KR100814665B1

KR100814665B1 - 덱스트란을 생산하는 루코노스톡 시트리움 ｓ5 균주 및이를 이용한 덱스트란 함유 발효물의 제조방법

Info

Publication number: KR100814665B1
Application number: KR1020060124797A
Authority: KR
Inventors: 손민정; 이삼빈
Original assignee: 계명대학교 산학협력단; 재단법인 대구테크노파크; 조재곤
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2008-03-26

Abstract

본 발명은 덱스트란을 생산하는 신균주 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)를 전통 발효식품인 동치미로부터 분리 및 동정하고, 이를 설탕을 함유한 기본배지에 접종하여 높은 점성을 갖는 덱스트란 발효물을 제조하는 방법을 제공하여 이를 점질물의 소재, 식품소재, 음료 및 건강 기능식품의 소재로 활용할 수 있는 유용한 발명이다.

루코노스톡 시트리움 S5 균주(Leuconostoc citreum S5), 젖산균, 덱스트란, 점성, 점조도

Description

덱스트란을 생산하는 루코노스톡 시트리움 Ｓ5 균주 및 이를 이용한 덱스트란 함유 발효물의 제조방법{Leuconostoc citreum S5 producing dextran and production of fermentation product comprising the dextran}

도 1은 본 발명에 의한 균주의 분리 · 동정 및 젖산 발효를 통한 덱스트란 생산 과정을 보여주는 흐름도.

도 2는 본 발명에 의한 루코노스톡 시트리움 S5 균주의 전자현미경사진(도 2a)과, 공시균주의 주사전자현미경사진(도2b).

도 3은 본 발명에 의한 균주를 이용한 덱스트란 생산에 있어서, 온도 조건에 따른 덱스트란의 점조도 변화를 보여주는 그래프.

도 4는 본 발명에 의한 균주를 이용한 덱스트란 생산에 있어서, pH에 따른 덱스트란의 점조도 차이를 보여주는 그래프.

도 5는 본 발명에 의한 루코노스톡 시트리움 S5 균주의 탄소원 이용성을 알아본 그래프.

도 6은 본 발명에 의한 루코노스톡 시트리움 S5 균주의 질소원 이용성을 알아본 그래프.

도 7은 본 발명에 의한 루코노스톡 시트리움 S5 균주의 16S rDNA 염기서열 분석도.

도 8은 본 발명에 의한 루코노스톡 시트리움 S5 균주의 16S rDNA 염기서열에 근거하여 작성한 계통도.

본 발명은 전통발효식품인 동치미에서 분리한 유용균주인 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5) 균주와 이를 이용한 덱스트란의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 동치미로부터 분리된 유용 균주인 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)와 이로부터 발효를 수행함으로써 점성이 높고, 젖산, 풍미 및 기능성을 가진 고점도의 덱스트란을 제조하는 방법에 관한 것이다.

루코노스톡 속(Leuconostoc sp.)에 속하는 유산균들의 가장 큰 특징으로는 몸에서 분해가 안 되는 섬유질과 비슷한 비소화성 식이섬유인 덱스트란을 스스로 만들어 내는 것이다.

덱스트란은 의가소성, 흡습성 및 점착성을 가지고, 식품의 물성에 매우 중요한 역할을 하며, 낮은 pH에서도 점도가 높기 때문에 아이스크림과 셔벗의 조직을 안정화하는데 뛰어난 효과를 가지고 있다. 특히 의료용으로는 분자량 범위에 따라 혈장 대체재 혹은 혈액흐름 촉진제 등으로 사용된다.

루코노스톡 속(Leuconostoc sp.)으로부터의 덱스트란 생산은 덱스트란수크레이즈(dextransucrase)에 의해 기질인 설탕으로부터 글루코즈(glucose)가 분리되어 중합반응에 의해 고분자의 덱스트란이 생산된다. 덱스트란은 균체 외로 분비되는 덱스트란수크레이즈에 의해 생성되어 α-D-글루코피라노즈(α-D-glucopyranose)가 α-(1→6) 글루코시딕(α-(1→6) glucosidic) 결합으로 이루어져 있는 대표적인 생물고분자로 세포외 세균 다당류로 통칭한다.

