NL8601154A - Stikstofhoudende polysacchariden, hun bereidingswerkwijze en hun toepassing als therapeutische middelen. - Google Patents

Description

NL 33527 dJ/hf r

Stikstofhoudende polysacchariden, hun bereidingswerkwijze en hun toepassing als therapeutische middelen.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking, in het algemeen, op stikstofhoudende polysacchariden, op een werkwijze ter bereiding daarvan, alsmede op de toepassing daarvan als therapeutische middelen. De uitvinding heeft in het bij-5 zonder betrekking op een bereidingswerkwijze van dergelijke stikstofhoudende polysacchariden, welke bestaat uit een fermentatiewerkwijze gedurende welke een stikstofhoudende polysaccharideverbinding zich vormt in de kweekbouillon, waarbij deze verbinding vervolgens van de kweekbouillon wordt 10 geïsoleerd in de vorm van een adsorptieprodukt, hetgeen hierna op meer volledige wijze zal worden beschreven.

De fermentatie wordt op originele wijze uitgevoerd, waarbij aanvankelijk gedurende de eerste dagen van de fermentatie gebruik wordt gemaakt van een microorganisme van de 15 soort Zymomonas als inoculum van het kweekmedium, en waarbij men vervolgens een andere enting in dezelfde kweekbouillon tot stand brengt, welke alzo wordt gemodificeerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van Pediococcus acidilactici. Daarna zet men de werkwijze voort tot het verkrijgen van de gezochte 20 verbinding in de kweekbouillon en zondert men deze verbinding vervolgens af dankzij de vorming van een adsorptieprodukt, dat nagenoeg de totale hoeveelheid van deze verbinding bevat.

Bijgevolg past men een fermentatie toe, die men zou kunnen noemen "fermentatie met verenigde culturen", welke 25 Dr. J. Risler beschrijft in zijn werk "Les complexes anti-biotiques d'adaption" (PACOMHY Uitgevers, 7 rue Gustave-Nadaud, Parijs (16e)), of met een gemengde cultuur ("fermentatie met gemengde cultuur"), zo genoemd door C.W. Hesseltine (Ann. Rev. Microbiol. 37,575-601-1983), in welk werk men het 30 verkrijgen van verschillende voedingsmiddelen uit een fermentatie onder gebruikmaking van gemengde culturen bestudeert.

Het fermentatieproces volgens de onderhavige werkwijze verschilt van de techniek, welke de laatstgenoemde auteur "polycultuur" noemt, in die zin, dat hoewel men meer 35 dan een micro-organisme gebruikt voor de fermentatie en de t ·/ > v V \ . ....

- 2 - bereiding van de gewenste eindverbinding, deze micro-organismen onbekend zijn, terwijl men in het onderhavige geval de bouillon inoculeert met zuivere culturen van de twee eerder genoemde micro-organismen, zorgdragend voor een 5 faseverschuiving tussen de toevoegingen van deze micro-organismen. Deze werkwijze is origineel en bezit diverse voordelen, zoals bijvoorbeeld het toestaan van een grotere groeisnelheid van de twee kiemen, een stabiele vereniging van deze beiden, een veel groter weerstandsvermogen tegen 10 de werking van fagocyten en een beter rendement van de gewenste verbinding, evenals de mógelijkheid om gemengde substraten te gebruiken in de bereiding van het kweek-medium.

Het volgende voorbeeld beschrijft op afdoende 15 wijze de uitvinding.

