TW201917208A - 具有高胞外多醣-生產能力的胚芽乳桿菌胚芽亞種lpcs2分離株及其在免疫調節上之相關用途 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一株具有高胞外多醣-生產能力(high exopolysaccharide-producing ability)的胚芽乳桿菌胚芽亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ) LPCS2分離株，它以寄存編號BCRC 910796被寄存於財團法人食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。該胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2分離株可被用於生產胞外多醣。

Description

具有高胞外多醣-生產能力的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2分離株及其在免疫調節上之相關用途

本發明是有關於一株具有高胞外多醣-生產能力(high exopolysaccharide-producing ability)的胚芽乳桿菌胚芽亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ) LPCS2分離株，它以寄存編號BCRC 910796被寄存於財團法人食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。該胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2分離株可被用於生產胞外多醣。

胞外多醣(extracellular polysaccharides或exopolysaccharides，EPS)是微生物生長代謝過程中所分泌之多醣類聚合物，它們一般被分類為：(1)莢膜EPS (capsular EPS, CPS)，它是以莢膜(capsule)的形式結合於細胞表面；以及(2)黏液EPS (slime EPS)，它是以黏液(slime)的形式被分泌至細胞外的環境中(De Vuyst L. and Degeest B. (1999),FEMS Microbiol. Rev. , 23(2):153-77)。

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一群能夠發酵醣類並以乳酸為主要代謝產物的革蘭氏陽性菌，其廣為被接受的形態與生理特徵包括：(1)外形為球狀(round)或桿狀(rod)；(2)缺乏細胞色素及過氧化氫酶(catalase)；(3)不形成內生性孢子；以及(4)不具運動性。乳酸菌是屬於一般被公認為安全的(generally recognized as safe, GRAS)且廣泛使用的益生菌(probiotics)。目前已知有部分的乳酸菌具有生產EPS的能力，它們大多是屬於鏈球菌屬(Streptococcus )、乳桿菌屬(Lactobacillus )、乳球菌屬(Lactococcus )、白念珠球菌屬(Leuconostoc )以及小球菌屬(Pediococcus )，此外，部分雙叉桿菌屬(Bifidobacterium )的菌株(strains)也被顯示能夠生產EPS。

乳酸菌所生產的EPS屬於長鏈的高分子聚合物，可依據其單醣組成(monosaccharide composition)的不同而被區分為下面兩大類型： (1) 同元多醣(homopolysaccharides, HoPS)，它是由單一類型的單醣所構成，例如，主要由α-1,6-連結的葡萄糖殘基(α-1,6-linked glucose residues)所構成的α-葡聚醣(α-glucans)、主要由β-1,3-連結的葡萄糖殘基(β-1,3-linked glucose residues)所構成的β-葡聚醣(β-glucans)，以及主要由β-2,6-連結的果糖殘基(β-2,6-linked fructose residues)所構成的聚果糖(fructans)；以及 (2) 異元多醣(heteropolysaccharides, HePS)，它通常是由包含有不同單醣的重複單元(repeating units)所構成，而重複單元通常含有3至8個單醣，且大多數都含有不同比例的葡萄糖、半乳糖(galactose)以及鼠李糖(rhamnose)。在少數的例子中，HePS還包含有N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)、N-乙醯半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)、海藻糖(fucose)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid)以及非醣類取代基(例如磷酸、乙醯基以及甘油)。

乳酸菌所生產的EPS在水中能夠展現增稠(thickening)或膠化(gelling)的特性，因此，在食品產業中已被廣泛用作為諸如增稠劑(thickener)、穩定劑(stabilizer)、乳化劑(emulsifier)以及膠化劑(gelling agent)等的食品添加劑。除此之外，乳酸菌所生產的EPS亦被證實具有許多有益於人體的功效，包括降低血膽固醇、抗氧化、抗腫瘤以及免疫調節等(Wang K.et al . (2014),Int. J. Biol. Macromol ., 67:71-78)。因此，分離與篩選出能夠生產EPS的乳酸菌即成為本領域的相關研究人員所致力的目標。例如，在Marieta C.et al. (2009),J. Agric. Food Chem., 57(14):6183-8中，Marieta等人自蘋果酒中分離出Lactobacillus suebicus CUPV221，該菌株被發現可生產β-1,3-葡聚醣。另外，在Garai-Ibabe G.et al . (2010),J. Agric. Food Chem ., 58(10):6149-565中，Garai-Ibabe等人從147株自蘋果酒中分離出的乳酸菌中篩選出32株具有EPS生產能力的小片球菌(Pediococcus parvulus )，且它們所生產的EPS中皆被發現含有β-1,3-葡聚醣。

為了因應產業界對於EPS的廣大需求，本領域中的相關研究人員皆致力於探討各種會影響乳酸菌的EPS生產率(productivity)的因素。目前已有諸多文獻證實，乳酸菌的EPS產量的多寡取決於培養基之組成[諸如碳源(carbon source)和氮源(nitrogen source)的組成等]以及培養條件(諸如溫度、pH值、氧氣含量等)。例如，在Degeest B. and De Vuyst L. (2000),Appl. Environ. Microbiol., 66(8):3519-27中，Degeest B.與De Vuyst L.發現，以乳糖作為碳源來培養嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus ) LY03時，所得到的EPS產量明顯地高於以葡萄糖作為碳源時所得到者。

在De Vuyst L.et al. (1998),J. Appl. Microbiol. , 84(6):1059-68中，De Vuyst等人發現，相較於未額外添加氮源的脫脂乳培養基(skim milk medium)，分別使用添加有酵母萃取物(yeast extract)和/或蛋白腖(peptone)的脫脂乳培養基來對嗜熱鏈球菌LY03進行培養時可使其EPS產量增加。另外，相較於25、30、37、50以55℃，使用42℃的培養溫度能夠獲致最高的EPS產量；以及相較於pH值為4.9、5.5以及6.9，使用pH值為6.2的培養環境能夠獲致最高的EPS產量。