이에 본 발명자는 전통 동치미로부터 점성을 갖는 균주를 개별분리한 후 이를 설탕이 함유된 배지에서 배양하여 순수 분리하고, 덱스트란을 생산하는 신균주임을 동정하였다.

또한 신균주를 이용하여 소정의 기본배지를 이용하여 높은 점성을 갖고 산 생성능이 우수한 덱스트란 발효물을 제조하는 방법을 개발하였다.

따라서 본 발명의 목적은 칼로리가 낮고 영양성 및 기능성이 뛰어난 다당류인 덱스트란을 생산하는 신균주를 제공하는 데 있다.

또한 본 발명의 목적은 신균주를 이용하여 높은 점성을 갖고 산 생성능이 우수한 덱스트란 함유 발효물을 제조하는 방법을 제공하는 데도 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 신균주는, 덱스트란을 생산하는 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5) 균주이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 덱스트란 함유 발효물의 제조 방법은 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5) 균주로부터 스타터 배양액을 제조하는 단계; 설탕 10~30%와 감자 분말 0.1~1%와의 혼합액을 포함한 기본배지를 준비하는 단계; 및 기본배지 100중량부에 상기 스타터 배양액을 1~5중량부 되도록 접종하여 20~37℃에서 24~72시간 발효시키는 단계를 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 전통 동치미로로부터 분리한 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5) 균주와 이를 이용한 덱스트란 발효물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 전통 동치미로부터 덱스트란을 생산하는 균주를 분리하였으며, 이에 대해 동정한 결과 루코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum)에 속하는 균주로 판단되어 이를 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)로 명명하고 이를 한국미생물보존센터에 기탁하여 2006년 10월 2일자로 KCCM10778P를 부여받았다.

본 발명에 따른 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)는 전통 동치미에서 분리된 젖산균이다.

본 발명에 따른 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)는 덱스트란 발효에 관여하는 여러 균들 중에서 점성이 높고, 산 생성능이 우수한 덱스트란을 생산을 할 수 있으며, 설탕을 덱스트란으로 전환시킨다.

본 발명에서 기능성 덱스트란 생산의 바람직한 제조방법은 우선, 우수한 젖 산균을 분리 및 동정하고, 이로부터 스타터 배양액을 제조한다.

스타터 배양액은 설탕을 함유한 배지로부터 얻어진 것이 바람직한데, 구체적으로는 2 내지 10%의 설탕, 0.1 내지 0.5%의 이스트 추출물, 0.1 내지 0.5%의 트립톤, 0.1 내지 0.5%의 제2인산칼슘을 포함하는 배지 중에서 배양하여 얻어진 스타터 배양액인 것이 좋다.

한편, 발효를 위한 기본배지로는 설탕과 함께 감자분말을 포함하는 것이 바람직한데, 구체적으로는 기본배지 조성 중 설탕을 10 내지 30중량%로, 그리고 감자분말을 0.1 내지 1중량%로 포함하는 기본배지인 것이 바람직하다.

설탕은 덱스트란으로 전환되며, 감자분말은 덱스트란 함유 발효물의 점성과 산 생산능을 향상키기 위한 것이다.

이와 같은 기본배지 조성에 스타터 배양액을 접종하여 발효시키면 덱스트란 함유 발효물을 얻을 수 있는데, 이때 스타터 배양액의 접종은 기본배지 조성 100중량부에 대해 1~5중량부 되도록 수행하는 것이 바람직하다. 만일 스타터 배양액의 접종량이 적으면 발효가 이루어지지 않을 수 있고, 상한보다 많이 첨가해도 발효 효율이 증가하지 않으므로 비효율적이다.

한편, 본 발명에 따른 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)는 전통 동치미에서 분리 가능한 같은 종(species)에 비해서 점성 생산능과 산 생산능이 우수하다.

