CN105555283B - 用于婴儿过度啼哭的益生菌 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含104至1012cfu/g的戊糖片球菌细胞的细菌组合物，所述戊糖片球菌细胞除了其它特征外具有诱导白介素‑10的生成以降低肠道中的炎症的能力。如此，细菌组合物可用于改善婴儿中的过度啼哭。特别地，戊糖片球菌细胞来自以CECT 8330保藏的菌株。细菌组合物可以为食物补充物、药物、婴儿配方乳品、食用产品和食物产品的形式。特别地，组合物为油性悬浮液形式的婴儿食物补充物形式。
Description
本发明涉及医药、微生物和营养领域，且具体而言涉及基于戊糖片球菌细胞的新的益生菌组合物。由于其生物功能性，组合物特别可用于改善婴儿中的过度啼哭。
发明背景
过度啼哭(excessive crying)是婴儿生命的前12个月中访视儿科医生的最常见原因之一。其发生率可以达到高达40％的数值。啼哭持续超过3个月的婴儿在学龄(schoolyears)中有不利后果的风险，包括焦虑、攻击性、活动过度、变态反应、睡眠障碍及以后岁月中甚至更多的不良心理健康的风险。过度啼哭不仅对于婴儿，而且对于父母以及一般对于家庭生活质量都是一项严重问题。过度啼哭导致父母筋疲力尽，并且具有许多不利的后果，包括难以集中(difficulties with concentration)、丧失耐心(loss of patience)、挫折、感觉无能(feeling of incompetence)、害怕伤害孩童、母乳喂养的早期停止和与其孩童的面对面交流减少。此外，在一些情况中，挫折可以导致一些有害行为来使啼哭停止，诸如拍击或摇动孩童。
尽管婴儿啼哭通常与明显的疾病状况有关，但是过度阵发性啼哭可以由于未知病因学的不同状况(例如婴儿绞痛)在表面健康且营养充足的婴儿中没有清楚原因而表现。关于此类状况的起源和它们应当如何限定，很少有一致。然而，已经提出了它们可以完全由胃肠障碍，诸如肠不成熟、痉挛性结肠、食物超敏感性、改变的肠微生物区系(microbiota)和气体生成引起。
传统上，不同药物疗法已经在用于减少啼哭和烦躁(fussing)，尤其是在“绞痛婴儿(colicky infant)”。最常用的药物之一是西甲硅油(simethicone)，但是临床试验的结果不确定。已经显示了基于盐酸双环胺(dicyclomine hydrochloride)或西托溴铵(cimetropium bromide)的其它治疗是更有效的，但是可能导致不想要的副作用，这限制了其使用，尤其是在小于6个月龄的婴儿中。
已经提出了草药治疗法(remedy)作为备选，尽管科学证据不足。显示了商品化组合物
(具有来自母菊(Matricaria recutita)、茴香(Foeniculum vulgare)和香蜂草(Melissa officinalis)的植物提取物)在双盲安慰剂对照临床试验中缩短啼哭时间。相反，已经报告了洋薄荷(Mentha piperita)提取物对于治疗婴儿绞痛是无效的。此外，已经在评估草药补充物的几项研究中鉴定出几种副作用，包括呕吐、嗜睡(sleepiness)、便秘和食欲缺乏。
已经报告了设计为克服食物变态反应的婴儿配方乳品(即具有低乳糖含量或部分水解的乳清蛋白的配方乳品)减少啼哭事件。然而，这些配方乳品可以使其过度啼哭主要与食物变态反应有关的那些婴儿受益。还已经提出了高纤维或富含纤维的配方乳品为一种可能的治疗，但是在与标准配方乳品相比时，尚未发现症状的显著差异。
基于异常肠微生物区系可以促成过度啼哭状况的假设，已经出现了对作为有希望的治疗的益生菌(probiotics)的极大兴趣。益生菌定义为“活的微生物，其在以某些量摄取后发挥超出固有基础营养的健康益处”。几种乳酸细菌和来自双歧杆菌属(Bifidobacterium)或乳杆菌属(Lactobacillus)的物种是益生性的，这暗示了已经显示了它们促进特定的健康益处。益生性细菌必须满足与毒性缺乏、存活力、粘附和有益效果相关的几个要求。这些益生性特征是菌株依赖性的，即使在相同物种的细菌中。因此，找到发挥期望益生性功能的那些菌株是重要的。
已经研究了仅少数用于治疗过度啼哭的益生性组合物。已经研究了包含鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG、鼠李糖乳杆菌LC705、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)Bbi99和费氏丙酸杆菌shermanii JS亚种(Propionibacterium freudenreichiissp.shermanii JS)的益生性配方乳品的效力，在啼哭模式上没有令人满意的结果(Mentula,S.et al.“Microbial composition and fecal fermentation end productsfrom colicky infants-A probiotic supplementation pilot”,Microbial Ecology inHealth and Disease 2008,vol.20,no.1,pp.37-47)。另一项研究评估了富含alpha-乳清蛋白的且补充益生菌的配方乳品(鼠李糖乳杆菌、婴儿双岐杆菌(Bifidobacteriuminfantis))对绞痛的影响。配方乳品降低喂养相关的胃肠副作用、应激性和兴奋，但是在啼哭持续时间中没有发现差异(Dupont,C.et al.“Α-Lactalbumin-Enriched andProbiotic-Supplemented Infant Formula in Infants with Colic:Growth andGastrointestinal Tolerance”European Journal of Clinical Nutrition 2010,vol.64,no.7,pp.765-767)。已经在WO2007142596中披露了罗伊乳杆菌(Lactobacillusreuteri)DSM 17938用于治疗绞痛相关过度啼哭的有益效果。测定了此菌株的效力，对婴儿啼哭具有有利的结果(Savino,F.et al."Lactobacillus reuteri(American TypeCulture Collection Strain 55730)versus Simethicone in the Treatment ofInfantile Colic:A Prospective Randomized Study"Pediatrics 2007,vol.119,no.1:e124-e130；Savino,F.et al."Lactobacillus reuteri DSM 17938in Infantile Colic:ARandomized,Double-Blind,Placebo-Controlled Trial"Pediatrics 2010,vol.126,no.3:e526-e533；Szajewska,H.et al."Lactobacillus reuteri DSM 17938for theManagement of Infantile Colic in Breastfed Infants:A Randomized,Double-Blind,Placebo-Controlled Trial",Journal of Pediatrics 2012,vol.162,no.2,pp.257-262)，但是不能改善肠生物多样性(Roos,S.et al.“454Pyrosequencing Analysis onFaecal Samples from a Randomized DBPC Trial of Colicky Infants Treated withLactobacillus reuteri DSM 17938”,PLoS ONE 2013,vol.8,no.2,e56710 1-5)。
