequel on amorce le processus de fermentation. Le troisième jour, on procède à une nouvelle inoculation du bouillon par un micro-organisme différent du précédent, ce micro-organisme étant constitué par une souche dénommée Pediococcus 20 acidilactici, la quantité d'inoculum que l'on utilise dans ce cas étant 9 de 10 cellules par litre de bouillon. Le bouillon inocule est maintenu sans agitation ni aération à une température comprise entre 37 et 40°C sur une période de temps qui oscille entre 5 et 15 jours. Durant cette période, se produit le processus de fermentation et d'extraction B 25 des composants, et les modifications chimiques de ceux-ci, ainsi qu'une décantation graduelle qui provoque la formation, au sein du liquide, d'un gradient de solides, de particules et de micro-organismes.

Lyse-hydrolyse - Le bouillon précédent est soumis à un processus de lyse -hydrolyse en ajoutant 120 kg d'acide phosphori-30 que à 85 % en poids, 120 kg d'urée en perles et 3,6 kg de pepsine en poudre d'un titre de 1/3.000.

Tous les réactifs s'ajoutent sous agitation jusqu'à dissolution totale. Grâce à ce procédé, combiné à l'action du processus fermentatif décrit précédemment, on atteint les objectifs suivants : 35 lyse totale de tous les micro-organismes et solubilisation du polysaccha- » 4 ride contenant de l'azote, ainsi que sa modification chimique, de manière à ce que l'on obtienne le composé final désiré, non toxique et biologiquement actif. Les analyses montrent qu'à ce stade, la macromolécule unique qui subsiste comme telle est le polysaccharide contenant de 5 l'azote (PN).

Précipitation et formation du produit d'adsorption : le bouillon ayant ainsi subi une lyse est filtré sur de l'Hyflo Super-Cel ou un co-adjuvant de filtration ayant des propriétés analogues. Pour cela, on prépare une suspension de 5 kg de Hyflo Super-Cel dans 100 10 litres d'eau, avec laquelle se forme une couche dans un filtre-presse de 10 châssis de 40 x 40 cm, auquel on applique une pression d'entrée de 1 kg/cm2 en laissant la sortie libre. Ensuite et sans interrompre le courant, on procède à la filtration du lysat en maintenant la même pression dans le filtre. Ensuite, on ajoute, à la solution filtrée, 300 kg 15 de chlorure de calcium en scories (anhydre), on agite jusqu'à obtention d'une dissolution totale et on incorpore avec précaution de l'hydroxyde de sodium en solution à 10 % en poids/poids, jusqu'à ce que le pH ait une valeur d'environ 4,7. Le courant approximatif d'addition d'hydroxyde de sodium est d'environ 20 litres/minute.

20 Cette opération étant terminée, on verse rapidement le total du liquide filtré et partiellement neutralisé sur 4.800 litres d'acétone pure. Ce changement de polarité du dissolvant détermine la formation d'un produit d'adsorption (sel complexe inorganique formé par du sulfate et du phosphate de calcium, dont l'analyse sera donnée » 25 dans la description chimique du composé) qui adsorbe pratiquement de façon sélective, la macromolécule constituée par le polysaccharide contenant de l'azote. Il se produit aussi des adsorptions de petites quantités de substances contaminantes (sucres réducteurs, bases azotées, aminoacides) mais ces substances s'éliminent quasi complètement 30 grâce à trois lavages successifs du produit d'adsorption avec 900 litres d'acétone à 28 % en volume/voiume dans de l'eau. On dessèche ces "eaux acétoniques" de lavage et la fraction solide en suspension dans ces eaux est séparée par filtration grâce à un filtre rotatif et est immédiatement séchée dans un four à air chaud à une température 35 de 40-60°C.

* * 5

Tableau I

Composition chimique du polysaccharide contenant de l'azote, ainsi que de son support inorganique - Polysaccharide de 5 Partie organique active manno-glucan 85,6 _+ 3,2 96 (2 % p/p) Protéines 14,4 _+3,2 96

Support inorganique Sel complexe de phosphate calcique (98 96 p/p) contenant du soufre, sous forme de sulfate 10 Caractéristiques du produit d'adsorption - Poudre blanche, inodore et insipide (d'une saveur de craie), insoluble dans l'eau et soluble dans les acides inorganiques dilués, l'acide nitrique, l'acide chlorhydrique, etc., et dans les acides organiques forts, comme par exemple l'acide acétique.

15 Sa solution nitrique donne à chaud, avec le molybdate ammonique (solution réactive) un précipité jaune de phosphomolybdate ammonique, ce qui indique la présence de phosphates.

Sa solution dans de l'acide chlorhydrique dilué (2N) donne, avec une solution de chlorure de baryum (réactif) un précipité 20 blanc qui indique la présence de sulfates.

La suspension aqueuse du produit d'adsorption traitée avec une solution du sel sodique de l'acide éthylènediamine-tétra-acéti-que, donne un liquide transparent et incolore par formation d'un complexe avec ce sel.

25 La solution du produit d'adsorption dans de l'acide acétique dilué donne, avec l'oxalate ammonique, un précipité blanc d'oxalate de calcium, ce qui indique la présence de calcium dans le produit d'adsorption.

