CN112852902B - 一种具有免疫调节作用的肠球菌胞外多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有免疫调节作用的肠球菌胞外多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有免疫调节作用的肠球菌胞外多糖及其制备方法和应用，利用海氏肠球菌(Enterococcus hirae)WEHI01发酵产生胞外多糖，并对胞外多糖进行分离纯化，海氏肠球菌WEHI01保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019068。制备的肠球菌胞外多糖包括四种组分：EPS‑I01，EPS‑I02，EPS‑I03和EPS‑I04，组分EPS‑I02的平均分子量为2.28×104Da，由鼠李糖、海藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为1:1.76:5.48:1.76:2.52:6.2:20.92。本发明制备的肠球菌胞外多糖具备免疫调节作用，可显著提高巨噬细胞增殖率及吞噬能力，并显著促进巨噬细胞分泌NO和细胞因子，该肠球菌胞外多糖作为添加剂应用于食品、医药领域，应用前景十分广阔。

Description

一种具有免疫调节作用的肠球菌胞外多糖及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及微生物学中的多糖技术领域，具体为一种具有免疫调节作用 的肠球菌胞外多糖及其制备方法和应用。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)，泛指利用可发酵碳水化合物，并且 产生大量乳酸的细菌，是公认的绿色安全(GRAS)的食品级微生物。乳酸菌 除了产乳酸、乙酸、甲酸和叶酸外，还会产生其他次生代谢产物，如细菌素 和胞外多糖等。乳酸菌胞外多糖不仅可以改善发酵乳制品的质构和风味，如 增稠、稳定、乳化、胶凝及持水等；还具有多种生理功能，包括促进菌体黏 附、抗氧化、降低胆固醇、抗肿瘤和增强人体免疫力等。乳酸菌胞外多糖的 多样化，使得乳酸菌资源的挖掘和胞外多糖的生物活性研究成为了关注的焦 点。
肠球菌(Enterococcus spp.)是乳酸菌的一类，其作为益生菌，常被应用 于饲料添加剂和微生态制剂中。肠球菌的益生功能包括：改善发酵食品的风 味，拮抗食源性致病菌，调节肠道菌群平衡，调节宿主的细胞和体液免疫， 降低胆固醇等。研究表明，肠球菌能够产生胞外多糖，相对于植物乳杆菌、 鼠李糖乳杆菌等乳酸菌，有关益生肠球菌胞外多糖的生物活性研究较少，在 免疫调节方面的作用更是少见。因此，探究肠球菌胞外多糖的免疫调节作用 具有重要的理论和应用价值。
近年的研究发现，来自于植物、微生物和藻类的多糖具有免疫调节、抗 氧化、抗肿瘤、抗病毒、抑菌和抑制糖尿病的作用。作为生物反应调节剂， 多糖对特定细胞具有免疫刺激活性，其通过刺激自然杀伤细胞、T细胞、B细 胞和巨噬细胞依赖的免疫系统反应，作出抵抗抗原的体液免疫反应。因此， 多糖有成为免疫调节剂的潜能。
巨噬细胞作为先天性免疫和适应性免疫的接口，在宿主防御系统中起着 至关重要的作用。巨噬细胞是免疫系统的第一道防线，执行各种复杂的生物 活动，包括吞噬、监测、趋化性和目标生物的破坏。调节巨噬细胞的活性是 预防疾病的一种潜在策略。在炎症反应过程中，被激活的巨噬细胞的吞噬作 用增强，同时通过分泌细胞因子(比如TNF-α、IL-1β、IL-6)、活性氧、NO 和其它对抗病原微生物的介质杀死病原体。巨噬细胞的激活是先天免疫和适 应性免疫中的关键，可引发和传播对病原体的防御反应。因此，鉴定能够调 节巨噬细胞的物质具有重要意义。巨噬细胞通常被认为是评价多糖免疫调节 作用的理想细胞模型。
然而，目前在本领域内，研究成熟并且能够在实践中推广应用的肠球菌 胞外多糖的种类并不多，生产和科研上都存在对新的胞外多糖进行研究的需 要，以丰富性能优良、用途广泛的肠球菌胞外多糖的种类。
发明内容
本发明提出一种具有免疫调节作用的肠球菌胞外多糖及其制备方法和应 用，肠球菌胞外多糖是具有免疫调节作用的海氏肠球菌胞外多糖，肠球菌胞 外多糖的制备方法包括海氏肠球菌胞外多糖的制备和分离纯化，制备的海氏 肠球菌胞外多糖应用于食品、医药和相关领域。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案之一是：