在关于具有绞痛的婴儿的肠微生物区系的研究的最近文章中，已经提出了过度啼哭可能是由于较高的病原体水平及抗炎性乳酸杆菌的减少所致的增加的炎性引起(DeWeerth,C.et al."Intestinal Microbiota of Infants With Colic:Development andSpecific Signatures"Pedriatrics 2013,vol.131,Number 2,e550–e558)。
WO2007142596披露了罗伊乳杆菌DSM17938菌株由于其促进大量的抗炎性细胞因子IL-10的能力而可用于治疗婴儿绞痛。
戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)通常在蔬菜和肉类的发酵中使用，并且在饲料中作为食物防腐剂添加以抑制食物腐败性细菌和食物传播性病原体的生长。然而，认为市场上没有基于戊糖片球菌在人中用作益生菌的产品。
已经披露了植物衍生的戊糖片球菌菌株作为干扰素-gamma和白介素IL-12p70的分泌水平的诱导物，以及卵清蛋白致敏的小鼠肾细胞中的IL-4生成的抑制剂。因此，该细菌可以有效刺激免疫活性，并且显示由于此类促炎性细胞因子的诱导所致的变应性抑制效果(Jonganurakkun,B.et al."Pediococcus pentosaceus NB-17for probiotic use",Journal of Bioscience and Bioengineering 2008vol.106,Issue 1,p.69–73)。
在相同方向上，Igarashi T.2010公开了菌株戊糖片球菌(KKM122)强烈诱导促炎性细胞因子IL-12的生成(Igarashi T."Study of the relationship between changesin lactic acid bacterial cell components and stimulation of IL-12productionunder salt-stressed conditions”,Bioscience,Biotechnology and Biochemistry2010,74,pp.2171-2175)。
Vitali et al.2012披露了属于不同物种的48种乳酸细菌菌株调控27种免疫介质(细胞因子、趋化因子和生长因子)合成的能力的研究。在此类免疫介质中，准备测定法以检测IL-10。用经LPS刺激的Caco-2和PBMC细胞进行测定法。结果指示了刺激了少数趋化因子。所有菌株显著刺激具有促炎性活性的免疫介质(IL-17、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)和干扰素-gamma)，接着是细胞因子IL-1beta、趋化因子干扰素-gamma诱导的蛋白-10(IP-10)、细胞因子IL-6和趋化因子巨噬细胞炎性蛋白-1alpha(MIP-1alpha)。仅少数菌株增加具有抗炎性活性的细胞因子合成。在测试的菌株中，从番茄分离的戊糖片球菌菌株刺激细胞因子IL-1beta、IL-4、IL-17和干扰素-gamma，而非IL-10。基于免疫调控活性，在此研究中不选择此菌株作为新的益生菌候选物以进一步表征(Vitali,B.et al."Novel probioticcandidates for humans isolated from raw fruits and vegetables",FoodMicrobiology 2012,31(1),pp.116-125)。
因此，清楚的是过度阵发性啼哭对于父母双方和婴儿可以具有立即且非常严重的后果。因此，需要安全且有效的组合物和治疗。在此领域中，可以认为益生菌是目前疗法的一种有希望的备选，但是需要进一步研究。
发明概述
本发明要解决的问题是提供可用于改善婴儿中的过度啼哭的新的组合物和治疗法。
解决办法基于新的戊糖片球菌菌株，本发明人已经发现了该戊糖片球菌菌株具有可用于改善婴儿中的过度啼哭的相关生物功能性。
首先重要的是注意到益生性配制剂中最常使用的细菌来自乳杆菌属和双歧杆菌属。因此，片球菌属在用作益生菌方面是非常罕见的，且对于儿童甚至更不常见。
如上文提及，现有技术已经描述了过度啼哭可以由升高的病原体水平以及抗炎性乳酸杆菌的减少所致的升高的炎性引起。还已经描述了罗伊乳杆菌DSM 17938(源自罗伊乳杆菌ATCC 55730)可用于通过其促进大量抗炎性细胞因子白介素-10(IL-10)的能力而治疗婴儿绞痛。因此，似乎增加IL-10量的能力与啼哭的改善相关。
然而，认为现有技术尚未描述具有此特征的戊糖片球菌菌株。实际上，相关现有技术描述了具有与本发明完全处于相反方向的特征的戊糖片球菌菌株。因此，诱导IL-10生成的能力不是戊糖片球菌细菌的内在或固有特征。例如，Igarashi T.2010披露了一种戊糖片球菌菌株(KKM122)，其强烈诱导促炎性细胞因子IL-12的生成，从而引起炎症，这是与本发明相反的效应。此外，Vitali et al.2012披露了一项广泛的研究，其实现包括IL-10在内的27种免疫介质的测定。然而，仅少数菌株增加了具有抗炎性活性的细胞因子的合成，并且尽管从番茄分离的戊糖片球菌菌株刺激细胞因子IL-1beta、IL-4、IL-17和干扰素-gamma，但它对IL-10没有影响。相关的是提到Vitali et al.2012中用于测定IL-10的测定法非常类似于本文中描述的，但是明显的是，Vitali et al.2012中没有鉴定具有诱导IL-10的能力的戊糖片球菌菌株。
总之，在对现有技术寻找具有此特性的细菌时，在具有此特性的细菌物种间没有找到戊糖片球菌。如此，认为现有技术没有描述包含104至1012cfu/g戊糖片球菌细胞的细菌组合物，所述戊糖片球菌细胞具有诱导IL-10的生成以降低肠道中的炎症的能力，如本文中描述的。
令人惊讶地，发明人已经发现了具有诱导IL-10生成的能力的戊糖片球菌菌株。查看现有技术，不能知道戊糖片球菌细菌具有这些特征。
因此，本文中提供了菌株戊糖片球菌CECT 8330。此外，依靠详细描述的筛选方法，似乎可能的是鉴定并分离戊糖片球菌细胞合并物(pool)内除了CECT 8330菌株外的戊糖片球菌菌株，其具有诱导IL-10生成的相同能力。
因此，本发明提供了作为一个方面，戊糖片球菌CECT 8330菌株。本发明描述了对于改善过度啼哭而言相关的细菌中的某些生物学特征；即诱导IL-10生成的能力作为最相关的特征。在本文中，依靠实施例证明了所述特征似乎真的与改善婴儿中的过度啼哭相关。因此，尽管已经鉴定了具有此特征的一种戊糖片球菌菌株(CECT 8330)，但是不限于理论，没有理由限制本发明的范围到此菌株，因为本文中似乎真实描述了得到其他良好菌株的所有方法步骤。因此，本发明还提供了具有相同特征的除了CECT 8330菌株外的戊糖片球菌菌株合并物。不是所有属于戊糖片球菌物种的菌株会具有诱导IL-10的能力。本发明提供了识别它们的方法。
因而，本发明的第一个方面涉及细菌组合物，其包含104至1012cfu/g的戊糖片球菌细胞，该戊糖片球菌细胞具有诱导白介素-10生成的能力，其中在存在戊糖片球菌细胞的情况中由THP-1巨噬细胞进行的白介素-10生成表示为标准化增加，当通过以下步骤确定所述标准化增加时，其比阴性对照的白介素-10生成较高，所述阴性对照是不存在戊糖片球菌细胞的THP-1巨噬细胞：
(a)将THP-1单核细胞分化成巨噬细胞，其通过在具有10％胎牛血清(FBS)，以及具有至终浓度0.16μM的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸盐(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)的洛斯维帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute)RPMI 1640培养基中培养自英格兰公共卫生部门(Public Health England)的细胞保藏中心获得的目录号88081201的THP-1单核细胞细胞系进行；
(b)在24孔ELISA板中在具有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养THP-1巨噬细胞至终浓度106个巨噬细胞/孔；
