CN107115362A - 凝结芽孢杆菌在制备预防或治疗支气管哮喘制剂中的应用 - Google Patents

凝结芽孢杆菌在制备预防或治疗支气管哮喘制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了凝结芽孢杆菌在制备预防或治疗支气管哮喘制剂中的应用，具体是用凝结芽孢杆菌预防或治疗支气管哮喘，降低气道高反应性、减轻哮喘症状。

Description

凝结芽孢杆菌在制备预防或治疗支气管哮喘制剂中的应用
技术领域
本发明涉及凝结芽孢杆菌在制备预防或治疗支气管哮喘制剂中的应用，具体是用凝结芽孢杆菌预防或治疗支气管哮喘，降低气道高反应性、减轻哮喘症状。
背景技术
支气管哮喘(简称哮喘)是世界范围内严重威胁公众健康的慢性疾病之一，是一种严重的呼吸道疾病。支气管哮喘患者具有气道高反应性，通常出现广泛多变的可逆性气流受限，并引起反复发作性的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状。支气管哮喘不但发病率高，而且病程长且发作反复，已经成为了一个严重的公共卫生问题。由哮喘所带来的经济负担无论从直接医疗费用(住院和药品使用)还是间接的非医疗费用(包括误工及非正常死亡)都相当大。WHO报道，在全世界范围计算，哮喘相关的经济花费比结核病和艾滋病的总数还高。儿童期是哮喘发作的敏感阶段，哮喘导致的患儿缺课率升高、活动受到限制、影响社交能力等，对儿童的发育和成长产生更为深远的影响。
目前哮喘的治疗常用药物包括吸入糖皮质激素(简称激素)、白三烯调节剂、长效β2-受体激动剂等。目前激素是临床上最常用的药物，但部分哮喘患者对激素不敏感，依从性不佳，长期或较高剂量应用会增加药物不良反应。
本发明人经过研究发现，凝结芽孢杆菌能够有效预防或治疗支气管哮喘，安全没有任何毒副作用，效果优于双歧杆菌，且未见相关研究报道，特申请此发明专利。
发明内容
本发明的目的是提供一种能预防或治疗支气管哮喘的制剂，该制剂由凝结芽孢杆菌制成。
本发明的制剂的制备优选是通过下述步骤实施的，但不局限于此制备工艺，公知的能实现的制备工艺均可以：采取可能含凝结芽孢杆菌的样品，然后将样品置于灭菌瓶内，研究时从中取一定量的样品加入18mL灭菌的稀释液中，充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释，取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度，分别涂布于凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于培养箱，37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于培养箱内，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，然后根据《伯杰细菌鉴定手册》、相关细菌鉴定文献或16S rRNA序列对比分析进行凝结芽孢杆菌鉴定和毒性试验，将无毒性的凝结芽孢杆菌干燥菌粉按需要比例添加辅料制成片剂、胶囊、散剂、粉剂或液体制剂等各种剂型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到协同作用。
凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于：纯化水1000mL，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，酵母粉5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，吐温801.0ml，碳酸钙20g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，调pH 6.2-6.5，115℃高压灭菌20min。
凝结芽孢杆菌液体扩增培养基优选但不局限于：纯化水1000mL，蛋白胨10g，牛肉浸取物3g，氯化钠5g，葡萄糖5g，调pH 7，115℃高压灭菌20min。
为进一步具体说明本发明，发明人利用上述方法通过凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了无毒性的凝结芽孢杆菌，本发明所述凝结芽孢杆菌并不局限于为说明本发明所述的菌，只要无毒性的凝结芽孢杆菌均是本发明所述，均在本发明的保护范围内。
本发明所述凝结芽孢杆菌优选但不限于凝结芽孢杆菌TBC169保藏编号CGMCC1207或凝结芽孢杆菌保藏编号CGMCC1.2407。
本发明实施说明中优选使用的凝结芽孢杆菌的细菌学性质：
1、为说明本发明，本发明利用上述方法分离的凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌TBC169保藏编号CGMCC1207。
2、菌落形态
显微镜观察：杆状，革兰氏染色阳性。
平板形态：菌落呈白色、圆形、边缘整齐、大小2-3mm。
3、生理生化鉴定
明胶液化：－；过氧化氢酶：+；VP试验：+；苯丙氨酸脱氨酶试验－。
4、糖酵解实验鉴定
葡萄糖：+；麦芽糖：+；蔗糖：+；木糖：－；果糖：+；鼠李糖：－；乳糖：+；菊粉：+；半乳糖：+；糊精：+。
5、分离的菌进行16S rRNA基因测序，测得序列用BLAST与GenBank和RDP数据库中的基因序列进行相似性分析，确定分离的菌为凝结芽孢杆菌。
本发明所述的凝结芽孢杆菌指活的生物个体。
本发明是以有效剂量按上述方法分离的凝结芽孢杆菌作为主要活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等辅料，制成任何一种适合于使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、粉剂等剂型。
本发明所述凝结芽孢杆菌作为主要药物活性成份制成活菌制剂。
本发明所指有效剂量是指按上述方法分离的凝结芽孢杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上。
本发明所指有效剂量是指按上述方法分离的凝结芽孢杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可达到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。
本发明所述制剂包括凝结芽孢杆菌单独应用或与其他药物联合应用，尤其包括凝结芽孢杆菌单独应用或与双歧杆菌联合应用。
本发明所述双歧杆菌指活的生物个体。
本发明所述双歧杆菌联合应用的制剂中，固体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上；或液体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可达到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。
由于本发明首次公开了凝结芽孢杆菌作为主要活性成份制成制剂在预防或治疗支气管哮喘中的应用，因此含上述凝结芽孢杆菌的制剂在预防或治疗支气管哮喘制剂中的应用均属于本发明的保护范围。
本发明所述的凝结芽孢杆菌在制成任何一种剂型时，均具有预防或治疗支气管哮喘的作用。如果其组份中含有凝结芽孢杆菌成份制备成制剂，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有预防或治疗支气管哮喘的作用，则落入本发明的保护范围之内。
本发明所述的凝结芽孢杆菌可以制成药品、保健食品、食品或饮品等。
具体实施方式
