CN101678053A - 用于治疗或预防全身性炎症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗或预防受治疗者的全身性炎症的新方法。该方法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG。

Description

用于治疗或预防全身性炎症的方法
相关专利和专利申请的交叉引用
[0001]本申请是非临时申请，但要求2007年2月28日申请的美国临时专利申请顺序号60/904,122的优先权的权益，该临时专利申请通过引用全部结合到本文中。
发明背景
(1)发明领域
[0002]本发明总的来讲涉及用于治疗或预防全身性炎症的方法。
(2)相关领域的描述
[0003]炎症反应是在身体受到感染因子侵袭、抗原攻击或者物理、化学或外伤损害后恢复和维持稳态的努力。局部性炎症限于特定部位，可表现出不同的症状，包括发红、肿胀、发热和疼痛。
[0004]虽然一般认为炎症反应是对损害的有益于健康的反应，但是如果免疫系统调节不当，则可能出现不良的生理反应。在这种情况下，身体的正常保护性免疫系统通过像对待受感染或异常组织那样对待健康组织，从而对自身组织造成损害。或者，如果出现损害，则炎症反应与引起损害的威胁不成比例。当出现这种情况时，炎症反应给身体造成的损害可能比因子本身所造成的损害大得多。
[0005]研究表明，炎症反应部分由促炎细胞因子和抗炎细胞因子两者的表达增加组成。细胞因子是低分子量的生物活性蛋白，参与免疫反应和炎症反应的协调，以及特定免疫细胞群之间的沟通。在炎症反应期间多种细胞类型产生细胞因子，包括嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。
[0006]炎症部位产生的细胞因子由存在的多种机制影响炎症反应。然而，如果促炎反应无法被抗炎细胞因子成功抵销，则可能发生不受控制的全身性炎症。
[0007]与局部性炎症相比，全身性炎症是遍及全身分布的。这种类型的炎症可包括特定部位的局部性炎症，但是也可能与普通“流感样”症状有关，包括发热、寒战、疲劳或活力减退、头痛、食欲减退和肌肉僵硬。全身性炎症可导致蛋白质降解、分解代谢和代谢亢进。因此，重要器官(例如肌肉、心脏、免疫系统和肝脏)的结构和功能可能受损，并且可能引起多器官衰竭，最终导致死亡。Jeschke等，InsulinAttenuates the Systemic Inflammatory Response to Thermal Trauma(胰岛素减弱对烧伤的全身性炎症反应)，Mol.Med.8(8)：443-450(2002)。虽然在对全身性炎症机制的了解方面已经取得了重大进展，但是由此病引起的死亡率之高仍然令人无法接受。
[0008]通常，细胞因子反应是促炎还是抗炎取决于在任何特定时间定居在肠腔内各种微生物的平衡。肠道粘膜表面定居着数量非常多、组成极其复杂且不断变化的微生物是众所周知的。肠道微生物区系的组成随消化道以及不同的小环境(例如上皮粘膜层、隐窝深粘膜层和粘膜上皮细胞表面)而变化。具体的定居状况取决于内外因素，包括腔内可获得的分子、粘膜性质以及宿主与微生物间的相互作用和微生物与微生物间的相互作用。Murch，S.H.，Toll of Allergy Reduced byProbiotics(益生菌降低Toll的变态反应)，Lancet，357：1057-1059(2001)。
[0009]这些微生物构成了肠道微生物区系，主动参与免疫应答。在存在双方互利共生关系(互利共生)的条件下，或者在对一方有利而对另一方并无害(偏利共生)的条件下，它们与上皮相互作用。Hooper等，How Host-Microbial Interactions Shape the Nutrient Environment ofthe Mammalian Intestine(宿主与微生物的相互作用如何形成哺乳动物肠道的营养环境)，Annu.Rev.Nutr.22：283-307(2002)。实际上，有大量证据显示肠道微生物区系与肠粘膜中不同细胞群之间强的相互作用或“相互影响”。Bourlioux等，The Intestine and its Microflora arePartners for the Protection of the Host：Report on the Danone Symposium“The Intelligent Intestine”(肠及其微生物区系是保护宿主的伙伴：达能专题研讨会报告“巧妙的肠”)，2002年6月14日在巴黎举行，Am.J.Clin.Nutr.78：675(2003)；Hooper，L.V.和Gordon，J.I.，CommensalHost-Bacterial Relationships in the Gut(肠内共生的宿主与细菌之间的关系)，Sci.292：1115(2001)；Haller等，Non-Pathogenic Bacteria Elicit aDifferential Cytokine Response by Intestinal Epithelial Cell/LeucocyteCo-Gultures(肠上皮细胞/白细胞共培养物中非致病性细菌诱导不同的细胞因子反应)，GUT 47：79(2000)；Walker，W.A.，Role of Nutrients andBacterial Colonization in the Development of Intestinal Host Defense(营养物和细菌定居在肠宿主防御发展中的作用)，J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.30：S2(2000)。另外，研究表明肠道微生物区系在成人局部和全身水平上诱导特异性免疫应答，Isolauri，E.等，Probiotics：Effects onImmunity(益生菌对免疫力的作用)，Am.J.Clin.Nutr.73：444S-50S(2001)。