(c)将所述THP-1巨噬细胞与终浓度10ng/ml的脂多糖(LPS)一起温育2.5小时，并且用杜伯科(Dulbecco)氏磷酸盐缓冲盐水培养基D-PBS清洗所述THP-1巨噬细胞；
(d)得到戊糖片球菌细胞培养物，其通过在Man，Rogosa和Sharpe培养基(MRS)中于37℃在5％CO2环境中将它培养过夜准备好；
(e)对每个ELISA-孔添加500μl具有10％FBS的RPMI 1640培养基和合适量的戊糖片球菌细胞稀释液以获得最终比率25:1，即2.5 x 107cfu的戊糖片球菌细胞:106个THP-1巨噬细胞；
(f)于37℃将所述THP-1巨噬细胞与所述戊糖片球菌细胞一起温育2.5小时，或者在相同条件下不与所述戊糖片球菌细胞一起温育，作为阴性对照；
(g)用D-PBS培养基清洗所述THP-1巨噬细胞以除去所述戊糖片球菌细胞，随后对所述THP-1巨噬细胞添加具有补充有50μg/ml庆大霉素、10μg/ml氨卡青霉素和12μg/ml氯霉素的10％FBS的RPMI 1640培养基，于37℃于5-7％CO2温育，并且在5和24小时时采集等分试样；
(h)将所述等分试样离心，并且通过流式细胞术测定上清液以量化白介素-10；并且
(i)用公式(IL1024h-IL105h)/IL105h计算白介素-10浓度的标准化增加；其中IL105h和IL1024h分别是在5和24小时时以pg/ml计的白介素-10浓度。
如此，基于本文中描述的详细测定法(对于IL-10诱导测定法，参见实施例1)，技术人员按常规能够重复此测定法以客观确定感兴趣的戊糖片球菌是否符合本发明的第一个方面的IL-10水平。在符合IL-10诱导水平的戊糖片球菌细胞内，本文中提供了保藏的菌株戊糖片球菌CECT 8330。
如本文中描述的新的细菌组合物对于人且特别是对于婴儿可用作益生性补充物。因而，本发明的第二个方面涉及如本文中定义的细菌组合物，其在改善婴儿中的过度啼哭中使用。在此意义上，认为现有技术尚未描述在改善婴儿中的过度啼哭中使用的戊糖片球菌细胞。
或者，此方面可以阐明为如本发明的第一个方面中限定的细菌组合物用于制备用于改善婴儿中的过度啼哭的食物补充物、药物、婴儿配方乳品、食用产品或食物产品的用途。或者，这可以阐明为用于改善婴儿中的过度啼哭的方法，包括对所述婴儿施用有效量的如本发明的第一个方面中限定的细菌组合物。
本发明的另一个方面是作为药物使用的如本文中限定的细菌组合物。
如本文中使用的，术语“有效量”指组合物中的每种菌株的菌落形成单位(cfu)的量，其在合理医学判断的范围内高得足以以积极的方式显著减轻要治疗的状况，但是低得足以避免严重副作用(以合理的益处/风险比率)。
本发明的第三个方面涉及长双歧杆菌CECT 7894菌株。
最后，本发明的第四个方面涉及用于筛选和分离新的戊糖片球菌细胞的方法，其包括下述步骤：
(i)通过遵循上文描述的IL-10诱导测定法的步骤对来自戊糖片球菌细胞合并物的新的戊糖片球菌细胞测定其诱导白介素-10生成的能力；并
(ii)从所述合并物中选择并分离所述新的戊糖片球菌细胞，该新的戊糖片球菌细胞诱导表示为标准化增加的白介素-10生成，其当遵循IL-10诱导测定法的步骤测定所述标准化增加时高于阴性对照的标准化增加。
对于技术人员明显的是，一旦本文的发明人公开了相关测试测定法以及符合诱导的IL-10水平的保藏菌株CECT 8330，选择符合本发明的第一方面的标准的其它新的戊糖片球菌细胞对于技术人员将是常规的工作。
发明详述
术语“细菌组合物”应当根据技术理解为包含一定数目的细菌细胞的组合物，其中104至1012cfu/g来自根据第一个方面的具有感兴趣特征的戊糖片球菌细胞。细菌组合物可以含有诸如载体或赋形剂等添加剂。然后，可以将细菌组合物包装到合适的容器中。
术语“cfu/g”指组合物本身的克重量，其包含组合物中存在的相关添加剂。它不包含用于包装细菌组合物的合适容器的重量。
本发明的第一个方面涉及细菌组合物，其包含104至1012cfu/g的戊糖片球菌细胞，该戊糖片球菌细胞在通过上文提及的步骤测定标准化增加时具有下述的能力，即诱导由THP-1巨噬细胞细胞进行的白介素-10生成，其高于在缺乏戊糖片球菌细胞的情况中的THP-1巨噬细胞的白介素-10生成。
IL-10(又称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF))是一种抗炎性细胞因子，其抑制多种细胞因子的合成，包括由活化的巨噬细胞及由辅助T细胞生成的IFN-gamma、IL-2、IL-3、TNF和GM-CSF。术语细胞因子指用于细胞信号传导的小信号传导分子。细胞因子可以分类为蛋白质、肽或糖蛋白。在此情况中，IL-10是一种具有免疫调控特性的蛋白质细胞因子。
在一个具体的实施方案中，在通过上文提及的步骤测定标准化增加时，在存在戊糖片球菌细胞的情况中的THP-1细胞的IL-10生成(表示为标准化增加)比在缺乏戊糖片球菌细胞的情况中的THP-1细胞的IL-10生成高至少2倍。在其它具体的实施方案中，标准化增加比对照高至少3倍、4倍、5倍或6倍。
承接诱导IL-10生成的能力，戊糖片球菌细胞具有针对过度啼哭婴儿中通常丰富的细菌物种的不想要成员的感兴趣拮抗特性(参见实施例2)。术语“拮抗”在本文中理解为对细菌生长的抑制或降低。因而，在另一个具体的实施方案中，细菌组合物的戊糖片球菌细胞具有拮抗革兰氏阳性和革兰氏阴性肠道细菌的能力。特别地，革兰氏阳性细菌包含选自下组的细菌：艰难梭菌和粪肠球菌。在另一个具体的实施方案中，革兰氏阴性细菌包含选自下组的细菌：大肠杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯氏菌和普通拟杆菌。在另一个具体的实施方案中，戊糖片球菌细胞具有拮抗艰难梭菌、粪肠球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯氏菌和普通拟杆菌的能力，其中通过下述步骤测定拮抗的能力：
(i)在含有Oxoid培养基的平板中一致拭抹病原体菌株，并且在CO2培养箱中于适合于每种病原体生长的温度和％CO2培养到汇合；
(ii)将所述戊糖片球菌细胞的一致接种汇合琼脂板的两个6mm直径圆筒切片置于与所述病原体接种平板接触，使下述两者相对：(a)一个圆筒切片的生长侧对着所述病原体接种平板；和(b)另一个圆筒切片的非生长侧对着所述病原体接种平板；并且于37℃温育过夜；
(iii)次日通过将所述琼脂平板放置到平尺(flat rule)上测量抑制圈；并
(iv)计算生长抑制活性，其通过遵循公式GI＝(IZD-CD)/2，从以厘米测量的抑制圈直径(IZD)减去圆筒直径(CD)，并将此差值除以2进行。
在一个具体的实施方案中，戊糖片球菌细胞来自以保藏号CECT 8330保藏于西班牙典型培养物保藏中心的戊糖片球菌。
戊糖片球菌CECT 8330
新戊糖片球菌菌株的样品已经由保藏机构AB-Biotics S.A.，位于EdificiEureka，office P1M1.1，Campus UAB,08193-Bellaterra(西班牙)保藏于Edificio3 CUE,Parc Científic Universitat de València,Catedrático Agustín Escardino,9,46980Paterna,Valencia(西班牙)的CECT(Colección
de Cultivos Tipo)。该菌株以保藏日2013年4月30日在保藏号CECT 8330下保藏。在国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的条件下进行保藏。保藏机构给予的标识参考是F3403。
如下文实施例中显示的，戊糖片球菌CECT 8330展示用于改善婴儿中的过度啼哭的下述令人感兴趣的特性：
·诱导IL-10生成的能力，如表1，实施例1中显示。
·针对研究的整个病原体谱的抑制性活性(表2，实施例2)。该菌株不仅有效抑制革兰氏阳性细菌，也抑制革兰氏阴性细菌。这是有极大兴趣的，因为它针对细菌诸如大肠杆菌、克雷伯氏菌属和梭菌属物种提供保护，所述细菌在呈现过度啼哭的婴儿中是异常丰富的。
·不生成乙醇和CO2，如此不引起婴儿烦乱(disturbances)。