Tableau II

30 Composition chimique du polysaccharide contenant de l'azote ; fraction polysaccharide Composition en monosaccharides Glucose 23 +_ 4 %

Mannose 7lf +_ 5 % 35 Autres 5 +_ 3 % (*) 6 *

Tableau II (suite)

Structure à l'aide de la dégradation de SMITH-UNION 1-6 princi-' paiement.

5 (*) Principalement ribose, qui provient probablement d'un peu de conta mination par acides nucléiques.

Tableau III

Composition chimique du polysaccharide azoté ; fraction polysaccharide Dérivés acétylés ( par CGL ) (%) DE

10 Glycérol 90,5

Mannitol 4,1

Glucitol 2,9

Autres 2,5

Tableau IV

15 Composition en aminoacides % en p/p

Phosphosérine 0,73 0,16

Acide aspartique 10,6 +.0,28

Thréonine 9,2 _+ 0,83 20 Sérine 8,01 _+ 0,32

Acide glutamique 17,6 _+ 1,22

Proline 6,1 _+ 1,4

Glycine 18 _+ 0,05

Alanine 3,9 +_ 0,2 25 Acide amino-butyrique 3,5 _+ 0,25

Valine 2,5 +0,16

Cystéine 3,2 _+ 0,23 Méthionine 0,62^+0,31

Isoleucine 3,05 _+ 0,13 30 Leucine 5,4 _+0,17

Tyrosine 2,8 _+ 0,16

Phénylalanine 1,87 _+0,1

Ornitine 0,17^0,02

Lysine 9,2 _+ 0,52 35 Histidine 2,15 _+ 0,38

Arginine 6,65 _+ 0,36

P

7

P

La Figure annexée donne le spectre dans l'infrarouge de deux échantillons du polysaccharide contenant de l'azote, à l'état pur, obtenus au départ de deux lots différents de produit d'adsorption. Comme on peut le voir, les spectres obtenus sont égaux. La position 5 des bandes les plus importantes (en cm L) se situe à : 3.400, 2.940, 1.660, 1.135, 1.060, 980 et 815.

Les polysaccharides suivant l'invention sont utilisables notamment à titre d'agents thérapeutiques, en particulier à titre d'im-munostimulants, notamment pour la stimulation des défenses organiques, 10 des états immunodéficitaires secondaires et des problèmes d'immunodéficience en général.

Claims

1. Polysaccharides azotés, caractérisés en ce qu'on les obtient par la fermentation du bouillon de culture, produites par l'inoculation de deux classes différentes de bactéries, appartenant aux genres Zymomonas et Pediococcus, le polysaccharide étant isolé 5 sous forme d'un produit d'adsorption.

2. Polysaccharides azotés suivant la revendication 1, caractérisés en ce que l'espèce du genre Zymomonas est le Zymomonas movilis et l'espèce du genre Pediococcus est le Pediococcus acidilac-tici.

3. Procédé d'obtention d'un polysaccharide azoté isolé sous la forme d'un produit d’adsorption, caractérisé en ce que la fermentation du bouillon de culture est réalisée grâce à l'inoculation de deux classes différentes de bactéries, les bactéries inoculées dans ie bouillon de culture appartenant aux genres Zymomonas et Pediococcus.

4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'espèce inoculée du genre Zymomonas est le Zymomonas movilis, et l'espèce appartenant au genre Pediococcus est le Pediococcus acidilactici.

5. Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 20. et 4, caractérisé en ce que les souches précitées ne sont pas inoculées en même temps dans le milieu de culture, le Pediococcus acidilactici étant inoculé le troisième jour après l'inoculation, dans le bouillon de culture, de la souche Zymomonas movilis.

6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 25 4 à 5, caractérisé en ce que le bouillon de culture n'est pas stérilisé à la chaleur et est maintenu sans agitation ni aération à une température de 37 à 40°C durant 5 a 15 jours.

7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que, lorsque la fermentation est terminée, on procède à un procé- 30 dé de lyse-hydrolyse du bouillon de culture, par addition à celui-ci d'acide phosphorique, d'urée et de pepsine.

8. Procédé suivant la revendication 7, en ce que le bouillon ayant subi la lyse et ayant été filtré en utilisant un co-adju vant de filtration, on y ajoute du chlorure de calcium anhydre et, V ** 9 κ « . ft après dissolution, on y ajoute une solution d'hydroxyde de sodium jusqu'à ce que le pH atteigne une valeur d'environ 4,7, puis la solution obtenue est versée sur un excès important d'acétone avec laquelle on obtient *· un précipité complexe dans lequel le polysaccharide azoté recherché 5 est retenu sous forme d'un produit d'adsorption.

9. Utilisation des polysaccharides azotés suivant la revendication 1 ou 2 ou tels qu'obtenus suivant l'une quelconque des revendications 3 à 8, à titre d'agents thérapeutiques, en particulier à titre d'immunostimulants, notamment pour la stimulation des défenses 10 organiques, des états immunodéficitaires secondaires et des problèmes d'immunodéficience en général. Dessins :........./l........planche^ w™,i2...pages dont.......y!......page de garde .........-tL- pages da description ..........- payes de revendication .......c brégé descriptif Luxembourg, ie -2 MA11986 Le mandataire : Me Alain Rukavina