DE3617368A1 - Verfahren zur herstellung eines stickstoffhaltigen polysaccharids - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines stickstoffhaltigen polysaccharidsInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
stickstoffhaltigen (azotierten) Polysaccharids auf mikrobiologischem
Wege. Bei diesem Verfahren wird die stickstoffhaltige
Polysaccharidverbindung in einer Gärbrühe gebildet
und anschließend aus der Brühe in Form eines Adsorbats
isoliert.
Die mikrobiologische Züchtung wird in spezieller Weise
durchgeführt, indem man die Gärbrühe zunächst während der
ersten Tage mit einem Mikroorganismus vom Typ Zymomonas
züchtet und anschliessend dasselbe Züchtungsmedium durch Beimpfung
mit Pediococcus acidilactici modifiziert. Die
Züchtung wird dann fortgeführt, bis man in der Gärbrühe
die gewünschte Verbindung erhält. Diese Verbindung wird
anschliessend durch Bildung eines Absorbats, das fast das
gesamte Produkt enthält, abgetrennt.
Somit handelt es sich um eine Fermentation die als "assoziierte
Kulturen" gemäss der Definition von J. Risler in
"Les complexes antibiotiques d'adaption" (Hrsg, PACOMHY,
7 rue Gustave Nadaud Paris) oder als "Mischkultur" gemäss
der Definition von C.W. Hesseltine (Ann. Rev. Microbiol.,
Bd. 37 (1983), S. 575-601) bezeichnet werden kann. Im
letztgenannten Artikel wird die Herstellung von verschiedenen
Nahrungsmitteln auf fermentativem Wege unter Verwendung
von Mischkulturen untersucht.
Das erfindungsgemässe Verfahren unterscheidet sich von der
Technik, die der letztgenannte Autor als "Polykultur" bezeichnet
darin, dass bei der Verwendung von mehr als einem
Mikroorganismus für die Fermentation und Bildung des gewünschten
Endprodukts die verwendeten Mikroorganismen unbekannt
sind, während beim anmeldungsgemässen Verfahren die
Gärbrühe mit Reinkulturen der vorerwähnten Mikroorganismen
beimpft werden, wobei die Zugabe der genannten Mikroorganismen
unter zeitlicher Verschiebung erfolgt. Dieses
spezielle Verfahren weist verschiedene Vorteile auf; z. B.
werden eine größere Geschwindigkeit der Kreuzung der beiden
Keime, eine stabile Assoziation der beiden Keime, eine
erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber Phagozyten und eine
höhere Ausbeute des gewünschten Produkts erzielt. Ferner
ist es möglich, zur Herstellung des Kulturmediums gemischte
Substrate zu verwenden.
Nachstehend wird die Erfindung anhand eines Beispiels näher
erläutert.
In einem Metallbehälter (vorzugsweise aus oxidationsbeständigem
Stahl) werden 90 kg Sojabohnenkerne vorgelegt und
2 mal mit Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird jeweils
verworfen. Schliesslich wird so viel Wasser zugesetzt, dass
die Kerne vollständig mit Wasser bedeckt sind. Sodann wird
der Behälter verschlossen und 18 Stunden in ein Bad mit
einer Temperatur von etwa 10 bis 15°C (diese Temperatur
ist nicht kritisch) gestellt. Nach Ablauf der Einweichzeit
werden die Kerne in feuchtem Zustand einem groben Mahlvorgang
unterworfen. Das erhaltene Produkt stellt dann einen
Bestandteil der Gärbrühe dar. Im vorliegenden Fall stellt
das beschriebene Verfahren eine wichtige Modifikation in
bezug zu herkömmlichen Fermentationstechniken dar, bei
denen man bei der Herstellung der Gärbrühe für die anschliessende
Fermentation (mit dem Ziel zur Herstellung
von therapeutisch wirksamen Verbindungen) immer fein gemahlene
Bestandteile (Mehl) verwendet und anschliessend
vor dem Animpfen mit dem die Fermentation bewirkenden
Mikroorganismus die Gärbrühe einer Sterilisation unterwirft.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden nach der Grobmahlung
in feuchtem Zustand das Wasser dekantiert und das von den
Sojakernen gebildete feste Produkt gewonnen. Dieses feste
Produkt wird in Stücke geschnitten und ohne Sterilisation
unter Rühren in einen Fermentationsbehälter von etwa 14 000
bis 15 000 Liter Nutzvolumen, in dem sich bereits etwa
3000 Liter Wasser mit einer Temperatur von 39 bis 40°C
(dieseTemperatur ist nicht kritisch) befinden, gegeben.