雖然已存在有上述文獻報導，申請人仍積極致力於篩選出具有高胞外多醣-生產能力的乳酸菌株。經研究，申請人從市售之發酵食品中分離出一株細菌分離株(bacterial isolate)(它後來經過特徵鑑定而被命名為胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2)，其具有極為優異的胞外多醣(特別是β-1,3-葡聚醣)生產能力，因而被預期可供用於大量生產胞外多醣以及β-1,3-葡聚醣。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2，它以寄存編號BCRC 910796被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。

在第二個方面，本發明提供一種用於生產胞外多醣的方法，其包括：將一如上所述的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2培養於一適於該菌株生長的培養基中。

在第三個方面，本發明提供一種含有胞外多醣的培養物，它是藉由一如上所述的方法而被製得。

在第四個方面，本發明提供一種藥學組成物，其包含有一如上所述的培養物，以及選擇性地一藥學上可接受的載劑。

在第五個方面，本發明提供一種食品產品，其包含有一如上所述的培養物。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

乳酸菌是屬於一般被公認為安全的且廣泛使用的益生菌，其生產的胞外多醣除了在食品產業中被廣泛運用為食品添加劑以外，亦被證實具有許多有益於人體的功效。因此，申請人積極致力於篩選出具有高胞外多醣-生產能力的乳酸菌株。

申請人從市售的數種發酵食品中分離與篩選出30株乳酸菌分離株，接著藉由評估胞外多醣-生產能力以及所生產的胞外多醣的免疫刺激能力，而進一步篩選出一株能夠生產大量的胞外多醣(包括β-1,3-葡聚醣)且所生產的胞外多醣具有最優異的免疫刺激能力之乳酸菌分離株。申請人對該乳酸菌分離株LPCS2進行特徵鑑定並測試培養條件對於胞外多醣-生產能力之影響，且參考國立台灣大學食品科技研究所的陳智強所著碩士論文[名稱：“培養條件對乳酸菌胞外多醣生產及抗氧化性之影響(Effect of fermentation conditions on the production and antioxidative activity of exopolysaccharide from several lactics)”]，而判斷該乳酸菌分離株LPCS2是屬於一株新穎的胚芽乳桿菌胚芽亞種分離株，它被申請人命名為“胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2”，並已於西元2017年09月08日以寄存編號BCRC 910796被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。

基於上述，本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2被預期具有可用於大量生產胞外多醣的潛力。於是，本發明提供一種用於生產胞外多醣的方法，其包括：將一如上所述的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2培養於一適於該菌株生長的培養基中。較佳地，該胞外多醣是β-1,3-葡聚醣。

如本文中所使用的，術語“培育(cultivation)”、“培養(culturing)”以及“發酵(fermentation)”可被交換地使用。

依據本發明，適用於培養胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2的培養基是熟習此項技藝者所熟知的。例如，該培養基可以是一合成培養基(synthetic medium)。

依據本發明，適用於本發明的合成培養基包括，但不限於MRS肉湯培養基(MRS broth)。

依據本發明，適用於本發明的培養基包含有一選自於由下列所構成之群組中的碳源：葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、麥芽糖(maltose)、果糖(fructose)、糖蜜(molasses)、半乳糖(galactose)、鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、木糖醇(xylitol)、菊糖(inulin)、山梨糖醇(sorbitol)、海藻糖(trehalose)，以及它們的組合。

較佳地，該培養基包含有葡萄糖。在本發明的一個較佳具體例中，該葡萄糖具有一範圍落在2.0至8.0% (v/v)的濃度。

依據本發明，適用於本發明的培養基包含有一選自於由下列所構成之群組中的氮源：蛋白腖(peptone)、酵母萃取物(yeast extract)、大豆蛋白腖(soy peptone)、牛肉萃取物(beef extract)、脫脂牛奶(skim milk)、聚蛋白腖(polypeptone)、胰化蛋白腖(tryptone)、玉米浸液(corn steep liquor)，以及它們的組合。

較佳地，該培養基包含有酵母萃取物。

較佳地，該培養基包含有酵母萃取物與蛋白腖。在本發明的一個最佳具體例中，在該培養基中的酵母萃取物與蛋白腖是呈一為1:4 (v/v)的比例。

依據本發明，適用於本發明的培養基具有一範圍落在4.5至6.5內的pH值。在本發明的一個較佳具體例中，該培養基具有一為4.5或6.5的pH值。在本發明的另一個較佳具體例中，該培養基具有一為4.5的pH值。

依據本發明，該胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2可於一範圍落在16至37℃的溫度下被進行培養。在本發明的一個較佳具體例中，該胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2是於一為23℃的溫度下被進行培養。

本發明亦提供一種含有胞外多醣的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2培養物，它是藉由一如上所述的方法而被製得。

有關胞外多醣的分離與純化以及濃度測定可以採用熟習此項技藝者所熟知且慣用的技術來進行。例如，有關胞外多醣的分離與純化可以採用三氯乙酸(trichloroacetic acid)或乙醇(ethanol)來進行，而有關胞外多醣濃度的測定可以採用酚-硫酸法(phenol-sulfuric method)來進行。在此方面，可以參考P. Ruas-Madiedo and C. G. de los Reyes-Gavilán (2005),J. Dairy Sci. , 88:843-856。另外，有關β-1,3-葡聚醣濃度的測定可以採用苯胺藍螢光染色法(aniline blue fluorescence staining)來進行。在此方面，可以參考國立台灣大學食品科技研究所的李儀儂所著碩士論文{名稱：“培養條件對靈芝菌絲多醣與其(1,3;1,6)-β-D-聚葡萄醣生成量及性質之影響[Yields and Properties of Polysaccharides and (1,3;1,6)-β-D-Glucans Extracted fromGanoderma lucidum Mycelium Cultivated at Different Conditions]”}。

自胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2培養物中所分離與純化出的胞外多醣藉由與巨噬細胞(macrophages)的共-培養(co-culture)而被證實具有免疫調節活性(immunomodulating activity)，同時基於胞外多醣的其他已知的益生性質(probiotic properties)，依據本發明之含有胞外多醣的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2培養物被預期在製備用於免疫調節(immune modulation)、降低膽固醇以及抗腫瘤(antitumor)等之醫藥品上的應用。

於是，本發明提供一種藥學組成物，其包含有一如上所述的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2培養物，以及選擇性地一藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。

依據本發明的藥學組成物可利用熟習此項技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地、局部地或口服地投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於，注射品(injection)[例如，無菌的水溶液或分散體(dispersion)]、無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)以及類似之物。

依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

此外，本發明亦預期該含有胞外多醣的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2培養物在製備用於免疫調節、降低膽固醇以及抗腫瘤等的保健食品與非處方醫藥品上的應用。

於是，本發明亦提供一種食品產品(food product)，其包含有一如上所述的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2培養物。該胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2培養物可以被當作食品添加物(food additive)而藉由習知方法於原料製備時被添加，或是被配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，該食品產品的種類包括，但不限於：奶粉(milk powder)、飲料(beverages)、甜點(confectionery)、糖果(candies)、發酵食品(fermented foods)、動物飼料(animal feeds)、健康食品(health foods)、膳食補充品(dietary supplements)、果凍(jellys)、嬰兒配方(infant formulas)、沙拉醬(dressings)、蛋黃醬(mayonnaise)、塗醬(spreads)、鮮乳油(creams)、醬料(sauces)、布丁(puddings)、冰淇淋(ice-cream)以及蕃茄醬(ketchup)。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。實施例 一般實驗材料： 1. MRS 肉湯培養基 (MRS broth) ：

在下面的實施例中所使用的MRS肉湯培養基具有一如下面表1所示的配方。 表1. MRS肉湯培養基的配方 2. MRS 瓊脂培養盤 (MRS agar plate) ：

在下面的實施例中所使用的MRS瓊脂培養盤是藉由在MRS肉湯培養基的配方中額外添加2%瓊脂而被製得。3. MRS- 碳酸鈣瓊脂培養盤 (MRS-calcium carbonate agar plate) ：

在下面的實施例中所使用的MRS-碳酸鈣瓊脂培養盤是藉由在MRS瓊脂培養盤的配方中額外添加0.5%碳酸鈣而被製得。4. MRS-SL 肉湯培養基：

在下面的實施例中所使用的MRS-SL肉湯培養基具有一如下面表2所示的配方。 表2. MRS-SL肉湯培養基的配方 5. 經修改的 MRS-SL 肉湯培養基 (modified MRS-SL broth) ：

在下面的實施例中所使用之含有不同碳源組成以及不同氮源組成的MRS-SL肉湯培養基具有一如下面表3所示的配方。 表3. 經修改的MRS-SL肉湯培養基的配方 6. 細胞株的來源與培養：

在下面的實施例中所使用的小鼠巨噬細胞株(mouse macrophage cell line) RAW 264.7以及人類乳癌細胞株(human breast cancer cell line) MDA-MB-231是購自於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。

這2種細胞分別依照下面表4所示的培養基被培養於96-井培養盤(96-well plate)中，並在設定為37℃、5% CO₂ 的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline, PBS)(pH 7.4)來清洗細胞共計2次，接著加入胰蛋白酶-EDTA (trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以定量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養瓶中，並在培養箱中進行培養。 表4. 用於培養2種細胞株的培養基 一般實驗方法： 1. 胞外多醣的 分離與純化 (Isolation and purification of exopolysaccharides) ：

將25 mL的培養物在26℃下以3000 rpm的轉速予以離心歷時5分鐘，接著收取5 mL的上清液，繼而添加以20 mL的95%乙醇並予以混合均勻，然後置於-20℃下進行沉澱歷時24小時。之後，在4℃下以9000 rpm的轉速予以離心歷時10分鐘，在倒除上清液後將沉澱物(precipitate)以5 mL的一次水予以回溶。此沉澱-離心-去除上清液步驟被重複進行2次，之後將所得到的沉澱物置於40℃下予以乾燥，藉此而得到胞外多醣(exopolysaccharide, EPS)備用。2. 胞外多 醣濃度的測定 (Determination of EPS concentration) ：

將依據上面第1項中所得到的胞外多醣溶於5 mL的一次水中以形成一胞外多醣溶液(EPS solution)，取1 mL的胞外多醣溶液，接而依序地添加以1 mL的5%酚溶液(phenol solution)以及5 mL的濃硫酸並予以混合均勻，然後在室溫、避光環境下予以靜置反應歷時30分鐘。最後，於490 nm的波長下以一分光光度計(spectrometer)(型號為U-2001，廠牌為HITACHI)來讀取所形成的反應混合物的吸光值(OD₄₉₀ )。由此所測得的OD₄₉₀ 數值接而根據預先以具有不同已知濃度(0、20、40、80以及100 mg/L)的葡萄糖標準品相對於它們自身的OD₄₉₀ 數值所作出的相關曲線(correlation curve)而被換算成濃度(mg/L)來表示。3. β-1,3- 葡聚醣 濃度的測定 (Determination of β-1,3-glucan concentration) ：

