TWI418355B

TWI418355B - 使用失活的益生菌（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）的方法及含彼之產物

Info

Publication number: TWI418355B
Application number: TW097106849A
Authority: TW
Inventors: Udo Herz; Robert J Mcmahon; William Michael Russell; Josef Neu
Original assignee: Mjn Us Holdings Llc
Priority date: 2007-02-28
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2013-12-11
Also published as: CN101678053B; MY151892A; US20080206213A1; EP2124977B9; EP2124977A1; MX2009008875A; TWI494114B; PL2124977T3; EP2114423B2; CN101636172A; RU2009135873A; US20080206212A1; HK1136969A1; US9408818B2; CN101678053A; ES2388198T3; HK1141729A1; US9408819B2; BRPI0808052A2; ATE544457T1

Description

使用失活的益生菌(probiotic)的方法及含彼之產物

相關專利及申請申請案之交互參照

本專利申請案為非臨時申請案且主張於2007年2月28日申請之美國專利臨時申請案第60/904,122號之優先權益，該案全部併此以為參考。

本發明大致上係有關一種含有至少一種失活的益生菌(probiotic)之產物及使用彼之方法。

發炎反應為身體受到感染劑侵入、抗原挑釁，或物理性、化學性或創傷性損害時，企圖恢復及維持體內平衡之反應。局部性發炎局限於特定區域且可顯現出不同症狀，包括發紅、腫脹、發熱及疼痛。

雖然一般認為發炎反應係針對受傷的健康反應，不過若未經適當調節，免疫系統卻會表現出不當的生理反應。在這種情況下，正常時應為保護性的免疫系統卻會傷害自體組織，因為它會把正常組織當作感染或異常組織來處置。另一種情況為身體受傷時，發炎反應卻以超過導致受傷之威脅程度的比例來反應。當這種情況發生時，發炎反應對身體的傷害會遠超過受傷本身所造成的傷害。

現在已知發炎反應在某種程度上係由於前-發炎性及抗-發炎性細胞激素的表現提高所造成的。細胞激素為低分子量、具生物活性之蛋白質，其涉及免疫性與發炎性反應之協調以及特定免疫細胞族群間之溝通。發炎期間有多種類型細胞會產生細胞激素，包括噬中性球、單核球及淋巴球。

發炎部位產生之細胞激素可經由多種機制來影響發炎反應。不過，若前-發炎性反應未成功地受到抗-發炎性細胞激素制衡，那麼就會產生失控的全身性發炎。

相對於局部性發炎，全身性發炎遍佈全身。此類型的發炎可包含特定部位的局部發炎，還伴有“類流感”症狀，包括發燒、發冷、疲倦或喪失活力、頭痛、沒有食慾，及肌肉僵硬。全身性發炎可導致蛋白質分解、異化及代謝亢進。結果，可能會危及基礎器官(像是肌肉、心臟、免疫系統及肝)之結構及功能且造成多器官衰竭及死亡。Jeschke,et al., Insulin Attenuates the Systemic Inflammatory Response to Thermal Trauma , Mol. Med. 8(8):443-450 (2002)。雖然對全身性發炎機制的瞭解已有巨大進步，不過此等疾病造成的死亡率仍高得難以接受。

呼吸道感染很常見，尤其好發於嬰兒。於生命的頭一年，嬰兒易於重複地發生呼吸道感染，單單一年通常就有3到6次的感染。僅僅美國，每一年就有約6%小於一歲的嬰兒因下呼吸道感染而住院。

依感染的病毒類型及感染部位而定，呼吸道感染的程度及症狀可從很輕微到很嚴重。上呼吸道感染通常看起來好像一般感冒，會造成鼻、喉嚨及鼻竇的襯膜發炎及腫脹。流行性感冒，一般稱為流感，為一種高傳染性病毒感染之上呼吸道疾病。流感之症狀包括發燒、發冷、頭痛、肌肉酸痛、頭昏、咳嗽、喉嚨痛、流鼻水、噁心及腹瀉。另一種上呼吸道感染，哮吼，會導致劇烈咳嗽及不同程度之呼吸困難，主要是吸氣困難。

一般認為下呼吸道感染比上呼吸道感染更為嚴重。呼吸道融合病毒(RSV)為導致嬰兒及小於4歲之孩童發生下呼吸道感染之最常見原因。Van Woensel, I., et al.,Viral Lower Respiratory Tract Infection in Infants and Young Children , BMJ 327:36-40 (2003)。由於此等病毒如此常見，因此所有小孩在三歲以前都曾受到RSV病毒感染。對多數的嬰兒及孩童而言，RSV係造成與一般感冒沒什麼兩樣的輕微呼吸道感染。通常會鼻塞、流鼻水及咳嗽。

預防RSV病毒涉及了T-細胞及B-細胞反應、抗體反應(IgM、IgG及IgA)，以及其他因細菌及病毒感染而被活化之免疫系統反應。有人認為嬰兒期受到RSV感染與稍後在孩童時期再發生呼吸喘鳴、氣喘及異位性體質有關。因此，限制RSV感染還可預防延伸到孩童時期之呼吸道併發症。

支氣管炎為一種下呼吸道感染，其會影響支氣管，因病毒性發炎而導致支氣管狹窄及腫脹。細支氣管炎與支氣管炎很像，不過主要發生在嬰兒。其為氣管分支系統中口徑更小的支氣管發炎。此種感染會導致呼吸吃力、頻繁及劇烈的咳嗽及呼吸喘鳴且可能需要住院。

對嬰兒而言最嚴重的下呼吸道感染就是肺炎。肺炎係由於肺泡受到感染所造成的，其內會充滿濃稠之膿狀性質液體，而妨礙適當的二氧化碳交換。肺炎的嚴重性將視所涉及之肺部組織的多寡而定。

多數的上呼吸道及下呼吸道感染係由目前沒有特定預防或治療方式之病毒所引起。某些呼吸道感染，例如流感，可用疫苗接種來預防。不過，即使可對特定的呼吸道感染發展出疫苗，這些疫苗往往很昂貴而無法普遍使用。類似地，治療此等感染的藥物應用有限也很昂貴。因此，宜提供一種非醫學性方法以預防或治療嬰兒之呼吸道感染。

常見的呼吸道感染通常伴有急性中耳炎(AOM)，亦稱為中耳感染。AOM的特徵為急性、短期的發炎病程及液體充塞於中耳。AOM亦伴有鼻炎、咳嗽、發燒、喉嚨痛、耳痛、聽力減退、心神不定、易怒、喪失食慾、噁心或腹瀉。AOM還包括通過穿孔鼓膜之化膿性耳漏。

50%的孩童在1歲時發生至少一次AOM。80%的孩童在第三次生日時發生至少一次AOM。在1至3歲間，35%的孩童將再發生AOM。

AOM可由病毒或細菌引起。引起AOM之最常見的細菌菌株為肺炎雙球菌(Streptococcus pneumoniae ，35%病例)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae ，30%病例)及黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis ，10%病例)。由於細菌性菌株經常會引起感染，所以AOM通常會藉由投予抗生素來治療。事實上，在嬰兒時期，醫生為了治療AOM所開出之抗生素類處方比起其他疾病更多。

一般來說，細胞激素反應為前-發炎性或抗-發炎性反應將視於任何特定時間定殖在腸腔內之諸微生物間之平衡而定。習知地，腸道黏膜表面係由數量龐大的、複雜且動態平衡之微生物聚集體所定殖。該腸道微生物菌叢的組成會隨著消化道及不同的微生境，例如上皮黏液層、隱窩黏液深層及黏膜上皮細胞之表面，而有所不同。特定的菌落形成將視外在及內在因素而定，包括腔室內可供利用之分子、黏液性質，及宿主-微生物間及微生物-微生物間之交互作用等。Murch, S. H.,Toll of Allergy Reduced by Probiotics , Lancet, 357:1057-1059 (2001)。

