TWI415942B - 生產胞外多醣的方法以及一新穎的乳酸小球菌分離株 - Google Patents

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Description

生產胞外多醣的方法以及一新穎的乳酸小球菌分離株
本發明是有關於一種用於生產胞外多醣的方法，其包括：將一乳酸小球菌菌株(a strain ofPediococcus acidilactici )培養於一適於該菌株生長的培養基中。本發明亦有關於一株具有高胞外多醣-生產能力(high exopolysaccharide-producing ability)的新穎乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )05B0111，它以寄存編號BCRC 910420被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center of the Food Industry Research and Development Institute)，以及以寄存編號DSM 22345被寄存於德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)。
胞外多醣(exopolysaccharides或extracellular polysaccharides，EPS)是由微生物所分泌的巨分子(macromolecules)，它們一般被分類為：(1)莢膜EPS(capsular EPS)，可形成一被鬆散地附著於細胞表面的黏液層(slime layer)；以及(2)未附著的EPS(unattached EPS)，可被分泌至細胞外的環境中。
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是屬於一般被公認為安全的(generally recognized as safe,GRAS)並且是為人所熟悉與廣泛使用的益生菌(probiotics)。已知部分的乳酸菌具有生產胞外多醣的能力，而這些會生產EPS的LAB(EPS-producing LAB)大多數是屬於鏈球菌屬(Streptococcus )、乳桿菌屬(Lactobacillus )、乳球菌屬(Lactococcus )、白念珠球菌屬(Leuconostoc )以及小球菌屬(Pediococcus )(Petronella J. Looijesteijnet al .(1999),Applied and Environmental Microbiology ,65:5003-5008；T. Smitinontet al .(1999),International Journal of Food Microbiology ,51:105-111；Patricia Ruas-Madiedoet al .(2007),Applied and Environmental Microbiology ,73:4385-4388)。此外，某些雙叉桿菌屬(Bifidobacterium )的菌株(strains)也被顯示能夠生產胞外多醣(P. Ruas-Madiedo and C. G. de los Reyes-(2005),J. Dairy Sci .,88:843-856)。
一般而言，乳酸菌所生產的胞外多醣可被區分為下面兩大類別：
1.同元多醣(homopolysaccharides,HoPS)，它是由單一類型的單醣(monosaccharide)所構成。HoPS包括α-聚葡萄糖(α-glucans)[例如葡聚糖(dextran)]、β-聚葡萄糖(β-glucans)以及聚果糖(fructans)[例如左聚醣類型(levan-type)與菊糖類型(inulin-type)]；以及
2.異元多醣(heteropolysaccharides,HePS)，它是由包含有不同單醣的重複單元(repeating units)所構成。HePS的重複單元通常是由3至8個單糖所形成並且大多數是含有D-葡萄糖(D-glucose)、D-半乳糖(D-galactose)以及L-鼠李糖(L-rhamnose)。在少數的例子中，HePS包含有N-乙醯葡萄胺糖(N-acetylglucosamine)、N-乙醯半乳胺糖(N-acetylgalactosamine)、海藻糖(fucose)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid)以及非醣類取代基(例如磷酸、乙醯基以及甘油)。
乳酸菌所生產的胞外多醣可賦予食品特殊的流變特性(rheological properties)與質地(texture)，因此在食品產業中常被用來作為增稠劑(viscosifiers)、安定劑(stabilizer)、乳化劑(emulsifiers)以及膠凝劑(gelling agents)。此外，乳酸菌所生產的胞外多醣已被證實具有許多有益於宿主(host)健康的功效，例如：降低膽固醇、調節免疫活性以及抗腫瘤等。基於上述的有利生物活性，乳酸菌所生產的胞外多醣已在各種產業上被廣泛地利用。
胞外多醣在細菌中的產量通常很低且又不穩定，為了因應產業界對於胞外多醣的廣大需求，現今有許多的研究人員致力於探討各種會影響乳酸菌的胞外多醣生產率(productivity)的因素，以期發展新的培養技術來提高胞外多醣的產量。例如，Petronella J. Looijesteijn等人提到：菌株、培養條件以及培養基組成(medium composition)會影響由一特定物種所生產之微生物EPS的數量，而碳源的類型在EPS生產率上具有一巨大的影響力而且可能也會影響到EPS的組成。Petronella J. Looijesteijn等人進一步提到：戴白氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbreuckii subsp.bulgaricus )NCFB 2772使用葡萄糖作為碳源所生產的EPS要比使用果糖超出3倍，而乳酪白乳桿菌(Lactobacillus casei )CG11、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus )C83以及唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus salivarius subsp.thermophilus )所生產的EPS的產率(yield)也都明顯地受到碳源影響(Petronella J. Looijesteijnet al .(1999)，同上述)。
P. Ruas-Madiedo以及C. G. de los Reyes-提到：乳酪乳桿菌CRL87在半乳糖中所生產的EPS要比在葡萄糖中高出1.7倍，而乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris )B40在葡萄糖中要比在果糖中能夠生產更高數量的EPS(P. Ruas-Madiedo and C. G. de los Reyes-(2005)，同上述)。而T. Smitinont等人報導：2株由傳統泰式食物中所分離出的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus )AP-1與AP-3能夠以高產率來生產EPS，這2株分離株在含有2%蔗糖作為碳源的液態培養基中所生產的EPS數量分別為6.0以及2.5g/L(T. Smitinontet al .(1999)，同上述)。
此外，在小球菌屬的已知物種中，有害片球菌(Pediococcus damnosus )、小片球菌(Pediococcus parvulus )以及戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus )已被報導具有生產胞外多醣的能力(Maite et al .(2003),International Journal of Food Microbiology ,87:113-120；S. Velascoet al .(2006),International Journal of Food Microbiology ,111:252-258；T. Smitinontet al .(1999)，同上述)。然而，就申請人所知，迄今尚無任何文獻或專利前案曾經揭示乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )具有胞外多醣-生產能力而能夠實際應用於產業界中。