對依據上面第1項中所得到的胞外多醣添加以3 mL的解旋液(含有0.3 M氫氧化鈉以及0.5 M氯化鈉)，接著在26℃下以90 rpm的轉速予以迴旋震盪歷時30分鐘。之後，添加以7 mL的緩衝液(含有0.02 M氫氧化鈉、0.5 M氯化鈉，以及0.05 M磷酸氫二鈉)，並以5 N的鹽酸與1 N的氫氧化鈉將所得到的預混物的pH值調整至11.5。取2 mL的該預混物，添加以0.2 mL之0.1%的苯胺藍溶液(aniline blue solution)(Ferak)並予以震盪混合，然後在室溫、避光環境下予以靜置反應歷時2小時。最後，在395 nm的激發波長(excitation wavelength)以及495 nm的放射波長(emission wavelength)下以一螢光光譜儀(fluorescence spectrophotometer)(型號為F-4500，廠牌為HITACHI)來讀取所形成的反應混合物的螢光強度(fluorescence intensity)。由此所測得的螢光強度接而根據預先以具有不同已知濃度(10、20、30、40以及50 μg/mL)的昆布多醣(laminarin)標準品相對於它們自身的螢光強度所作出的相關曲線而被換算成濃度(mg/L)來表示。4. 統計學分析：

在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，而實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。各組實驗數據之間的差異是藉由鄧肯氏新多變域檢定(Duncan’s new multiple range test)而被評估。若所得到的統計比對結果是p ＜0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。實施例 1. 具有高胞外多醣 - 生產能力的乳酸菌分離株的篩選 (Screening of lactic acid bacteria isolates having high EPS-producing ability) A、 試驗菌 株的來源與分離：

申請人使用購自於台南市傳統市場的數種發酵食品(包括泡菜、臭豆腐、發酵鳳梨汁、發酵番茄汁、發酵楊桃汁以及發酵乳等)作為樣品來源來進行乳酸菌分離株的分離。首先，以無菌水沖洗固態的發酵食品並收集沖洗液，接著對沖洗液與液態的發酵食品分別進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)而配製成不同稀釋倍數(10³ ~10⁶ 倍)，然後分別取出0.1 mL並將之均勻塗佈於MRS-碳酸鈣瓊脂培養盤上，繼而在30℃下靜置培養24至48小時。待菌落(colony)形成後，依據乳酸菌所生產出的乳酸會與碳酸鈣反應而形成無色的乳酸鈣之特性，挑選出在MRS-碳酸鈣瓊脂培養盤上形成透明圈之菌落，繼而分別以MRS瓊脂培養盤予以繼代培養並純化。

之後，對所得到之經純化的細菌分離株進行初步試驗，試驗項目包括：革蘭氏染色(Gram stain)以及過氧化氫酶(catalase)反應。依據初步試驗結果，30株呈革蘭氏陽性且不具過氧化氫酶活性的乳酸菌分離株被篩選出。接著，將該等乳酸菌分離株分別接種至100 mL之MRS肉湯培養基，並置於一恆溫振盪培養箱(30℃、100rpm)中進行培養歷時15小時。之後，對該等乳酸菌分離株的培養物分別添加以適量的甘油溶液(glycerol solution)至一為10% (v/v)之最終濃度，繼而將之冷凍保存於-80℃下備用。B、 活化乳酸菌分離株：

將依據上面第A項中所得到的乳酸菌分離株接種至MRS瓊脂培養盤上，繼而於30℃下予以培養歷時24小時。此接種-培養步驟被重複2至3次，俾以活化菌株。C、 篩選具有高胞外多醣 - 生產能力的乳酸菌分離株：

將依據上面第B項中所得到的30株經活化的乳酸菌分離株分別接種至100 mL之MRS-SL肉湯培養基中，並置於一恆溫振盪培養箱(30℃、100rpm)中進行培養歷時48小時。

之後，所形成的培養物分別依照上面“一般實驗方法”的第1項「胞外多醣的分離與純化」以及第2項「胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離、純化與濃度測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖1中。

從圖1可見，乳酸菌分離株C2、J、K1、K3、L1、LPCS2以及AL的培養物所測得的胞外多醣濃度皆高於300 mg/L，特別地，乳酸菌分離株C2的胞外多醣濃度高達512 mg/L。而其餘乳酸菌分離株的培養物所測得的胞外多醣濃度則是落在150至300 mg/L之間。

申請人進一步依照上面“一般實驗方法”的第3項「β-1,3-葡聚醣濃度的測定」當中所述的方法對所分離與純化出的胞外多醣進行β-1,3-葡聚醣的濃度測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖2中。

從圖2可見，乳酸菌分離株J、K1、L1、L3、L4、LPCS2以及AL的乳酸菌分離株的培養物所測得的β-1,3-葡聚醣濃度皆高於200 mg/L。

根據上述實驗結果，申請人認為乳酸菌分離株C2、J、K1、L1、LPCS2以及AL具有開發潛力，並將它們拿來進行下面的效用評估。另外，基於乳酸菌分離株C1的菌落被觀察到具有拉絲(ropy strand)現象，它一併被拿來進行相同的評估。實施例 2. 不同乳酸菌分離株所生產的胞外多醣在刺激小鼠巨噬細胞 (macrophages) 的免疫活性上的能力之評估

在本實施例中，在實施例1中所篩選出的7個乳酸菌分離株所生產的胞外多醣被拿來與小鼠巨噬細胞進行培養，並分析小鼠巨噬細胞分泌NO的能力，隨後將小鼠巨噬細胞之培養上清液(culture supernatant)拿來與人類乳癌細胞進行培養，並分析人類乳癌細胞生長的細胞可活性，藉此來評估胞外多醣在刺激小鼠巨噬細胞的免疫活性上的效用。A、 乳酸菌分離株所生產的胞外多醣在刺激 RAW 264.7 細胞分泌 NO 上的效用評估：

取適量之在實施例1的第C項「篩選具有高胞外多醣-生產能力的乳酸菌分離株」中所得到的7個乳酸菌分離株所生產的胞外多醣溶於2 mL的無菌水中，而分別配製成一具有一最終濃度為1 mg/mL的胞外多醣試驗溶液，並繼而以一孔徑為0.22 μm的過濾膜予以過濾後備用。