[00010]已知婴幼儿体内肠道微生物区系的发育程度远不及成人。虽然成人的微生物区系由1013个以上的微生物和接近500种菌种组成，但是有一些是有害的，有一些是有益的，在绝对数和菌种多样性两者上，婴幼儿的微生物区系仅含有这些微生物的一小部分。婴幼儿与生具有无菌肠道，但是从产道、他们最初的环境和他们摄入的食物中获得肠内微生物区系。因为肠道微生物区系在新生儿早期生命中非常不稳定，婴幼儿的肠道通常难以维持有害细菌和有益细菌之间脆弱的平衡，因此降低了免疫系统正常发挥作用的能力。
[00011]对于配方奶粉喂养的婴幼儿(formula-fed infant)尤其难以维持由配方奶粉喂养的婴幼儿和母乳喂养的婴幼儿(breast-fed infant)肠内细菌菌种之间的差异所引起的这种平衡。母乳喂养的婴幼儿粪便中主要含有双歧杆菌属(Bifidobacterium)，和作为不常见贡献者的链球菌属(Streptococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)。相比之下，配方奶粉喂养的婴幼儿体内微生物区系更为多样化，含有双歧杆菌属和拟杆菌属(Bacteroides)以及更多种致病菌-葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和梭菌(Clostridia)。母乳喂养的婴幼儿和配方奶粉喂养的婴幼儿的粪便中，双歧杆菌属的各种菌种也有不同。研究提出了作为母乳喂养的婴幼儿和配方奶粉喂养的婴幼儿不同粪便菌群的原因的多个因素，包括人乳中蛋白质含量较低、蛋白质组成不同，人乳中磷含量较低，人乳中有大量寡糖以及母乳中多种有免疫功能的体液介质和细胞介质。Agostoni等，Probiotic Bacteria in Dietetic Productsfor Infants：A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition(婴幼儿食品中的益生细菌：ESPGHAN委员会对营养的意见)，J.Pediatr.Gastro.Nutr.38：365-374(2004年4月)。
[00012]因为配方奶粉喂养的婴幼儿体内微生物区系非常不稳定，肠道微生物区系在很大程度上参与刺激肠免疫，所以配方奶粉喂养的婴幼儿发生炎症性疾病的可能性更高。许多影响婴幼儿的主要疾病，包括慢性肺病、脑室周围白质软化、新生儿脑膜炎、新生儿肝炎、脓毒症和坏死性小肠结肠炎本质上都是炎症性质的。根据具体疾病，伴发的炎症可发生在特定器官(例如肺、脑、肝或肠)中，或者炎症可能完全是全身性质的。
[00013]例如，慢性肺病引起肺内组织发炎，而新生儿脑膜炎包括脑膜(linings of the brain)炎症和脊髓炎症。脑室周围白质软化由正在发育中的脑的脑室周围区域的炎性损害所引起。坏死性小肠结肠炎引起可导致部分或全部肠被破坏的肠炎，而新生儿肝炎包括发生于婴儿早期的肝炎。脓毒症，亦称全身性炎症反应综合征，是由产毒素细菌对血流的致死性感染所引起的严重疾病。该病中，血流中的病原体引起遍及全身的炎症反应。
[00014]在肠免疫发展和全身性炎症预防方面，也是对早产婴儿和患严重疾病的婴儿的严重挑战。常常将早产婴儿或患严重疾病的婴儿及时放入无菌恒温箱，使他们保持不暴露于健康足孕婴儿可正常暴露于其中的细菌群体中。这可延迟或削弱天然定居过程。这些婴儿还常常用广谱抗生素治疗，该抗生素可杀死力图定居在婴儿肠道中的共生细菌。另外，这些婴儿常常用婴儿配方奶粉喂养，而不是用母乳喂养。这些因素的每一个都可引起婴儿肠内微生物区系的产生不当，因此引起或加快危及生命的全身性炎症。
[00015]近年来，有研究提议向配方奶粉喂养的婴幼儿饮食中补充益生细菌以便促进有益微生物的肠定居。益生细菌是对宿主健康发挥有益作用的活的微生物。Fuller，R.Probiotics in Man and Animals(人与动物中的益生菌)，J.Appl.Bacteriol.66：365-78(1989)。
[00016]虽然有活力的益生细菌(viable probiotic bacteria)可有效地使肠道微生物区系正常化，但是已公布的评价其在早产婴儿和受免疫抑制婴幼儿中的安全性的研究却非常少。这些特定群体的肠防御屏障尚未成熟，这就增加了腔内细菌(luminal bacteria)发生转移的风险，引起感染风险的可能性增高。在许多情况下，有活力的益生菌剂(viableprobiotics)一般不推荐给受免疫抑制的患者、心脏手术后患者、患胰腺功能障碍的患者或患有便血的患者使用。已经报道了在受免疫抑制个体中有至少一宗死亡事件是由于补充益生菌所致的。MacGregor G.等，Yoghurt biotherapy：contraindicated in immunosuppressed patients(酸乳酪生物制剂疗法：在受免疫抑制的患者中的禁忌)？Postgrad Med J.78：366-367(2002)。
[00017]因此，对于受免疫抑制的患者或早产婴儿，提供可治疗或预防全身性炎症的无活力的补充剂(non-viable supplement)可能是有益的。活益生菌(live probiotics)的无活力替代品(non-viable alternative)可具有其它益处，例如存放期较长。活的益生菌对热、湿度和光敏感，理想的是应冷藏以保持其存活力。即使利用这些预防措施，典型的益生菌的存放期仍相对较短。活益生菌的无活力替代品可避免冷藏需要，可提供具有较长存放期的产品。然后无需易于利用的冷藏条件便可将该产品配送到世界各地。另外，益生菌的无活力替代品可能与其它食物组分发生相互作用的风险较小，例如发酵以及产品味道、质地和新鲜度的改变。因此，提供用于减轻或预防配方奶粉喂养的婴幼儿的全身性炎症的方法将会是有益的，该方法包括给予灭活益生菌(inactivated probiotics)。
发明概述
[00018]因此简单来讲，本发明涉及用于治疗、预防或减轻受治疗者的全身性炎症的新方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG。