이하에서는 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)의 분리방법, 세균학적 특성에 근거한 동정에 관한 상세한 예와 신균주를 이용하여 설탕과 감자분말을 포함한 기본 배지로 하여 발효를 수행함으로써 점조도가 높은 덱스트란 및 젖산 생성으로 맛과 풍미가 증진된 덱스트란함유 고점도 발효물을 제조하는 방법을 구체 예로써 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 균주의 분리 및 동정

제 1 단계: 균의 분리

본 발명자들은 전통 동치미를 멸균 증류수에 첨가하여 잘 희석시킨 후, 그 액을 MRS 한천 플레이트에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하여 점성을 지니는 균주를 개별 분리하였다. 그 다음 상기에서 각각의 분리된 균주를 설탕이 포함된(설탕 2% 함유) MRS 한천 플레이트에서 도말하여 순수 분리하였다. 분리된 균주를 설탕이 포함된(설탕 2% 함유) MRS 한천 플레이트에서 30℃, 24시간 계대배양하여 활성화시킨 후, 한 콜로니를 따서 멸균된 스타터 배양액(2% 설탕, 0.5% 식용이스트 추출물, 0.25% 트립톤, 0.25% 식용 제2 인산칼슘)에 접종한 후 30℃ 항온배양기에서 24시간 정치 배양시켜 사용하였다.

제 2 단계: 분리된 미생물의 동정 및 특성

전통 동치미로부터 미생물을 분리 및 동정하고 다양한 프로바이오틱(probiotic) 특성에 대한 조사를 하는 일련의 과정을 도 1에 도시하였다.

상기 제 1 단계로부터 분리된 균주에 대한 배양학적, 생리학적 및 생화학적 인 특성은 하기 표 1에 나타낸 것과 같고, 당 이용성은 표 2에 나타낸 것과 같다.

또한 분리균주의 형태학적 특성은 도 2의 전자현미경사진과 같이 세포 크기는 대략 0.6~0.7 × 1.18~1.53㎛인 짧은 막대모양의 간균이었으며(도2a), 이는 도2b로 도시된 공시균주인 루코노스톡 시트리움 KCTC 3526(Leuconostoc citreum KCTC 3526)과 유사한 형태학적 특성을 갖는 것이다.

배양학적 특성으로는 통성혐기성이며, 균체 성장에 미치는 온도영향에서는 15~30℃에서 성장이 양호하였다. MRS 한천 배지에서는 유백색의 균 집락을 형성하였고, 높은 점액성을 나타내는 균의 집락을 형성하였으며, 둥글고 볼록한 외형을 나타내었다.

본 발명 균주의 배양 및 생리학적 특성
특성	본 발명 균주
그람염색	양성
성장온도	15~37℃
호기적인 조건에서의 성장	+
혐기적인 조건에서의 성장	+
이동성	-
보게스-프로스카우저 시험	-
O-F 시험	+
카탈라제 생성	+
우레아제 생성	-
젤라틴나제 생성	-
시트르산 이용성	-

본 발명 균주의 탄소원 이용성
탄소원	이용성	탄소원	이용성
L-arabinose(L-아라비노즈)	+	Adonitol(아도니톨)	-
D-cellobiose(D-셀로비오즈)	-	D-fructose(D-프락토오즈)	+
D-galactose(D-갈락토즈)	+	D-glucose(D-글루코스)	+
D-mannitol(D-만니톨)	+	Raffinose(라피노즈)	-
L-rhamnose(L-람노즈)	-	Salicin(살리신)	+
D-설탕(D-수크로오즈)	+	D-xylose(D-크실로즈)	-

(기호설명 : + 양성반응, - 음성반응)

상기 표 2와 같이, 본 발명에 따라 분리된 균주의 당 이용성은 아도니톨(adonitol), D-셀로비오즈(D-cellobiose), 라피노즈(raffinose), L-람노즈(L-rhamnose), D-크실로즈(D-xylose)의 이용성은 없는 것으로 나타났으며, 그 외에 L-아라비노즈(L-arabinose), D-프락토오즈(D-fructose), D-갈락토즈(D-galactose), D-글루코스(D-glucose), D-만니톨(D-mannitol), 살리신, D-설탕 등의 당들은 이용할 수 있는 것으로 나타났다.