經研究，申請人意外地發現乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )具有胞外多醣-生產能力(exopolysaccharide-producing ability)。特別地，申請人從發酵食品中篩選出一株乳酸小球菌分離株(isolate)，它在種系上(phylogenetically)是不同於所屬物種中已公開的菌株，並且具有極為優異的胞外多醣-生產能力，因而被預期可供用於大量生產胞外多醣。
 發明概要
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於生產胞外多醣的方法，其包括：將一乳酸小球菌菌株培養於一適於該菌株生長的培養基中。
在第二個方面，本發明提供一種含有胞外多醣的乳酸小球菌培養物(Pediococcus acidilactici culture containing exopolysaccharide)，它是藉由一如上所述的方法而被製得。
在第三個方面，本發明提供一種藥學組成物，其包含有一如上所述的乳酸小球菌培養物，以及選擇性地一藥學上可接受的載劑。
在第四個方面，本發明提供一種食品產品，其包含有一如上所述的乳酸小球菌培養物。
特別地，經由菌株篩選以及胞外多醣-生產能力的評估，申請人發現一株新穎的乳酸小球菌分離株，它具有極為優異的胞外多醣-生產能力。
因此，在第五個方面，本發明提供一種乳酸小球菌05B0111，它以寄存編號(accession number)BCRC 910420被寄存於財團法人食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)，以及以寄存編號DSM 22345被寄存於德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。
乳酸菌(lactic acid bacteria)是一種被公認為安全的並且為大眾所熟悉與廣泛使用的益生菌(probiotics)，它們已被證實具有許多有益於宿主(host)健康的功效，而它們所生產的胞外多醣在各種不同的產業上均具有極高的利用價值。為了能夠在產業上大規模地生產胞外多醣，申請人嘗試從乳酸菌當中找出具有高胞外多醣-生產能力(high exopolysaccharide-producing ability)的乳酸菌分離株來因應產業界對於胞外多醣的需求。
於是，申請人以市售的發酵食品作為乳酸菌分離株的分離來源並從中初步篩選出26株具有胞外多醣-生產能力的乳酸菌分離株(Lactic acid bacteria isolates)，而經由對這26株乳酸菌分離株進行16S rDNA序列分析發現到：有5株乳酸菌分離株在種系上(phylogenetically)是歸屬於乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )。特別地，申請人藉由胞外多醣-生產能力以及種系新穎性(phylogenetic novelty)的評估發現到：在該5株乳酸小球菌分離株中，乳酸小球菌05B0111具有最佳的胞外多醣-生產能力並且是一株新穎的乳酸小球菌分離株。該乳酸小球菌05B0111已於民國98年02月10日以寄存編號BCRC 910420被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。這株分離株亦有依據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)的規定，於西元2009年03月05日以寄存編號DSM 22345被寄存於德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司。
於是，本發明提供一種用於生產胞外多醣的方法，其包括：將一乳酸小球菌菌株培養於一適於該菌株生長的培養基中。
如此處所用的，術語“培育(cultivation)”、“培養(culturing)”以及“發酵(fermentation)”可被交換地使用。
較佳地，該乳酸小球菌菌株是本發明的乳酸小球菌05B0111或其繼代培養後代(sub-cultured offspring)。
依據本發明，適用於培養乳酸小球菌的培養基是熟習此項技藝者所熟知的。例如，該培養基可以是一合成培養基(synthetic medium)或一可食性材料(edible material)。
依據本發明，適用於本發明的合成培養基包括，但不限於MRS肉湯培養基(MRS broth)。
依據本發明，適用於本發明的可食性材料包括，但不限於：流體乳品(fluid milk products)，例如牛奶；濃縮牛奶(concentrated milk)；奶粉(milk powder)；果汁(fruit juices)；豆奶(soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruit juices)；健康食品(health foods)；動物飼料(animal feeds)；農產品(agricultural products)；畜產品(livestock products)；水產品(aquatic products)；以及機能性素材(functional ingredients)。在本發明的一個較佳具體例中，該可食性材料是牛奶。在本發明的另一個較佳具體例中，該可食性材料是柳丁原汁。在本發明的又一個較佳具體例中，該可食性材料是豆奶。
依據本發明，適用於本發明的培養基包含有一選自於下列群組中的碳源：乳糖(lactose)、果糖(fructose)、麥芽糖(maltose)、葡萄糖(glucose)、糖蜜(molasses)、半乳糖(galactose)、木糖(xylose)、木糖醇(xylitol)、菊糖(inulin)、山梨糖醇(sorbitol)、海藻糖(trehalose)、蔗糖(sucrose)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該培養基包含有一選自於下列群組中的碳源：麥芽糖、葡萄糖、糖蜜、木糖、菊糖、蔗糖以及它們的組合。在本發明的一個更佳具體例中，該培養基包含有一選自於下列群組中的碳源：菊糖、蔗糖以及它們的組合。在本發明的一個最佳具體例中，該培養基包含有蔗糖。
較佳地，適用於本發明的培養基具有一範圍落在3至7內的初始pH值。在本發明的一個較佳具體例中，該培養基具有一為5的初始pH值。
較佳地，該乳酸小球菌菌株是於一範圍落在25至37℃內的溫度下被進行培養。在本發明的一個較佳具體例中，該乳酸小球菌05B0111是於一為30℃的溫度下被進行培養。
本發明亦提供一種含有胞外多醣的乳酸小球菌培養物，它是藉由一如上所述的方法而被製得。
有關胞外多醣的分離與純化以及濃度測定可以採用熟習此項技藝者所熟知且慣用的技術來進行。例如，有關胞外多醣的分離與純化可以採用三氯乙酸(trichloroacetic acid)或乙醇(ethanol)來進行，而有關胞外多醣濃度的測定可以採用酚-硫酸法(phenol-sulfuric method)(P. Ruas-Madiedo and C. G. de los Reyes-(2005)，同上述)來進行。
自乳酸小球菌培養物中所分離與純化出的胞外多醣藉由與巨噬細胞(macrophages)的共-培養(co-culture)而被證實具有免疫調節活性(immunomodulating activity)，同時基於胞外多醣的其他已知的益生性質(probiotic properties)，依據本發明之含有胞外多醣的乳酸小球菌培養物被預期在製備用於免疫調節(immune modulation)、降低膽固醇以及抗腫瘤(antitumor)等之醫藥品上的應用。
於是，本發明提供一種藥學組成物(pharmaceutical composition)，其包含有一如上所述的乳酸小球菌培養物，以及選擇性地一藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable vehicle)。
依據本發明的藥學組成物可利用熟習此藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地、局部地或口服地投藥的劑型(dosage form)。
較佳地，該藥學組成物被製成一適於口服投藥(oral administration)的劑型，這包括，但不限於，溶液(solution)、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、糖漿(syrup)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)、濃漿(slurry)以及類似之物。