[00019]在其它实施方案中，本发明涉及制备用于治疗、预防或减轻受治疗者的全身性炎症的药物的方法，其特征在于至少介于约1×104个细胞等同物/kg体重/天和1×1010个细胞等同物/kg体重/天之间的灭活鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)被用作药理活性物质。
[00020]在其它实施方案中，本发明涉及用于治疗、预防或减轻受治疗者的呼吸道炎症的新方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG。
[00021]在其它实施方案中，本发明涉及用于减轻或预防受治疗者的一种或多种促炎细胞因子或趋化因子的全身性释放的方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG。
[00022]在另一个实施方案中，本发明包括用于预防受治疗者的IkB表达的遍在蛋白化的方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG。此外，本发明可包括用于降低受治疗者体内NFkB转运的方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG。
[00023]在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗、预防或减轻受治疗者的全身性炎症或呼吸道炎症的方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG以及至少一种LCPUFA和/或至少一种有活力的益生菌。在具体实施方案中，LCPUFA可以是二十二碳六烯酸(DHA)或花生四烯酸(ARA)。
[00024]通过本发明所获得的若干优势之一是减轻或预防全身性炎症。本发明可减轻肝、血浆、肺和肠的炎症。另外，本发明减少或防止各种促炎细胞因子和趋化因子(包括白介素-1β(IL-1β)、IL-8、CINC-1)的释放和生长相关性癌基因(GRO/KC)水平。因为本发明可用于改善炎症状况，所以它还可防止发生造成伤害的感染(deleteriousinfection)和疾病。
附图简述
[00025]为了更全面地理解本发明，下面结合附图进行下列描述以供参考。
[00026]图1表示采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的活LGG和灭活LGG对肝中的细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物-1(CINC-1)肽产生的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG(heat-LGG)”。
[00027]图2表示采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的活LGG和灭活LGG对血浆中的细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物-1(CINC-1)肽产生的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG”。
[00028]图3表示采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的活LGG和灭活LGG对肺中的细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物-1(CINC-1)肽产生的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG”。
[00029]图4表示采用细胞因子多重测定法(cytokine multiplexassay)测定的活LGG和灭活LGG对肝中的生长相关性癌基因(GRO/KC)产生的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG”。
[00030]图5表示采用细胞因子多重测定法测定的活LGG和灭活LGG对肺中的生长相关性癌基因(GRO/KC)产生的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG”。
[00031]图6表示采用细胞因子多重测定法测定的活LGG和灭活LGG对肝中的IL-1β水平的作用。灭活LGG被标记为“热-LGG”。
优选实施方案详述
[00032]下面将提供下文所述的本发明实施方案、一个或多个实施例的详情以供参考。提供各实施例是为了解释本发明，而不是对本发明的限制。实际上，对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围或精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和变动。例如，所说明或描述的特征作为一个实施方案的组成部分，可被用于另一个实施方案中以便得到更进一步的实施方案。
[00033]因此，本发明旨在涵盖落入所附权利要求书及其等同内容范围内的这些修改和变动。本发明的其它目的、特征和方面公开于下面的详述中，或者从下面的详述来看是显而易见的。本领域普通技术人员应当了解的是，本发明的论述只是对示例性实施方案的描述，不是对本发明更多方面的限制。
[00034]本文使用了下列缩写：LGG，鼠李糖乳杆菌GG；LCPUFA，长链多不饱和脂肪酸；LPS，脂多糖；IL，白介素；CINC-1，细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物-1；GRO/KC，生长相关性癌基因；ELISA，酶联免疫吸附测定法；RT-PCR，逆转录-聚合酶链式反应；ANOVA，方差分析；SD，标准差；RMS，大鼠乳代用品；TLR，Toll样受体；核因子κB，NF-κB；EPA，二十碳五烯酸；DHA，二十二碳六烯酸；ARA，花生四烯酸。
[00035]术语“灭活益生菌”或“灭活LGG”是指益生菌或LGG生物的代谢活性或繁殖能力降低或遭到破坏。然而，“灭活益生菌”或“灭活LGG”仍然还在细胞水平上保持至少部分其生物糖蛋白和DNA/RNA结构。本文所用术语“灭活”与“无活力”同义。