另外，將依照上面“一般實驗材料”的第6項「細胞株的來源與培養」來進行繼代培養的小鼠巨噬細胞株RAW 264.7細胞分成9組，其中包括1個對照組、1個正對照組(positive control)以及7個實驗組(亦即實驗組C1、C2、J、K1、L1、LPCS2以及AL)。將各組細胞分別以一為10,000細胞/井的數量培養於含有20 µL DMEM培養基(添加有10% FBS以及4 mM的麩醯胺酸)的96-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO₂ )中進行培養歷時48小時。

接著，將適量之各個乳酸菌分離株的胞外多醣試驗溶液分別加入至各個對應的實驗組的培養物中，而使得各個實驗組分別具有最終濃度為1000 μg/mL的胞外多醣。另外，正對照組的細胞培養物被添加以適量的脂多醣(lipopolysaccharide, LPS)，而使得正對照組的細胞培養物具有一最終濃度為2 μg/mL的LPS。至於對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組的細胞培養物被置於培養箱(37℃、5% CO₂ )中進行培養歷時24小時。

之後，收取各組細胞培養物的培養上清液，繼而以每井100 μL的體積將培養上清液分別加入至一96-井培養盤的各井中，並對各井分別加入50 μL的革利士試劑(Griess reagent){含有0.1%的N-(1-萘基)乙二胺[N -(1-Naphthyl)ethylenediamine]以及5%的磷酸(phosphoric acid)}，於室溫下進行反應歷時5分鐘之後，於540 nm的波長下以分光光度計來讀取各井的吸光值(OD₅₄₀ )。將所獲得的OD₅₄₀ 數值分別根據預先以具有不同已知濃度的亞硝酸鈉(NaNO₂ )相對於它們自身的OD₅₄₀ 數值所作出的相關曲線而被換算成亞硝酸鹽濃度。

NO分泌量(%)是藉由將所測得的亞硝酸鹽濃度代入下列公式(1)而被計算出：公式 (1) ： A ＝ (B/C) × 100 其中：A＝NO分泌量(%) B＝各組所測得的亞硝酸鹽濃度 C＝對照組所測得的亞硝酸鹽濃度

之後，依照上面“一般實驗方法”的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖3中。

由圖3可見，與對照組相較之下，各個實驗組的亞硝酸鹽濃度皆呈現升高的情形。特別地，實驗組J與LPCS2的亞硝酸鹽濃度皆高於正對照組所具者。這個實驗結果顯示：乳酸菌分離株C1、C2、J、K1、L1、LPCS2以及AL所生產的胞外多醣能夠有效地活化RAW 264.7細胞而刺激其分泌NO。B、 經胞外 多醣刺激的 RAW 264.7 細胞的培養上清液在抑制 MDA-MB-231 細胞生長上的效用評估：

首先，將依照上面“一般實驗材料”的第6項「細胞株的來源與培養」來進行繼代培養的人類乳癌細胞株MDA-MB-231細胞分成9組，其中包括1個空白對照組(blank control)、1個對照組以及7個實驗組(亦即實驗組C1、C2、J、K1、L1、LPCS2以及AL)。將各組細胞分別以一為4,000細胞/井的數量培養於含有200 µL的DMEM培養基(添加有10% FBS)的96-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO₂ )中進行培養歷時72小時。

接著，以每井200 μL的體積將依據上面第A項當中所得到的對照組以及各個實驗組之培養上清液分別加入至本實驗的對照組以及各個對應的實驗組的培養物中。至於空白對照組的細胞培養物則不作任何處理。各組的細胞培養物被置於培養箱(37℃、5% CO₂ )中進行培養歷時24小時。

之後，加入20 µL的5 mg/mL 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]溶液(配於PBS中，並以一孔徑為0.22 μm的過濾膜予以過濾)，並於培養箱(37℃、5% CO₂ )中進行培養歷時4小時。接著，移除各井中的液體，繼而加入200 mL的二甲亞碸(dimethyl sulfoxide, DMSO)至各井中並予以混合均勻，然後於540 nm的波長下以分光光度計來讀取各井的吸光值(OD₅₄₀ )。

細胞可活性百分比(%)是藉由將所測得的吸光值(OD₅₄₀ )代入下列公式(2)而被計算出：公式 (2) ： D ＝ (E/F) × 100 其中：D＝細胞可活性百分比(%) E＝各組所測得的OD₅₄₀ 吸光值 F＝空白對照組所測得的OD₅₄₀ 吸光值

之後，依照上面“一般實驗方法”的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖4中。

從圖4可見，與空白對照組相較之下，對照組的細胞可活性百分比沒有呈現顯著的差異性，實驗組C1與C2的細胞可活性百分比則有呈現上升的情形，而實驗組J、L1以及LPCS2的細胞可活性百分比皆有呈現顯著下降的情形。特別地，實驗組LPCS2具有最低的細胞可活性百分比。

綜合以上的實驗結果，申請人認為乳酸菌分離株LPCS2是最具開發潛力的菌株，故將它拿來進行下面的特徵鑑定。實施例 3. 乳酸菌分離株 LPCS2 的特徵鑑定

為了確認在上面實施例中所篩選出的乳酸菌分離株LPCS2之所屬菌種，乳酸菌分離株LPCS2被拿來進行下面的初步試驗、16S rDNA序列分析(16S rDNA sequence analysis)，以及醣類發酵型態分析(carbohydrate fermentation profile analysis)。A、 初步試驗：

申請人對乳酸菌分離株LPCS2進行初步試驗，試驗項目包括：革蘭氏染色、形態觀察(morphological observation)、運動性(motility)、觸酶(catalase)與氧化酶(oxidase)反應、在好氧(aerobic)與厭氧(anaerobic)條件下的生長情形，以及是否會形成內生孢子(endospore)等。

依據初步試驗結果，乳酸菌分離株LPCS2為革蘭氏陽性桿菌、不具運動性、不具觸酶或氧化酶活性，在好氧與厭氧環境下均可生長，以及不會形成內生孢子。B、 16S rDNA 序列分析：