如本文中所用的，術語“藥學上可接受的載劑”意指一種當被投藥時不會在被投予的個體內造成一過敏性反應或其它非所欲之效用的載劑。依據本發明，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)以及類似之物。
此外，本發明亦預期該含有胞外多醣的乳酸小球菌培養物在製備用於免疫調節、降低膽固醇以及抗腫瘤等的保健食品與非處方醫藥品上的應用。
於是，本發明亦提供一種食品產品(food product)，其包含有一如上所述的乳酸小球菌培養物。該乳酸小球菌培養物可以被當作食品添加物(food additive)而藉由習知方法於原料製備時被添加，或是被配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
依據本發明，該食品產品的種類包括，但不限於：奶粉(milk powder)、飲料(beverages)、甜點(confectionery)、糖果(candies)、發酵食品(fermented foods)、動物飼料(animal feeds)、健康食品(health foods)、膳食補充品(dietary supplements)、果凍(jellys)、嬰兒配方(infant formulas)、沙拉醬(dressings)、蛋黃醬(mayonnaise)、塗醬(spreads)、鮮乳油(creams)、醬料(sauces)、布丁(puddings)、冰淇淋(ice-cream)、烘培產品(bakery products)、蕃茄醬(ketchup)以及芥末(mustard)。
 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 實驗材料： A、MRS肉湯培養基(MRS broth)：
在下面實施例中所使用的MRS肉湯培養基是商業上可購得的乳桿菌MRS肉湯培養基(Lactobacilli MRS broth)(DIFCO,Cat. No. 0881)，它含有2%葡萄糖(glucose)作為碳源(carbon source)。
B、MRS-醣類肉湯培養基(MRS-carbohydrate broth)：
在下面實施例中所使用的含有不同醣類的MRS肉湯培養基大體上是參照MRS肉湯培養基的組成來進行配製，不同之處在於：使用葡萄糖以外的醣類作為碳源，且該醣類的濃度為10%。以MRS-蔗糖肉湯培養基(MRS-sucrose broth)為例，它含有10%蔗糖來代替2%葡萄糖。
C、含有10%(v/v)蔗糖的飲料：
在下面實施例中所使用的飲料包括：柳丁原汁(pH=3.89)[購自於佳美食品工業股份有限公司(CHIA MEEI FOOD INDL. CORP.)]、全脂牛奶[購自於光泉牧場股份有限公司(Kuang Chuan Dairy Co.,Ltd.)]以及無糖豆奶[購自於義美食品股份有限公司(I-Mei Foods Co.,Ltd.)]。
首先，將適量的蔗糖溶解於ddH2 O中以配製具有一濃度為50%(v/v)的蔗糖原液(sucrose stock solution)，接著於121℃下進行滅菌歷時15分鐘，待冷卻後備用。將柳丁原汁置於90℃水浴下進行滅菌歷時1分鐘，另外，將全脂牛奶與無糖豆奶分別置於100℃水浴下進行滅菌歷時30分鐘。待這3種飲料冷卻至室溫後，取一部分的柳丁原汁(pH=3.89)並以氫氧化鈉(NaOH)來調整pH值，藉此而得到具有一為5.0之pH值的柳丁原汁。
之後，將適量的50%(v/v)蔗糖原液分別加入至經滅菌的柳丁原汁(pH=3.89以及5)、全脂牛奶以及無糖豆奶中，而得到含有10%蔗糖的柳丁原汁(pH=3.89以及5)、牛奶以及豆奶。
一般實驗方法： A、胞外多醣的分離與純化(Isolation and purification of exopolysaccharides)：
將一預定體積的測試樣品(test sample)與等體積的20%三氯乙酸(trichloroacetic acid)以一旋轉混合器(suspension mixer)予以混合均勻(200rpm，2小時)。接著，在3,000rpm下進行離心歷時20分鐘之後，收取上清液並加入2倍體積的95%酒精(4℃)，繼而置於4℃下過夜。之後，以3,000rpm來進行離心歷時20分鐘，倒除上清液，而沉澱物(precipitate)以1倍體積的ddH2 O予以回溶，接著加入2倍體積的95%酒精(4℃)，然後置於4℃下過夜。在3,000rpm下進行離心歷時20分鐘之後，倒除上清液，將沉澱物進行冷凍乾燥以得到呈膠狀(gelatinous)或薄膜狀(membranous)的胞外多醣(exopolysaccharide,EPS)備用。
B、胞外多醣濃度的測定(Determination of EPS concentration)：
將依據上面「A、胞外多醣的分離與純化」中所得到的胞外多醣溶於ddH2 O(其具有一與上述“預定體積”相同的體積)中以形成一胞外多醣溶液(EPS solution)。吸取1mL的胞外多醣溶液，接而依序地加入0.5mL的5%酚溶液(phenol solution)以及2.5mL的濃硫酸並予以混合均勻。將所形成的混合物置於室溫下進行反應歷時10分鐘，然後轉移到30℃水浴下作用歷時15分鐘。最後，以一ELISA讀取儀(ELISA reader)(SpectraMax M2,Molecular Devices)來測量該混合物在波長490nm下的吸光值(OD490 )。由此所測得的OD490 數值接而根據預先以具有不同已知濃度(0、20、40、80以及100mg/L)的胞外多醣標準品相對於它們自身的OD490 數值所作出的相關曲線(correlation curve)而被換算成濃度(mg/L)來表示。
實施例1.　具有胞外多醣-生產能力的乳酸菌分離株的篩選(Screening of lactic acid bacteria isolates having EPS-producing ability) A、試驗菌株的來源與分離：
申請人使用購自於傳統市場的數種發酵食品(包括酸菜、泡菜、豆腐乳、醃梅子以及醃漬食品等)作為樣品來源來進行乳酸菌分離株的分離。首先，將適量的樣品加入至MRS肉湯培養基中並於37℃下進行培養歷時1至3天。接著，將所形成的細菌培養物進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)而配製成具有不同稀釋倍數(101 ~107 -倍)後，分別取出0.2mL之經102 -、103 -、104 -、105 -、106 -以及107 -倍稀釋的菌液，並將之均勻塗佈於MRS瓊脂平板培養基(MRS agar plate)上，於37℃下靜置培養歷時72小時。然後，依據菌落形態以及鏡檢結果，申請人挑選出121株乳酸菌分離株並分別予以純化數次。接著，該等經純化的乳酸菌分離株分別被混合以等體積的20%甘油，繼而予以置入冷凍管(frozen vial)中並冷凍保存於-80℃下備用。
B、製備乳酸菌分離株的接種源(Preparation of the inoculum of lactic acid bacteria isolates)：
將依據上面「A、試驗菌株的來源與分離」中所得到的乳酸菌分離株以一為1%(v/v)的接種量接種至5mL MRS肉湯培養基中，並於37℃下進行培養歷時18小時。此培養步驟被重複2次，俾以活化菌株。所形成的培養物被使用作為下面實施例中的乳酸菌分離株的接種源。
C、初步篩選具有胞外多醣-生產能力的乳酸菌分離株：
將依據上面「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所得到的121株乳酸菌分離株的接種源分別以一為1%(v/v)的接種量接種至EPS選擇培養基(EPS selection medium,ESM)中，並於37℃下進行培養歷時72小時。之後，將適量之所形成的培養物吸取至黏度計(BROOKFIELD,model DV-I+viscometer,USA)上來進行黏度(centipoise,cp)的測定。
另外，將適量之依據上面「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所得到的121株乳酸菌分離株的接種源分別以四區劃線法(four-quadrant streak method)的方式塗佈至MRS-蔗糖瓊脂平板培養基(MRS-sucrose agar plate)上，並於37℃下進行培養歷時5天。之後，以肉眼來觀察菌落外觀，繼而使用牙籤的尖端沾取菌落並將之往上拉提，俾以評估是否會產生拉絲(ropy strand)現象。