組成腸道微生物菌叢之此等微生物活躍地涉及免疫反應。他們與上皮組織間的互動可為兩者皆獲利之關係(互利共生)或者為一方受利但另一方未受損之關係(片利共生)。Hooper,et al., How Host-Microbial Interactions Shape the Nutrient Environment of the Mammalian Intestine , Annu. Rev. Nutr. 22:283-307 (2002)。事實上，有大量證據顯示：於腸黏液中腸道微生物菌叢及不同的細胞族群間之相互影響或“交談”非常熱烈。Bourlioux,et al., The Intestine and its Microflora are Partners for the Protection of the Host: Report on the Danone Symposium "The Intelligent Intestine"，2002年6月14日於巴黎舉行，Am. J. Clin Nutr. 78:675 (2003); Hooper, L.V. & Gordon, J. I.,Commensal Host-Bacterial Relationships in the Gut , Sci. 292:1115 (2001); Haller,et al., Non-Pathogenic Bacteria Elicit a Differential Cytokine Response by Intestinal Epithelial cell/Leucocyte Co-Cultures , GUT 47:79 (2000); Walker, W.A.,Role of Nutrients and Bacterial Colonization in the Development of Intestinal Host Defense , J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30:S2 (2000)。此外，該腸微生物菌叢還可於成人引發局部或全身性層次之特異性免疫反應。Isolauri, E.,et al., Probiotics: Effects on Immunity , Am. J. Clin. Nutr. 73:444S-50S (2001)。

已知嬰兒腸道之微生物菌叢的發展較成人差。雖然成人之微生物菌叢係由多於10¹³ 個微生物及近乎500種物種(有些有害有些有益)所組成，然而嬰兒的微生物菌叢，就絕對數目及物種歧異性兩者而言，皆只有成人微生物菌叢之一小部份。嬰兒出生時只有無菌的腸道，但會從產道、初始環境及消化的食物中獲得腸道菌叢。由於早期的新生兒生命中腸道微生物族群很不穩定，因此嬰兒腸道很難維持有益及有害細菌間之平衡，故而會降低免疫系統正常運作的能力。

由於餵食配方食品之嬰兒與餵母乳之嬰兒其腸道內之細菌物種有所不同，所以對於餵食配方食品之嬰兒而言維持此種平衡會更困難。餵母乳之嬰兒糞便內主要是雙歧桿菌屬(Bifidobacterium )細菌，而鏈球菌(Streptococcus )及乳酸桿菌(Lactobacillus )則較少。相對地，餵食配方食品之嬰兒的微生物菌叢之歧異性更大，其除了雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬細菌以外，還含有致病性較強之物種，包括葡萄球菌(Staphylococcus )、大腸桿菌(Escherichia coli )及梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia )細菌。餵食配方食品之嬰兒與餵母乳之嬰兒之糞便內的雙歧桿菌屬細菌之菌種亦有所不同。已有多種因素被認為是引起餵食配方食品之嬰兒與餵母乳之嬰兒糞便內微生物菌叢不同的原因，其包括母乳內蛋白質含量較低及組成不同，母乳內磷含量較低，母乳內有大量寡聚醣，母乳內還有多種免疫功能之體液性及細胞性調節劑。Agostoni,et al., Probiotic Bacteria in Dietetic Products for Infants: A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition, J. Pediatr. Gastro. Nutr. 38:365-374 (Apr. 2004)。

由於餵食配方食品之嬰兒的微生物菌叢如此不穩定而腸道之微生物菌叢又深入地參與激發腸道免疫之作用，因此餵食配方食品之嬰兒似乎較容易發生炎性疾病。影響嬰兒的多種主要疾病，包括慢性肺病、腦室周圍白質軟化、新生兒腦膜炎、新生兒肝炎、敗血病及壞死性腸炎，皆具有發炎本質。依該特定疾病而定，所伴隨的發炎可發生在特定器官，例如肺、腦、肝或腸，或者發炎作用實質上遍佈全身。

舉例來說，慢性肺病會使肺內組織發炎而新生兒腦膜炎則涉及腦及脊髓的底膜發炎。腦室周圍白質軟化則是由於正在發育的腦之腦室周圍區域發炎性損傷所造成的。壞死性腸炎會引起腸發炎而導致部份或所有的腸道損壞，而新生兒肝炎則涉及於嬰兒早期肝發炎的現象。敗血病，亦稱為全身性發炎反應症候群，係由毒素-產生細菌於血流造成全面性感染而引起的嚴重疾病。此種疾病係由血流內之病原體引發全身性發炎反應。

早產及重病嬰兒在發展腸道免疫及預防全身性發炎上有著嚴重挑戰。早產或重病嬰兒通常會馬上被放到無菌保溫箱中，於此他們保持著不曝露在健康、足月的嬰兒通常會接觸之細菌族群中。此舉可能會延遲或損及自然的菌落定殖過程。此等嬰兒通常還會用廣效性抗生素來治療，而廣效性抗生素卻會殺死試圖定殖到嬰兒腸道之共生細菌。此外，這些嬰兒通常會餵食嬰兒配方食品，而非母奶來餵養。任一此等因素都可能會使得嬰兒腸道微生物菌叢發展不良，因此造成或加重危及生命之全身性發炎。

近年來，人們建議於餵食配方食品之嬰兒的飲食中補充益生菌以利於有益微生物於腸道定殖。益生菌為對宿主健康顯示出有利影響之活微生物。Fuller, R.Probiotics in Man and Animals , J. Appl. Bacteriol. 66:365-78 (1989)。

雖然活的益生菌可有效地讓腸道微生物菌叢正常化，不過僅有極少數已公開之研究評估其於早產及免疫受抑制之嬰兒的安全性。此種特定群體只有不成熟之腸道防禦障壁，如此會增加腸腔細菌移位的風險，而有可能造成感染之高度危險。於許多情況下，人們並不建議把活的益生菌投予給免疫受抑制之患者、心臟手術後之患者、胰臟功能衰竭之患者，或糞便中有血之患者。已有報導指出至少有一起死亡係由於免疫受抑制之個體補充益生菌所造成的。MacGregor G.,et al. Yoghurt biotherapy: contraindicated in immunosuppressed patients? Postgrad Med J. 78:366-367 (2002)。

因此，對免疫受抑制之患者或早產嬰兒而言，提供一種能治療或預防全身性發炎之非活體補充品會很有用。相對於活性或活體益生菌，非活體之另一選項還有著上架壽命較長的額外優點。活性或活體益生菌對溫度、濕度及光線很敏感，理想上應冷藏保持活性。即使在這樣小心的照料下，典型的益生菌上架壽命仍很短。相對於活體益生菌之非活體選項則可以免除冷藏需求且能提供上架壽命較長之產物。這種產物無需冷藏即可流通到全世界的每個區域。益生菌之非活體選項還可減少其與其他食物成份間發生交互作用的風險，例如醱酵、風味及質感改變，及產物新鮮度等。據此，提供一種藉由投予失活的益生菌來於餵食配方食品之嬰兒減少或預防全身性發炎之方法會很有用。

發明總論

簡要地，本發明係關於一種含有至少一種失活的益生菌之新穎產物，其中該益生菌不是有活力的，但是該失活的益生菌之細胞成份仍保有與該益生菌之有活力的或非失活化細胞之同樣或類似的生物反應性特質。