此外，菌株CECT 8330具有特别可用作益生菌的优点。益生性细菌必须满足与毒性缺乏、存活力、粘附和有益效果相关的几项要求。每种细菌菌株的特性是独特的，并且不能外推到相同物种的其它菌株。因此，重要的是找到那些在所有益生性要求中具有更好表现的菌株。为了确保菌株CECT 8330能够克服胃肠(GI)道，开发出模拟其条件的体外方案。量化用溶菌酶、过氧化氢、酸性环境和胆汁盐处理后的存活。这是一项证实性实验，因为菌株使用非常高的稀释度从人粪便中分离，并且其在粪便中的存在较高。结果指示该菌株能够幸免于GI道的通过。
还对菌株CECT 8330测定其定殖肠道的能力。这是一个关键点，因为它确保观察到的生物功能性可以由该菌株形成。在实验开发中，使用肠粘液和Caco-2细胞，这模拟益生性菌株的结肠锚定位置。从氚标记胸苷的闪烁测量菌株的粘附能力，并且与用作对照的罗伊乳杆菌菌株比较。粘液细胞粘附和Caco-2细胞粘附分别是1.40 x 106和4.5 x 106cfu/cm2(罗伊乳杆菌：6.58 x 106和1.01 x 106cfu/cm2)。如此，结果指示了与罗伊乳杆菌相当，CECT 8330具有良好的对肠上皮的粘附，这容许它保留于肠道中，并且发挥其益生性效果。
菌株CECT 8330在工业培养基中具有良好的生长。
此外，菌株CECT 8330属于具有QPS状态的细菌物种(Andreoletti,O.et al."Themaintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food orfeed.Question no:EFSA-Q-2008-006",The EFSA Journal 2008.923:p.1-48).QPS(“合格的推定安全(Qualified Presumption of Safety)”)是一种由欧洲食品安全管理局(European Food Safety Authority)开发的系统，以授予具有经证明的长期表观安全使用史的分类学单元。
长双歧杆菌CECT 7894
在另一个具体的实施方案中，细菌组合物进一步包含104至1012cfu/g长双歧杆菌CECT 7894细胞。
新的长双歧杆菌菌株的样品已经由保藏机构AB-Biotics S.A.，位于EdificiEureka，office P1M1.1，Campus UAB,08193-Bellaterra(西班牙)保藏于Edificio 3CUE,Parc Científic Universitat de València,Catedrático Agustín Escardino,9,46980Paterna,Valencia(西班牙)的CECT(Colección
de Cultivos Tipo)。该菌株以2011年3月30日的保藏日期在保藏号CECT 7894下保藏。在国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的条件下进行保藏。保藏机构给予的标识参考是Bif F2。
菌株长双歧杆菌CECT 7894也具有用于改善婴儿中的过度啼哭的令人感兴趣的特性，如实施例中显示的：
·诱导IL-10生成的能力，如表1，实施例1中显示。
·针对研究的整个病原体谱的抑制性活性(表2，实施例2)。该菌株不仅有效抑制革兰氏阳性细菌，还抑制革兰氏阴性细菌。参见关于菌株CECT 8330的评述。
·不生成乙醇和CO2，如此不引起婴儿烦乱。
如对于戊糖片球菌菌株CECT 8330，也对长双歧杆菌CECT 7894测定其克服胃肠(GI)道的能力。结果指示菌株能够幸免于GI道的通过。
遵循上文对戊糖片球菌提及的测定法，也对菌株CECT 7894测定其定殖肠道的能力。菌株CECT 7894的粘液细胞粘附和Caco-2细胞粘附分别是1.21 x 105和1.18 x 106cfu/cm2(罗伊乳杆菌：6.58 x 106和1.01 x 106cfu/cm2)。如此，结果指示与罗伊乳杆菌相当，CECT 7894具有良好的对肠上皮的粘附能力，这容许它保留于肠道中，并且发挥其益生性效果。
菌株CECT 7894在工业培养基中也具有良好的生长。
因此，这两种菌株戊糖片球菌CECT 8330和长双歧杆菌CECT 7894共享各种功能特性，所述功能特性使它们适合于其在改善婴儿的过度啼哭中使用，通过在单一配方乳品中分开或一起使用所述菌株进行。除了其它特性外，它们都具有诱导IL-10生成的能力，并且它们有效抑制肠道细菌(革兰氏阳性还有革兰氏阴性细菌)的生长。
此外，菌株具有的优点在于它们不产生气体。异质发酵性(heterofermentative)细菌通过葡萄糖发酵生成CO2和乙醇以及乳酸。乙醇可以影响肠运动性，产生绞痛婴儿特征性的腹胀。CO2可以导致腹中积气(meteorism)(气体积累)和肠胃气胀(flatulence)，也是绞痛婴儿典型的。已经描述了绞痛婴儿中异质发酵性菌株的存在较高。比较而言，本发明的菌株不产生乙醇也不产生CO2，如此在此意义上不对婴儿引起障碍。
如对于本领域技术人员显而易见的，戊糖片球菌CECT 8330和长双歧杆菌CECT7894在依靠其自身使用时或者在单一组合物中组合时是有效的。它们也可以在同时、序贯或在某些时间段后分开施用的两种不同组合物中施用。
鉴于上文描述的特性，细菌组合物在在前述啼哭原因中表现出生理学改善，引起与过度啼哭相关的一些临床症状的减轻。因而，本发明的细菌组合物特别可用于改善婴儿的过度啼哭。术语“过度啼哭”在本文中理解为强烈、持续且不可安慰的啼哭，对于正常家庭单位运转成问题，这暗示在至少1周期间观察到每天至少60分钟(在3个以上的事件中)。
术语“婴儿”在本说明书中应当理解为人或动物的非常小的后代。在用于人时，认为该术语与术语“婴孩”同意。术语“儿童”指出生和青春期阶段之间的人。“儿童”还描述了与父母的关系，作为“儿子”和“女儿”的同义词。然而，在此说明书中，认为术语“婴儿”、“婴孩”和“儿童”是同义的，并且可互换使用。
在一个具体的实施方案中，本发明的细菌组合物可用于改善与婴儿绞痛有关的过度啼哭。术语“婴儿绞痛”在本文中理解为无法解释且无法安慰的引起父母悲痛的啼哭(“难取悦的(fussy)”)。由于对于父母和内科医生难以分类啼哭的类型，术语“难取悦的”是一种而非常主观的测量。此外，过度啼哭行为(容易平静或不然)可以指示绞痛。因此，最经常引用的绞痛婴儿纳入标准之一基于时间规则(a time rule)(即基于Wessel标准)，如：每天超过3小时啼哭持续至少1周(Savino,F.et al.2010见上文)。
在本发明的另一个实施方案中，婴儿具有3周至12个月的年龄。
进行了具有20名婴儿的引导临床试验(pilot clinical trial)以评估基于菌株CECT 8330和CECT 7894混合物的产品的效力和安全性(参见实施例7)。每天一次施用安慰剂和菌株混合物(5滴/天)持续14天。如在图3中可以看到，益生性配方乳品引起平均每日啼哭时间和每个事件的持续时间的较大缩短。在安慰剂和益生性组中没有观察到不利影响，确认了可以认为益生性配方乳品是安全的。因此，菌株混合物可用于改善啼哭模式。
从上文解释的细菌组合物的相关特性看，得出细菌组合物的施用，它也可用于治疗以由于免疫系统不成熟所致的与炎症有关的胃肠失调为特征的其它状况；可用于治疗肠超敏感性以及平衡肠中过多的不想要细菌。
考虑上文提及的特性，当与本领域中已知的商业菌株相比时，菌株CECT 8330和7894在过度啼哭相关的研究参数方面具有更好的表现。如下文实施例中显示，与罗伊乳杆菌菌株之一相比，菌株CECT 8330显示与IL-10生成诱导相关的更好的标准化增加。此外，本发明的菌株展现针对研究的整个病原体谱的抑制性活性。本发明的菌株不仅有效抑制革兰氏阳性，而且还抑制革兰氏阴性细菌。罗伊乳杆菌的情况不是这样，其不充分抑制大肠杆菌和普通拟杆菌的生长。这是有极大兴趣的，因为异常量的细菌(诸如大肠杆菌)通常存在于呈现过度啼哭的婴儿中。还值得注意的是，一般地，与罗伊乳杆菌相比，CECT 8330和特别是CECT 7894更有效抑制几乎所有病原体细菌的生长。此外，菌株CECT 8330和CECT 7894不产生气体，而罗伊乳杆菌确实产生气体。
测量IL-10生成诱导的测定法