한편, 분리된 균주의 DNA의 GC 함량을 HPLC로 분석한 결과, 공시균주인 루코노스톡 시트리움 KCTC 3526(Leuconostoc citreum KCTC 3526)은 GC 함량이 41.98 mol%인 것에 비해 본 발명 균주는 41.45 mol%로서 유사한 GC 함량을 가졌다.

또한 균주 동정을 보다 더 정확하게 하기 위해, 세포벽 지방산 분석을 하였다. 비교를 위하여 공시균주인 루코노스톡 시트리움 KCTC 3526(Leuconostoc citreum KCTC 3526)을 함께 분석한 결과는 다음 표 3과 같다.

세포벽 지방산	본 발명의 균주(%)	Leuconostoc citreum KCTC 3526
C14:0	6.48	5.61
C16:0	29.43	31.20
C18:1 w9c	22.35	14.26
C18:1 w7c	8.92	6.99
C19:0 cyclo w8c	15.85	20.91

표 3으로부터, 두 균주 모두 C16:0 및 C18:1 w9c가 주요 지방산으로 관찰되었으며, 두 균주 모두 유사한 분석 결과를 나타내었다.

이상에서와 같은 당 이용성 및 지방산 분석 등을 통한 동정결과 분리된 균주는 루코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum)에 속하는 균주로 판단하고, 이 분리 균주를 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)라 명명하였다. 이 균주는 한국미생물보존센터에 기탁하여 2006년 10월 2일자로 KCCM 10778P를 부여받았다.

한편, 본 발명에 따른 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5) 균주의 rDNA 염기서열을 도 7로 나타내었고, 이에 근거하여 작성한 계통도를 도 8로서 나타내었다.

실시예 2 : 덱스트란 생산으로 확인한 균주의 특성 비교

제 1 단계: 루코노스톡 시트리움 스타터 제조

스타터 제조를 위해서 전통 동치미에서 분리 선별한 균주인 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)와 공시균주인 루코노스톡 시트리움 3526(Leuconostoc citreum 3526)을 MRS 한천 배지에서 30℃ 항온배양기를 이용하여 24시간 활성화시킨 후, 한 콜로니(colony)를 따서 멸균된 스타터 배양액 (2% 설탕, 0.5% 식용이스트 추출물, 0.25% 트립톤, 0.25% 식용 제2 인산칼슘)에 접종한 후 30℃ 항온배양기에서 24시간 정치 배양시켜 스타터로 사용하였다.

제 2 단계: 덱스트란 생산을 위한 배지 제조

기본배지인 20% 설탕과 0.5% 감자분말 혼합액을 121℃, 15 min 멸균한 후, 기본배지로 하였다(pH 7.8).

여기에 배양한 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)균과 루코노스톡 시트리움 3526(Leuconostoc citreum 3526)을 각각 기본배지 100중량부에 대해 1-5중량부 되도록 접종하여 20-37℃에서 24-72시간 배양하여 덱스트란을 생산하였고, 덱스트란의 생산 정도를 점조도를 비교해 알아보았다.

제 3 단계: 덱스트란의 점조도 측정

생산된 덱스트란의 점성 비교를 위해 점조도를 측정하였다. 구체적으로, 점조도는 레오미터 시스템(HAAKE RheoStress 1, Germany)에 cone plate device(Platte PP35 Ti, 3.5㎝ diameter)를 장착하여 측정하였다. 시료 1.2 mL을 plate 중심에 올려 구간 당 10초 동안의 평균값이 측정되어 얻은 값을 변형 속도(shear rate, 1/s)와 변형 압력(shear stress, Pa)으로 나타내어 점조도가 높아짐에 따라 층밀림 변형력이 높아지는 효과를 측정하였다. 측정온도 20℃에서 전단속도(㎎)는 1-100 s^-1의 범위로 유동특성을 알아보았고, 점조도지수와 유동지수 값은 파워 로우 모델(Power law model)(τ = ar^b)로 측정하였다.