於其他具體例中，本發明係關於一種使用一或多種與有活力或活的益生菌具有同樣或類似的生物反應性優點之益菌的失活菌株的方法。

於其他具體例中，本發明係關於一種治療、預防或減少個體的全身性發炎或呼吸性發炎之方法，該方法包含把治療有效量之至少一種失活的益生菌投予給該個體，其中該益生菌之活體形式可用來治療、預防或減少個體之全身性發炎或呼吸性發炎。

於其他具體例中，本發明係關於一種治療、預防或減少個體的呼吸性發炎之方法，該方法包含把治療有效量之至少一種失活的益生菌投予給該個體，其中該益生菌之活體形式可用來治療、預防或減少個體之呼吸性發炎。

於其他具體例中，本發明係關於一種減少或預防個體的一或多種前-發炎性細胞激素或趨化素之釋出的方法，該方法包含把治療有效量之至少一種失活的益生菌投予給該個體。

於一特定具體例中，本發明係關於一種治療、預防或減少個體的全身性發炎之方法，該方法包含把治療有效量之至少一種失活的益生菌以及至少一種長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)及/或至少一種活的益生菌投予給該個體。於特定具體例中，該LCPUFA可為二十二碳六烯酸(DHA)或花生四烯酸(ARA)。

於本發明所提供之多項優點中，有一項為能降低或預防全身性或呼吸性發炎。本發明還能減少肝、血漿、肺及腸之發炎。此外，本發明還能減少或預防多種前-發炎性細胞激素及趨化素之釋出，其包括(影響)介白素-1 β(IL-1 β)、IL-8、CINC-1及生長相關致癌基因(GRO/KC)之含量。由於本發明可用來改善發炎病況，所以還能預防不當感染或疾病之發生。

較佳具體例之詳細說明

現在將詳細參照本發明之具體例，以下顯示本發明之一或多個實施例。各實施例係用以解釋本發明，而非限制本發明。事實上，對於熟悉此技術者而言很明顯地，可在不偏離本發明之範疇或精神下對本發明進行多種修正及改變。舉例來說，於一具體例中顯示或描述之特性，可用在另一具體例而產生再一具體例。

故而，本發明意圖涵括伴隨後附申請專利範圍及其均等物之此等修正與變化。本發明之其他目標、特性及態樣係揭露於以下詳細說明中，或者基於此等說明即明顯可知。熟知此技術之一般人士應瞭解現在的討論僅是針對示範性具體例的說明，而非意圖限制本發明之較廣態樣。

在此使用以下縮寫：LGG，鼠李糖乳酸桿菌GG(或雷諾氏菌GG)；LCPUFA，長鏈多不飽和脂肪酸；LPS，脂多醣；IL，介白素；CINC-1，細胞激素誘生之嗜中性球趨化因子-1;GRO/KC，生長-相關致癌基因；ELISA，酵素-連結免疫吸附檢定；RT-PCR，逆轉錄-聚合酶連鎖反應；ANOVA，變異數分析；SD，標準差；RMS，大鼠乳汁替代品；TLR，類鐸受體(Toll-like receptor)；核因子kB，NF-kB;EPA，二十碳五烯酸；DHA，二十二烷基六烯酸；ARA，花生四烯酸。

TLR為一群脊椎動物辨識受體。它們已演化成先天性及適應性免疫力的關鍵分子。它們在辨認保留之微生物成份上扮演著重要的角色。生物之細胞壁成份、DNA及雙股RNA明顯地係由不同的TLR來辨認。此等細菌-衍生之成份(不論其為LPC、肽聚醣或CpG DNA)為天然的TLR配體，其在缺乏病原性序列(一般係源自正常的細菌性增殖作用-腹瀉、組織毀損、全身性發炎、障壁穿透性)下仍保有強烈的免疫調節性質。該等細菌性成份一般係對適應性免疫反應發生作用，然而細菌本身則由先天性免疫反應來辨識。

術語“益生菌(probiotic)”意指對宿主健康有益之活的、活性或有活力的微生物。

術語“促生素(prebiotic)”意指能刺激益生菌生長或增進其活性之不可消化的食物成份。

在此使用時，術語“治療”意指緩和、改善或醫治一疾病、病況或一疾病或病況之症狀。

術語“減少”意指縮小範圍、降低數量或減輕程度。

術語“預防”意指透過某些動作來停止或阻礙一疾病、病況或一疾病或病況之症狀。

術語“全身性”在此使用時意指關於或影響到整個身體。

術語“呼吸性感染”或“呼吸性疾病”意指影響到負責把氧氣從空氣中攜載到血流內及排除掉二氧化碳之器官群的疾病或感染。

術語“失活的益生菌”或“失活LGG”意指該益生菌或LGG生物之內代謝活性或繁殖能力已被降低或破壞。一般相信該“失活的益生菌”或“失活LGG”於細胞層次上仍保有至少一部份天然TLR配體，其換句話說仍保有至少一部份免疫調節性質。在此使用時，“失活”與“非活力的”為同義詞。

術語“治療有效量”意指能改善或醫治該疾病、病況或該疾病或病況之症狀之份量。

術語“早產”意指妊娠未滿37週即出生之嬰兒。

術語“嬰兒”意指小於約1歲之已出生人類。

術語“兒(孩)童“意指從約1歲到12歲之人類。於特定具體例中，兒童係約1歲到6歲之人類。於其他具體例中，兒童係約7到12歲之人類。

在此使用時，術語“嬰兒配方食品”意指能滿足嬰兒營養需求、可作為母乳替代品之組成物。

根據本發明，現已發現一種使用益生菌之新穎產物及方法。該產物及方法包含治療有效量之至少一種失活的益生菌之使用及投予給個體。於某些具體例中，該個體為嬰兒。

有效投予失活的益生菌之早期嘗試遭遇實質阻礙。舉例來說，Kirjavainen, P.等人指出：在比較補充活性LGG及熱-失活的LGG之孩童以後，發現補充失活LGG之孩童近乎40%會有嚴重腹瀉。Probiotic Bacteria in the Management of Atopic Disease: Underscoring the Importance of Viability , J. Ped. Gastro. 36:223-227 (2003)。安慰劑組或活的LGG組則沒有副作用，出處同上 第225頁。由於腹瀉廣泛地伴有發炎反應，所以該Kirjavainen 研究顯示失活的LGG實際上可能會造成消化道發炎。事實上，該研究指出“熱-失活化過程可能會造成表面肽變質及熱-休克蛋白質之表現，經如此修改之LGG免疫刺激性質會使得該熱失活化形式引起發炎反應且繼而增加腸道之通透性”。出處同上 ，第226頁。相對地，本案發明者則發展出一種新穎的方法，其能藉著食用含有失活的益生菌之產物來投予至少一種失活的益生菌以治療或預防發炎。

本案發明者發現到人類食用失活的益生菌也可以達到人類食用同種活的或有活力之益生菌時所達到之相同或類似的有益影響。本發明之失活的益生菌除了不具有繁殖力以及嚴格伴隨著活生物體之其他活性特質以外，仍保有其細胞性及分子性特質且可於攝取它們之宿主體內引發生物反應性反應。因此，本發明之失活的益生菌可為此技術習知之任一益生菌或任何益生菌之組合。