一种具有免疫调节作用的肠球菌胞外多糖，所述肠球菌胞外多糖为海氏 肠球菌胞外多糖，由海氏肠球菌(Enterococcus hirae)WEHI01菌株发酵产生。 所述海氏肠球菌(Enterococcus hirae)WEHI01菌株筛选自健康婴儿的粪便， 具有良好的耐酸耐胆盐性能，且能缓解二型糖尿病，推测其具有潜在的益生 功能，为了更好地了解其结构和功能，对其粗胞外多糖进行分离纯化及功能 研究，所述海氏肠球菌WEHI01 Enterococcus hiraeWEHI01已于2019年1月 21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299 号，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2019068。
优选地，所述海氏肠球菌胞外多糖包括四种组分：EPS-I01、EPS-I02、 EPS-I03和EPS-I04，海氏肠球菌胞外多糖的组分EPS-I02由鼠李糖、海藻糖、 阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，且摩尔比为 1:1.76:5.48:1.76:2.52:6.2:20.92，分子量为2.28×104Da。
优选地，所述海氏肠球菌胞外多糖的组分EPS-I02增强小鼠单核巨噬细胞 白血病细胞RAW264.7的吞噬能力，同时刺激RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α 和IL-6因子。
本发明提供的技术方案之二是：一种具有免疫调节作用的肠球菌胞外多 糖及其制备方法，包括肠球菌胞外多糖的制备和肠球菌胞外多糖的分离纯化， 所述肠球菌胞外多糖的制备包括以下步骤：
(1)将海氏肠球菌WEHI01的种子液以体积比1.0～4.0％的接种量接种于 无菌脑心浸液肉汤培养基中，于37℃厌氧培养10～25h，获得发酵液；
(2)将步骤(1)获得的发酵液于4℃，7000～9000×g离心5min，去 除菌体，获得发酵上清液；
(3)向步骤(2)获得的发酵上清液中加入2～4倍体积的无水乙醇，置 于4℃冰箱中醇沉48～72h，4℃条件下，10000×g离心20min，收集沉淀物， 并将沉淀物溶于水，用截留分子量为8000～14000Da的透析袋于4℃条件透析 3天，期间每天换两次水，透析后的样品进行冷冻干燥，获得肠球菌胞外多糖 粗提物；
(4)将步骤(3)获得的肠球菌胞外多糖粗提物复溶后，加入1/3～1/5体 积的Sevag液，剧烈震荡后，9000×g离心5min，取上层水相，多次重复上 述操作，获得的粗胞外多糖溶液，置于4℃条件透析3～5天后，冷冻干燥，获 得肠球菌胞外多糖粗品。
步骤(1)中所述接种量较佳地是1.0～3.0％，更佳地是1.0％，发酵时间 较佳地是10～20h，更佳地是15h；
步骤(2)中所述发酵液较佳地于4℃，8000～9000×g离心5min；
步骤(3)中所述无水乙醇加入体积较佳地为3～4倍；
步骤(4)中较佳地加入1/4～1/5体积的Sevag液，更佳地加入1/5体积的 Sevag液，所述Sevag液中氯仿：正丁醇的体积比为4:1，透析时间较佳地为 3～4天。
所述肠球菌胞外多糖的分离纯化包括以下步骤：
(1)用阴离子交换层析柱对所述肠球菌胞外多糖粗品进行分离纯化，以 0、0.5、0.7、1mol/L NaCl溶液进行分段洗脱分离，洗脱速度为1～2mL/min， 0.5mol/L NaCl溶液洗脱得到海氏肠球菌胞外多糖的组分EPS-I02，合并收集 组分峰的洗脱产物，装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，4℃条件 下，在去离子水中透析24～72h，每隔4～12h换水一次，最后真空冷冻干燥；
(2)再采用凝胶过滤层析柱进一步纯化，以0.2mol/L的NH4HCO3溶液 洗脱，洗脱速度为0.5～1.5mL/min，合并收集组分峰的洗脱产物，反复加水减 压蒸干除去NH4HCO3后，最后真空冷冻干燥。
优选地，步骤(1)中采用5mL的HiTrap Q Sepharose High Performance 阴离子交换层析柱，洗脱速度为1mL/min，透析48h，每隔4h换水一次。
优选地，步骤(2)中采用10mm×300mm的Superdex G 200凝胶过滤 层析柱，洗脱速度为0.5mL/min。
(三)有益效果
本发明提供了一种具有免疫调节作用的肠球菌胞外多糖及其制备方法和 应用，具备以下有益效果：