실험예 1: 온도에 따른 덱스트란의 점조도 차이 비교

루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)를 이용한 덱스트란 제조시 온도에 따른 점조도의 변화를 비교하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 참조하여 보면, 25℃에서 가장 높은 점조도를 가진 덱스트란의 제조가 가능하였고, 30℃와 20℃에서도 발효 시간이 증가함에 따라 점조도값이 증가하는 것을 알 수 있다.

또한 전체적으로 모든 온도에서 점조도를 비교했을 때 루코노스톡 시트리움S5(Leuconostoc citreum S5)균주가 공시균주인 루코노스톡 시트리움 3526 (Leuconostoc citreum 3526)보다 점조도값이 월등히 높은 것을 알 수 있었다.

실험예 2: pH에 따른 덱스트란의 점조도 차이 비교

루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)를 이용하여 pH를 5-9로 조절한 후, 발효 48시간 후의 점조도를 비교하여 그 결과를 도 4로 나타내었다.

pH 조절을 하지 않았을 때 기본 배지의 pH는 7.8을 나타내었다. 발효 후 점조도값을 비교한 결과, 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5) 균주는 pH 7에서 가장 높은 점조도를 나타내었고, 루코노스톡 시트리움 3526(Leuconostoc citreum 3526) 균주는 pH 6에서 가장 높은 점조도를 나타내어 두 균주가 활성을 나타내는 pH의 범위가 다른 것을 알 수 있었다. 또한 루코노스톡 시트리움 S5 (Leuconostoc citreum S5) 균주가 pH 7-8 범위에서 루코노스톡 시트리움 3526 (Leuconostoc citreum 3526) 균주보다 높은 점조도를 나타내는 것을 알 수 있었다.

실험예 3: 루코노스톡 시트리움 S5 ( Leuconostoc citreum S5) 균주의 탄소원 이용성 조사

루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)를 pH 7로 조절한 기본 배지에 다양한 탄소원을 2%씩 첨가하여 48시간 발효시킨 후 생산된 덱스트란의 점조도를 조사하여 그 결과를 도 5로 나타내었다.

그 결과 기본배지가 설탕인 만큼 사카로즈(saccharose)를 첨가하였을 때, 점조도가 높았으나 컨트롤(control)보다는 값이 낮아 본 발명 균주 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)는 다른 탄소원의 첨가에 따른 활성은 없는 것으로 나타났다.

실험예 4: 루코노스톡 시트리움 S5( Leuconostoc citreum S5) 균주의 질소원 이용성 조사

루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)를 pH 7로 조절한 기본 배지에 다양한 질소원을 1%씩 첨가하여 48시간 발효시킨 후 생산된 덱스트란의 점조도를 조사하여 그 결과를 도 6으로 나타내었다.

그 결과 효모 추출물(yeast extract)를 첨가했을 때 점조도가 월등히 높은 것을 알 수 있어 본 균주 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5)는 질소원으로 효모 추출물을 첨가했을 때 활성이 높은 것을 알 수 있었다.

이상 상기 실시예 및 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명의 주체인 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5) 균주는 전통 동치미에서 분리한 것으로 덱스트란 생산능이 우수한 균주이며, 이를 설탕 배지에 감자 분말을 첨가한 후 덱스트란을 제조함으로써 점성이 높고, 생성된 젖산의 조화로 관능미가 우수한 발효물을 제조할 수 있으며, 궁극적으로는 얻어진 덱스트란을 식품 소재로 사용할 수 있어 식품산업상 매우 유용한 발명이다.

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Claims

덱스트란(dextran)을 생산하는 루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5) 균주(기탁번호 KCCM10778P).
루코노스톡 시트리움 S5(Leuconostoc citreum S5) 균주로부터 스타터 배양액을 제조하는 단계;

설탕 10~30%와 감자 분말 0.1~1%와의 혼합액을 포함한 기본배지를 준비하는 단계; 및

기본배지 100중량부에 상기 스타터 배양액을 1~5중량부 되도록 접종하여 20~37℃에서 24~72시간 발효시키는 단계를 포함하는 덱스트란 함유 발효물의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 기본배지는 질소원으로 효모 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 덱스트란 함유 발효물의 제조방법.