於其他具體例中，該失活的益生菌可為乳酸桿菌屬(Lactobacillus )之一員。例如，該失活的益生菌可為嗜酸乳酸桿菌(L. acidiphilus )，嗜澱粉乳酸桿菌(L. amylovorus )，保加利亞乳酸桿菌(L. bulgaricus )，皺緣乳酸桿菌(L. crispatus )，戴耳布呂克氏乳酸桿菌(L. delbrueckii )，鼠李糖乳酸桿菌(L. rhamnosus )，乾酪乳酸桿菌(L. casei )，家禽乳酸桿菌(L. gallinarum )，醱酵乳酸桿菌(L. fermentum )，加氏乳酸桿菌(L. gasseri )，瑞士乳酸桿菌(L. helveticus )，佐氏乳酸桿菌(L. jugurti )，約氏乳酸桿菌(L. johnsonii )，萊希曼氏乳酸桿菌(L. leichmannii )，胚芽乳酸桿菌(L.plantarum )，洛德乳酸桿菌(L. reuteri )或唾液乳酸桿菌(L. salivarius )。於特定具體例中，該失活的益生菌可為嗜酸乳酸桿菌LA-5®、嗜酸乳酸桿菌NCFM、嗜酸乳酸桿菌AS-1、嗜酸乳酸桿菌DDS-1、嗜酸乳酸桿菌HP10、嗜酸乳酸桿菌HP100、嗜酸乳酸桿菌HP101、嗜酸乳酸桿菌HP102、嗜酸乳酸桿菌HP103、嗜酸乳酸桿菌HP104、嗜酸乳酸桿菌HP15、嗜酸乳酸桿菌PIM703、嗜酸乳酸桿菌SBT2062、乾酪乳酸桿菌DN-114 001、乾酪乳酸桿菌LC10、乾酪乳酸桿菌PIM61、乾酪乳酸桿菌431®(CRL431)、乾酪乳酸桿菌F19、乾酪乳酸桿菌Shirota、乾酪乳酸桿菌immunitass、皺緣乳酸桿菌BG2FO4、戴耳布呂克氏乳酸桿菌保加利亞亞種、戴耳布呂克氏乳酸桿菌保加利亞亞種2038、戴耳布呂克氏乳酸桿菌保加利亞亞種MR120、戴耳布呂克氏乳酸桿菌保加利亞亞種PIM695、胚芽乳酸桿菌299V、洛德乳酸桿菌1063-S、洛德乳酸桿菌11284、洛德乳酸桿菌SD2112、洛德乳酸桿菌T-1、洛德乳酸桿菌ATTC 55730、洛德乳酸桿菌SD2112、洛德乳酸桿菌RC-14®、鼠李糖乳酸桿菌GG (LGG)ATCC 53013、鼠李糖乳酸桿菌GR-1®、鼠李糖乳酸桿菌LB21、鼠李糖乳酸桿菌R-011、鼠李糖乳酸桿菌R-049、鼠李糖乳酸桿菌MX1、加氏乳酸桿菌ADH，瑞士乳酸桿菌MR220、瑞士乳酸桿菌NCK388、約氏乳酸桿菌11088 (NCK088)、約氏乳酸桿菌La-1、唾液乳酸桿菌UCC500、唾液乳酸桿菌UCC118或雷特氏乳酸桿菌San。

如前文所述，於本發明一特定具體例中，該失活的益生菌可為LGG。LGG為一種從健康人類腸菌叢中分出來的益生菌株。揭示於Gorbach等人之美國專利第5,032,399號，其全部併此以為參考。LGG能耐受大多數的抗生素，於酸及膽汁中很穩定，緊密地依附在人類腸道的黏膜細胞上。於大多數個體內可存活1-3天，於30%個體中可長達7天。除了定殖能力以外，LGG還能有益地影響黏膜之免疫反應。LGG已寄存於寄存機構美國菌種中心且寄存編號為ATCC 53103。

於再一具體例中，該失活的益生菌可為雙歧桿菌屬之一員。例如，該失活的益生菌可為動物雙歧桿菌(B.animalis )、短雙歧桿菌(B.breve )、嬰兒雙歧桿菌 (B.infantis )、雷特氏雙歧桿菌(B.lactis )、豬雙歧桿菌(B.suis )、或羅根雙歧桿菌(B.longum )。於特定具體例中，該失活的益生菌可為動物雙歧桿菌動物亞種、動物雙歧桿菌DN-173010、動物雙歧桿菌雷特氏亞種(BB-12®)、短雙歧桿菌Yakult、短雙歧桿菌R-070、嬰兒雙歧桿菌BBI、嬰兒雙歧桿菌35624、雷特氏雙歧桿菌HN019 (DR10)、羅根雙歧桿菌BB46、羅根雙歧桿菌BBL或羅根雙歧桿菌BB536。

如同所提到地，該失活的益生菌可為動物雙歧桿菌雷特氏亞種(BB-12®)，其係來自Chr. Hansen Biosystems，位於密爾瓦基市，WI(美國威斯康辛州)。BB-12®為一種格蘭氏陽性厭氣性桿狀細菌，存在於大多數哺乳動物(包括人類)的大腸內。

於其他具體例中，該失活的益生菌可為大腸桿菌(Escherichia coli )、糞腸球菌(Enterococcus faecium )、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )、雷特氏乳酸球菌(Lactococcus lactis )、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、戊糖小球菌(Pediococcus pentosaceus )、乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici )、血鏈球菌(Streptococcus sanguis )或嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )。於特定具體例中，該失活的益生菌可為大腸桿菌Nissle 1917。於另一具體例中，該失活的益生菌可為釀酒酵母菌(boulardii)lyo。於另一具體例中，該失活的益生菌可為雷特式乳酸球菌L1A。於再一具體例中，該失活的益生菌可為嗜熱鏈球菌TH-4^TM 。

於本發明一具體例中，可使用一種以上的失活益生菌。於此具體例中，任何失活的益生菌之組合乃為意圖提供能達到所欲結果之組合。於一特定具體例中，組合可包含一或多種雙歧桿菌屬細菌及一或多種乳酸桿菌屬細菌，例如可使用BB-12®及LGG。於一個別具體例中，係採用BB-12®及LA-5®之組合。

於本發明方法中，該失活的益生菌之治療有效量乃為可於個體減少或預防全身性發炎之份量。此份量相當於約1×10⁴ 到1×10¹² 個細胞當量/公斤體重/天。於另一具體例中，本發明包括投予約1×10⁶ 到1×10⁹ 個細胞當量/公斤體重/天。於再一具體例中，本發明包括投予約1×10⁹ 個細胞當量/公斤體重/天。於另一具體例中，本發明包括投予約1×10¹⁰ 個細胞當量/公斤體重/天。

本發明使用至少一種已經失活化之益生菌。失活化可採用此技術現在已知或未來發展出之任何方法來進行。失活化可透過例如加熱、凍乾、紫外線、伽瑪輻射、壓力、化學瓦解或機械瓦解來達成。舉例來說，該益生菌可藉著置於80℃到100℃下10分鐘加熱失活化。該益生菌亦可藉由置於離30瓦UVC燈5公分處用紫外線照射5分鐘來失活化。另外，該益生菌還可用鈷-60源以20公分的距離用2kg-Gray(kGy)伽瑪照射來失活化。

於本發明方法中，失活的益生菌之投藥形式並不重要，只要能投予治療有效量即可。於某些具體例中，該至少一種失活益生菌係經由藥錠、藥片、封裝物、糖衣片、膠囊錠、膠囊、油滴或小包來投予給個體。於另一具體例中，該失活的益生菌係封裝在糖、脂肪或多醣內。於另一具體例中，該失活的益生菌係被添加到食品或飲品中攝取。該食品或飲品可為兒童營養品如較大嬰兒配方食品、成長乳、飲料、乳品、優格、果汁、水果-基礎飲品、可嚼錠、甜餅乾、鹹餅乾或奶粉。於另一具體例中，該產品可為嬰兒營養食品，像是嬰兒配方食品或母乳強化營養品。