本文中的工作实施例1提供了适合于测量IL-10生成诱导的测定法的详细描述，称为本发明的第一个方面的步骤(a)-(i)。相关的是，注意到第一个方面的步骤(a)-(i)中及实施例1中公开的IL-10诱导测定法的描述和条件不限制本发明的范围。该测定法测试戊糖片球菌细胞诱导IL-10生成的能力的一种适合的测定法。本文中此实施例1的详细条件是一种优选的测定法，以测定感兴趣的戊糖片球菌细胞是否符合第一个方面的标准。
因而，基于本文中描述的详细测定法，技术人员按常规能够重复此测定法以客观确定感兴趣的戊糖片球菌细胞是否符合第一个方面的IL-10生成诱导。
在使用描述的测定法时，根据第一个方面，表示为标准化增加的在存在戊糖片球菌细胞的情况中由THP-1细胞生成的IL-10水平高于对照。如本文中及根据第一个方面，对照理解为在缺乏戊糖片球菌细胞的情况中由THP-1细胞生成的IL-10的标准化增加。在一个具体的实施方案中，在存在戊糖片球菌的情况中由THP-1细胞生成的IL-10水平是对照水平的至少2倍。在其它具体的实施方案中，标准化增加是比对照高至少3倍、4倍、5倍或6倍。
测量针对肠道细菌的拮抗能力的测定法
本文中的工作实施例2提供了适合于测量戊糖片球菌细胞拮抗肠道细菌的能力的测定法的详细描述，如在本发明的一个实施方案中提到的。相关的是，注意到实施例2中公开的测定法的描述和条件不限制本发明的范围。该测定法是适合于测试戊糖片球菌细胞拮抗肠道细菌的能力的测定法。
因而，基于本文中的详细测定法描述，技术人员按常规能够重复此测定法以客观确定感兴趣的戊糖片球菌细胞是否符合上文详述的细菌谱；即能够拮抗艰难梭菌、粪肠球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯氏菌和普通拟杆菌。
组合物和施用形式
在本发明的一个具体的实施方案中，如上文定义的细菌组合物为选自下组的形式：食物补充物、药物、婴儿配方乳品、食用产品和食物产品。
本发明的细菌组合物可以以任何合适的形式制备，所述形式对形成本发明组合物的细菌细胞的存活力没有负面影响。考虑到组合物的特定目的选择赋形剂和最合适的配制方法在药物和食品技术领域的普通技术人员的范围内。
根据本发明的细菌组合物可以配制成下述形式，其中细菌细胞是唯一的活性剂，或者与一种或多种其它活性剂混合，和/或与药学可接受赋形剂或适当的添加剂或成分(在食物产品的情况中)混合。在本发明的一个具体的实施方案中，组合物另外含有一种或多种别的活性剂。优选地，一种或多种别的活性剂是其它益生性细菌，其对形成本发明组合物的细菌细胞不是拮抗性的。根据配制剂，细菌细胞可以作为纯化的细菌、作为细菌培养物、作为细菌培养物的一部分、作为已经后处理的细菌培养物，并且单独或与合适的载体或成分一起添加。也可以添加益生元(Prebiotics)。
细菌组合物可以为药物产品的形式。术语“药物产品”在本说明书中以其广泛意义理解，包括包含活性成分(在此情况中是细菌细胞)以及药学可接受赋形剂的任何组合物。术语“药物产品”不限于指药物。如本文中使用，术语“药学可接受”涉及在合理医学判断的范围内适合于用于接触受试者(例如人)的组织而没有过度毒性、刺激(irritation)、变应性应答、或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比率相称的化合物、材料、组合物和/或剂量形式。每种载体、赋形剂等在与配制剂的其它成分相容的意义上必须也是“可接受的”。合适的载体、赋形剂等可以参见标准的药学教科书。
根据产品批准途径及还根据国家，药物产品可以采用不同形式或名称。例如，药物是一种特定的药物产品。在本说明书中认为医药食物是另一种具体的药物产品。术语“医药食物”或“用于特殊医药目的的食物”在一些国家用于指特殊配制并意图用于疾病的饮食管理的食物，该疾病具有仅通过正常饮食不能满足的独特营养需要。它们在规章(诸如美国食品药物管理局1988年罕用药法案修正案(Food and Drug Administration’s 1988OrphanDrug Act Amendments in the United States)和欧洲委员会导则1999/21/EC(theCommission Directive 1999/21/EC in Europe))中限定。医药食物与较宽种类的食物补充物和带有健康要求的传统食物不同。如此，在一个具体的实施方案中，本发明的组合物是医药产品。
通常，认为益生性细菌组合物(诸如本文中公开的)是食物补充物。认为食物补充物(又称为饮食补充物或营养补充物)是另一种具体的药物产品。这是一种意图补充饮食并且提供通常不在正常饮食中摄取或者可能不以足够数量消耗的营养物或有益成分的制剂。通常，认为食物补充物是食物产品，但是有时它们定义为药物、天然健康产品或营养食品(nutraceutical)产品。在本发明的意义中，食物补充物还包括营养食品。食物补充物通常以“非处方药(over the counter)”(即无需处方)出售。若食物补充物采用丸剂或胶囊形式，则它包含与药物中使用的相同的赋形剂。然而，食物补充物也可以采用加强有一些营养物的食物产品形式(例如婴儿配方乳品)。
如此，在一个具体的实施方案中，本发明的组合物是食物补充物，且更具体是婴儿食物补充物。
根据本发明的组合物可以本身或者与合适的可食用液体或固体混合，以片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂、颗粒剂、粉末、悬浮剂、囊剂、糖浆剂形式或通常以单位剂量形式冷冻干燥来施用。它也可以是以冷冻干燥组合物的单剂量形式，与施用前要混合的单独液体容器一起呈现。
在非常幼小年龄的婴儿的背景中，施用限于几种施用形式。如此，在一个优选的实施方案中，本发明的细菌组合物为单独或与液体混合施用的油性悬浮液形式。油性悬浮液包含至少一种食用油，诸如橄榄油、玉米油、大豆油、亚麻籽油、向日葵油或米糠油(riceoil)。油以至少70％重量/重量的量存在。在一个具体的实施方案中，油性悬浮液还以0.1-15％w/w的量包含至少一种赋形剂，其是乳化剂、稳定剂或抗结剂。合适的药剂是二氧化硅、硅胶、胶体硅土、沉淀硅土、滑石、硅酸镁、卵磷脂、果胶(pectin)、淀粉、改性淀粉、konjac胶、黄原胶、胶凝糖胶(gellan gum)、角叉菜胶、藻酸钠、脂肪酸甘油单酯或二酯，如单硬脂酸甘油酯或甘油单油酸酯和甘油单酯或二酯的柠檬酸酯。
根据本领域技术人员公知的技术并且使用已知的机器(machinery)制备油性悬浮液。将给定数量的油导入配备有搅拌和加热手段的容器中。随后，在搅拌下并且在必要时在略微加热到20至50℃之间包含的温度的情况下添加至少一种赋形剂以避免块和凝聚体的形成，直到完全同质化。冷却悬浮液到室温，并且在搅拌下逐渐添加固体形式的细菌细胞，直到悬浮液完全同质化。
具体地，本发明的细菌组合物为油性悬浮液形式的婴儿食物补充物形式。在一个具体的实施方案中，油性悬浮液包含向日葵油和胶体硅土(优选为按重量计1％)和细菌细胞。
在另一个实施方案中，油性悬浮液包含向日葵油和选自下组的药剂以及细菌细胞：卵磷脂、脂肪酸甘油单酯或二酯、角叉菜胶和藻酸钠。
本发明的细菌组合物也可以包含在多种食物产品或食用产品(诸如在婴儿的情况中乳产品)中。术语“食用产品”在本文中以其最广义使用，包括可以被动物摄取的任何呈现形式的任何类型的产品；即在器官感觉上可接受的产品。术语“食物产品”理解为还为身体提供营养支持的食用产品。特别感兴趣的食物产品是食物补充物和婴儿配方乳品。优选地，食物产品包含载体材料，诸如燕麦片粥(oat meal gruel)、乳酸发酵食物、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、蛋白质和糖基化蛋白。在一个具体的实施方案中，本发明的细菌细胞与其它成分，诸如谷类或奶粉同质化以构成婴儿配方乳品。
如此，应当理解本发明的细菌组合物可用于管理婴儿的过度啼哭，无论组合物的形式如何；即无论是药物产品、药物、食物产品、食用产品、食物补充物或医药产品。
细菌细胞生长、突变体和剂量