Unter leichtem Rühren wird das Kulturmedium anschliessend
mit folgenden Bestandteilen, die vorher fein pulverisiert
worden sind, versetzt. Die Zugabe erfolgt in folgender
Reihenfolge: Kristalliner Kampfer 65 kg, fein zerkleinerter
Schwefel 65 kg, Kollophonium 40 kg, Hefeextrakt 75 kg,
Mangandioxid 2,5 kg und Mangansulfat 75 kg. Nach beendeter
Zugabe dieser Bestandteile wird der Fermentationsreaktor
unter fortgesetztem Rühren mit Wasser mit einer Temperatur
von etwa 39 ± 2°C bis zu einem Gesamtvolumen von 13 000
Liter versetzt. Damit ist die Herstellung der Gärbrühe beendet.
Nach der Herstellung und Homogenisierung des Gemisches
wird darauf geachtet, dass die Temperatur vorzugsweise
während des Fermentationsvorgangs auf 39°C gehalten
wird.
Die Gärbrühe wird mit einem Stamm von Zymomonas movilis
beimpft. Die Menge des verwendeten Inokulats beträgt 109
Zellen pro Liter Gärbrühe. Mit dieser Menge wird der Fermentationsvorgang
eingeleitet. Am dritten Tag wird die
Brühe einer erneuten Inokulation mit einem anderen Mikroorganismus
unterworfen. Beim letztgenannten Mikroorganismus
handelt es sich um einen Stamm der Bezeichnung Pediococcus
acidilactici. Auch in diesem Fall beträgt die Inokulatmenge
109 Zellen pro Liter Gärbrühe. Die inokulierte
Brühe wird während einer zwischen 5 und 15 Tagen variierenden
Zeitdauer ohne Bewegung (Rühren) und ohne Belüftung
bei einer Temperatur von 37 bis 40°C belassen. Während
dieser Zeit läuft ein Fermentations-Extraktionsvorgang
der Bestandteile ab. Ferner erfolgen chemische Modifikationen
der Bestandteile sowie eine graduelle Klärung, bei
der im Flüssigkeitszentrum Feststoffe, teilchenförmige Produkte
und Mikroorganismen gebildet werden.
Die vorstehende Gärbrühe wird einem Lysis-Hydrolysevorgang
unterworfen, indem man 120 kg 85-gewichtsprozentige Phosphorsäure,
120 kg perlierten Harnstoff und 3,6 kg pulverförmiges
Pepsin in einer Konzentration von 1/3000 zusetzt.
Die Zugabe sämtlicher reagierender Bestandteile erfolgt
unter Rühren bis sie vollständig gelöst sind. Mit diesem
Verfahren wird durch Kombination mit dem vorstehend beschriebenen
Fermentationsverfahren folgendes erreicht:
Vollständige Lysis sämtlicher Mikroorganismen und Solubilisierung
des stickstoffhaltigen Polysaccharids sowie dessen
chemische Modifikation, so dass man das gewünschte Endprodukt
erhält; d.h. eine nicht-toxische und biologisch aktive
Verbindung. Zu diesem Zeitpunkt durchgeführte Analysen zeigen,
dass es sich beim einzigen verbleibenden Makromolekül
um das stickstoffhaltige (azotierte) Polysaccharid (PN)
handelt.
Die auf diese Weise lysierte Brühe wird durch Hyflo Super-
Cel oder unter Verwendung eines Filtrationshilfsmittels
mit analogen Eigenschaften filtriert. Hierzu wird eine
Suspension von 5 kg Hyflo Super-Cel in 100 Liter Wasser hergestellt.
Damit wird auf einer Filterpresse mit 10 Rahmen
von 40 × 40 cm, an die ein Eingangsdruck von 1 kg/cm2 bei
freiem Ausgang angelegt wird, eine Vorschicht gebildet.
Anschliessend führt man bei gleichem Druck auf den Filter
ohne Unterbrechung der Zirkulation die Filtration des
Lysats durch. Anschliessend versetzt man die filtrierte
Lösung mit 300 kg calciniertem (wasserfreiem) Calciumchlorid,
rührt bis zur vollständigen Auflösung und setzt vorsichtig
eine 10-prozentige (Gew./Gew.) Natriumhydroxidlösung
zu, bis ein pH-Wert von etwa 4,7 erreicht wird. Das
Natriumhydroxid wird in einer Menge von etwa 20 Liter/min
zugesetzt.