(1)本发明制备的肠球菌胞外多糖为一种组成明确、具备一定免疫调节 作用的新型多糖，具有促进巨噬细胞的增殖、增强巨噬细胞的吞噬作用及增 加巨噬细胞的一氧化氮和细胞因子的产生量的作用，作为添加剂应用于制药、 临床等相关领域中，应用前景十分广阔。
(2)本发明制备的肠球菌胞外多糖作为微生物产生的高分子物质，具有 免疫刺激活性，通过刺激小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7分泌产生 NO、TNF-α和IL-6因子，增强机体的免疫作用，在应用时对于剂量的确定及 应用的范围也更为明确，具有显著的技术优势。
附图说明
图1为海氏肠球菌胞外多糖粗品的阴离子交换层析洗脱曲线图；
图2为海氏肠球菌胞外多糖组分EPS-I02的凝胶层析洗脱曲线图；
图3为海氏肠球菌胞外多糖组分EPS-I02的单糖组成的气质色谱图；
图4为海氏肠球菌胞外多糖组分EPS-I02对RAW264.7细胞增殖的影响；
图5为海氏肠球菌胞外多糖组分EPS-I02对RAW264.7细胞吞噬能力的影 响；
图6为海氏肠球菌胞外多糖组分EPS-I02对RAW264.7细胞NO分泌量影 响的结果图；
图7为海氏肠球菌胞外多糖组分EPS-I02对RAW264.7细胞TNF-α分泌 量影响的结果图；
图8为海氏肠球菌胞外多糖组分EPS-I02对RAW264.7细胞IL-6分泌量 影响的结果图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种具有免疫 调节作用的肠球菌胞外多糖及其制备方法和应用进行说明，本发明的保护范 围不受以下实施例的限制。
实施例1：
海氏肠球菌胞外多糖粗品的制备：
(1)将海氏肠球菌WEHI01的种子液以体积比1.0％的接种量接种于无 菌脑心浸液肉汤培养基中，于37℃厌氧培养15h，获得发酵液；
(2)将步骤(1)获得的发酵液于4℃，9000×g离心5min，去除菌体， 获得发酵上清液；
(3)向步骤(2)获得的发酵上清液中加入3倍体积的无水乙醇，置于 4℃冰箱中醇沉48～72h，4℃条件下，10000×g离心20min，收集沉淀物， 并将沉淀物溶于水，用截留分子量为8000～14000Da的透析袋于4℃条件透析 3天，期间每天换两次水，透析后的样品进行冷冻干燥，获得肠球菌胞外多糖 粗提物；
(4)将步骤(3)获得的肠球菌胞外多糖粗提物复溶后，加入1/5体积的 Sevag液，Sevag液中氯仿：正丁醇的体积比为4:1，剧烈震荡后，9000×g离 心5min，取上层水相，多次重复上述操作，获得的粗胞外多糖溶液，置于4℃ 条件透析4天后，冷冻干燥，获得肠球菌胞外多糖粗品。
实施例2：
海氏肠球菌胞外多糖粗品的制备：
(1)将海氏肠球菌WEHI01的种子液以体积比4.0％的接种量接种于无 菌脑心浸液肉汤培养基中，于37℃厌氧培养25h，获得发酵液；
(2)将步骤(1)获得的发酵液于4℃，7000×g离心5min，去除菌体， 获得发酵上清液；
(3)向步骤(2)获得的发酵上清液中加入4倍体积的无水乙醇，置于 4℃冰箱中醇沉72h，4℃条件下，10000×g离心20min，收集沉淀物，并将 沉淀物溶于水，用截留分子量为8000～14000Da的透析袋于4℃条件透析3天， 期间每天换两次水，透析后的样品进行冷冻干燥，获得肠球菌胞外多糖粗提 物；
(4)将步骤(3)获得的肠球菌胞外多糖粗提物复溶后，加入1/3体积的 Sevag液，Sevag液中氯仿：正丁醇的体积比为4:1，剧烈震荡后，9000×g离 心5min，取上层水相，多次重复上述操作，获得的粗胞外多糖溶液，置于4℃ 条件透析3天后，冷冻干燥，获得肠球菌胞外多糖粗品。
实施例3：
海氏肠球菌胞外多糖的分离纯化，得到海氏肠球菌胞外多糖的组分 EPS-I02：
(1)用5mL的HiTrap Q Sepharose High Performance阴离子交换层析柱 对实施例1制备的肠球菌胞外多糖粗品进行分离纯化，以0、0.5、0.7、1mol/L NaCl溶液进行分段洗脱分离，洗脱速度为1mL/min，0.5mol/L NaCl溶液洗 脱得到海氏肠球菌胞外多糖的组分EPS-I02，合并收集组分峰的洗脱产物，装 入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，4℃条件下，在去离子水中透析 48h，每隔4h换水一次，最后真空冷冻干燥；
(2)再采用10mm×300mm的Superdex G 200凝胶过滤层析柱进一步纯 化，以0.2mol/L的NH4HCO3溶液洗脱，洗脱速度为0.5mL/min，合并收集组 分峰的洗脱产物，反复加水减压蒸干除去NH4HCO3后，最后真空冷冻干燥。