细菌通过在合适的培养基中并且在合适的条件下培养它们来生长。可以单独培养本发明的细菌细胞以形成纯培养物，或者作为与其它微生物一起的混合培养物，或者通过分开培养不同类型的细菌，然后以期望的比例组合它们。在培养后，回收细胞悬浮液，并且本身使用或者以期望的方式(例如通过浓缩、脱水、喷雾或冷冻干燥)处理，以进一步用于制备药物或食物产品。有时，益生性制剂经受固定化或胶囊化方法以改善保质期。几种用于固定化或胶囊化细菌的技术是本领域中已知的。
本发明的另一个方面涉及本文中描述的新菌株或“其突变体”。清楚的是，通过使用保藏菌株作为起始材料，本领域技术人员可以通过常规的诱变或再分离技术按常规获得其进一步的突变体或衍生物，其至少保留形成本发明组合物的菌株的本文中描述的相关特征和优点。因而，术语“其突变体”指通过使用保藏菌株作为起始材料获得的突变体菌株。在一个实施方案中，通过使用重组DNA技术获得突变体。在本发明的第一个方面的另一个实施方案中，通过随机诱变获得突变体。在本发明的第一个方面的一个具体的实施方案中，变体是天然存在变体。或者，这可以阐明为获得菌株的方法，包括使用本文中保藏的菌株之一作为起始菌株，生成保藏菌株的突变体，并且分离新的菌株，其中突变体保留保藏菌株的必需特性。
细菌细胞的有效量会由本领域技术人员确定，并且会随要实现的特定目的、所治疗的患者的年龄和身体状况、潜在病症的严重性和最终配制剂而变化。在口服施用时，本发明的菌株以下述量存在于组合物中，所述量给出107至1012cfu(根据目前的立法)，优选109至1011cfu的有效每日剂量。表述“集落形成单位”(“cfu”)定义为如通过在琼脂板上的微生物学计数揭示的细菌细胞的数目。在以本发明组合物的形式使用时，优选地，不同菌株为1:1的浓度比率。
本发明菌株的一般使用为活细胞的形式。然而，它也可以扩展到非活细胞，诸如经杀死的培养物或细胞溶胞物(除了杀死或裂解细菌的其它手段外，通过例如暴露于改变的pH、超声处理、放射、温度或压力获得)或含有由本发明菌株生成的有益因子的组合物。
贯穿整个说明书和权利要求书，词语“包含”及其变型并不意图排除其它技术特征、添加物、组分或步骤。本发明的别的目的、优点和特征在检查说明书后对于本领域技术人员会变得明显或者可以通过实施本发明获悉。此外，本发明覆盖本文中描述的具体的和优选的实施方案的所有可能组合。为了例示目的，且不意图限制本发明，本文中提供下述实施例和附图。
附图简述
图1：下列各项的Sma-I(左侧)和Not-I(右侧)限制性酶切的基因组DNA的脉冲场凝胶电泳模式，从左至右：鼠李糖乳杆菌GG(LGG)、戊糖片球菌CECT 8330(8330)、乳酸片球菌的两个菌株作为对照(1,2)和分子标志物(M)。
图2：下列各项的Xba-I(左侧)和Spe-I(右侧)限制性酶切的基因组DNA的脉冲场凝胶电泳模式，从左至右：长双歧杆菌CECT 7894(7894)、长双歧杆菌CECT 4551(4551)和分子标志物(M)。
图3：平均每日啼哭时间和每个事件的持续时间的缩短。A)平均每日啼哭时间的缩短(每天啼哭的总分钟)。B)每个事件的平均持续时间的缩短(每个事件的分钟)。对于安慰剂组中的n＝9和益生性配方乳品组中的n＝11，结果表示为均值±均值标准误差(SEM)。PLA对应于安慰剂组。PRO对应于益生性组。
实施例
在一些实验中使用菌株罗伊乳杆菌ATCC 55730作为对照。
实施例1：在肠粘膜模型中对诱导IL-10生成的能力的体外评估。
研究了细菌菌株的源自其与消化道的免疫系统(经常称为肠关联淋巴样组织，GALT)的相互作用的免疫调控能力。更具体地，寻求测试细菌菌株是否具有诱导抗炎性IL-10生成以降低炎性肠道的能力。这种能力的分子基础是益生菌细胞表面受体与派尔集合淋巴结(Peyer’s plates)中存在的树突细胞上可以找到的TLR-2和TLR-4(Toll样受体)的相互作用。
THP-1细胞系
选定的模型是细胞系THP-1，其表达TLR-2和TLR-4。此模型对细菌组分，如脂多糖-LPS-(作为免疫应答的诱导剂)敏感，并且在培养基中有适合于诱导抗炎性细胞因子模式的生成的分子时易于调控细胞因子生成。
根据技术的术语“THP-1细胞系”指源自急性单核细胞性白血病患者的人单核细胞性细胞系。它用于在蛋白质-蛋白质相互作用的免疫细胞化学分析和免疫组织化学中测试白血病细胞系。
从英格兰公共卫生部门的细胞保藏中心(目录号88081201)获得了THP-1细胞系。在本申请的提交日时，来自提供者英格兰公共卫生部门(www.hpacultures.org.uk)的关于88081201的产品目录编码就THP-1细胞而言读为：“人单核细胞性白血病。源自具有急性单核细胞性白血病的1岁龄男性的外周血”。
培养基和LPS
在洛斯维帕克纪念研究所(RPMI)1640培养基+10％胎牛血清(FBS)中培养THP-1单核细胞。RPMI是一种标准的商品化培养基(RPMI 1640，来自Gibco的参考61870-010)。FBS也来自Gibco。
通过对生长培养基添加5mg佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸盐(PMA，来自SIGMA的参考P8139)至终浓度0.16μM，并且温育约72小时使THP-1单核细胞分化成巨噬细胞。
在MRS培养基中培养细菌菌株。它是一种标准的商品化Man，Rogosa和Sharpe培养基(MRS，Broth Oxoid参考CM0359)。
用LPS刺激THP-1巨噬细胞以诱导炎性应答。脂多糖(LPS)(又称为脂聚糖)是由通过共价键连接的脂质和多糖组成的大分子；它们存在于革兰氏阴性菌细菌的外膜中，起内毒素的作用，并且在动物中引发强的免疫应答。此研究中使用的LPS是一种标准的商品化脂多糖(来自Sigma的参照L4391)。
培养，温育和IL-10测量
THP-1巨噬细胞在24孔ELISA板中的RPMI 1640+10％FBS培养基中培养至106个巨噬细胞/孔的终浓度。通过使用锥虫蓝(Tripan blue)染料和Neubauer计数室计算最终细胞浓度。
将THP-1巨噬细胞与LPS(终浓度10ng/ml)共温育2.5小时。然后，用杜伯科氏磷酸盐缓冲盐水培养基(D-PBS，来自Gibco的参照14190-094)清洗细胞。将500μl RPMI 1640+10％FBS培养基添加到每个ELISA孔。
先前在MRS培养基中于37℃在5％CO2环境中培养细菌菌株过夜。将适当稀释以获得最终比率25:1(2.5 x 107cfu细胞:106个THP-1巨噬细胞)的细菌菌株添加到每个孔。使用Neubauer计数室计算浓度。
然后，于37℃将THP-1巨噬细胞与或不与(阴性对照)细菌菌株一起温育2.5小时。随后，用D-PBS培养基清洗巨噬细胞两次以除去细菌菌株。然后，添加补充有庆大霉素(50μg/ml)、氨卡青霉素(10μg/ml)和氯霉素(12μg/ml)的RPMI 1640+10％FBS培养基，于37℃于5-7％CO2温育，并且在5和24小时时采集等分试样。
离心等分试样，并且通过使用商业化试剂盒Human IL-10Flex Set(来自BDBiosciencies的Bead B7参考号558274)遵循制造商用法说明通过流式细胞术对上清液测定IL-10。
计算
为了解读结果，不使用绝对数值。最有信息的数值是细胞因子的演化，在此情况中是IL-10浓度，其采集5和24小时时的数值表示为标准化的增加。这反映在肠中发生了什么，并且提供了容许实验间的横向比较的标准数值。遵循下述公式计算标准化增加，其中IL105h和IL1024h分别是5或24小时时以pg/ml计的IL-10浓度：
(IL1024h-IL105h)/IL105h
结果
数值越高，IL-10诱导越高。如表1中显示，LPS诱导的THP-1巨噬细胞在存在细菌菌株的情况中诱导IL-10的生成，IL-10诱导在存在菌株CECT 8330的情况中特别高。由CECT8330引起的诱导比由罗伊乳杆菌引起的诱导略高。
表1：LPS诱导的THP-1巨噬细胞中的IL-10的标准化增加。“阴性对照”对应于不与细菌菌株一起温育的THP-1巨噬细胞。
| 以pg/ml计的IL-10<sub>5h</sub> | 以pg/ml计的IL-10<sub>24h</sub> | 标准化增加 | |
| CECT 8330 | 30.83 | 140.18 | 3.54 |
| CECT 7894 | 23.87 | 57.43 | 1.40 |