Nach Beendigung dieses Schritts wird die gesamte filtrierte
und teilweise neutralisierte Flüssigkeit in 4800 Liter reines
Aceton gegossen. Aufgrund der Polaritätsänderung des
Lösungsmittels wird ein Adsorbat (komplexes Mineralsalz
aus Calciumsulfat und -phosphat, dessen Analyseergebnisse
in den Tabellen I, II, III und IV wiedergegeben sind) gebildet,
das in praktisch selektiver Weise das aus dem
stickstoffhaltigen Polysaccharid bestehende Makromolekül
adsorbiert. Ferner kommt es zur Adsorption von geringen
Mengen an verunreinigenden Substanzen (reduzierende Zucker,
stickstoffhaltige Basen, Aminosäuren). Jedoch werden diese
Substanzen fast vollständig durch drei anschliessende
Waschvorgänge beseitigt, bei denen das Adsorbat mit 900
Liter Aceton mit einem Gehalt an 28 Prozent (Vol./Vol.)
Wasser gewaschen wird. Die aus wässrigem Aceton bestehenden
Waschflüssigkeiten werden verworfen. Die in Suspension in
der Waschflüssigkeit vorliegende feste Fraktion wird mittels
eines Drehfilters abfiltriert und anschliessend in einem
Heisslufttrockenschrank bei 40 bis 60°C getrocknet.
Die Zeichnung zeigt das IR-Spektrum von zwei Proben von
stickstoffhaltigem Polysaccharid in reinem Zustand, die
aus zwei unterschiedlichen Adsorbatansätzen erhalten worden
sind. Es zeigt sich, dass die erhaltenen Spektren
identisch sind.
Es ergeben sich folgende Hauptbanden: 3400, 2940, 1660,
1135, 1060, 980 und 815 cm-1.
Weisses geruchloses und geschmackloses (Kreidegeschmack)
Pulver, das in Wasser unlöslich und in verdünnten Mineralsäuren,
wie Salpetersäure, Salzsäure und dergl., sowie in
starken organischen Säuren, wie Essigsäure, löslich ist.
Die Salpetersäurelösung ergibt in der Wärme mit Ammoniummolybdat
(Reaktionslösung) einen gelben Ammoniumphosphomolybdatniederschlag,
was die Anwesenheit von Phosphaten
zeigt. Eine Lösung in verdünnter Salzsäure (double liaison
normale) ergibt mit einer Bariumchloridlösung (reaktiv)
einen weissen Niederschlag, was die Anwesenheit von Sulfaten
zeigt. Eine wässrige Lösung des Adsorbats ergibt
nach Behandlung mit einer Lösung des Natriumsalzes von
Äthylendiamintetraessigsäure aufgrund der Bildung eines
Komplexes mit diesen Salzen eine durchsichtige und ungefärbte
Lösung. Eine Lösung des Adsorbats in verdünnter
Essigsäure ergibt mit Ammoniumoxalat einen weissen Calciumoxalatniederschlag,
was die Anwesenheit von Calcium im
Adsorbat zeigt.
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung eines stickstoffhaltigen, in
Form eines Adsorbats isolierten Polysaccharids, dadurch
gekennzeichnet, dass eine mikrobiologische Züchtung in
einer Gärbrühe unter Inokulation mit zwei verschiedenen
Klassen von Bakterien durchgeführt wird und die Bakterien
den Gattungen Zymomonas und Pediococcus angehören.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei der Spezies der Gattung Zymomonas um Zymomonas
movilis und bei der Spezies der Gattung Pediococcus
um Pediococcus acidilactici handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass
die Inokulation des Züchtungsmediums mit den genannten
Stämmen nicht gleichzeitig erfolgt, sondern dass die
Inokulation mit Pediococcus acidilactici am dritten Tag
nach der Inokulation der Gärbrühe mit Zymomonas movilis
durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
dass die Gärbrühe nicht hitzesterilisiert
ist und 5 bis 15 Tage ohne Bewegen und ohne Belüften
bei einer Temperatur von 37 bis 40°C belassen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass
die Gärbrühe nach beendeter Züchtung durch Zugabe von
Phosphorsäure, Harnstoff und Pepsin einer Lysis-Hydrolyse-
Behandlung unterworfen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass
man die lysierte und unter Verwendung eines Filtrationshilfsmittels
filtrierte Brühe mit wasserfreiem Calciumchlorid
versetzt und nach dessen Auflösung eine Natriumhydroxidlösung
zusetzt, bis ein pH-Wert von etwa 4,7
erreicht ist, wonach man die erhaltene Lösung zu einem
grossen Überschuss an Aceton gibt, wodurch man einen
komplexen Niederschlag erhält, in dem das gewünschte
stickstoffhaltige Polysaccharid in Form eines Absorbats
vorliegt.
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