有關乳酸菌分離株LPCS2的16S rDNA序列分析是委託食品工業發展研究所(FIRDI)來代為進行。

所得到之該乳酸菌分離株LPCS2的16S rDNA序列(序列辨識編號：1)繼而被拿來與NCBI網站上的基因資料庫進行比對分析，而結果顯示，該乳酸菌分離株LPCS2的16S rDNA序列與胚芽乳桿菌胚芽亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum )以及胚芽乳桿菌安氏亞種(Lactobacillus plantarum subsp.argentoratensis )所具者之間具有高達99%以上的相同性(identity)。C、 醣類發酵型態分析：

有關醣類發酵型態的分析是使用API 50 CHL鑑定系統(API 50 CHL identification system)(bioMérieux)並且委託食品工業發展研究所來代為進行。

此外，在參考上面第B項中的比對分析結果之後，胚芽乳桿菌胚芽亞種以及胚芽乳桿菌安氏亞種之標準菌株亦被拿來進行醣類發酵型態分析以供比較。所得到的分析結果被顯示於下面表5中。 表5. 乳酸菌分離株LPCS2以及胚芽乳桿菌胚芽亞種與胚芽乳桿菌安氏亞種的標準菌株的醣類發酵型態分析結果 註：“＋”表示能夠利用所測試的醣類進行發酵並產酸，而“－”表示無法利用所測試的醣類進行發酵。

綜合本實施例的第A至C項的特徵鑑定結果，本發明的乳酸菌分離株LPCS2被鑑定為胚芽乳桿菌胚芽亞種，其在生理生化活性上與胚芽乳桿菌胚芽亞種BCRC 10069^T 分離株最為相近，但在醣類發酵型態上仍存在有差異。

本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2已於西元2017年09月08日以寄存編號BCRC 910796被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)(300新竹市食品路331號，台灣)。實施例 4. 不同的培養條件對於胚芽乳桿菌胚芽亞種 LPCS2 的胞外多 醣 - 生產能力之影響： A、 碳源對於 胚芽乳桿菌胚芽亞種 LPCS2 的胞外多 醣 - 生產能力之影響：

本實驗是探討使用多種不同的碳源組成對於胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2的胞外多醣-生產能力的影響。

首先，將於實施例1的第B項「活化乳酸菌分離株」中所得到的經活化的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2分成5個實驗組(亦即實驗組1至5)，繼而將實驗組1至4分別接種至不同的經修改的MRS-SL肉湯培養基(100 mL)中，並將實驗組5接種至MRS-SL肉湯培養基(100 mL)中，其中，該等MRS-SL肉湯培養基的碳源組成分別如下面表6中所示，而氮源組成皆為1%蛋白腖、1%牛肉萃取物以及0.5%酵母萃取物。 表6. 各組的MRS-SL肉湯培養基中的碳源組成

將各組的培養物置於一恆溫振盪培養箱(30℃、100 rpm)中進行培養歷時48小時之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「胞外多醣的分離與純化」以及第2項「胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離、純化與濃度測定，並依照第3項「β-1,3-葡聚醣濃度的測定」當中所述的方法來進行β-1,3-葡聚醣的濃度測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖5中。

由圖5可見，實驗組1的胞外多醣以及β-1,3-葡聚醣的產量皆明顯高於其他各組所具者，特別地，實驗組1的β-1,3-葡聚醣的產量近似實驗組2至4的胞外多醣產量。這個實驗結果顯示：以葡萄糖作為生長所需的碳源與能量來源有利於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2生成大量的胞外多醣，特別是β-1,3-葡聚醣。

此外，申請人進一步探討不同濃度之葡萄糖對於胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2的胞外多醣-生產能力的影響。

將於實施例1的第B項「活化乳酸菌分離株」中所得到的經活化的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2分成5個實驗組(亦即實驗組1至5)，繼而將實驗組1至5分別接種至不同的經修改的MRS-SL肉湯培養基(100 mL)中，其中，該等經修改的MRS-SL肉湯培養基的碳源組成分別如下面表7中所示，而氮源組成皆為1%蛋白腖、1%牛肉萃取物以及0.5%酵母萃取物。 表7. 各組的經修改的MRS-SL肉湯培養基中的碳源組成

將各組的培養物置於一恆溫振盪培養箱(23℃、100 rpm)中進行培養歷時48小時之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「胞外多醣的分離與純化」以及第2項「胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離、純化與濃度測定，並依照第3項「β-1,3-葡聚醣濃度的測定」當中所述的方法來進行β-1,3-葡聚醣的濃度測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的實驗結果被顯示於圖6中。

由圖6可見，實驗組1至4的胞外多醣產量皆明顯地高於實驗組5所具者，特別地，實驗組1至4的β-1,3-葡聚醣的產量皆高於實驗組5的胞外多醣產量。這個實驗結果顯示，當作為碳源的葡萄糖的濃度為2%至8%時，有利於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2生成大量的胞外多醣，特別是β-1,3-葡聚醣。B、 氮源對於 胚芽乳桿菌胚芽亞種 LPCS2 的胞外多 醣 - 生產能力之影響：

本實驗是探討使用多種不同的氮源組成對於胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2的胞外多醣-生產能力的影響。

首先，將於實施例1的第B項「活化乳酸菌分離株」中所得到的經活化的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2分成5個實驗組(亦即實驗組1至5)，繼而將實驗組1至5分別接種至不同的經修改的MRS-SL肉湯培養基(100 mL)中，該等經修改的MRS-SL肉湯培養基的氮源組成分別如下面表8中所示，而碳源組成皆為4%葡萄糖。 表8. 各組的經修改的MRS-SL肉湯培養基中的氮源組成