| 罗伊乳杆菌 | 30.31 | 122.17 | 3.03 |
| 阴性对照 | 27.56 | 43.24 | 0.56 |
实施例2：针对肠道细菌的拮抗能力
目的是评估细菌菌株拮抗过度啼哭婴儿中通常丰富的物种的不想要成员的能力。
用于检测和评估这些能力的方案称为Campbell方案。此技术牵涉将培养皿中要拮抗的细菌与益生性菌株的一致接种汇合琼脂板的圆筒切片一起温育。测量围绕圆筒切片的生长抑制圈。
培养基
在Oxoid培养基中培养病原体菌株。它是一种标准的商品化Oxoid培养基(OxoidCM0359)。
温育和测量
将病原体菌株在含有Oxoid培养基的板中一致性拭抹，并且在CO2培养箱中于适合于每种病原体生长的温度和％CO2培养到汇合。然后，将要测试的益生性菌株的一致接种汇合琼脂板的两个6mm直径圆筒切片置于与病原体接种平板接触，使病原体接种平板与圆筒切片之一的生长侧相对，且与另一个圆筒切片的非生长侧相对，并且于37℃温育过夜。
计算
次日，通过将琼脂平板放置到平尺上测量抑制圈。然后，计算生长抑制活性，其遵循公式GI＝(IZD-CD)/2，通过从以厘米测量的抑制圈直径(IZD)减去圆筒直径(CD)，并将此差值除以2进行。将本发明菌株的抑制能力与商业菌株罗伊乳杆菌的抑制能力比较。最终抑制活性以每种菌株的两个上文提及的圆筒切片的GI值的均值计算。
结果
表2：益生性菌株的生长抑制活性(GI)。以cm表示的结果；“n.i.”表示无抑制。
菌株展现对研究的整个病原体谱的抑制活性。因此，菌株不仅有效抑制革兰氏阳性，而且还抑制革兰氏阴性细菌。罗伊乳杆菌不是这样，其不充分抑制大肠杆菌和普通拟杆菌的生长。这是有极大兴趣的，因为细菌(诸如大肠杆菌)的异常量通常存在于呈现过度啼哭的婴儿中(De Weerth,C.et al.2013supra；Lehtonen,L.et al.“IntestinalMicroflora in colicky and noncolicky infants:Bacterial Cultures and Gas-Liquid Chromatography”,Journal of pediatric Gastroenterology and Nutrition1994,vol.19,pp.310-314)。还值得注意的是，一般地，与罗伊乳杆菌相比，CECT 8330和特别是CECT 7894更有效抑制几乎所有病原体细菌的生长。此外，也相关的是，本发明的这两种菌株提供针对克雷伯氏菌和梭菌(它们在呈现过度啼哭的婴儿的肠中也是丰富的)的保护(De Weerth,C.et al.2013见上文；Lehtonen,L.et al.1994见上文).
实施例3：无气体生成
异质发酵性细菌通过遵循下述代谢途径的葡萄糖发酵生成CO2和乙醇，以及乳酸：
1葡萄糖→1乳酸+1乙醇/乙酸+2ATP+1CO2
测定了菌株的CO2生成。如公式中显示，CO2的生成也提供乙醇生成的信息。使用达拉姆管(Durham Tubes)技术测定CO2生成，所述达拉姆管技术基于益生性菌株在管中的异质发酵培养液中的温育，所述管含有较小且倒置的管内部，其中当生成气体时，其得到积累(Pilone,G.J.,et al.,"Characterization of wine lactic acid bacteria:singlebroth culture for tests of heterofermentation,mannitol from fructose,andammonia from arginine"Am J Enol Vitic 1991,vol.42,pp.153-157)。
菌株CECT 8330和CECT 7894不产生气体。用作对照的罗伊乳杆菌的确产生气体。
实施例4：毒性测定法
与来自双歧杆菌属(Bifodobacterium)和乳杆菌属的细菌形成对比，戊糖片球菌通常不作为人消费的益生菌使用。如此，虽然本发明的益生性菌株CECT 8330属于具有QPS状态的物种，但是进行额外的毒性测定法以避免任何安全性忧虑。
鉴于婴儿的由于其不成熟的消化道所致的高敏感性，决定使用Wistar Han IGSCrl:WI新生大鼠(出生后10天，在实验开始时具有18-23g的体重范围)开发更合适的急性毒性(acute toxicity)模型以确保菌株在婴儿中的完全安全性。
在妊娠的第19天时接收妊娠雌性。出生后，将一窝幼崽调整为4只雄性和4只雌性，混合所有母本的幼崽以避免母体效应，并且实现相等大小的一窝幼崽。给每个哺乳雌性放置有4只雄性和4只雌性。给哺乳雌性任意喂养SAFE A03饮食和水。
实验方案包括4个组：媒介物-移位(VEHICLE-translocation)、媒介物-临床体征/CECT 8330-移位和CECT 8330-临床体征。
每个组包括一只具有哺乳雌性和4只雄性和4只雌性的一窝幼崽的笼。以终浓度0.5 x 1010cfu/ml配制剂每日制备CECT 8330产品。媒介物组接受水代替益生菌。以固定体积5ml/kg(在CECT 8330的情况中为2.5 x 1010cfu/kg)通过用口胃套管进行口服管饲法给所有新生儿大鼠施用媒介物或CECT 8330处理5天(从研究的第0天至第4天)。选择口服路径进行研究，这是因为它是人类中意图的施用路径。
实验期间的观察是：发病率/死亡率；体重；临床体征(幼畜外貌，包括水合(hydration)和身体状况；对刺激物的响应；自然活动(若仰卧放置，扭动(wriggle)的能力)和皮肤颜色)。
在两个不同的时间段后对动物实施安乐死：
-在实验的第4天(5天处理的最后一天)对“移位”组实施安乐死；
-在研究的第11天(最后一次口服给药后1周)对“临床组”实施安乐死。
通过断头对幼崽实施安乐死，并且实施尸检，包括检查完整的动物和所有其表面组织，接着是内部检查胸和腹腔。在属于“移位”组的动物中，在安乐死后立即收集动物的肝，并且维持于2-4℃，直到细菌移位分析。在1ml0.01％明胶PBS中均质化约5mg每份肝样品。将来自此匀浆的100μl置于McConkey板或MRS板上。在于37℃温育48小时后对菌落计数。
在研究期间没有观察到自发死亡率或毒性相关临床体征。没有检出对照(媒介物)和CECT 8330之间的体重差异，并且所有动物的行为是正常的。此外，在显示乳酸细菌或肠细菌在肝中的移位的动物的数目上在对照和CECT 8330组之间没有观察到差异。
实施例5：分离菌株
从0-9岁龄儿童收集新鲜粪便，并且溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)中，等分取样，并且在补充有各种抗生素组合的MRS上铺板。在微需氧条件(5％CO2)下于37或30℃培养菌株。温育时间取决于生长速率，但是通常进行24小时到3天。实施革兰氏染色以得到第一次鉴定。一旦培养，通过在具有15％脱脂乳粉末的PBS 0.1x中冻干贮存分离的菌株。在补充有10μg/ml万古霉素的MRS琼脂上培养菌株。显微检查揭示了长双歧杆菌CECT 7894是革兰氏阳性杆菌，并且戊糖片球菌CECT 8330是革兰氏阳性球菌。
通过扩增16S rRNA基因完成属和种鉴定，如先前描述(Bosch,M.et al.,Probiotic properties of Lactobacillus plantarum CECT 7315and CECT7316isolated from faeces of healthy children.Lett App.Microbiol,2012vol.54,pp.240–6)。SEQ ID NO:1对应于戊糖片球菌CECT 8330的16S rRNA序列，并且SEQ ID NO:2对应于长双歧杆菌CECT 7894的16S rRNA序列。
通过基因组酶切和脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行菌株基因型分型。