當乳酸菌分離株有符合下面2項條件中的至少一者時，即被判斷為具有胞外多醣-生產能力的菌株：
(1)黏度達150cp以上；以及
(2)在菌落周圍被觀察到有黏液(slime)，或者以牙籤的尖端沾取菌落並將之往上拉提時被觀察到有拉絲現象。
依據上面所示的條件，並同時考量樣品來源以及開發成為食品產品的合適性等因素後，申請人由121株乳酸菌分離株中初步篩選出26株潛力菌株並將它們拿來進行下面的16S rDNA序列分析以確認它們分別所屬的菌種。
D、16S rDNA序列分析(16S rDNA sequence analysis)：
將依據上面「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所得到的26株乳酸菌分離株的接種源分別添加至MRS瓊脂平板培養基上並以一L型玻棒予以塗佈均勻，繼而於37℃下進行培養歷時24小時。之後，從MRS瓊脂平板培養基上刮取少量的新鮮菌體置於1.5mL微量離心管中，並使用血液&組織基因組DNA萃取Miniprep系統(Blood & Tissue Genomic DNA Extraction Miniprep System)(Viogene,U.S.A.)來進行基因組DNA(genomic DNA)的萃取。由此所得到的基因組DNA被溶於適量的ddH2 O中，藉此而形成26個分別含有該等潛力菌株之基因組DNA的樣品。
以所得到的基因組DNA作為模版(template)，並且在一GeneAmpPCR系統9700(GeneAmpPCR system 9700)(Applied Biosystem)中使用MicroSeq完整基因16S rDNA細菌鑑定PCR套組(MicroSeqFull Gene 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit)(Applied Biosystem)來進行16S rDNA的聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)。於完成PCR之後，藉由1%的瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來確認是否有得到一大小約為500bps的PCR擴增產物。接著，使用PCR清除-M系統(PCR Clean up-M System)(Viogene)從凝膠中回收並純化出該經確認的PCR擴增產物。
經純化的PCR擴增產物是在該GeneAmpPCR系統9700中使用MicroSeq完整基因16S rDNA細菌鑑定定序套組(MicroSeqFull Gene 16S rDNA Bacterial Identification Sequencing Kit)(Applied Biosystem)來進行循環定序(cycle sequencing)，而所得到的循環定序產物(cycle sequencing product)繼而以PerformaTM DTR凝膠過濾系統凝膠過濾匣盒(PerformaTM DTR Gel Filtration Systems Gel Filtration Cartridges)(Edge BioSystems)來予以純化。經純化的循環定序產物接而使用一3730 DNA分析儀(3730 DNA Analyzer)(Applied Biosystems)來進行定序，而所得到的定序結果是使用MicroSeqID分析軟體(MicroSeqIDAnalysis Software)(v. 1.40,Applied Biosystems)來與NCBI網站上的資料庫進行比對分析，所得到的比對分析結果被顯示於下面的表1。
依據表1所示的16S rDNA序列比對分析結果，有13株分離株為乳桿菌屬物種，9株為小球菌屬物種，2株為類腸膜魏斯氏菌，1株為鏈球菌屬物種，以及1株為糞腸球菌。特別地，申請人注意到，在隸屬於小球菌屬的9株分離株中有5株(編號分別為05B0111、05B0164、05B0167、05B0168以及05B034-2)為乳酸小球菌。就申請人所知，迄今不曾有任何文獻曾經揭示乳酸小球菌具有胞外多醣-生產能力。
為了進一步篩選出具有高胞外多醣-生產能力的菌株以供用於在產業上大規模生產胞外多醣，申請人將這26株乳酸菌分離株拿來進行下面的實驗。
E、篩選具有高胞外多醣-生產能力的乳酸菌分離株：
將依據上面「C、初步篩選具有胞外多醣-生產能力的乳酸菌分離株」中所篩選出的26株乳酸菌分離株的接種源分別以一為1%(v/v)的接種量接種至15mL的MRS-蔗糖肉湯培養基(MRS-sucrose broth)中，並於37℃下進行培養歷時72小時。所形成的培養物分別依照上面「一般實驗方法」的「A、胞外多醣的分離與純化」以及「B、胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離純化與濃度測定。
由實驗結果發現，在上面「D、16S rDNA序列分析」中被初步鑑定為乳酸小球菌的5株分離株中，編號為05B0111、05B0164、05B0167、05B0168以及05B034-2的乳酸小球菌的培養物所測得的胞外多醣濃度分別為845、11.34、29.51、17.99以及17.74mg/L。另外，在其餘的21株乳酸菌分離株中，有4株乳酸菌分離株的培養物所測得的胞外多醣濃度是落在60至110mg/L之間，而其餘分離株的培養物所測得的胞外多醣濃度則是落在50mg/L以下，但最低濃度仍有2.89mg/L。根據本實驗結果，申請人認為乳酸小球菌05B0111是最具開發潛力的菌株，並將它拿來進行下面的種系新穎性(phylogenetic novelty)評估。
實施例2.　乳酸小球菌05B0111的種系新穎性的評估(Assessment of phylogenetic novelty o f Pediococcus acidilactici 05B0111)
為了確認在實施例1中所篩選出的乳酸小球菌05B0111在種系上是不同於所屬物種中已公開的菌株，乳酸小球菌05B0111被拿來進行下面的初步試驗、16S rDNA序列分析、生理與生化試驗(physiological and biochemical tests)以及DNA-DNA雜交分析(DNA-DNA hybridization analysis)。
實驗材料與方法： A、初步試驗：
對乳酸小球菌05B0111進行初步試驗，試驗項目包括：革蘭氏染色(Gram stain)、形態觀察(morphological observation)、運動性(motility)、觸酶(catalase)與氧化酶(oxidase)反應、在好氧(aerobic)與厭氧(anaerobic)條件下的生長情形，以及是否會形成內生孢子(endospore)等。
依據初步試驗結果，乳酸小球菌05B0111為革蘭氏陽性球菌，不具運動性，不具觸酶或氧化酶的活性，在好氧與厭氧條件下均可生長，不會形成內生孢子。
B、16S rDNA序列分析：
依照實施例1的「D、16S rDNA序列分析」當中所述的方法來進行乳酸小球菌05B0111的16S rDNA序列分析。所得到的全長16S rDNA序列分析結果被顯示於圖1中，而將所得到的序列以MicroSeqID分析軟體來與NCBI網站上的資料庫進行比對分析，比對分析結果顯示：乳酸小球菌05B0111的全長16S rDNA序列(序列辨識編號：1)與乳酸小球菌[Genbank寄存編號(accession number)AJ249535]、Pediococcus stilesii (Genbank寄存編號AJ973157)以及Pediococcus claussenii (Genbank寄存編號AF404716)的16S rDNA之序列相似度(sequence similarity)均可達97%以上。
C、生理與生化試驗：
在本實驗中，申請人針對乳酸小球菌05B0111的溫度耐受性(temperature tolerance)、pH耐受性(pH tolerance)、NaCl耐受性(NaCl tolerance)以及醣類發酵型態(carbohydrate fermentation profile)來進行分析。