实施例4：
海氏肠球菌胞外多糖的分离纯化，得到海氏肠球菌胞外多糖的组分 EPS-I02：
(1)用5mL的HiTrap Q Sepharose High Performance阴离子交换层析柱 对实施例2制备的肠球菌胞外多糖粗品进行分离纯化，以0、0.5、0.7、1mol/L NaCl溶液进行分段洗脱分离，洗脱速度为2mL/min，0.5mol/L NaCl溶液洗 脱得到海氏肠球菌胞外多糖的组分EPS-I02，合并收集组分峰的洗脱产物，装 入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，4℃条件下，在去离子水中透析 72h，每隔12h换水一次，最后真空冷冻干燥；
(2)再采用10mm×300mm的Superdex G 200凝胶过滤层析柱进一步纯 化，以0.2mol/L的NH4HCO3溶液洗脱，洗脱速度为1.5mL/min，合并收集组 分峰的洗脱产物，反复加水减压蒸干除去NH4HCO3后，最后真空冷冻干燥。
实施例5：
海氏肠球菌胞外多糖的组分EPS-I02的对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7的作用验证：
材料与试剂：实施例3分离提纯的海氏肠球菌胞外多糖的组分EPS-I02， 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7，DMEM培养基(索莱宝)，胎牛 血清(索莱宝)，小牛血清(Sigma)，胰蛋白酶消化液(索莱宝)。
仪器：厌氧培养箱(Gene Science)，恒温培养箱(上海智城分析仪器制 造有限公司)，多功能酶标仪(ThermoFisher),光学显微镜(Olympus)。
(1)组分EPS-I02对巨噬细胞RAW264.7细胞增殖的影响：
将RAW264.7细胞以5×104/mL接种于96孔板中，①空白组：孵育1h 后，检测细胞活性；②实验组：孵育4h后，加入不同浓度的EPS-I02(终浓 度为50，100，200，400，600，800和1000μg/mL)，孵育24h。移去培养 基，PBS洗3次，加入新培养基100μL，每孔加入10μL CCK-8试剂，孵育1 h，在450nm测定吸光度值。细胞活性(Cell viability)按照如下方法计算：
Figure BDA0002904276220000081
式中：A1是空白组的吸光度值，A2是实验组的吸光度值。
结果如图4所示，与空白对照组相比，50μg/mL的EPS-I02显著促进了 RAW264.7细胞的增殖(P<0.05)，增殖率高达150％。
(2)组分EPS-I02对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的影响：
取对数生长期RAW264.7细胞，按5×103/孔加入96孔细胞培养板中， 分别加入各浓度的EPS-I02(终浓度分别为50，100，200，400，600，800和 1000μg/mL)，补充培养液至200μL，培养基孔和LPS(终浓度为1μg/mL) 孔作为空白对照和阳性对照。培养24h后，弃去100μL培养液，加入100μ L 0.1％的中性红溶液，继续培养3h。倾去上清液，用PBS洗三遍，每孔加入 乙醇：冰醋酸＝1:1的细胞裂解液100μL，室温下放置1h，待细胞溶解后， 在酶标仪上测定540nm处吸光度。
结果如图5所示，与空白对照组相比，经EPS-I02处理的RAW264.7细胞 其吞噬中性红的能力均显著增强(P<0.001)。
(3)组分EPS-I02对RAW264.7细胞产生一氧化氮(NO)以及细胞因子 的影响：
①ELISA检测NO和细胞因子：取对数生长期RAW264.7细胞，按每孔 1×106个细胞加入6孔板，孵育24h后，加入各浓度EPS-I02(终浓度为50， 100，200，400，600，800和1000μg/mL)，培养基孔和LPS(终浓度为1μg/mL) 孔作为空白对照和阳性对照，孵育12h后，吸取上清液，用NO试剂盒测定。
②ELISA检测细胞因子(IL-6、TNF-α)：取对数生长期RAW264.7细 胞，按每孔1×106个细胞加入6孔板，孵育24h后，加入各浓度EPS-I02(终 浓度为50，100，200，400，600，800和1000μg/mL)，培养基孔和LPS(终 浓度为1μg/mL)孔作为空白对照和阳性对照，孵育12h后，吸取上清液。 按照ELISA试剂盒说明书操作，来检测细胞因子的含量。