若該至少一種失活的益生菌係經由嬰兒配方食品投予，那麼該嬰兒配方食品宜營養完備且含有適當類型及份量之脂質、醣類、蛋白質、維生素及礦物質。脂質或脂肪的份量典型地可為約3到約7 g/100 kcal不等。脂質源可為任何此技術已知或使用之來源，例如植物油像是棕櫚油、黃豆油、精品棕櫚、椰子油、中鏈三酸甘油酯、高油酸葵花油、高油酸紅花油等等。蛋白質份量可為約1到約5 g/100 kcal不等。蛋白質源可為任何此技術已知或使用之來源，例如無脂乳、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白質、水解蛋白質、胺基酸等等。醣類份量可為約8到約12 g/100 kcal不等。醣類源可為任何此技術已知或使用之來源，例如乳糖、葡萄糖、玉米糖漿固體、麥芽糊精、蔗糖、澱粉、米糖漿固體等等。

方便地，可使用市售之嬰兒配方食品。例如，可於 Enfamil®、Enfamil®早產兒配方奶粉、Enfamil®含鐵奶粉、Lactofree®、Nutramigen®、Pregestimil®及ProSobee®(來自Mead Johnson & Company，Evansville，美國印地安那州)補充適量之失活益生菌且用以實施本發明之方法。

於本發明一具體例中，該至少一種失活的益生菌可組合一或多種活的益生菌以於餵食配方食品之嬰兒治療或預防全身性發炎。任何此技術已知之活的益生菌只要能達到所需效果皆可用於此具體例。於一特定具體例中，該活的益生菌係選自任一種以上討論之益菌屬或種。

若活的益生菌係與失活的益生菌一起投予，該活的益生菌之份量可相當於約1×10⁴ 到1×10¹² 菌落形成單位(cfu)/公斤體重/天。於另一具體例中，該活的益生菌份量可為約1×10⁶ 到1×10⁹ cfu/公斤體重/天。於另一具體例中，該活的益生菌份量可為約1×10⁹ cfu/公斤體重/天。於再一具體例中，該活的益生菌份量可為約1×10¹⁰ cfu/公斤體重/天。

於本發明另一具體例中，該至少一種失活的益生菌可組合一或多種促生素以於餵食配方食品之嬰兒治療或預防全身性或呼吸性發炎。任何此技術已知之促生素只要能達到所需效果皆可用於此具體例。用於本發明之促生素可包括乳酮搪、葡萄-寡醣、菊糖、聚葡萄糖、半乳-寡醣、果-寡醣、異麥芽-寡醣、大豆寡醣、乳蔗糖、木-寡醣及龍膽-寡醣。

於本發明另一具體例中，該嬰兒配方食品還可含有其它活性劑如LCPUFA。適當的LCPUFA包括但不限於α-亞麻油酸、γ-亞麻油酸、蘇子油酸、二十碳五烯酸(EPA)、ARA及/或DHA。於一具體例中，失活的益生菌係與DHA一起投予。於一具體例中，失活的益生菌係與ARA一起投予。於一具體例中，失活的益生菌係與DHA及ARA一起投予。亦可於含有DHA、ARA或其組合之市售嬰兒配方食品中補充至少一種失活的益生菌且用於本發明。例如，Enfamil®LIPIL®，其含有有效量之DHA及ARA，可商業性購得且可補充至少一種失活的益生菌且用於本發明。

於一具體例中，係以DHA及ARA兩者與至少一種失活的益生菌組合來治療嬰兒之全身性發炎。與此具體例中，該ARA:DHA之重量比一般為約1:3到約9:1。於本發明一具體例中，該比例為約1:2到約4:1。於本發明另一具體例中，該比例為約2:3到約2:1。於一特定具體例中，該比例為約2:1。於另一特定具體例中，該比例為約1:1.5。於其他具體例中，該比例為約1:1.3。於再一具體例中，該比例為約1:1.9。於一特定具體例中，該比例為約1.5:1。於更一具體例中，該比例為約1.47:1。

於本發明特定具體例中，該DHA之份量為脂肪酸重量之約0.0重量%到約1.00重量%。

該DHA量可為約0.32重量%。於某些具體例中，該DHA量為約0.33重量%。於其他具體例中，該DHA量為約0.64重量%。於另一具體例中，該DHA量為約0.67重量%。於再一具體例中，該DHA量為約0.96重量%。於更一具體例中，該DHA量為約1.00重量%。

於本發明特定具體例中，該ARA之份量為脂肪酸重量之約0.0重量%到約0.67重量%。於另一具體例中，該ARA量可為0.67重量%。於其他具體例中，該ARA量為約0.5重量%。於再一具體例中，該DHA量為約0.47重量%到0.48重量%。

若含有DHA，那麼於本發明具體例中該DHA之有效量一般為約3mg/公斤體重/天到約150mg/公斤體重/天。於一具體例中，該份量為約6mg/公斤體重/天到約100mg/公斤體重/天。於另一具體例中，該份量為約10mg/公斤體重/天到約60mg/公斤體重/天。於再一具體例中，該份量為約15mg/公斤體重/天到約30mg/公斤體重/天。

若含有ARA，那麼於本發明具體例中該ARA之有效量一般為約5mg/公斤體重/天到約150mg/公斤體重/天。於一具體例中，該份量為約10mg/公斤體重/天到約120mg/公斤體重/天間。於另一具體例中，該份量為約15mg/公斤體重/天到約90mg/公斤體重/天間。於再一具體例中，該份量為約20mg/公斤體重/天到約60mg/公斤體重/天間。

若採用嬰兒配方食品，那麼在嬰兒配方食品中DHA之份量可為約5mg/100 kcal到約80mg/100 kcal。於本發明一具體例中，該DHA量為約10mg/100 kcal到約50 mg/100 kcal；且於另一具體例中，為約15mg/100 kcal到約20mg/100 kcal。於本發明一特定具體例中，該DHA量為約17mg/100 kcal。

若採用嬰兒配方食品，那麼在嬰兒配方食品中ARA之份量可為約10mg/100 kcal到約100mg/100 kcal。於本發明一具體例中，該ARA量為約15mg/100 kcal到約70mg/100 kcal。於另一具體例中，該ARA量為約20mg/100 kcal到約40mg/100 kcal。於本發明一特定具體例中，該ARA量為約34mg/100 kcal。

若採用嬰兒配方食品時，可用此技術習知之技藝把含有DHA及ARA之油類補充到該嬰兒配方食品中。例如，可用DHA及ARA取代等當量之油類(例如於嬰兒配方食品中常見之高油酸葵花油)來把DHA及ARA添加到該配方食品中。於另一具體例中，可用含有DHA及ARA之油類來取代等當量之總脂肪混合物之其餘部份，在配方食品中這部份往往不含DHA及ARA。

若使用DHA及ARA時，該DHA及ARA的來源可為任何此技術習知的來源，例如水產油脂、單細胞油脂、卵黃脂、腦脂等等。於某些具體例中，該DHA及ARA係來自單細胞Martek油，DHASCO®，或其變化。該DHA及ARA可為天然形式，惟該LCPUFA源之其餘部份不能對嬰兒產生任何實質的不良影響。另一選擇地，該DHA及ARA可為精製形式。

於本發明具體例中，該DHA及ARA來源可為單細胞油脂，如同美國專利第5,374,567號；5,550,156號及5,397,591號所教示般，該等專利揭示全部併此以為參考。不過，本發明並不只限於此等油類。

於一具體例中，係以含有EPA之LCPUFA源組合至少一種失活的益生菌來使用。於另一具體例中，係以實質上不含EPA之LCPUFA源組合至少一種失活的益生菌來使用。舉例來說，本發明一具體例係於含有少於約16mg EPA/100 kcal之嬰兒配方食品中補充至少一種失活的益生菌且用於本發明之方法。於另一具體例中，係於含有少於約10mg EPA/100 kcal之嬰兒配方食品中補充至少一種失活的益生菌且用於本發明之方法。於再一具體例中，係於含有少於約5mg EPA/100 kcal之嬰兒配方食品中補充至少一種失活的益生菌且用於本發明之方法。本發明之另一具體例係於連微量EPA都沒有之嬰兒配方食品中補充至少一種失活的益生菌。