[00036]术语“益生菌(probiotic)”是指对宿主健康发挥有益作用的活的、有活性的或有活力的微生物。
[00037]术语“益生素(prebiotic)”是指刺激益生菌的生长和/或活性的非消化性食物成分。
[00038]本文所用术语“治疗”是指改善、改进或医治疾病、病症或者疾病或病症的症状。
[00039]术语“减轻”是指范围、数量减小或程度降低。
[00040]术语“预防”是指通过某些措施终止或阻碍疾病、病症或者疾病或病症的症状。
[00041]本文所用术语“全身性”是指与整个身体有关或者累及整个身体。
[00042]术语“治疗有效量”是指使疾病、病症或者疾病或病症的症状得到医治或改善的量。
[00043]术语“早产儿(preterm)”是指在妊娠第37周结束前出生的婴儿。
[00044]术语“婴(幼)儿”是指不满1岁的人。
[00045]术语“儿童”是指年龄介于1岁左右和12岁左右之间的人。在某些实施方案中，儿童的年龄介于1岁左右和6岁左右之间。在其它实施方案中，儿童的年龄介于7岁左右和12岁左右之间。
[00046]本文所用术语“婴幼儿配方奶粉(infant formula)”是指通过替代人乳以满足婴幼儿营养需要的组合物。
[00047]本发明发明了一种用于治疗或预防全身性炎症的新方法。该方法包括给予受治疗者治疗有效量的灭活LGG。在一些实施方案中，受治疗者是婴幼儿。
[00048]以前有效给予灭活益生菌的尝试都遇到了巨大的障碍。例如，Kirjavainen，P.等人报道了在活LGG和热灭活LGG的比较中，接近40％补充了灭活LGG的儿童经历了严重腹泻。Probiotic Bacteriain the Management of Atopic Disease：Underscoring the Importance ofViability(特应性疾病控制中的益生细菌：强调存活力的重要性)，J.Ped.Gastro.36：223-227(2003)。未报道在安慰剂或有活力的LGG组中出现不良反应(出处同上，P225)。因为腹泻在很大程度上与炎症有关，所以Kirjavainen的研究表明灭活LGG实际上可引起胃肠炎症。实际上，该研究指出，“热灭活方法可引起表面肽变性和热激蛋白表达，因此以可诱导炎症反应从而增加肠通透性的热灭活形式的这种方式，改变了LGG的免疫刺激性质”(出处同上，P226)。相比之下，本发明的发明人研发出了通过给予灭活LGG而用于治疗或预防全身性炎症的新方法。
[00049]LGG是自健康人体肠内微生物区系分离出的益生菌菌株。它公开于Gorbach等人的美国专利号5,032,399，该专利通过引用全部结合到本文中。LGG对多数抗生素具有耐药性，在酸和胆汁存在下保持稳定，与人肠道粘膜细胞的附着具有亲合力。在多数个体中存活1-3天，在30％受治疗者中存活长达7天。除其定居能力以外，LGG还有益地影响粘膜免疫应答。LGG保藏于保藏权威机构美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，保藏号为ATCC53103。
[00050]在本发明中，使用已被灭活的LGG。可通过本领域任何目前已知或者仍在开发的方法进行灭活。例如，可通过热处理、冻干、紫外线、γ辐射、加压、化学分解或机械破坏来实现灭活。例如，可将LGG保存在80℃和100℃之间10分钟经热处理灭活。LGG还可通过距离为5cm的30瓦UVC灯照射5分钟经紫外线灭活。或者，灭活LGG可使用距离为20cm的钴-60源通过2kg-Gray(kGy)照射经γ辐射灭活。
[00051]在本发明的方法中，灭活LGG的治疗有效量是足以减轻或预防受治疗者的全身性炎症的量。该量相当于约1×104个细胞等同物/kg体重/天和1×1012个细胞等同物/kg体重/天之间。在另一个实施方案中，本发明包括给予从约1×106个细胞等同物/kg体重/天到1×109个细胞等同物/kg体重/天。在又一个实施方案中，本发明包括给予约1×108个细胞等同物/kg体重/天。
[00052]在本发明的一些实施方案中，受治疗者有治疗、减轻或预防全身性炎症的需要。受治疗者可能由于遗传体质、饮食、生活方式、疾病、病症等而有患全身性炎症的风险。例如，早产儿或受免疫抑制的婴幼儿可能有患全身性炎症的风险，因此可能需要这类治疗、减轻或预防。
[00053]在某些实施方案中，可将灭活LGG给予婴幼儿或儿童以预防、治疗或减轻全身性炎症。在一个实施方案中，婴幼儿可不满1岁。在另一个实施方案中，儿童的年龄可介于1岁和6岁之间。在又一个实施方案中，儿童的年龄可介于7岁和12岁之间。
[00054]在本发明的方法中，灭活LGG的给药方式并不是关键，只要给予治疗有效量即可。在一些实施方案中，通过片剂、丸剂、包囊剂(encapsulation)、囊片剂、软胶囊剂、胶囊剂、油滴剂或小药囊剂给予受治疗者灭活LGG。在该实施方案的方法中，灭活LGG补充剂可与其它营养补充剂(例如维生素)或与LCPUFA补充剂(例如DHA或ARA)组合摄取。
[00055]在另一个实施方案中，灭活LGG用糖、脂肪或多糖包封。在又一个实施方案中，将灭活LGG加到食物或饮品中食用。食物或饮品可以是儿童营养品，例如改良配方乳品(follow-on formula)、成长奶(growing up milk)、饮料、奶、酸乳酪、果汁、果汁型饮料、咀嚼片、饼干、薄脆饼(cracker)或奶粉，或者产品可以是婴幼儿营养品，例如婴幼儿配方奶粉。
[00056]在一个实施方案中，用于本发明的婴幼儿配方奶粉营养齐全，含有适当类型和适量的脂质、糖、蛋白质、维生素和矿物质。脂质或脂肪的含量通常可从约3g/100kcal到约7g/100kcal不等。蛋白质的含量通常可从约1g/100kcal到约5g/100kcal不等。糖的含量通常可从约8g/100kcal到约12g/100kcal不等。可以任意使用本领域的蛋白质源，例如脱脂奶、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、水解蛋白、氨基酸等。可以任意使用本领域的糖源，例如乳糖、葡萄糖、玉米糖浆干粉(corn syrup solid)、麦芽糖糊精、蔗糖、淀粉、米糖浆干粉(ricesyrup solid)等。可以任意使用本领域的脂质源，例如植物油，例如棕榈油、大豆油、棕榈油精、椰子油、中链甘油三酯油、高油酸葵花籽油、高油酸红花油等。