將各組的培養物置於一恆溫振盪培養箱(30℃、100 rpm)中進行培養歷時48小時之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「胞外多醣的分離與純化」以及第2項「胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離、純化與濃度測定，並依照第3項「β-1,3-葡聚醣濃度的測定」當中所述的方法來進行β-1,3-葡聚醣的濃度測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖7中。

由圖7可見，實驗組2的胞外多醣產量明顯高於其他各組所具者，而實驗組1的β-1,3-葡聚醣的產量明顯高於其他各組所具者。這個實驗結果顯示：單獨以酵母萃取物作為生長所需的氮源有利於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2生成大量的胞外多醣，而在酵母萃取物之外進一步使用蛋白腖則有利於生成大量的β-1,3-葡聚醣。

此外，申請人亦進一步探討呈不同比例之蛋白腖與酵母萃取物對於胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2的胞外多醣-生產能力的影響。

首先，將於實施例1的第B項「活化乳酸菌分離株」中所得到的經活化的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2分成6個實驗組(亦即實驗組1至6)，繼而將實驗組1至6分別接種至不同的經修改的MRS-SL肉湯培養基(100 mL)中，其中，該等經修改的MRS-SL肉湯培養基的氮源組成分別如下面表9中所示，而碳源組成皆為4%葡萄糖。 表9. 各組的經修改的MRS-SL肉湯培養基中的氮源組成

將各組的培養物置於一恆溫振盪培養箱(30℃、100 rpm)中進行培養歷時48小時之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「胞外多醣的分離與純化」以及第2項「胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離、純化與濃度測定，並依照第3項「β-1,3-葡聚醣濃度的測定」當中所述的方法來進行β-1,3-葡聚醣的濃度測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖8中。

由圖8可見，實驗組1至6的胞外多醣產量會隨著酵母萃取物在總氮源中所佔的比例增加而提升。另外，實驗組2的β-1,3-葡聚醣的產量明顯高於其他各組所具者。這個實驗結果顯示：以越多的酵母萃取物作為氮源有利於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2生成越多的胞外多醣，而以呈一比例為1:4的酵母萃取物以及蛋白腖作為氮源則有利於生成大量的β-1,3-葡聚醣。C、 溫度對於胚芽乳桿菌胚芽亞種 LPCS2 的胞外多 醣 - 生產能力之影響：

本實驗是探討不同的培養溫度對於胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2的胞外多醣-生產能力的影響。

將於實施例1的第B項「活化乳酸菌分離株」中所得到的經活化的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2分成5個實驗組(亦即實驗組1至5)，繼而將實驗組1至5分別接種至經修改的MRS-SL肉湯培養基(100 mL)中，其中，該等經修改的MRS-SL肉湯培養基中的碳源組成皆為4%葡萄糖，而氮源組成皆為2%蛋白腖以及0.5%酵母萃取物。

將實驗組1至5分別置於溫度被設定為16、23、30、37以及44℃的恆溫振盪培養箱(100 rpm)中進行培養歷時48小時之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「胞外多醣的分離與純化」以及第2項「胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離、純化與濃度測定，並依照第3項「β-1,3-葡聚醣濃度的測定」當中所述的方法來進行β-1,3-葡聚醣的濃度測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖9中。

由圖9可見，實驗組1至4的胞外多醣以及β-1,3-葡聚醣的產量皆明顯高於實驗組5所具者，其中，實驗組2具有最高的胞外多醣以及β-1,3-葡聚醣的產量。這個實驗結果顯示：16至37℃的培養溫度有利於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2生產大量的胞外多醣，特別是β-1,3-葡聚醣。D、 pH 值對於胚芽乳桿菌胚芽亞種 LPCS2 的胞外多 醣 - 生產能力之影響：

本實驗是探討不同的pH值對於胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2的胞外多醣-生產能力的影響。

首先，將於實施例1的第B項「活化乳酸菌分離株」中所得到的經活化的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2分成3個實驗組(亦即實驗組1至3)，繼而將實驗組1至3分別接種至經修改的MRS-SL肉湯培養基(100 mL)中，其中，該等經修改的MRS-SL肉湯培養基的碳源組成皆為4%葡萄糖，而氮源組成皆為2%蛋白腖以及0.5%酵母萃取物。將各組的培養物置於一恆溫振盪培養箱(23℃、100 rpm)中進行培養歷時12小時之後，所形成的培養物被拿來作為胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2的接種源。

隨後，將各組的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2的接種源分別以一為100 mL的接種量接種至含有3L經修改的MRS肉湯培養基之5 L的發酵槽中，其中，實驗組1至3所使用的經修改的MRS肉湯培養基的碳源組成皆為4%葡萄糖，氮源組成皆為2%蛋白腖以及0.5%酵母萃取物，而pH值分別為6.5、5.5以及4.5。接著，在一兼性厭氧環境下以及一為23℃的溫度下進行發酵反應歷時72小時。在發酵的期間，使用5 N的磷酸以及1 N的氫氧化鈉來維持各組的pH值。在發酵反應結束之後，收取發酵培養物，繼而依照上面“一般實驗方法”的第1項「胞外多醣的分離與純化」以及第2項「胞外多醣濃度的測定」當中所述的方法來進行胞外多醣的分離、純化與濃度測定，並依照第3項「β-1,3-葡聚醣濃度的測定」當中所述的方法來進行β-1,3-葡聚醣的濃度測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。所得到的結果被顯示於圖10中。

由圖10可見，實驗組1與3的胞外多醣的產量皆明顯高於實驗組2所具者。另外，實驗組3的β-1,3-葡聚醣的產量明顯高於其他各組所具者。這個實驗結果顯示：pH值為6.5與4.5的培養環境有利於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2生產大量的胞外多醣，其中，pH值為4.5的培養環境有利於生產大量的β-1,3-葡聚醣。