一般認為提供至少一種失活的益生菌及DHA及/或ARA之組合可對含有此等成份之調合劑的抗發炎性質有增效或協同的效果。雖然不希望將本發明用此一理論或任何其他的理論來束縛，不過一般相信失活的益生菌能提供抗-發炎效果一部份是由於其能預防抑制性-kB (IkB)之泛素化。於正常細胞內，IkB會在細胞質內結合核因子-kB (NFkB)。當IkB泛素化發生時，NFkB被釋出，進入到細胞核中，且活化負責發炎反應之基因。就是這種特異性交互作用及所導致之基因表現的變化被認為涉及發炎的調節作用。一般相信該失活的益生菌可以預防IkB泛素化，藉此防止NFkB釋出及減少或預防發炎產生。

相對地，ω-3脂肪酸例如DHA被認為係透過改變前-發炎性、脂肪酸-衍生之介質(以二十酸類廣泛為人所知)來提供抗-發炎作用。ω-6脂肪酸例如ARA係位於細胞膜之磷脂質池內，發炎反應期間會被釋出而提供一池游離的ARA。而後此ARA池會被兩種酶(脂氧化酶及環氧化酶)作用，產製出特殊的二十碳酸類，其包含2-系列前列腺素類(激素)，像是前列腺素、凝血噁烷及白三烯素。

此等前列腺素類已知對多種類型細胞及器官有過多的前，發炎性作用。已知當飲食中富含ω-3脂肪酸例如EPA及DHA(於此過程多個步驟中，ω-3脂肪酸為ω-6脂肪酸之競爭物)時，可以緩和ARA之前，發炎性作用。例如，ω-3脂肪酸能調節ω-6脂肪酸延長成ARA，把ARA併入細胞膜磷脂質池內，且從ARA製造前發炎性前列腺素類激素。因此，DHA及ARA之組合可提供獨特但互補的效用以緩和多組織之發炎反應。

此外，於本發明某些具體例中，活的及失活的益生菌會彼此組合來投藥。此種活的及失活的益生菌之組合被認為對於含有此等成份之調合物的抗發炎性質有互補或協同的效果。雖然不希望將本發明用此一理論或任何其他的理論來束縛，不過一般相信活的益生菌能有抗發炎效果一部份是透過與特殊受體(即，位於特異性免疫細胞表面上的類鐸受體(TLR))之間的交互作用來達成。活的益生菌與此等受體間直接或間接的交互作用會引發細胞內訊號傳遞級聯，其會導致此等目標細胞內基因表現的改變。就是這種特異性交互作用導致基因表現改變以及其他涉及發炎調節之細胞性影響。由於活的及失活的益生菌被認為係透過不同機制來運作，所以一般認為合併此等成份可提供互補或協同的抗發炎效果。

此外，於本發明某些具體例中，係組合至少一種活的益生菌、至少一種失活的益生菌及至少一種LCPUFA來投予。由於活的益生菌、失活的益生菌及LCPUFA被認為各透過不同的機制來作用，所以一般認為這種組合對於含有此等成份之調合物的抗發炎性質有互補或協同的效果。

於本發明一些具體例中，個體為需要治療、減少或預防全身性發炎者。該個體係由於遺傳性體質、飲食、生活型態、疾病、異常等而有全身性發炎的風險。舉例來說，早產或免疫受抑制之嬰兒可能會有全身性發炎的風險，因此需要此等治療、減少或預防作用。

於特定具體例中，可把失活的益生菌投予給嬰兒或孩童以預防、治療或減少全身性發炎。於一具體例中，該嬰兒可小於一歲。於另一具體例中，該孩童可介於一到六歲之間。於再一具體例中，該孩童可為七到十二歲。

於本發明一具體例中，該個體為餵食配方食品之嬰兒。於一具體例中，該嬰兒從一出生即餵食配方食品。於另一具體例中，該嬰兒出生後係餵食母乳但在一歲以前改餵配方食品，此時即開始補充失活的益生菌。

於本發明特定具體例中，該方法包含於餵食配方食品之早產嬰兒治療或預防全身性發炎。於此方法中，該失活的益生菌係以嬰兒配方食品、母乳營養強化品或任何其他適當的形式來投予給該早產嬰兒。此外，若有需要，該失活的益生菌係組合DHA、ARA及/或一或多種活的益生菌來投予給該早產嬰兒以創造出可能的協同性抗-發炎效果。

於本發明一具體例中，該失活的益生菌能減少或預防一或多種前發炎性細胞激素或趨化素之全身性釋出。在此使用時，“前發炎性”細胞激素或趨化素包括此技術所習知之涉及發炎反應上升調節作用之物質。其實例包括但不限於TNF-α、IL-1 β、IL-6、IL-8、IL-18及GRO/KC。

趨化素為一群細胞激素，其能令白血球從血液中移動到發炎部位的組織。當其過量產生時，趨化素會導致健康組織受損。生長-相關之致癌基因(GRO/KC)為一種能把免疫細胞吸引到發炎部位之趨化素。其為對應於大鼠細胞激素-誘生之嗜中性球趨化因子(CINC-1)之人體對應物，且功能上與介白素-8家族相關。

於本發明再一具體例中，失活的益生菌已顯示出能抑制核因子-kB (NFkB)之移動(translocation)。NF-kB為一種可於所有類型細胞發現到之主要轉錄因子，其被認為與發炎之發端有關。於多數細胞中，NF-kB係以隱性、無活性、抑制性kB (IkB)-結合複合物的形式存在於細胞質中。當細胞接受到任一種細胞外訊號(例如來自細胞激素、細菌性抗原或自由基)時，NF-kB會迅速進入到細胞核中且活化負責發炎反應之基因。現已發現到抑制NF-kB引起發炎之作用可以降低發炎反應。Lawrence,et al., possible New Role for NFkB in the Resolution of Inflammation , Nature Med. 7:1291 (2001)。因此，本發明經由補充失活的益生菌來抑制NFkB能有助於減輕或預防全身性發炎。

如同於實施例中所見到地，失活的益生菌能於餵食配方食品之嬰兒有效地減輕全身性發炎。餵食配方食品之大鼠嬰兒補充失活的益生菌時，其體內之CINC-1及多種細胞激素的含量會減少到類似於餵食母乳之大鼠嬰兒體內的量。

如同於實施例中所見到地，失活的益生菌還顯示出能夠顯著地減少IL-8之製造、降低NF-kB移動及增加腸上皮細胞中IkB之製造。本案發明者還意外地發現到失活的益生菌能預防IkB泛素化，而活的益生菌則不能。

以下實施例說明本發明之多種具體例。熟悉此技術之人士在考量在此揭露之本專利說明書的內容或施行本發明以後，即能明顯得知在此所述之申請專利範圍所涵蓋之其他具體例。

本發明之專利說明書及實施例應僅被視為闡述舉例用，本發明之範疇及精神將由跟隨在實施例後方之申請專利範圍來界定。於此等實施例中，除非另有說明，否則所有的百分率(%)係以重量為基礎來提供。