制备例说明：上述已经对凝结芽孢杆菌制剂的制备进行说明，这里通过凝结芽孢杆菌TBC169保藏编号CGMCC1207或凝结芽孢杆菌保藏编号CGMCC1.2407(凝结芽孢杆菌保藏编号CGMCC1.2407购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)为例进行具体说明，其他凝结芽孢杆菌菌种制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握，在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。
制备实施例1凝结芽孢杆菌粉剂的制备
1菌粉的制备和菌种的鉴定
采取人的粪便、土壤、草垛底物等样品，然后将样品置于灭菌瓶内，从中取2克样品加入18mL灭菌的稀释液中，充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀释，取10-5，10-6，10-7三个稀释梯度，涂布于凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于培养箱，37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落接种到凝结芽孢杆菌液体扩增培养基中，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×109CFU/g以上，然后进行菌种鉴定，经生理生化和16S rRNA序列对比分析鉴定为凝结芽孢杆菌，为凝结芽孢杆菌TBC169保藏编号CGMCC1207。
凝结芽孢杆菌保藏编号CGMCC1.2407菌粉制备，将凝结芽孢杆菌保藏编号CGMCC1.2407接种到凝结芽孢杆菌液体扩增培养基中，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×109CFU/g以上。
2毒性试验
2.1动物及分组 取30只SPF级别小鼠，6-8周龄，体重14-18g，随机分凝结芽孢杆菌CGMCC1207组、凝结芽孢杆菌CGMCC1.2407组和未给药组，每组10只。
2.2制备菌液 将上述不同的凝结芽孢杆菌菌粉分别用纯化水调制为含菌数均为1×109CFU/mL的菌液。
2.3方法 各凝结芽孢杆菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，各凝结芽孢杆菌组每天灌服凝结芽孢杆菌菌液0.5mL，未给药组每天灌服纯化水0.5mL，饲喂14天，观察体重及毒性反应。
2.4结果
各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，未见中毒反应。
3制备成粉剂等剂型
根据上述步骤和方法分离鉴定后，经实验检验无毒性，就可将凝结芽孢杆菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选据凝结芽孢杆菌菌粉的活菌数，按比例添加淀粉制成粉剂，使活菌数不低于1×107CFU/g，然后装袋。
应用效果实施例说明：
本发明以凝结芽孢杆菌TBC169保藏编号CGMCC1207或凝结芽孢杆菌保藏编号CGMCC1.2407为代表说明凝结芽孢杆菌的应用效果。本发明中使用的双歧杆菌来自于市场销售产品，公众能够购买到的双歧杆菌活菌均可。
应用效果实施例1：凝结芽孢杆菌在治疗支气管哮喘中的应用
1模型组制备：
1.1实验动物 6-8周龄雄性BALB/c小鼠，体重20～25g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。实验前适应饲养一周：按照昼夜节律采光，控制温度和湿度，自由摄取食物和水，每日定时更换饲料，通风良好，排除其它应激因素干扰。
1.2制备方式 BALB/c小鼠于造模第1天和第7天用200μl致敏液(100μg卵清蛋白(OVA)+1.5mgAl(OH)3的生理盐水溶液)进行腹腔注射致敏。造模第14-21天，将小鼠放入密闭容器中，使用1％OVA溶液(生理盐水配制)连续雾化吸入激发，每日1次，每次30min。建立小鼠支气管哮喘模型。
1.3模型组制备结果造模成功。
2药物治疗实验：
2.1实验方法 选取6-8周龄的健康雄性BALB/c小鼠50只，随机分为正常对照组(n＝10)、凝结芽孢杆菌CGMCC1207组(n＝10)、凝结芽孢杆菌CGMCC1.2407组(n＝10)、双歧杆菌组(n＝10)、模型对照组(n＝10)。所有对象均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致。正常对照组不做任何处理，各治疗组和模型对照组按1.2所述方式建立小鼠支气管哮喘模型，并于模型建立的第8天起，凝结芽孢杆菌(CGMCC1207、CGMCC1.2407)和双歧杆菌治疗组使用含菌数为1×106CFU/mL(用0.9％生理盐水调制菌粉)的菌液灌服0.5mL，模型对照组和正常对照组每天灌服0.9％生理盐水0.5mL，直至第21天结束。
2.2检测 所有对象均在第22天进行气道反应性测定(检测气道阻力)。数据使用SPSS 21.0进行统计学分析。观察凝结芽孢杆菌对支气管哮喘小鼠气道高反应性的影响，并与双歧杆菌进行比较。
3结果
与正常对照组相比较，支气管哮喘模型小鼠气道阻力显著升高(6.25,12.5,25,50mg/ml乙酰甲胆碱)，气道反应性显著升高(P＜0.01)，差别有统计学意义。与支气管哮喘模型小鼠相比，凝结芽孢杆菌CGMCC1207和CGMCC1.2407治疗后，小鼠气道阻力显著降低(6.25,12.5,25,50mg/ml乙酰甲胆碱)，气道反应性下降(P＜0.01)，差异具有统计学意义。与双歧杆菌治疗组小鼠相比，凝结芽孢杆菌CGMCC1207和CGMCC1.2407治疗组小鼠气道阻力显著降低(6.25,12.5,25,50mg/ml乙酰甲胆碱)，小鼠气道反应性更低(P＜0.05)，差异具有统计学意义。凝结芽孢杆菌CGMCC1207组和CGMCC1.2407组之间，小鼠气道反应性无统计学差异(P＞0.05)。凝结芽孢杆菌对支气管哮喘小鼠的气道高反应性有显著改善作用，并显著高于双歧杆菌治疗组。见表1。
表1不同组别小鼠气道高反应性变化统计分析
4讨论
支气管哮喘模型组和正常对照组相比小鼠的气道反应性显著升高(P＜0.01)，而经凝结芽孢杆菌治疗后，小鼠的气道反应性显著降低(P＜0.01)，且疗效显著好于双歧杆菌治疗组。表明凝结芽孢杆菌干预能显著降低支气管哮喘模型小鼠的气道高反应性、减轻支气管哮喘症状。
凝结芽孢杆菌制剂能够有效预防或治疗支气管哮喘，显著降低气道高反应性、减轻支气管哮喘症状，且无任何毒副作用，应用依从性好，是预防或治疗支气管哮喘的新方法、新突破。
本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已于2004年8月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所邮编100101)保藏。分类命名：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans,保藏编号1207。凝结芽孢杆菌TBC169保藏编号CGMCC1207由本发明申请单位自行分离获得，已在商业渠道销售，并且已经授权专利保护(专利号200410098660.4)，按照专利审查指南的规定，公众能够从商业渠道买到或已经授权，不用保藏，即不用提供保藏证明，因此，本发明未提供凝结芽孢杆菌TBC169保藏编号CGMCC1207保藏证明。
凝结芽孢杆菌CGMCC1.2407购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