In een metalen vat (bij voorkeur van roestvrij staal) brengt men 90 kg sojabonen, welke men tweemaal met water wast, waarna men de wasvloeistoffen verwijdert en vervolgens zoveel water toevoegt, dat de bonen totaal worden 20 bedekt door dit water. Men sluit het vat af en laat de bonen weken bij een temperatuur van circa 10 - 15°C (deze temperatuur is niet kritiek) gedurende circa 18 uur. Nadat deze weektijd is beëindigd, gaat men voort met een grove maling in vochtige toestand van de zaden, die vervolgens 25 een deel zullen vormen van de kweekbouillon. In het onderhavige geval stelt de werkwijze een belangrijke modificatie voor ten opzichte van normale fermentatietechnieken, waarin men bij de bereiding van de kweekbouillon met het oog op zijn latere fermentatie, teneinde verbindingen te verkrijgen 30 met een therapeutische werking, altijd gebruik maakt van fijn gemalen bestanddelen ("meel"), waarbij men, zodra de bouillon is bereid, doorgaat met de sterilisatie ervan voorafgaande aan het enten van het micro-organisme als voortbrenger van de fermentatie. In het geval van de uit-35 vinding decanteert men het water nadat het grove malings-proces in vochtige toestand is beëindigd, en wint daaruit het vaste gedeelte terug, dat bestaat uit onderverdeelde sojabonen, die zonder sterilisatie worden overgebracht in een fermentor met een bruikbaar werkvolume van circa - 3 - 14000 - 15000 liter, welk apparaat is uitgerust met een roer-systeem en waarin men van te voren circa 3000 liter water met een temperatuur van 39-40°C {deze temperatuur is niet kritiek) heeft overgebracht. Terwijl men een gematigde 5 roering instandhoudt, voegt men de volgende bestanddelen van het kweekmedium toe, waarbij deze bestanddelen vooraf fijn verpoederd zijn. De toevoeging geschiedt in de volgende volgorde: 65 kg gekristalliseerde kamfer; 65 kg microfijne zwavel; 40 kg kolofonium; 75 kg droog gistextract; 2,5 kg 10 mangaandioxyde; en 75 kg mangaansulfaat. Na het beëindigen van de toevoeging van deze bestanddelen brengt men in de fermentor, zonder te stoppen met roeren, water met een temperatuur van circa 39°C + 2°C, totdat een eindvolume van 13.000 liter is verkregen, waarna de bereiding van de kweek-15 bouillon aldus is beëindigd.

Wanneer het mengsel bereid en gehomogeniseerd is, controleert men de temperatuur ervan, welke dient te worden gehandhaafd, gedurende het fermentatieproces op bij voorkeur 39°C.

20 Het enten van de kweekbouillon - Vervolgens ent men de kweekbouillon met een stam van Zymomonas movilis. De g enthoeveelheid, die men gebruikt, bedraagt 10 cellen inoculum per liter kweekbouillon, waarmee men het fermentatieproces aanvangt. Op de derde dag gaat men voort met een nieuwe 25 inoculatie van de bouillon met een micro-organisrae dat verschilt van het vorige, waarbij het micro-organisme wordt gevormd door een stam genoemd Pediococcus acidilactici, terwijl de hoeveelheid inoculum, welke men in dit geval gebruikt, q 10 cellen per liter bouillon bedraagt. De geïnoculeerde 30 bouillon wordt zonder roeren en zonder beluchting gehouden op een temperatuur tussen 37 - 40°C gedurende een tijdsduur die varieert tussen 5 en 15 dagen. Gedurende deze periode verloopt het fermentatieproces en de extractie van de bestanddelen, en de chemische modificaties daarvan, evenals een 35 graduele decantering die in de vloeistof de vorming van een gradient van vaste stoffen, van deeltjes en van micro-organ ismen teweegbrengt.

Lysis-hydrolyse - De voorafgaande bouillon wordt onderworpen aan een lysis-hydrolyseproces door het toevoegen - 4 - van 120 kg 85 gew.% fosforzuur, 120 kg ureumparels en 3,6 kg pepsinepoeder met een titer van 1/3.000.

Alle reactiebestanddelen worden toegevoegd onder roeren totdat ze volledig zijn opgelost. Dankzij deze werk-5 wijze, gecombineerd met de eerder beschreven werking van het fermentatieproces, bereikt men de volgende doelen: een totale lysis van alle micro-organismen en het oplosbaar maken van het stikstofhoudende polysaccharide, evenals zijn chemische modificatie, op zodanige wijze, dat men de gewenste, 10 niet-toxische en biologisch actieve eindverbinding verkrijgt. De analyses tonen aan, dat in dit stadium het unieke macromolecuul, dat als zodanig bestaat, het polysaccharide is dat stikstof bevat (PN) .

De preeipitatie en vorming van het adsorptieprodukt: 15 de bouillon, welke aldus een lysis heeft ondergaan, wordt gefiltreerd over Hyflo Super-Cel of een filtratie co-adjuvans met analoge eigenschappen. Hiertoe bereidt men een suspensie van 5 kg Hyflo Super-Cel in 100 liter water, waarmee zich een laag vormt in een persfilter van 10 met een raam van 40 x 40 20 cm, waarop men een ingangsdruk aanbrengt van 1 kg/cm2, terwijl men de uitgang vrij laat. Vervolgens gaat men door, zonder de stroming te onderbreken, met het filtreren van het lysaat, terwijl dezelfde druk in het filter wordt gehandhaafd. Daarna voegt men aan de gefiltreerde oplossing 300 kg calcium-25 chlorideslak (watervrij) toe, waarna men roert tot het bereiken van een totale oplossing, gevolgd door het voorzichtig toevoegen van natriumhydroxide in een 10% gewicht/gewicht oplossing, totdat de pH een waarde heeft van circa 4,7. De benaderde toevoeghoeveelheid van natriumhydroxide bedraagt 30 circa 20 1iter/minuut.