将戊糖片球菌CECT 8330进行具有微小修改的先前描述的方案(Rodas,A.M.,etal.,Polyphasic study of wine Lactobacillus strains:taxonomic implications.IntJ Syst Evol Microbiol,2005.55(1):p.197-207)。由于没有用作对照的商品化戊糖片球菌菌株，测定法中包括两种商业乳酸片球菌菌株(图1中的1和2)。将菌株在MRS琼脂板上培养，并且于37℃5％CO2温育18小时。将细胞收获，并且在8ml PET(10mM Tris pH 7.6,1MNaCl)中清洗3次，然后以6000rpm离心10分钟。在700ml裂解缓冲液(6mM Tris、1M NaCl、0.1M EDTA、0.5％SLS、0.2％脱氧胆酸；1mg/ml溶菌酶；40U/ml变溶菌素(mutanolysin)；20mg/ml RNA酶)中重悬团粒。将等体积的1.6％低熔点琼脂糖(FMC BioProducts,Rockland,ME,USA)添加到重悬的细胞，并且容许于4℃固化1小时。将插入物转移到2ml裂解缓冲液II(0.5M EDTA pH 9.2,1％N-月桂基肌氨酸(N-lauryl sarcosine)和1mg/ml链霉蛋白酶)，并且于50℃温育48小时。然后，于室温用TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA pH 8.0)清洗插入物。分开通过Sma-I和Not-1限制酶(Roche Diagnostics)进行总DNA酶切。使用CHEFDRIII装置(BioRad Laboratories)实施脉冲场凝胶电泳。在1％琼脂糖凝胶(SeaKem ME琼脂糖,FMC BioProducts,ME,USA)中加载插入物。表3描述了每种酶的电泳条件。DNA分子量标志物是Lambda ladder PFG标志物和Low Range PFG标志物(New England Biolabs)。在电泳后，用溴化乙啶染色凝胶，并且使用GelDoc System(BioRad)进行UV检测。
表3：电泳条件
| 酶 | 区块 | 初始脉冲(秒) | 最终脉冲(秒) | 时间(小时) |
| Not-I | 1 | 2 | 25 | 18 |
| Sma-I | 1 | 0.5 | 5 | 16 |
使用Xba I和Spe I作为限制酶通过PFGE表征长双歧杆菌CECT 7894，如由Briczinski,E.P.et al.“Technical note:a rapid pulsed-field gel electrophoresismethod for analysis of bifidobacteria”J.Dairy Sci.2006,vol.89,pp 2424–2427描述。将所得的模式与长双歧杆菌CECT 4551的模式比较。
图1和图2中描绘了结果。对于菌株戊糖片球菌CECT 8330和属于乳酸片球菌物种的商业对照菌株(1和2)，脉冲场凝胶电泳Not-I和Sma-I限制性酶切模式是不同的。不可能的是将戊糖片球菌菌株纳入作为对照，因为它们不是商品化的。PFGE容许区分相同物种的菌株，并且如此可以用于独特鉴定细菌物种内的给定细菌菌株(Rodas,A.M.,et al.2005见上文)。
实施例6：制备油性悬浮液
将400ml向日葵油引入装备有搅拌手段的容器中。在搅拌(150rpm)下缓慢添加9.5g胶体硅土以避免块和凝聚物的形成，直到完全均质化。在缓慢搅拌(50rpm)下将含有5x 1012cfu的13.3g戊糖片球菌CECT 8330添加到容器，直到完全分散。然后，在缓慢搅拌(50rpm)下将含有5 x 1012cfu的42.75g长双歧杆菌CECT 7894添加到容器，直到完全分散。最终，用向日葵油使悬浮液达到1000ml，并且搅拌以使最终的悬浮液均匀。将悬浮液保持于室温。
实施例7：临床研究
研究的设计
进行引导临床试验以评估组合戊糖片球菌CECT 8330和长双歧杆菌CECT 7894的益生性配方乳品的效力和安全性。研究设计为具有两个平行分组的前瞻性双盲、安慰剂对照、随机化临床试验，其牵涉来自加泰罗尼亚(西班牙)的总数8个参与中心。遵照赫尔辛基宣言，研究方案得到IDIAP Jordi Gol(巴塞罗纳，西班牙)和Fundació Unió Catalana d’Hospitals(巴塞罗纳，西班牙)伦理委员会批准。
招募满足所有下述纳入标准的两种性别的健康分娩婴儿：21至120天龄；最小出生重量2.5Kg；母乳喂养或喂养婴儿配方乳品(水解或初始配方乳品(hydrolyzed orinitiation formula))；根据下述定义的过度啼哭和难取悦的：“强烈、持续且不可安慰的啼哭，对于正常家庭单位运转成问题，这暗示在至少1周期间观察到的3天以上的3个以上事件中每天至少60分钟，先前排除有机病因学(organic etiology)，如肠的肠套叠等”。排除标准是：早产婴儿(37周前出生)；慢性病；胃肠病症史(与绞痛无关)；免疫抑制婴儿；先前或预期的手术干预；在登记前1周已经服用益生菌或抗生素；其父母或代表人不能适当遵循研究要求的婴儿。将受试者随机归入益生性处理组或安慰剂组。处理在于如实施例6中描述的组合物。安慰剂在于没有益生菌的相同油性悬浮液。喂养前30分钟施用组合物(5滴/天)达14天。在研究期间，要求父母填写记录对处理的遵守、啼哭演化和不利影响的问卷。
用
SPSS Statistic v20(Windows)进行数据分析，并且结果表示为平均值和标准误差。临床试验期间每日啼哭时间的平均减少以研究的最后3天(第12、13、14天)期间每天的啼哭分钟总数平均值与研究前3天(第1、2、3天)期间每天的啼哭分钟总数平均值之间的差值计算。每个事件的持续时间的平均减少以研究的最后3天(第12、13、14天)期间每个事件持续的分钟数目平均值与研究前3天(第1、2、3天)期间每个事件持续的分钟平均值之间的差异计算。
结果
在临床试验开始时，确认n＝9名属于安慰剂组的婴儿和n＝11名属于益生性配方乳品组的婴儿满足提出的啼哭时间的定义，并且因此容许继续研究。在研究开始时此群体的平均啼哭时间范围为60至240分钟。在研究期间，安慰剂和益生性配方乳品两者都是耐受良好的，并且没有观察到与补充相关的不利影响。此外，如图3中显示，啼哭时间在研究期间在安慰剂和益生性组两者中是缩短的。然而，益生菌食用引起更大的平均啼哭时间缩短。对于每个事件的持续时间观察到类似的趋势。
观察到的临床效应支持体外观察到的益生性特性。这些结果是有相关兴趣的，因为与已经使用益生菌治疗绞痛的其它研究相比，此研究呈现一些优势。例如，研究包括母乳喂养和配方乳品喂养的婴儿两者，这是有相关兴趣的，因为目前的益生性配方乳品不能在配方乳品喂养的亚群中展现任何改善。此外，更实际地根据每日临床实践，基于婴儿绞痛的临床定义招募参与婴儿，并且治疗期(14天)短于许多其它临床试验的治疗期(21-28天)。
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Claims (2)
1.细菌组合物，其包含104至1012cfu/g的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，其中戊糖片球菌是以保藏号CECT 8330保藏于西班牙典型培养物保藏中心(Spanish TypeCulture Collection)的戊糖片球菌。
2.根据权利要求1的细菌组合物，其进一步包含104至1012cfu/g的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CECT 7894细胞。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Effective date of registration: 20211109 Address after: Seldaniola Valley, Spain Patentee after: AB-Bio Co.,Ltd. Address before: Seldaniola Valley, Spain Patentee before: AB-Bio Co.,Ltd. Patentee before: Grammar Laboratory Co.,Ltd. |
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