Claims (10)

1.凝结芽孢杆菌在制备预防或治疗支气管哮喘制剂中的应用。
2.按权利要求1所述应用，其特征在于所述制剂包括凝结芽孢杆菌单独应用或与其他药物联合应用。
3.按权利要求1所述应用，其特征在于所述制剂包括药品、保健食品、食品、饮品。
4.按权利要求1所述应用，其特征在于所述凝结芽孢杆菌指活的生物个体。
5.按权利要求1所述应用，其特征在于所述凝结芽孢杆菌包括凝结芽孢杆菌TBC169保藏编号CGMCC1207或凝结芽孢杆菌保藏编号CGMCC1.2407。
6.按权利要求2所述应用，其特征在于所述制剂包括凝结芽孢杆菌单独应用或与双歧杆菌联合应用。
7.按权利要求6所述应用，其特征在于所述双歧杆菌指活的生物个体。
8.按权利要求1所述应用，其特征在于预防或治疗支气管哮喘，降低气道高反应性、减轻哮喘症状。
9.按权利要求1所述制剂，其特征在于固体制剂包含的凝结芽孢杆菌总活菌数不低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上；或液体制剂包含的凝结芽孢杆菌总活菌数不低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可达到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。
10.按权利要求6所述制剂，其特征在于固体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上；或液体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可达到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。
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