Nadat deze bewerking is geëindigd, giet men snel de X ij k totale hoeveelheid gefiltreerde en gedeelte-geneutraliseerde vloeistof in 4.800 liter zuivere aceton. Deze verandering van polariteit van het oplosmiddel veroorzaakt de vorming 35 van een adsorptieprodukt (een anorganisch complex zout, gevormd door het sulfaat en het fosfaat van calcium, waarvan de analyse gegeven is in de chemische beschrijving van de verbinding), dat op praktisch selectieve wijze het uit het stikstofhoudende polysaccharide bestaande macromolecuul ad-

' *ï 4 U

3 : - ^ - 5 - sorbeert. Tevens ontstaan er adsorpties van kleine hoeveelheden verontreinigende stoffen (reducerende suikers, stikstof-basen, aminozuren), maar deze stoffen worden nagenoeg volledig verwijderd dankzij drie opeenvolgende wasbehandelingen 5 van het adsorptieprodukt met 900 liter aceton met 28% volume/volume in water. Men droogt dit van het wassen afkomstige "aceton-water" en de vaste fractie in suspensie in dit water wordt afgezonderd met behulp van filtratie onder toepassing van een roterend filter, waarna de fractie on-10 middellijk wordt gedroogd in een hete luchtoven bij een temperatuur van 40-60°C.

Tabel A

Chemische samenstelling van het stikstofhoudende polysaccharide, evenals zijn anorganische drager 15 Polysaccharide van

Actief organisch gedeelte manno-glucaan 85,6 + 3,2% (2% gew./gew.) Eiwitten 14,4 _+ 3,2%

Anorganische drager Complex zout van calciumfosfaat (98 % gew./gew.) dat zwavel bevat, in de vorm 20 van sulfaat

Kenmerken van het adsorptieprodukt - Wit, geurloos en smaakloos (een krijtsmaak) poeder, dat onoplosbaar is in water en oplosbaar in verdunde anorganische zuren, salpeterzuur, zoutzuur enz., en in sterk organische zuren, zoals bij-25 voorbeeld azijnzuur.

Zijn oplossing in salpeterzuur geeft bij verhitting, tezamen met ammoniummolybdaat (reactieve oplossing) een gele neerslag van ammoniumfosformolybdaat, hetgeen de aanwezigheid van fosfaten aangeeft.

30 Zijn oplossing in verdund zoutzuur (2N) geeft, met een oplossing van bariumchloride (reactiemiddel) een witte neerslag, die duidt op de aanwezigheid van sulfaten.

De waterige suspensie van het adsorptieprodukt, behandeld met een oplossing van het natriumzout van ethyleen-35 diaminetetra-azijnzuur, levert een heldere niet gekleurde oplossing op door de vorming van een complex met dit zout.

De oplossing van het adsorptieprodukt in verdund -Jtt 3 - 6 - azijnzuur geeft, met ammoniumoxalaat, een witte neerslag van calciumoxalaat, hetgeen duidt op de aanwezigheid van calcium in het adsorptieprodukt.

Tabel B

5 Chemische samenstelling van het stikstofhoudende polysaccharide; polysaccharidefractie Samenstelling in monosacchariden Glucose 23 ± 4 %

Mannose 74 ± 5 % 10 Andere 5 ± 3 % (*)

Structuur met behulp van de SMITH-UNION 1-6 principale analyse.

(*) Voornamelijk ribose, dat waarschijnlijk een geringe 15 verontreiniging door nucleine zuren veroorzaakt.