结果如图6、7和8所示，I01-2显著增加了RAW264.7细胞NO、TNF- α和IL-6的分泌量(P<0.001)，且呈现浓度依赖性。当I01-2浓度为800μ g/mL时，NO的分泌量达到68.75μmol/L；当I01-2浓度为1000μg/mL时， IL-6的分泌量分别达到8.64×104pg/mL，TNF-α的分泌量达到1.01×105 pg/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种具有免疫调节作用的肠球菌胞外多糖，其特征在于：该肠球菌胞外多糖为海氏肠球菌胞外多糖，由海氏肠球菌（Enterococcus hirae）WEHI01菌株发酵产生，所述海氏肠球菌（Enterococcus hirae）WEHI01于2019年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019068；所述海氏肠球菌胞外多糖包括四种组分：EPS-I01、EPS-I02、EPS-I03和EPS-I04，海氏肠球菌胞外多糖的组分EPS-I02由鼠李糖、海藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，且摩尔比为1:1.76:5.48:1.76:2.52:6.2:20.92，分子量为2.28×104Da。
2.一种权利要求1所述具有免疫调节作用的肠球菌胞外多糖的制备方法，包括肠球菌胞外多糖的制备和肠球菌胞外多糖的分离纯化，其特征在于：所述肠球菌胞外多糖的制备包括以下步骤：
(1)将海氏肠球菌（Enterococcus hirae）WEHI01的种子液以体积比1.0～4.0％的接种量接种于无菌脑心浸液肉汤培养基中，于37℃厌氧培养10～25h，获得发酵液；
(2)将步骤(1)获得的发酵液于4℃，7000～9000×g离心5min，去除菌体，获得发酵上清液；
(3)向步骤(2)获得的发酵上清液中加入2～4倍体积的无水乙醇，置于4℃冰箱中醇沉48～72h，4℃条件下，10000×g离心20min，收集沉淀物，并将沉淀物溶于水，用截留分子量为8000～14000Da的透析袋于4℃条件透析3天，期间每天换两次水，透析后的样品进行冷冻干燥，获得肠球菌胞外多糖粗提物；
(4)将步骤(3)获得的肠球菌胞外多糖粗提物复溶后，加入1/3～1/5体积的Sevag液，剧烈震荡后，9000×g离心5min，取上层水相，多次重复上述操作，获得的粗胞外多糖溶液，置于4℃条件透析3～5天后，冷冻干燥，获得肠球菌胞外多糖粗品。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述接种量为1.0％，所述厌氧培养时间为15h；步骤(2)中所述发酵液于4℃，8000～9000×g离心5min；步骤(3)中所述无水乙醇加入体积为3～4倍；步骤(4)中加入1/5体积的Sevag液，所述Sevag液中氯仿：正丁醇的体积比为4:1，透析时间为3～4天。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述肠球菌胞外多糖的分离纯化包括以下步骤：
(1) 用阴离子交换层析柱对所述肠球菌胞外多糖粗品进行分离纯化，以0、0.5、0.7、1mol/L NaCl溶液进行分段洗脱分离，洗脱速度为1～2mL/min，0.5mol/L NaCl溶液洗脱得到海氏肠球菌胞外多糖的组分EPS-I02，合并收集组分峰的洗脱产物，装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，4℃条件下，在去离子水中透析24～72h，每隔4～12h换水一次，最后真空冷冻干燥；
(2)再采用凝胶过滤层析柱进一步纯化，以0.2mol/L的NH4HCO3溶液洗脱，洗脱速度为0.5～1.5mL/min，合并收集组分峰的洗脱产物，反复加水减压蒸干除去NH4HCO3后，最后真空冷冻干燥。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中采用5mL的HiTrap QSepharose High Performance阴离子交换层析柱，洗脱速度为1mL/min，透析48h，每隔4h换水一次。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中采用10mm×300mm的Superdex G 200凝胶过滤层析柱，洗脱速度为0.5mL/min。
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