有關溫度耐受性、pH耐受性以及NaCl耐受性試驗的操作步驟是參照Charles M. A. P. Franzet al. (2006),International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology ,56:329-333當中所述的方法並稍作修改後來進行。簡言之，將適量的於實施例1的「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所製備出的乳酸小球菌05B0111的接種源添加至MRS瓊脂平板培養基上並以一支L型玻棒予以塗佈均勻，繼而於37℃下進行培養歷時5天。之後，觀察乳酸小球菌05B0111在MRS瓊脂平板培養基上的生長情形。
有關醣類發酵型態的分析是使用API 50 CHL鑑定系統(API 50 CHL identification system)()並參照廠商所提供的操作指引來進行，所試驗的醣類包括：阿拉伯糖(arabinose)、半乳糖(galactose)、乳糖(lactose)、麥芽糖(maltose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、甘油(glycerol)、葡萄糖酸鉀(potassium gluconate)、2-酮葡萄糖酸鉀(potassium 2-keto gluconate)以及海藻糖(trehalose)。
另外，在參考上面「B、16S rDNA序列分析」的實驗結果之後，申請人使用購自於財團法人食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)的3株小球菌屬標準菌株(Pediococcus type strains)作為比較菌株來進行比對分析，它們分別為：
(1)乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )BCRC 17599T ，對應於DSM 20284T ，分離來源為大麥(barley)；
(2)Pediococcus claussenii BCRC 17600T ，對應於DSM 14800T 、ATCC BAA-344T 以及KCTC 3811T ，分離來源為腐敗的啤酒(spoiled beer)；以及
(3)Pediococcus stilesii BCRC 17601T ，對應於DSM 18001T 、CCUG 51290T 以及LMG 23082T ，分離來源為白玉米顆粒(white maize grains)。
本發明的乳酸小球菌05B0111以及3株小球菌屬標準菌株的溫度耐受性、pH耐受性、NaC1耐受性以及醣類發酵型態試驗結果被歸納在下面的表2中。
依據表2所示的生理與生化試驗結果，申請人認為乳酸小球菌05B0111的生理與生化特性符合小球菌屬(Pediococcus )所具者，並且與乳酸小球菌BCRC 17599T 、Pediococcus claussenii BCRC 17600T 以及Pediococcus stilesii BCRC 17601T 的特性相似。
D、DNA-DNA雜交分析：
為了進一步確認乳酸小球菌05B0111的所屬物種，申請人依照上面「B、16S rDNA序列分析」當中所述的方法來分別製備出乳酸小球菌05B0111、乳酸小球菌BCRC 17599T 、Pediococcus claussenii BCRC 17600T 以及Pediococcus stilesii BCRC 17601T 的基因組DNA樣品，並且參照TAKAYUKI EZAKIet al. (1989),INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY ,39:224-229當中所述的方法來進行DNA-DNA雜交分析。首先，將各個基因組DNA樣品進行加熱-變性(heat-denaturing)，繼而分別以磷酸鹽緩衝的生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)(含有0.1M MgCl2 )予以配製成具有一濃度為20μg/mL的DNA溶液，其中乳酸小球菌05B0111的DNA溶液被使用作為05B0111組，而乳酸小球菌BCRC 17599T 、Pediococcus claussenii BCRC 17600T 以及Pediococcus stilesii BCRC 17601T 的DNA溶液被使用作為標準菌株組(type strains)。另外，胎牛胸腺(calf thymus)的DNA溶液(Merck,Cat. No. 2618)被使用作為負對照組(negative control)。將各組的DNA溶液分別取100μL並加入至一個96-井的培養盤(96-well plate)的各井中，繼而在37℃下進行培育歷時1小時。之後，移除各井中的DNA溶液並以PBS(含有0.1M MgCl2 )予以清洗，繼而於60℃下乾燥過夜。
另一方面，將5μL的光生物素(photobiotin)與5μL之經加熱-變性的(heat-denatured)乳酸小球菌05B0111的基因組DNA樣品(1μg/μL，配於蒸餾水中)加入至一微量離心管中並予以混合均勻。在以太陽燈(sunlamp,500W)予以照射歷時15分鐘之後，藉由2-丁醇萃取(2-butanol extraction)來移除游離的光生物素(free photobiotin)，俾以得到含有經生物素化的DNA(biotinylated DNA)備用。
取出經乾燥過夜的96-井的培養盤，繼而將200μL的預雜交溶液(prehybridization solution)[含有2X SSC、5X登哈特溶液(Denhardt solution)、經變性的鮭魚精子DNA(denatured salmon sperm DNA)(200μg/mL)以及50%甲醯胺(formamide)]加入至已被覆(coated)有DNA溶液的各井中，並於37℃下培育歷時1小時。之後，移除各井中的液體，繼而將100μL的雜交溶液(hybridization solution)[含有2X SSC、5X登哈特溶液、3%硫酸聚葡萄醣(dextran su1fate)、50%甲醯胺、經變性的鮭魚DNA(denatured salmon DNA)(50μg/mL)以及50ng經生物素化的DNA]加入至各井中，並於42℃下進行雜交反應歷時1小時。之後，移除各井中的液體並以300μL的2X SSC緩衝液予以洗滌4次，繼而加入100μL的鏈黴抗生物素蛋白-β-D-半乳糖苷酶溶液(streptavidin-beta-D-galactosidase solution)[10ng/mL，配於PBS(含有0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin)以及0.1% Triton X-100)中]並於37℃下進行反應歷時30分鐘。
之後，移除各井中的液體並以PBS(含有0.1% Triton X-100)予以洗滌2次，繼而對各井加入100μL的4-甲基繖形基-β-D-乳糖哌喃糖苷(4-methylumbelliferyl-beta-D-galactopyranoside)(3×10-4 M，配於PBS中)並於37℃下進行反應歷時10分鐘。最後，使用一Fluoroskan II培養盤螢光計(Fluoroskan II microplate fluorometer)(Labsystems)並於一為360nm的激發波長(excitation wavelength)與一為450nm的放射波長(emission wavelength)下來測量各井的螢光強度(fluorescence intensity)。
乳酸小球菌05B0111與乳酸小球菌BCRC 17599T 、Pediococcus claussenii BCRC 17600T 以及Pediococcus stilesii BCRC 17601T 的DNA親源數值(DNA relatedness value)是藉由將上面所測得的螢光強度代入下列公式而被計算出：
DNA親源數值(%)=[(A-C)/(B-C)]×100
其中：A=標準菌株組的螢光強度
B=05B0111組的螢光強度
C=負對照組的螢光強度
實驗結果發現，乳酸小球菌05B0111的基因組DNA與乳酸小球菌BCRC 17599T 、Pediococcus claussenii BCRC 17600T 以及Pediococcus stilesii BCRC 17601T 的基因組DNA的DNA親源數值分別為75.5%、21.1%以及4.9%。依據本實驗結果，申請人確認本發明的乳酸小球菌05B0111為乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )。