[00057]可适当地使用市售的婴幼儿配方奶粉。例如
Figure A20088000632600141
Figure A20088000632600142
早产儿配方奶粉、加铁
Figure A20088000632600144
和
Figure A20088000632600145
(可获自Mead Johnson&Company，Evansville，IN，U.S.A.)可以补充适当水平的灭活LGG，并用于实施本发明的方法。
[00058]在本发明的一个实施方案中，灭活LGG可与一种或多种有活力的益生菌和/或灭活益生菌联用以治疗或预防配方奶粉喂养的婴幼儿的全身性炎症。在本实施方案中，本领域已知的任何活益生菌或灭活益生菌都是可接受的，只要它能达到预期效果。在一个具体的实施方案中，有活力的益生菌和/或灭活益生菌选自乳杆菌属和双歧杆菌属。
[00059]如果活益生菌与灭活益生菌联用，则活益生菌的量可相当于约1×104菌落形成单位(cfu)/kg体重/天和1×1012菌落形成单位(cfu)/kg体重/天之间。在另一个实施方案中，活益生菌可包含约1×106～1×109cfu/kg体重/天。在又一个实施方案中，活益生菌可包含约1×108cfu/kg体重/天。
[00060]在本发明的另一个实施方案中，灭活LGG可与一种或多种益生素联用以治疗或预防配方奶粉喂养的婴幼儿的全身性炎症。在本实施方案中，本领域已知的任何益生素都是可以接受的，只要能达到所需效果。本发明的益生素可包括乳果糖、低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide)、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚乳蔗糖(lactosucrose)、低聚木糖和低聚龙胆糖(gentio-oligosaccharide)。
[00061]在本发明的又一个实施方案中，婴幼儿配方奶粉可含有其它活性剂，例如长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)。合适的LCPUFA包括但不限于α-亚油酸、γ-亚油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)、ARA和DHA。在一个实施方案中，灭活LGG与DHA联用。在另一个实施方案中，灭活LGG与ARA联用。在又一个实施方案中，灭活LGG与DHA和ARA两者联用。含有DHA、ARA或其组合的市售婴幼儿配方奶粉可以补充灭活LGG并用于本发明。例如，含有有效水平的DHA和ARA的
Figure A20088000632600151
是市售的，可以补充灭活LGG并用于本发明。
[00062]在一个实施方案中，DHA和ARA同时与灭活LGG联用以治疗婴幼儿的全身性炎症。在该实施方案中，ARA∶DHA的重量比通常为约1∶3至约9∶1。在本发明的一个实施方案中，该比率为约1∶2至约4∶1。在又一个实施方案中，该比率为约2∶3至约2∶1。在一个具体实施方案中，该比率约为2∶1。在本发明的另一个具体实施方案中，该比率约为1∶1.5。在其它实施方案中，该比率约为1∶1.3。在另外其它的实施方案中，该比率约为1∶1.9。在一个具体的实施方案中，该比率为约1.5∶1。在又一个实施方案中，该比率为约1.47∶1。
[00063]在本发明的某些实施方案中，DHA的水平以重量计是脂肪酸的约0.0％和1.00％之间。
[00064]DHA的水平可约为0.32％(重量)。在一些实施方案中，DHA的水平可约为0.33％(重量)。在另一个实施方案中，DHA的水平可约为0.64％(重量)。在另一个实施方案中，DHA的水平可约为0.67％(重量)。在又一个实施方案中，DHA的水平可约为0.96％(重量)，在又一个实施方案中，DHA的水平可约为1.00％(重量)。
[00065]在本发明的实施方案中，ARA的水平以重量计是脂肪酸的0.0％和0.67％之间，在另一个实施方案中，ARA的水平可约为0.67％(重量)。在另一个实施方案中，ARA的水平可约为0.5％(重量)。在又一个实施方案中，DHA的水平可介于约0.47％和0.48％(重量)之间。
[00066]在本发明的一个实施方案中，DHA的有效量通常为约3mg/kg体重/天至约150mg/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中，该量为约6mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。在另一个实施方案中，该量为约10mg/kg体重/天至约60mg/kg体重/天。在又一个实施方案中，该量为约15mg/kg体重/天至约30mg/kg体重/天。
[00067]在本发明的一个实施方案中，ARA的有效量通常为约5mg/kg体重/天至约150mg/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中，该量从约10mg/kg体重/天到约120mg/kg体重/天不等。在另一个实施方案中，该量从约15mg/kg体重/天到约90mg/kg体重/天不等。在又一个实施方案中，该量从约20mg/kg体重/天到约60mg/kg体重/天不等。
[00068]用于本发明的婴幼儿配方奶粉中的DHA的量通常从约5mg/100kcal到约80mg/100kcal不等。在本发明的一个实施方案中，DHA从约10mg/100kcal到约50mg/100kcal不等；在另一个实施方案中，从约15mg/100kcal到约20mg/100kcal不等。在本发明的一个具体实施方案中，DHA的量约为17mg/100kcal。
[00069]用于本发明的婴幼儿配方奶粉中的ARA的量通常从约10mg/100kcal到约100mg/100kcal不等。在本发明的一个实施方案中，ARA的量从约15mg/100kcal到约70mg/100kcal不等。在另一个实施方案中，ARA的量从约20mg/100kcal到约40mg/100kcal不等。在本发明的一个具体实施方案中，ARA的量约为34mg/100kcal。