實施例1

此實施例係顯示於餵食配方食品之大鼠新生幼鼠補充失活的益生菌對全身性發炎的影響。於此實施例中係採用LGG為益生菌。

材料及方法

於兩組各別的實驗中，把史伯格-達利(Taconic, Germantown, NY)大鼠嬰兒隨機分成四組胃造口-餵食組，每組五隻：對照組(無LPS或LGG)、LPS組、LPS＋活的LGG組，及LPS＋失活的LGG組。使用同樣年齡之母鼠-撫育之大鼠為參考對照組。胃造口-餵食，係採用大鼠嬰兒“杯中幼鼠(pup-in-the-cup)”模式，於大鼠幼鼠出生後7天開始施行。胃造口餵食管係由24-cm切面之管道系統所組成，其可插入幼鼠胃內。胃造口管置入係在異氟烷麻醉下進行。該餵食管上接有計時器-控制之針筒泵且設定成於每個小時前20分鐘依體重-相關流速來餵食大鼠。

在2-天適應期期間，胃造口-餵食之大鼠幼鼠係餵以大鼠母乳替代品(RMS)。於適應期結束後，有一組RMS餵食組會補充1×10⁸ 細胞當量/公斤體重/天之失活LGG。該LGG係以致命性加熱來失活化。第二組則給予1×10⁸ cfu/L/公斤體重/天之活的LGG。第三組則餵食RMS且未補充任何類型之LGG。此種餵食連續6天。所有的胃造口-餵食組都接受相同份量之脂肪及醣類，且蛋白質成份近似於正常生長所需份量。使用同樣年齡之母鼠-撫育之大鼠為參考對照組。

把來自大腸桿菌0127:BB之脂多醣(LPS; Sigma, St. Louis, MO)以2mg/ml的濃度攪拌溶於水中。胃造口，餵食之大鼠在開始人工餵食2天後，會給予0.25到0.5mg/kg/天之LPS。該幼鼠以LPS補充營養6天。此劑量係以前導研究決定出來，其會導致非經常性顫抖、豎毛、體重增加不良但是並不會顯著提高這6天期間之死亡率。

在這6天治療期結束後，把大鼠幼鼠用過量戊巴比妥鈉安樂死。取出小腸且分成三份：迴腸、空腸及十二指腸，儲存於-80℃下以供進行酵素檢定及ELISA，或以10%中性緩衝之福馬林固定以進行腸形態學分析。肺、肝及血漿儲存於-80℃以供進行酵素檢定及ELISA。

使用Sigmastat統計軟體(SPSS, Chicago, IL)分析體重、CINC-1之ELISA分析、及細胞激素/趨化素多重檢定結果。所有數據皆以平均值±標準差(SD)來表示。使用單因子群組間變異數分析(ANOVA)來決定所有治療群組間是否有顯著差異。當ANOVA之顯著性p<0.05時，採用Holm-Sidak方法來作成對比較。

結果及討論生長

此實施例係顯示益生菌投予對於胃造口-餵食之幼鼠生長的影響。該等大鼠幼鼠在以胃造口管餵食以後每日秤重且與母鼠餵哺之參考組動物作比較。母鼠餵哺之動物較LPS-治療、胃造口-餵食之動物生長得更快。對胃造口-餵食、LPS-治療之幼鼠提供活的或失活的益生菌並不會改善體重增加的現象。

CINC-1

於本發明，補充活的或失活的益生菌會降低CINC-1量。CINC-1量係使用大鼠生長-相關之致癌基因/CINC-1的TiterZyme酵素免疫度量檢定套組(Assay Designs, Ann Arbor, MI)來測定。組織樣本係從肝、腸、血漿及肺之全組織細胞萃取物中分離出來。吸光率係於450nm下測定，且濃度係用衍生自線性標準曲線之方程式計算出來。

如第1圖到第3圖所顯示地，ELISA結果顯示LPS能增加肝、肺及血漿內之CINC-1含量。活的及失活的益生菌兩者皆能減少肝(第1圖)及血漿(第2圖)內LPS-誘生之CINC-1的製造(p<0.05)，還顯示出肺部CINC-1含量的變化趨勢(p=0.09)(第3圖)。

第1圖顯示補充活的益生菌會使得肝之CINC-1含量較該LPS組降低約50%。然而，失活的益生菌則使得肝之CINC-1含量相較於該LPS組降低約75%。因此，相較於活的益生菌，失活的益生菌對於肝之CINC-1含量有顯著更好的降低效果。類似地，第2圖顯示失活的益生菌組之血漿CINC-1含量較活的益生菌組更低。於肺部，活的及失活的益生菌可讓CINC-1含量降低到類似的程度(第3圖)。

GRO/KC

如第4圖及第5圖所顯示地，該細胞激素多重檢定顯示肝及肺內之GRO/KC含量有類似的減少現象。於肝臟，失活的益生菌令GRO/KC含量減少的程度較活的益生菌更大，顯示出其有更強的抗-發炎效果(第4圖)。於肺部，活的及失活的益生菌可讓GRO/KC含量降低到類似的程度(第5圖)。

此實驗於肺部觀察到之CINC-1及GRO/KC含量較低的現象顯示失活的益生菌之抗發炎效果可擴及末端器官。因而，該失活的益生菌之抗發炎效果本質上的確是全身性的。

於肝臟，補充失活的益生菌可讓CINC-1含量減少到實質上低於餵食母乳之大鼠幼鼠體內之CINC-1含量。於肺及血漿，失活的益生菌能令CINC-1含量減少到類似於餵食母乳之大鼠幼鼠體內之CINC-1含量。此等結果顯示：失活的益生菌具有讓餵食配方食品之嬰兒的全身性發炎程度減低到類似於(於某些例子中，則低於)餵食母乳之嬰兒的發炎程度。

細胞激素及趨化素

活的及失活的益生菌還能減少細胞激素及趨化素的含量。從LINCO Research, Inc. (St. Charles, MO, USA)購得多樣珠粒套組。藉由套組來分析細胞激素/趨化素，其包括：顆粒球-巨噬細胞集落-刺激因子(GMCSF)、干擾素-λ(IFN-λ)、介白素-1α(IL-1 α)、IL-1 β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-18、單核球趨化蛋白-1 (MCP-1)、GRO/KC(大鼠CINC-1)及TNF-α。該多樣檢定係依照廠商的說明書來進行。各細胞激素/趨化素之標準曲線係使用廠商提供之參考濃度來產生。原始數據(平均螢光強度)係使用MasterPlex定量軟體(MiraiBio, Inc. Alameda, CA, USA)分析以得到濃度值。

如第6圖所顯示地，以胃造口-餵食、LPS-治療之幼鼠之肝臟的IL-1 β含量顯著地高於對照組幼鼠之含量。活的及失活的益生菌顯著地鈍化LPS引發之IL-1 β升高現象。事實上，失活的益生菌降低IL-1 β量之程度會大於補充活的益生菌時的程度。失活的益生菌能令IL-1 β的表現減少到類似於對照組幼鼠之程度。因此，這一部份的實驗進一步顯示該失活的益生菌之全身性抗發炎活性。

總括來說，此等結果顯示補充失活的益生菌能減少全身性發炎。進一步地，此等結果顯示該失活的益生菌能使餵食配方食品之嬰兒體內之全身性發炎減少到類似於餵食母乳之嬰兒的程度。透過比較失活的益生菌-治療之群組及充份餵食母乳之群組可以顯示在此說明之結果。於多種情況下，投予失活的益生菌所造成之發炎反應係類似於餵食母乳之群組。

實施例2

此實施例係顯示於餵食配方食品之大鼠新生幼鼠補充失活的益生菌對發炎的影響。於此實施例中係採用LGG為該益生菌。

腸上皮細胞先用濃度1×10⁸ cfu/L之活的LGG或UV-失活的LGG預處理，然後用鞭毛蛋白500ng/mL刺激。IL-8之製造量係用ELISA測量。IkB及泛素化-IkB (UbQ-IkB)之表現係用Western墨漬法及免疫沈澱法測量。NFkB位置係用免疫螢光染色來評估。