綜合以上的各項分析結果，同時參考Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology(Holtet al .(1994),Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology ,9th edition,Williams ＆ Wilkins)以及Franzet al .(2006),International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology ,56:329-333等微生物學相關文獻，申請人認為：本發明的乳酸小球菌05B0111是一株新穎的乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )分離株。
本發明的乳酸小球菌05B0111已於西元2009年02月10日以寄存編號BCRC 910420被寄存於財團法人食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。這個分離株亦有依據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)的規定，於西元2009年03月05日以寄存編號DSM 22345被寄存於德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ)。
實施例3.乳酸小球菌05B0111的耐酸性以及膽鹽耐受性試驗
本發明的乳酸小球菌05B0111被拿來進行下面的實驗，俾以確認該菌株在攝食之後是否能夠通過消化道的嚴苛條件而存活下來。
實驗方法： A、耐酸性試驗(Acid tolerance test)：
將適量的於實施例1的「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所得到之乳酸小球菌05B0111的接種源接種至10mL MRS肉湯培養基中，並於37℃下進行培養歷時24小時，繼而以3,000rpm離心歷時10分鐘。之後，移除上清液並加入1mL的PBS以充份散浮菌體，藉此而得到一懸浮液。接著，將0.5mL懸浮液分別接種至pH值為2與7.2的PBS(體積皆為10mL)中並予以充分混合，然後將所形成的混合物置於37℃下靜置培養歷時2小時。之後，取出1mL的培養物並以PBS來進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，繼而進行塗盤以檢測存活的菌數。
B、膽鹽耐受性試驗(Bile salt tolerance test)：
將於實施例1的「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所得到之乳酸小球菌05B0111的接種源以一為2%(v/v)的接種量分別接種至10mL MRS肉湯培養基與10mL之含有0.3%(v/v)牛膽汁(ox gall)(DIFCO)的MRS肉湯培養基中並予以充份混合，然後將所形成的混合物置於37℃下靜置培養歷時24小時。之後，取出1mL的培養物並以PBS來進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，繼而進行塗盤以檢測存活的菌數。
結果：
當以pH值為2與7.2的PBS來培養本發明的乳酸小球菌05B0111歷時2小時之後，所測得的存活菌數分別為9.05 log CFU/mL與9.40 log CFU/mL。此外，當以不含有牛膽汁與含有0.3%(v/v)牛膽汁的MRS肉湯培養基來培養本發明的乳酸小球菌05B0111歷時24小時之後，所測得的存活菌數分別為9.07 log CFU/mL與8.40 log CFU/mL。這個實驗結果顯示：本發明的乳酸小球菌05B0111具有耐酸性與膽鹽耐受性，因此，在攝食之後能夠克服人類消化道的環境壓力，而可以有效到達腸道內。
實施例4.不同的培養條件對於乳酸小球菌05B0111的胞外多醣-生產能力之影響 A、醣類對於乳酸小球菌05B0111在胞外多醣-生產能力上的影響：
本實驗是探討使用12種不同的醣類[包括乳糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖、糖蜜(molasses)、半乳糖、木糖、木糖醇(xylitol)、菊糖(inulin)、山梨糖醇(sorbitol)、海藻糖(trehalose)以及蔗糖]作為碳源對於乳酸小球菌05B0111的胞外多醣-生產能力的影響。
將於實施例1的「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所得到之乳酸小球菌05B0111的接種源以一為1%(v/v)的接種量分別接種至12種MRS-醣類肉湯培養基(15mL)中，並於37℃下進行培養歷時72小時。之後，所形成的培養物依照上面「一般實驗方法」的「A、胞外多醣的分離與純化」以及「B、胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離純化與濃度測定。所得到的實驗結果被顯示於圖2中。
從圖2可見，乳酸小球菌05B0111的胞外多醣-生產能力會隨著所使用的碳源種類而有不同，特別地，相較於其他的醣類，使用蔗糖作為碳源可以得到較高的胞外多醣產量(大約為850mg/L)。這個實驗結果顯示：當本發明的乳酸小球菌05B0111以蔗糖作為生長所需的碳源與能量來源時，可以生成大量的胞外多醣。
B、溫度對於乳酸小球菌05B0111在胞外多醣-生產能力上的影響：
本實驗是探討在使用蔗糖作為碳源的培養條件下，不同的培養溫度對於乳酸小球菌05B0111的胞外多醣-生產能力的影響。
將於實施例1的「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所得到之乳酸小球菌05B0111的接種源以一為4%(v/v)的接種量接種至含有10%蔗糖的柳丁原汁(5L)中，接著分別於30以及37℃下靜置培養。之後，在培養的第8與第72小時之時，分別收取一部分的培養物並依照上面「一般實驗方法」的「A、胞外多醣的分離與純化」以及「B、胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離純化與濃度測定。所得到的實驗結果被顯示於圖3中。
從圖3可見，無論是在培養的第8或者第72小時之時，於一為30℃的培養溫度下所測得的胞外多醣濃度均高於在一為37℃的培養溫度下所測得者。這個實驗結果顯示：當本發明的乳酸小球菌05B0111利用蔗糖作為碳源並於一為30℃的溫度下進行培養時會具有較佳的胞外多醣-生產能力。
C、初始pH值(initial pH)對於乳酸小球菌05B0111在胞外多醣-生產能力上的影響：
本實驗是探討使用蔗糖作為碳源並且在一為30℃的溫度下進行培養時，不同的初始pH值對於乳酸小球菌05B0111的胞外多醣-生產能力的影響。
將於實施例1的「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所得到之乳酸小球菌05B0111的接種源以一為4%(v/v)的接種量分別接種至初始pH值為3.89與5.0之含有10%蔗糖的柳丁原汁(80mL)中，然後於30℃下靜置培養歷時72小時。之後，所形成的培養物依照上面「一般實驗方法」的「A、胞外多醣的分離與純化」以及「B、胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離純化與濃度測定。
實驗結果發現，在具有一初始pH值為3.89的培養條件下所測得的胞外多醣濃度為677.33mg/L，而在具有一初始pH值為5.0的培養條件下所測得的胞外多醣濃度為1154mg/L。這個實驗結果顯示：當本發明的乳酸小球菌05B0111利用蔗糖作為碳源，並且在一為30℃的溫度下以及一為5.0的初始pH值下進行培養時會具有較佳的胞外多醣-生產能力。
實施例5.乳酸小球菌05B0111在不同飲料中的胞外多醣-生產能力的評估
為瞭解在含有10%(v/v)蔗糖的飲料中的胞外多醣濃度是否會因為本發明的乳酸小球菌05B0111的添加而有所差異，首先，分別取出適量之各個含有10%(v/v)蔗糖的柳丁原汁、牛奶以及豆奶並依照上面「一般實驗方法」的「A、胞外多醣的分離與純化」以及「B、胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離純化與濃度測定。