Tabel C

Chemische samenstelling van het stikstofhoudende polysaccharide; polysaccharidefractie Acetylderivaten (met GLC) (%) DE

20 Glycerol 90,5

Mannitol 4,1

Glucitol 2,9

Overige 2,5

Tabel D

25 Aminozurensamenstelling % gew./gew.

Fosfoserine 0,73 ± 0,16

Asparaginezuur 10,6 ± 0,28

Threonine 9,2 ± 0,83 30 Serine 8,01 ± 0,32

Glutaminezuur 17,6 ± 1,22

Proline 6,1 ± 1,4

Glycine 18 ±0,05

Alanine 3,9 ± 0,2 35 Aminobutaanzuur 3,5 ± 0,25

Valine 2,5 ± 0,16

Cysteine 3,2 ± 0,23 ·- r - 7 -

Tabel D (vervolg)

Methionine 0,62 ± 0,31

Isoleucine 3,05 + 0,13

Leucine 5,4 ± 0,17 5 Tyrosine 2,8 ± 0,16

Fenylalanine 1,87 ± 0,1

Ornitine 0,17 ± 0,02

Lysine 9,2 ± 0,52

Histidine 2,15 ± 0,38 10 Arginine 6,65 ± 0,36

De bijgevoegde figuur toont het infrarood spectrum van twee monsters van het stikstofhoudende polysaccharide, in zuivere toestand, verkregen uit twee verschillende partijen van adsorptieprodukt. Zoals men daaruit kan zien, komen 15 de verkregen spectra overeen. De positie van de meest belang-rijke banden (en cm ) is gelegen bij: 3.400, 2.940, 1.660, 1.135, 1.060, 980 en 815.

De polysacchariden volgens de uitvinding zijn vooral bruikbaar als therapeutische middelen, in het bijzonder als 20 immunostimulerende middelen, vooral voor de stimulatie van de organische afweermechanismen, van secundaire immunodeficiente toestanden, alsmede van immunodeficiente problemen in het algemeen.

Claims (9)

1. Stikstofhoudende polysacchariden, met het kenmerk, dat men deze verkrijgt door de fermentatie van de kweekbouillon, welke is geproduceerd door het inoculeren van twee verschillende klassen van bacteriën, 5 behorende tot de soorten Zymomonas en Pediococcus, waarbij het polysaccharide geïsoleerd is in de vorm van een adsorp-tieprodukt.

2. Stikstofhoudende polysacchariden volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het exemplaar 10 van de Zymomonassoort Zymomonas movilis is en het exemplaar van de Pediococcussoort het Pediococcus acidilactici is.

3. Werkwijze ter bereiding van een stikstofhoudend polysaccharide, dat geïsoleerd is in de vorm van een adsorptieprodukt, met het kenmerk, dat de 15 fermentatie van de kweekbouillon tot stand wordt gebracht door het inoculeren van twee verschillende klassen van bacteriën, waarbij de in de kweekbouillon geïnoculeerde bacteriën behoren tot de soorten Zymomonas en Pediococcus.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het 20 kenmerk, dat als geïnoculeerd exemplaar van de Zymomonassoort Zymomonas movilis wordt gebruikt en als exemplaar, dat tot de Pediococcussoort behoort, Pediococcus acidilactici wordt gebruikt.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 3 of 4, 25. e t het kenmerk, dat de voornoemde stammen niet tegelijkertijd in het kweekmedium worden geïnoculeerd, waarbij het Pediococcus acidilactici wordt geïnoculeerd op de derde dag na het inoculeren van de stam Zymomonas movilis in de kweekbouillon.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 4 of 5, met het kenmerk, dat de kweekbouillon niet met behulp van hitte wordt gesteriliseerd en gedurende 5-15 dagen zonder roeren en zonder beluchting wordt gehouden bij een temperatuur van 37 - 40°C.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat, wanneer de fermentatie beëindigd is, men voortgaat met een lysis-hydrolysebehandeling van de kweekbouillon, door daaraan fosforzuur, ureum en pepsine - 9 - toe te voegen.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de bouillon, nadat deze de lysis heeft ondergaan, wordt gefiltreerd onder gebruikmaking van een 5 filtratie co-adjuvans, waarna men watervrij calciumchloride toevoegt en, na het oplossen, daaraan een oplossing van natriumhydroxide toevoegt totdat de pH een waarde van circa 4,7 heeft bereikt, vervolgens wordt de verkregen oplossing gegoten in een grote overmaat aceton, waardoor men een 10 complexe neerslag krijgt waarin het gezochte stikstofhouden-de polysaccharide wordt vastgehouden in de vorm van een adsorptieprodukt.

9. Toepassing van de stikstofhoudende polysaccha-riden volgens conclusies 1 of 2, of verkrijgbaar volgens 15 een der conclusies 3-8, als therapeutische middelen, in het bijzonder als immunostimulerende middelen, vooral voor de stimulatie van organische afweermechanismen, van secundaire immunodeficiente toestanden en van immuno-deficiente problemen in het algemeen. C ‘