實驗期間，鞭毛蛋白會導製細胞性IL-8之製造顯著增加(p<0.05)。細胞先用活的LGG或UV-失活的LGG預處理且然後用鞭毛蛋白刺激，顯示出IL-8、NFkB核轉位、IkB及UbQ-IkB有顯著(p<0.05)改變。此等結果示於表1。箭頭向上顯示該參數值增加，而箭頭向下顯示該參數值減少。

如表1所顯示地，鞭毛蛋白會導致腸上皮細胞之細胞性IL-8的製造顯著地增加(p<0.05)。當有活的及失活LGG時，IL-8的製造顯著地向下調節。此外，受到鞭毛蛋白刺激之細胞顯現出NFkB核移動的現象，此現象在有活的及失活的LGG時會被抑制。鞭毛蛋白會減少IkB的製造，但是若以活的及失活的LGG預處理時此作用會被逆轉(p<0.05)。鞭毛蛋白及活的LGG會增加UbQ-IkB(p<0.05)，而失活的LGG會減少UbQ-IkB。

此實施例顯示活的及失活的益生菌能有效減少IL-8(一種前發炎性細胞激素)之製造，因此具有抗-發炎的效果。因為鞭毛蛋白及該活的益生菌會增加UbQ-IkB，但是失活的益生菌則會減少UbQ-IkB，所以失活的益生菌似乎是透過防止IkB泛素化來運作，而活的益生菌則非如此。因此，此實施例進一步顯示活的及失活的益菌似乎是透過不同機制來運作且當一起投予時可具有協同效果。

本發明已顯示能減少肝、血漿及肺發炎。由於本發明可改善發炎病況，所以其亦可用來預防嚴重感染或病況之發生。

所有在本專利說明書中引用之參考資料，包括但不限於所有論文、刊物、專利、專利申請案、演講、教科書、報告、手稿、小冊、書籍、網路發表、雜誌、期刊等等，全部併入本專利說明書以為參考。此等參考資料之討論僅是意圖簡介原作者之主張，並非同意任何參考資料構成本案先前技術。申請人仍保留挑戰引用資料之正確性及適當性之權力。

熟悉此技術之人士可在不悖離本發明之精神及範疇下進行本發明這些及其他的修改及變化，而本發明之精神及範疇係由後附之申請專利範圍來詳細說明。此外，應瞭解地，不同具體例之態樣可全部或部份互換。進一步地，熟悉此技術之人士應瞭解前述說明僅係用來舉例，而非意圖限制本發明，本發明之範圍應由所附之申請專利範圍來說明。因此，後附申請專利範圍之精神及範疇不應限於內含之較佳版本的描述。

為了更徹底地了解本發明，以上說明宜參考後附圖式。

第1圖顯示使用酵素連結免疫吸附檢定(ELISA)檢測活的及失活的益生菌對於肝臟之細胞激素誘生之嗜中性球趨化因子-1 (CINC-1)肽之製造的影響。失活的鼠李糖乳酸桿菌GG (Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)，為舉例用之失活的益生菌，係標示成“加熱-LGG”。

第2圖顯示使用ELISA檢測活的及失活的益生菌對於血漿之CINC-1肽之製造的影響。失活LGG係標示成“加熱-LGG”。

第3圖顯示使用ELISA檢測活的及失活的益生菌對於肺臟之CINC-1肽之製造的影響。失活LGG係標示成“加熱-LGG”。

第4圖顯示使用細胞激素多重檢定檢測活的益生菌及失活的益生菌對於肝臟之生長相關致癌基因(GRO/KC)之製造的影響。失活LGG係標示成“加熱-LGG”。

第5圖顯示使用細胞激素多重檢定檢測活的及失活的益生菌對於肺之GRO/KC之製造的影響。失活LGG係標示成“加熱-LGG”。

第6圖顯示使用細胞激素多重檢定檢測活的及失活的益生菌對於肝臟之介白素-1 β (IL-1 β)含量的影響。失活LGG係標示成“加熱-LGG”。

Claims

一種用於治療、預防或減少嬰兒全身性發炎之營養組成物，其中該營養組成物包含熱失活的鼠李糖乳酸桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)且係以有效提供介於1×10⁴ 到1×10¹⁰ 細胞當量/公斤體重/天之熱失活的鼠李糖乳酸桿菌GG的量投予給嬰兒。
如申請專利範圍第1項之營養組成物，其進一步包含至少一種促生素(prebiotic)。
如申請專利範圍第1項之營養組成物，其進一步包含至少一種其他失活的益生菌。
如申請專利範圍第3項之營養組成物，其中該至少一種其他失活的益生菌包括一或多種乳酸桿菌屬(Lactobacillus )菌及一或多種雙歧桿菌屬(Bifidobacterium )菌之組合。
如申請專利範圍第1項之營養組成物，其中該營養組成物係以有效提供介於1×10⁶ 到1×10⁹ 細胞當量/公斤體重/天之熱失活的鼠李糖乳酸桿菌GG的量投予給嬰兒。
如申請專利範圍第1項之營養組成物，其中該營養組成物係以有效提供約1×10⁹ 細胞當量/公斤體重/天之熱失活的鼠李糖乳酸桿菌GG的量投予給嬰兒。
如申請專利範圍第1項之營養組成物，其進一步含有至少一種活的益生菌。
如申請專利範圍第7項之營養組成物，其中該活的益生菌係選自鼠李糖乳酸桿菌GG、動物雙歧桿菌雷特氏亞種(B.animalis ssp.lactis )、及其組合。
如申請專利範圍第1項之營養組成物，其中該營養組成物進一步含有至少一種長鏈多不飽和脂肪酸。
如申請專利範圍第9項之營養組成物，其中該長鏈多不飽和脂肪酸係選自二十二碳六烯酸、花生四烯酸及其組合。
如申請專利範圍第10項之營養組成物，其中該花生四烯酸：二十二碳六烯酸之比例為2：3到2：1之間。
如申請專利範圍第1項之營養組成物，其包含嬰兒配方食品。
一種使用熱失活的鼠李糖乳酸桿菌GG於製造治療、預防或減少嬰兒全身性發炎的營養組成物之用途，其中該營養組成物係以有效提供介於1x10⁴ 到1x10¹⁰ 細胞當量/公斤體重/天之熱失活的鼠李糖乳酸桿菌GG的量投予給嬰兒。
如申請專利範圍第13項之用途，其中該營養組成物進一步包含至少一種促生素。
如申請專利範圍第13項之用途，其中該營養組成物進一步包含至少一種其他失活的益生菌。
如申請專利範圍第15項之用途，其中該至少一種其他失活的益生菌包括一或多種乳酸桿菌屬菌及一或多種雙歧桿菌屬菌之組合。
如申請專利範圍第13項之用途，其中該營養組成物係以有效提供介於1×10⁶ 到1×10⁹ 細胞當量/公斤體重/ 天之熱失活的鼠李糖乳酸桿菌GG的量投予給嬰兒。
如申請專利範圍第13項之用途，其中該營養組成物係以有效提供約1×10⁹ 細胞當量/公斤體重/天之失活的鼠李糖乳酸桿菌GG的量投予給嬰兒。
如申請專利範圍第13項之用途，其中該營養組成物進一步含有至少一種活的益生菌。
如申請專利範圍第19項之用途，其中該活的益生菌係選自鼠李糖乳酸桿菌GG、動物雙歧桿菌雷特氏亞種、及其組合。
如申請專利範圍第13項之用途，其中該營養組成物進一步含有至少一種長鏈多不飽和脂肪酸。
如申請專利範圍第21項之用途，其中該長鏈多不飽和脂肪酸係選自二十二碳六烯酸、花生四烯酸及其組合。
如申請專利範圍第13項之用途，其中該營養組成物包含嬰兒配方食品。