之後，將於實施例1的「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所得到之乳酸小球菌05B0111的接種源分別以一為4%、2%以及2%(v/v)的接種量接種至含有10%蔗糖的柳丁原汁(5L)、牛奶(30mL)以及豆奶(50mL)中，然後將接種有本案菌株的柳丁原汁置於30℃下，而將接種有本案菌株的牛奶與豆奶置於37℃下，分別予以培養歷時72小時。之後，所形成的培養物依照上面「一般實驗方法」的「A、胞外多醣的分離與純化」以及「B、胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離純化與濃度測定。
由實驗結果發現，在本發明的乳酸小球菌05B0111的接種之前，含有10%蔗糖的柳丁原汁、牛奶以及豆奶的胞外多醣濃度分別為452、10以及157mg/L，而當它們分別被接種以本發明的乳酸小球菌05B0111並經過72小時的培養之後，所形成之培養物的胞外多醣濃度分別為677、655以及1128mg/L。這個實驗結果顯示：本發明的乳酸小球菌05B0111在不同來源的飲料中均具有胞外多醣-生產能力，因而被預期可供用於各種食品產業中。
實施例6.乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣刺激小鼠巨噬細胞(macrophages)分泌前發炎性細胞激素(proinflammatory cytokines)以及一氧化氮(nitric oxide,NO)能力的評估
在本實施例中，本發明的乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣被拿來與小鼠巨噬細胞(macrophage)進行培養，並且選用介白素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、單核球趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α)以及IL-12p70來作為評估前發炎性細胞激素(proinflammatory cytokines)的表現量之指標，同時，亦選用亞硝酸鹽來作為評估一氧化氮(NO)的表現量之指標。
實驗材料與方法： A、巨噬細胞的來源與培養：
首先，將13.4g的DMEM粉末(HyClone)以及1.5g的碳酸氫鈉(sodium bicarbonate,NaHCO3 )分別加入至600mL以及300mL的ddH2 O中，待充分溶解後，將兩者混合均勻並以1N的HCl將pH值調整至7.2~7.4而得到杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)。之後，加入10%之加熱去活化(heat inactivation)的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)以及2%的麩醯胺酸(glutamine)，繼而以一孔徑為0.22μm的過濾膜(Millipore)予以過濾後儲存於4℃下備用。
在本實施例中是使用小鼠BALB/c巨噬細胞RAW 264.7(mouse BALB/c macrophage RAW 264.7)[它是購自於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心，寄存編號(accession number)為BCRC 60001]來進行實驗。首先，將RAW 264.7細胞培養於含有DMEM[含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、4mM的麩醯胺酸(glutamine)以及1.5g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate,NaHCO3 )，pH=7.2~7.4]的10cm培養皿(petri dish)中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO2 的培養箱中進行培養。
當培養皿底部的面積有80至90%被RAW 264.7細胞所覆蓋且在顯微鏡下所觀察到的細胞生長形態為正常時，移除培養皿中的培養基，繼而加入3mL的新鮮DMEM並以量吸管(pipette)吸取培養皿中的新鮮DMEM來反覆地沖提培養皿底部的細胞，藉此而使得細胞自培養皿的底部脫離而形成一懸浮液。然後，將適量的懸浮液加入至含有10mL DMEM的新培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5%CO2 的培養箱中進行培養。
B、製備胞外多醣試驗溶液：
將於實施例1的「E、篩選具有高胞外多醣-生產能力的乳酸菌分離株」中所得到之乳酸小球菌05B0111的胞外多醣溶液(845mg/L)使用無菌水予以稀釋成具有最終濃度分別為845、422.5、169以及84.5mg/L的胞外多醣試驗溶液，繼而以一孔徑為0.22μm的過濾膜予以過濾後備用。
C、乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣刺激RAW264.7細胞分泌前發炎性細胞激素能力的評估：
在進行實驗之前，收取依據上面「A、巨噬細胞的來源與培養」來進行繼代培養的RAW 264.7細胞並且以DMEM來調整細胞濃度，藉此而得到一具有一細胞濃度為8×105 細胞/mL的細胞懸浮液。將100μL的RAW 264.7細胞懸浮液加入至96-井培養盤的各井內，接著，以1,000rpm來進行離心歷時5分鐘。之後，將96-井的培養盤置於培養箱(37℃、5% CO2 )中進行培養歷時1至2小時，俾以使得RAW 264.7細胞貼附於各井的底部。接著，將RAW 264.7細胞分成7組，其中包括4個實驗組、2個對照組以及1個空白組，並分別予以加入：(1)實驗組1、2、3以及4，20μL的最終濃度分別為84.5、169、422.5以及845mg/L的胞外多醣試驗溶液；(2)正對照組(positive control)，20μL的脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)(10μg/mL)；(3)負對照組(negative control)，20μL的DMEM；以及(4)空白組，20μL的無菌水。
在培養箱(37℃、5% CO2 )中進行培養歷時24小時之後，收取各井中的液體來分別進行使用小鼠TNF-α/TNFSF1A(mouse TNF-α/TNFSF1A,R&D Systems,Cat. No. DY410)的酵素結合免疫吸附分析(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)。另外，取一部分的實驗組4以及空白組的細胞培養物來分別進行使用小鼠發炎套組(Mouse Inflammation Kit)(BD,Cat. No. 552364)的流式微球陣列(Cytometric Bead Array)分析。
D、乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣刺激RAW264.7細胞分泌NO能力的評估：
將依據上面「A、巨噬細胞的來源與培養」來進行繼代培養的RAW 264.7細胞接種至96-井培養盤的各井(1×105 細胞/井)內，並且在37℃下培養過夜。之後，分成3組(包括1%、5%以及10%胞外多醣組)來分別加入100μL的測試溶液，其中測試溶液含有100ng/mL的脂多醣、1ng/mL的IFN-γ以及不同濃度[亦即，1%、5%以及10%(v/v)]的胞外多醣試驗溶液，繼而在37℃下進行培養歷時24小時。另外，添加有脂多醣以及IFN-γ的RAW 264.7細胞被用來作為正對照組並進行相同的實驗。
之後，自各井中收取50μL的液體並將之分別加入至一個新的96-井培養盤的各井中以供進行下面的一氧化氮分析(nitric oxide assay,NO assay)。將50μL的胺苯磺醯胺(sulfanilamide)(60mM)以及50μL的N-1-萘基乙二胺(N-1-naphthylethylenediamine)(4mM)加入至96-井培養盤的各井內，並予以震盪歷時5分鐘。接著，以ELISA讀取儀來讀取各井在波長540nm下的吸光值(OD540 )。將所獲得的OD540 數值分別根據預先以具有不同已知濃度的亞硝酸鈉(NaNO2 )相對於它們自身的OD540 數值所作出的相關曲線而被換算成亞硝酸鹽濃度。將正對照組所測得的亞硝酸鹽濃度當作100%，其他各組相對於正對照組的亞硝酸鹽濃度百分比被計算出。
結果：