[00070]用于本发明的补充了含有DHA和ARA的油的婴幼儿配方奶粉可采用本领域已知的标准技术制备。例如，通过替换正常存在于配方奶粉中的等量的油(例如高油酸葵花籽油)，将其加到配方奶粉中。又如，可通过替换等量的其余正常存在于不含DHA和ARA的配方奶粉中的总脂肪混合物，将含有DHA和ARA的油加到配方奶粉中。
[00071]DHA源和ARA源可以是本领域已知的任何来源，例如海产油、鱼油、单细胞油、蛋黄脂质、脑脂质等。DHA和ARA可以是天然形式，只要LCPUFA源的其余成分不会对婴幼儿产生任何重大的有害作用。或者，可以使用精炼形式的DHA和ARA。
[00072]在本发明的一个实施方案中，DHA源和ARA源为单细胞油，参见美国专利号5,374,567、5,550,156和5,397,591，该专利的公开内容通过引用全部结合到本文中。然而，本发明不仅仅限于这类油。
[00073]在一个实施方案中，LCPUFA源含有EPA。在另一个实施方案中，LCPUFA源基本上不含EPA。例如，在本发明的一个实施方案中，婴幼儿配方奶粉含有不超过约16mg/100kcal的EPA；在另一个实施方案中，EPA不超过约10mg/100kcal；在又一个实施方案中，EPA不超过约5mg/100kcal。一个具体的实施方案基本上不含EPA。另一个实施方案不含EPA，因为即使痕量的EPA都不存在于配方奶粉中。
[00074]我们认为对于含有这些成分的制剂的抗炎性质，提供灭活LGG与DHA和/或ARA的组合便提供了互补效应(complimentaryeffect)或协同效应。虽然无意受该理论或任何其它理论的束缚，但是我们认为灭活LGG通过防止抑制性-kB(inhibitory-kB，IkB)的遍在蛋白化而部分赋予抗炎作用。在正常细胞中，IkB与胞质内的核因子kB(NFkB)结合。当发生IkB遍在蛋白化时，NFkB被释放出来，进入到细胞核中，并激活负责炎症反应的基因。我们认为正是这种特异性相互作用和所引起的基因表达的改变参与了炎症的调节。我们认为灭活LGG防止IkB的遍在蛋白化，从而防止NFkB的释放，并减轻或预防炎症。
[00075]相比之下，ω-3脂肪酸(例如DHA)被认为是通过改变广义上称为类二十烷酸的脂肪酸衍生的促炎介质的产生而赋予抗炎作用。细胞膜磷脂层(phospholipid pool)中的ω-6脂肪酸(例如ARA)在炎症反应期间释放出来，并释出一层游离的ARA。该层ARA然后通过被称为脂加氧酶和环加氧酶的两类酶起作用，它产生各种类二十烷酸，包括2系列前列腺素类激素(prostanoids)，例如前列腺素、血栓烷和白三烯。
[00076]已知这些类二十烷酸在许多细胞类型和器官中的促炎作用过剩。已知富含ω-3脂肪酸(例如EPA和DHA)的饮食在该过程的若干步骤中是ω-6脂肪酸的竞争剂，因此，降低了ARA的促炎效果。例如，ω-3脂肪酸调节ω-6脂肪酸延长至ARA、ARA掺入细胞膜磷脂层和由ARA产生促炎类二十烷酸。因此，DHA和ARA的组合在多个组织中提供调节炎症反应的独特而又互补的作用。
[00077]另外，在本发明的一些实施方案中，活LGG和灭活LGG相互联用。对于含有这些成分的制剂的抗炎性质，我们认为活LGG和灭活LGG的组合提供互补效应或协同效应。虽然无意受该理论或任何其它理论的束缚，但是我们认为活益生菌(例如LGG)部分通过与特定免疫细胞表面的特异性受体(称为Toll样受体(TLR))相互作用而赋予抗炎作用。活LGG和这些受体之间的直接或间接相互作用启动胞内信号转导级联，这导致了在这些靶细胞中基因表达的改变，我们认为正是这种特异性相互作用以及在基因表达和其它细胞作用中所引起的改变参与了炎症的调节。正是因为我们认为活LGG和灭活LGG通过不同的机制起作用，所以相信这些组分的组合可提供互补或协同的抗炎作用。
[00078]另外，在本发明的一些实施方案中，将活LGG、灭活LGG和至少一种LCPUFA联用。因为我门认为活LGG、灭活LGG和LCPUFA是分别通过不同机制起作用的，对于含有这些成分的制剂的抗炎性质，我们认为活LGG和灭活LGG的组合提供互补效应或协同效应。
[00079]在本发明的一个实施方案中，受治疗者是配方奶粉喂养的婴幼儿。在一个实施方案中，婴幼儿是自出生起就用配方奶粉喂养。在另一个实施方案中，婴幼儿是自出生起就用母乳喂养直到不满1岁，之后用配方奶粉喂养，期间开始补充灭活LGG。
[00080]在本发明的一个具体实施方案中，该方法包括治疗或预防配方奶粉喂养的早产儿的全身性炎症。在该方法中，可以婴幼儿配方奶粉的形式或其它合适的形式给予早产儿灭活LGG。另外，如有需要，可将灭活LGG与DHA、ARA和/或一种或多种活益生菌组合给予早产儿以产生潜在的协同抗炎作用。
[00081]在本发明的方法中，灭活LGG减少或防止一种或多种促炎细胞因子或趋化因子的全身性释放。本文所用“促炎”细胞因子或趋化因子包括本领域已知的参与上调炎症反应的促炎细胞因子或趋化因子。实例包括但不限于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18和GRO/KC。
[00082]趋化因子是能够使白细胞从血液迁移到炎症部位组织的一组细胞因子。当趋化因子过量产生时，可导致健康组织受到损害。生长相关性癌基因(GRO/KC)是向炎症部位募集免疫细胞的趋化因子。它是大鼠细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物(CINC-1)的人的对应物，在功能上与白介素-8家族有关。
[00083]在本发明的又一个实施方案中，灭活LGG显示出抑制核因子kB(NFkB)的转运。NFkB是存在于所有细胞类型中的主要转录因子，据信在炎症发生时起重要作用。在多数细胞中，NF-κB以潜伏的无活性的抑制性kB(IkB)结合复合物形式存在于胞质中。当细胞接受例如来自细胞因子、细菌抗原或自由基的大量胞外信号之一时，NF-κB便快速进入核中，并激活负责炎症反应的基因。研究表明在炎症开始时抑制NFkB导致炎症反应降低。Lawrence等，Possible NewRole for NFkB in the Resolution of Inflammation(NFkB在消除炎症中的可能的新作用)，Nature Med.7：1291(2001)。因此，在本发明中通过补充灭活LGG来抑制NFkB有助于减轻或预防全身性炎症。