另外，申請人發現，針對在上面實施例3中被拿來與本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2相比較的胚芽乳桿菌胚芽亞種BCRC 10069^T ，在國立台灣大學食品科技研究所的陳智強所著碩士論文[名稱：“培養條件對乳酸菌胞外多醣生產及抗氧化性之影響(Effect of fermentation conditions on the production and antioxidative activity of exopolysaccharide from several lactics)”]中有測試其在生產胞外多醣上所偏好的培養條件。為供比較，其相關結果與本發明所具者一起被整理於下面的表10中。 表10. 胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2與BCRC 10069^T 所偏好的培養條件

依據表5以及表10的實驗結果，申請人認為：本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2是一株新穎的胚芽乳桿菌胚芽亞種分離株。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中： 圖1顯示不同的乳酸菌分離株分別在胞外多醣-生產能力上的比較； 圖2顯示不同的乳酸菌分離株分別在β-1,3-葡聚醣-生產能力上的比較； 圖3顯示不同的乳酸菌分離株之胞外多醣試驗溶液在刺激小鼠巨噬細胞RAW 264.7分泌NO上的效用比較，其中對照組表示未經任何處理的RAW 264.7細胞；正對照組表示被處理以2 μg/mL的脂多醣的RAW 264.7細胞；實驗組C1、C2、J、K1、L1、LPCS2以及AL分別表示被處理以對應的乳酸菌分離株的胞外多醣試驗溶液之RAW 264.7細胞；“*”表示當與對照組作比較，p ＜0.05；以及“**”表示當與對照組作比較，p ＜0.01； 圖4顯示以不同的乳酸菌分離株之胞外多醣試驗溶液刺激RAW 264.7細胞所得到的培養上清液在抑制人類乳癌細胞MDA-MB-231生長上的效用比較，其中空白對照組表示未經任何處理的MDA-MB-231細胞；對照組表示被處理以未經胞外多醣試驗溶液刺激的RAW 264.7細胞的培養上清液之MDA-MB-231細胞；實驗組C1、C2、J、K1、L1、LPCS2以及AL分別表示被處理以經對應的乳酸菌分離株的胞外多醣試驗溶液刺激的RAW 264.7細胞的培養上清液之MDA-MB-231細胞；以及“*”表示當與空白對照組作比較，p ＜0.05； 圖5顯示不同碳源組成對於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2在胞外多醣與β-1,3-葡聚醣的生產能力上的影響，其中實驗組1至5分別表示在表6中所示的碳源組成下被培養的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2； 圖6顯示不同濃度之葡萄糖對於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2在胞外多醣與β-1,3-葡聚醣的生產能力上的影響，其中實驗組1至5分別表示在表7中所示的碳源組成下被培養的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2； 圖7顯示不同氮源組成對於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2在胞外多醣與β-1,3-葡聚醣的生產能力上的影響，其中實驗組1至5分別表示在表8中所示的氮源組成下被培養的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2； 圖8顯示不同比例之蛋白腖與酵母萃取物對於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2在胞外多醣與β-1,3-葡聚醣的生產能力上的影響，其中實驗組1至6分別表示在表9中所示的氮源組成下被培養的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2； 圖9顯示不同培養溫度對於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2在胞外多醣與β-1,3-葡聚醣的生產能力上的影響，其中實驗組1至5分別表示在16、23、30、37以及44℃的培養溫度下被培養的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2；以及 圖10顯示不同pH值對於本發明的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2在胞外多醣與β-1,3-葡聚醣的生產能力上的影響，其中實驗組1至3分別表示在6.5、5.5以及4.5的pH值下被培養的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2。

TW中華民國；食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2017/09/08；BCRC 910796。

＜110＞ 南臺學校財團法人南臺科技大學 ＜120＞ 具有高胞外多醣-生產能力的胚芽乳桿菌胚芽亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ) LPCS2分離株及其用途 ＜160＞ 1 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 1519 ＜212＞ DNA ＜213＞ 胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2 ＜400＞ 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gaactctggt attgattggt 60 gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc 120 tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa taccgcataa caacttggac 180 cgcatggtcc gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt ttggatggtc ccgcggcgta 240 ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat acgtagccga cctgagaggg 300 taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360 atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg 420 gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga gtaactgttc aggtattgac 480 ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540 gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 600 gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 660 gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720 ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac 780 aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt 840 ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cggccgcaag 900 gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960 gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactat gcaaatctaa gagattagac 1020 gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080 tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc agttgccagc attaagttgg 1140 gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200 atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaac 1260 tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg 1320 cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc 1380 cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg 1440 gtaacctttt aggaaccagc cgcctaaggt gggacagatg attagggtga agtcgtaaca 1500 aggtagccgt aggagaacc 1519

Claims (12)

1. 一種胚芽乳桿菌胚芽亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ) LPCS2，其以寄存編號BCRC 910796被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。
2. 一種用於生產胞外多醣的方法，其包括：將一如請求項1的胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2培養於一適於該菌株生長的培養基中。
3. 如請求項2的方法，其中該胞外多醣是β-1,3-葡聚醣。
4. 如請求項3的方法，其中該培養基包含有葡萄糖。
5. 如請求項4的方法，其中以該培養基的總體積為計算基礎，該葡萄糖具有一範圍落在2.0至8.0% (v/v)的濃度。
6. 如請求項3的方法，其中該培養基包含有蛋白腖與酵母萃取物。
7. 如請求項6的方法，其中在該培養基中，酵母萃取物與蛋白腖是呈一為1:4 (v/v)的比例。
8. 如請求項3的方法，其中胚芽乳桿菌胚芽亞種LPCS2是於一範圍落在16至37℃的溫度下被進行培養。
9. 如請求項3的方法，其中該培養基具有一為4.5的pH值。
10. 一種含有胞外多醣的培養物，它是藉由一如請求項2至9中任一項的方法而被製得。
11. 一種藥學組成物，其包含有一如請求項10的培養物，以及選擇性地一藥學上可接受的載劑。
12. 一種食品產品，其包含有一如請求項10的培養物。