有關ELISA的結果，4個實驗組在波長450nm下所測得的吸光值(OD450 )分別根據預先以具有不同已知濃度的TNF-α標準品相對於它們自身的OD450 數值所作出的相關曲線而被換算成濃度(mg/L)，所得到的結果被顯示於圖4中。從圖4可見，當RAW 264.7細胞分別與不同濃度的胞外多醣試驗溶液進行共培養(co-culture)時，RAW 264.7細胞的TNF-α分泌量會隨著胞外多醣濃度的增加而上升。這個實驗結果顯示：乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣可以促進RAW 264.7細胞分泌TNF-α，表示乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣有助於活化巨噬細胞。
有關流式微球陣列分析的結果，就空白組而言，當RAW 264.7細胞與無菌水進行共培養歷時24小時之後，所測得的IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF以及IL-12p70的濃度分別為0、0、113、0、1362以及0pg/mL。就實驗組4而言，將RAW 264.7細胞與具有一濃度為845mg/L的胞外多醣試驗溶液進行共培養歷時24小時之後，所測得的IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF以及IL-12p70的濃度分別為7、68、215、26、2473以及4.92pg/mL。這個實驗結果顯示：本發明乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣可以刺激RAW 264.7細胞分泌TNF，但是對於刺激RAW 264.7細胞分泌IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ以及IL-12p7這5種前發炎性細胞激素則不具有明顯的效用。
有關一氧化氮分析的結果，當RAW 264.7細胞分別與1%、5%以及10%的胞外多醣試驗溶液進行共培養歷時24小時之後，各組所測得的亞硝酸鹽濃度百分比都有降低的情形，並且降低的程度會隨著胞外多醣濃度的增加而趨於明顯，特別地，10%胞外多醣組的亞硝酸鹽濃度被降低至約為正對照組濃度的69%。這個實驗結果顯示：乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣可以抑制RAW 264.7細胞分泌NO，以減緩發炎反應的發生。
已知TNF-α可作為判斷巨噬細胞是否被活化的指標之一，而前發炎性細胞激素以及NO可作為判斷發炎反應的指標。因此，依據上述的實驗結果，申請人認為：本發明乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣可以活化巨噬細胞，但是不會刺激巨噬細胞引起發炎反應，因而具有調節免疫活性的效用。
實施例7.在使用不同醣類作為碳源的培養條件下，乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣刺激小鼠巨噬細胞分泌TNF-α能力的評估 實驗材料與方法：
將於實施例1的「B、製備乳酸菌分離株的接種源」中所得到之乳酸小球菌05B0111的接種源以一為1%(v/v)的接種量分別接種至15mL的MRS肉湯培養基(葡萄糖組，含有10%葡萄糖)、MRS-蔗糖肉湯培養基(蔗糖組)以及MRS-麥芽糖肉湯培養基(麥芽糖組)中，並於37℃下進行培養歷時72小時。之後，所形成的培養物依照上面「一般實驗方法」的「A、胞外多醣的分離與純化」以及「B、胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離純化與濃度測定。接著，將經純化的胞外多醣溶於ddH2 O中並使用無菌水進行2倍、5倍以及10倍稀釋，藉此而得到具有不同濃度的胞外多醣試驗溶液。所得到的具有不同濃度的胞外多醣試驗溶液大體上是參照實施例6的「實驗材料與方法」的「C、乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣刺激RAW264.7細胞分泌前發炎性細胞激素能力的評估」當中所述的方法來測定RAW 264.7細胞的TNF-α分泌量，而與無菌水進行共培養的RAW 264.7細胞被用來作為空白組。所得到的實驗結果被顯示於下面的表3。
結果：
從表3可見，無論是以葡萄糖、蔗糖或者麥芽糖作為碳源，乳酸小球菌05B0111所生產的胞外多醣皆會刺激RAW 264.7細胞分泌TNF-α，並且TNF-α分泌量會隨著胞外多醣濃度的增加而上升。此外，相較於空白組，葡萄糖組、蔗糖組以及麥芽糖組的胞外多醣在不同的濃度下對於刺激RAW 264.7細胞分泌TNF-α的能力是不同的。申請人推論：乳酸小球菌05B0111可能會因為所使用的碳源種類之不同而導致所生成的胞外多醣在分子量、結構以及分支程度(degree of branching)上的差異，進而影響胞外多醣在刺激巨噬細胞分泌TNF-α上的效用。
於本案說明書中被引述之所有文獻資料以及專利文件以它們的整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案的詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，顯著地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
圖1顯示本發明的乳酸小球菌05B0111的全長16S rDNA核苷酸序列；
圖2顯示不同醣類對於本發明的乳酸小球菌05B0111在胞外多醣-生產能力上的影響；
圖3顯示將接種有本發明的乳酸小球菌05B0111之含有10%蔗糖的柳丁原汁分別置於30以及37℃下進行培養，在培養的第8小時以及第72小時之時所分別測得的胞外多醣濃度；以及
圖4顯示小鼠BALB/c巨噬細胞RAW 264.7在分別與不同濃度的胞外多醣試驗溶液進行共培養後所測得的TNF-α分泌量。
<110> 財團法人食品工業發展研究所
<120> 生產胞外多醣的方法以及一新穎的乳酸小球菌分離株
<130> 乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )05B0111
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 513
<212> DNA
<213> 乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )05B0111
<400> 1

Claims (13)

  1. 一種乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )05B0111，其寄存編號為BCRC 910420。
  2. 一種用於生產胞外多醣的方法，其包括：將一如申請專利範圍第1項的乳酸小球菌05B0111培養於一適於該菌株生長的培養基中。
  3. 如申請專利範圍第2項的方法，其中該培養基是選自於由下列所構成的群組：一合成培養基以及一可食性材料。
  4. 如申請專利範圍第3項的方法，其中該可食性材料是選自於由下列所構成的群組：流體乳品、濃縮牛奶、奶粉、果汁、豆奶、蔬果汁、健康食品、動物飼料、農產品、畜產品、水產品以及機能性素材。
  5. 如申請專利範圍第3項的方法，其中該培養基包含有一選自於下列群組中的碳源：乳糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖、糖蜜、半乳糖、木糖、木糖醇、菊糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖，以及它們的組合。
  6. 如申請專利範圍第5項的方法，其中該培養基包含有蔗糖。
  7. 如申請專利範圍第2項的方法，其中該培養基具有一範圍落在3至7內的初始pH值。
  8. 如申請專利範圍第7項的方法，其中該培養基具有一為5的初始pH值。
  9. 如申請專利範圍第2項的方法，其中該乳酸小球菌 05B0111是於一範圍落在25至37℃內的溫度下被進行培養。
  10. 如申請專利範圍第9項的方法，其中該乳酸小球菌05B0111是於一為30℃的溫度下被進行培養。
  11. 一種含有胞外多醣的乳酸小球菌培養物，它是藉由一如申請專利範圍第2至10項中任一項的方法而被製得。
  12. 一種藥學組成物，其包含有一如申請專利範圍第11項的乳酸小球菌培養物，以及選擇性地一藥學上可接受的載劑。
  13. 一種食品產品，其包含有一如申請專利範圍第11項的乳酸小球菌培養物。
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