[00084]如实施例中所示，灭活LGG显示减轻配方奶粉喂养的婴幼儿的全身性炎症。在配方奶粉喂养的幼大鼠中，当补充LGG时，CINC-1和各种细胞因子水平降低到与母乳喂养的幼大鼠类似的水平。
[00085]如实施例中所示，灭活LGG还显示出在肠上皮中显著减少IL-8产生、降低NF-κB转运并增加IkB产生。另外，本发明的发明人预料不到地发现灭活LGG防止IkB的遍在蛋白化，而活LGG则不能。
[00086]下面的实施例描述了本发明的各种实施方案。鉴于本文所公开的说明书或本发明的实践，落入所附权利要求书范围内的其它实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的。本说明书连同实施例一起被视为只是示例性的，落入实施例之后所附权利要求书中所限定的本发明的范围和精神内。在实施例中，除非另有说明，否则所有给出的百分比都是重量百分比。
实施例1
[00087]本实施例说明灭活LGG对配方奶粉喂养的新生大鼠幼仔全身性炎症的作用。
材料与方法
[00088]在两个独立的实验中，将Sprague-Dawley(Taconic，Germantown，NY)幼大鼠随机分成以下4个胃造口进食组，每组5只大鼠：对照组(无LPS或LGG)、LPS组、LPS加活LGG组和LPS加灭活LGG组。用相同龄期的母鼠喂养大鼠作为对照。使用幼大鼠“pup-in-the-cup”模型，从幼大鼠出生第7天开始进行胃造口进食。在插入幼鼠胃中的聚乙烯管的24cm截面上放置胃造口术进食管。在异氟烷麻醉下进行胃造口术放置。将定时器控制的注射泵与进食管相连接，并设置成按依赖于体重的流速，在每小时的头20分钟内饲喂大鼠。
[00089]在2天适应期内，给胃造口进食幼大鼠喂以大鼠奶代用品(RMS)。适应期过后，给予RMS进食组之一补充1×108个细胞等同物/kg体重/天的灭活LGG。LGG经致死热处理灭活。给予第二组补充1×108cfu/L/kg体重/天的活LGG。给第三组饲喂未补充任何类型LGG的RMS。这些饲喂法持续6天。所有胃造口进食组接受同等量的脂肪和糖，蛋白质组分近似于正常生长所需要的量。用相同龄期的母鼠喂养大鼠作为对照。
[00090]将得自大肠杆菌0127：B8的脂多糖(LPS)(LPS；Sigma，St.Louis，MO)按2mg/ml的浓度通过涡旋溶于水。在开始人工饲喂后2天，开始通过胃造口术进食管给予胃造口进食大鼠0.25mg/kg/天至0.5mg/kg/天的LPS。给予幼鼠LPS补充6天。该剂量是在导致偶发战栗、立毛和体重增加缓慢但在6天时间内与死亡显著增加无关的初步研究中确定的。
[00091]在6天治疗时间结束时，用过量的戊巴比妥钠使幼大鼠安乐死。摘取小肠并分成三部分：回肠、空肠和十二指肠，保存在-80℃下用于酶测定和ELISA，或者在10％中性缓冲福尔马林中固定用于肠形态研究。将肺、肝和血浆保存在-80℃下用于酶测定和ELISA。
[00092]应用Sigmastat统计软件(SPSS，Chicago，IL)分析体重、CINC-1的ELISA和细胞因子/趋化因子多重测定的结果。所有数据都用平均值±标准差(SD)报告。采用组间单因素方差分析(ANOVA)以确定所有治疗组中是否存在显著差异。当ANOVA为显著时(p＜0.05)，应用Holm-Sidak方法进行两两比较。
结果与讨论
生长
[00093]本实施例说明在胃造口进食后LGG对幼鼠生长的作用。在胃造口进食后每天给幼大鼠称重，并与母鼠喂养的对照动物进行比较。母鼠喂养动物的生长比LPS处理的胃造口进食幼鼠的快。给予胃造口进食的LPS处理幼鼠活LGG或灭活LGG无法改善体重。
CINC-1
[00094]在本发明中，活LGG和灭活LGG均降低CINC-1水平。通过用于大鼠生长相关性癌基因/CINC-1的TiterZyme酶免疫测定试剂盒(Assay Designs，Ann Arbor，MI)测定CINC-1水平。从肝、肠、血浆和肺的整个组织的细胞提取物中分离出组织样品。在450nm下测定吸光度，利用从线性标准曲线推导出的公式计算出浓度。
[00095]如图1至图3所示，ELISA结果显示LPS增加肝、肺和血浆中的CINC-1水平。活LGG和灭活LGG两者在肝(图1)和血浆(图2)中都降低LPS诱导的CINC-1产生(p＜0.05)，在肺(图3)中也显示出这种趋势(p＝0.09)。
[00096]图1表明当与LPS组相比时，补充活LGG使肝中的CINC-1水平降低约50％。然而当与LPS组相比时，灭活LGG使肝中的CINC-1水平降低约75％。因此，灭活LGG对肝CINC-1水平的降低作用比活LGG的显著较大，这就表明较强的抗炎作用。同样地，图2表明灭活LGG组中血浆的CINC-1水平比活LGG组中的低。在肺中，活LGG和灭活LGG两者均降低CINC-1水平到同样的程度(图3)。
GRO/KC
[00097]如图4和图5所示，细胞因子多重测定法显示同样降低肝和肺中的GRO/KC水平。在肝中，灭活LGG降低GRO/KC水平的程度比活LGG的大，这就表明较强的抗炎作用(图4)。在肺中，活LGG和灭活LGG两者均降低GRO/KC水平到同样的程度(图5)。
[00098]在本实验中，在肺中观察到CINC-1和GRO/KC水平的降低表明灭活LGG的抗炎作用延伸到远端器官。因此，灭活LGG的抗炎作用实质上完全是全身性的。
[00099]在肝中，补充灭活LGG降低CINC-1水平至实际上低于母乳喂养的幼大鼠的水平。在肺和血浆中，灭活LGG降低CINC-1水平至非常近似于母乳喂养的幼大鼠的水平。这些结果表明，灭活LGG具有减轻配方奶粉喂养的幼鼠的全身性炎症的水平至近似于以及在某些情况下低于母乳喂养的幼鼠的水平的能力。
细胞因子与趋化因子
[000100]活LGG和灭活LGG还降低细胞因子和趋化因子水平。多重微珠试剂盒(Multiplex bead kit)购自LINCO Research，Inc.(St.Charles，MO，USA)。通过试剂盒进行了分析的细胞因子/趋化因子包括：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、干扰素-λ(IFN-λ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-18、单核细胞化学引诱物蛋白-1(MCP-1)、GRO/KC(大鼠CINC-1)和TNF-α。按照生产商的说明书进行了多重测定法。通过生产商供应的参比浓度绘制各细胞因子/趋化因子的标准曲线。通过MasterPlex定量软件(MiraiBio，Inc.，Alameda，CA，USA)对原始数据(平均荧光强度)进行了分析得到浓度值。
[000101]如图6所示，比起对照幼鼠，胃造口进食的LPS处理幼鼠肝中的IL-1β水平显著较高。活LGG和灭活LGG两者均使LPS诱导的IL-1β的升高显著钝化。实际上，灭活LGG降低IL-1β水平的程度比补充活LGG降低的程度大。灭活LGG降低IL-1β表达至近似于对照幼鼠的水平。因此，本项实验的这一部分也表明了灭活LGG的全身性抗炎活性。
[000102]总之，这些结果表明，补充灭活LGG减轻全身性炎症。此外，结果表明，灭活LGG降低配方奶粉喂养的幼鼠的全身性炎症至近似于母乳喂养的幼鼠的水平。这在本文所述的通过灭活LGG治疗组和仅喂母乳组的比较结果中进行了说明。在一些情况下，给予灭活LGG引起的炎症反应与母乳喂养组的炎症反应非常相似。
实施例2
[000103]本实施例进一步表明灭活LGG对配方奶粉喂养的新生大鼠幼仔的炎症的作用。
[000104]肠上皮细胞用活LGG或UV灭活LGG按1×108cfu/L预处理，然后用鞭毛蛋白500ng/mL刺激。通过ELISA测定IL-8的产生。通过蛋白质印迹法和免疫沉淀法测定IkB和遍在蛋白化-IkB(UbQ-IkB)的表达。通过免疫荧光染色法评价了NFkB定位。
[000105]实验期间，鞭毛蛋白诱导细胞IL-8产生显著增加(p＜0.05)。用活LGG或UV灭活LGG预处理，然后通过鞭毛蛋白刺激的细胞显示IL-8、NFkB核转运、IkB和UbQ-IkB的变化显著(p＜0.05)。结果见表1。上指箭头表示参数升高，而下指箭头则表示参数降低。
表1.由于补充活LGG或灭活LGG所引起的表达改变。
  IL-8   NFkB转运   IkB   UbQ-IkB
  仅鞭毛蛋白   ↑   ↑   ↓   ↑
  活LGG   ↓   ↓   ↑   ↑
  灭活LGG   ↓   ↓   ↑   ↓
[000106]如表1中所示，鞭毛蛋白诱导肠上皮细胞的IL-8产生显著增加(p＜0.05)。IL-8的产生在活LGG和灭活LGG两者的存在下显著下调。另外，由鞭毛蛋白刺激的细胞显示出NFkB核转运，活LGG和灭活LGG可防止这种NFkB核转运。鞭毛蛋白降低IkB产生，但活LGG和灭活LGG预处理使该作用逆转(p＜0.05)。鞭毛蛋白和活LGG增加UbQ-IkB(p＜0.05)，而灭活LGG则降低UbQ-IkB。
[000107]本实施例表明活LGG和灭活LGG均有效地降低促炎细胞因子IL-8的产生，因此具有抗炎作用。因为鞭毛蛋白和活LGG增加UbQ-IkB，但灭活LGG降低UbQ-IkB，所以灭活LGG很可能通过防止IkB的遍在蛋白化的机制起作用，而活LGG则很可能不是通过防止IkB的遍在蛋白化的机制起作用。因此，本实施例进一步表明活LGG和灭活LGG很可能通过不同的机制起作用，并且当同时给予时可具有协同效应。
[000108]本发明表明在肝、血浆和肺中减轻炎症。因为本发明可用于改善炎症状况，所以它还可防止发生造成伤害的感染和疾病。
[000109]本说明书所引用的所有参考文献，包括但不限于所有的论文、出版物、专利、专利申请、简报、教科书、报告、手稿、小册子、书籍、互联网上传文献、杂志文章、期刊等均通过引用全部结合到本说明书中。有关参考文献的论述只是概述其作者提出的主张，并非认定所有参考文献均构成现有技术。申请人保留对所引用的参考文献的准确性和关联性提出异议的权利。
[000110]本领域普通技术人员无需偏离本发明的精神和范围便可实施本发明的这些修改和变动以及其它的修改和变动，这些将在所附权利要求书中予以更具体的描述。另外，应当了解的是，各个实施方案的方面可完全或部分互换。此外，本领域普通技术人员应了解的是，仅通过实施例进行了前面的描述，并不是对在所附权利要求书中所进一步描述的本发明的限制。因此，所附权利要求书的精神和范围不应局限于对其中所包括的优选形式的描述。

Claims (11)

1.一种制备用于治疗、预防或减轻受治疗者的全身性炎症的药物的方法，其特征在于介于约1x104个细胞等同物/kg体重/天和1x1010个细胞等同物/kg体重/天之间的灭活鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillusrhamnosus GG)(LGG)被用作药理活性物质。
2.权利要求1的方法，其中存在的灭活LGG的量介于约1x106个细胞等同物/kg体重/天和1x109个细胞等同物/kg体重/天之间。
3.权利要求1的方法，其中存在的灭活LGG的量约为1x108个细胞等同物/kg体重/天。
4.权利要求1的方法，其中所述药物还包含至少一种其它的灭活益生菌。
5.权利要求1的方法，其中所述药物还包含存在有至少一种有活力的益生菌。
6.权利要求5的方法，其中所述有活力的益生菌包括LGG。
7.权利要求1的方法，其中所述药物另外还包含至少一种长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)。
8.权利要求7的方法，其中所述LCPUFA选自DHA和ARA。
9.权利要求1的方法，其中所述受治疗者是儿童。
10.权利要求1的方法，其中所述受治疗者是婴幼儿。
11.权利要求10的方法，其中所述婴幼儿是早产儿。
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