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La présente invention concerne l'obtention d'une nouvelle enzyme protéolytique.
Les enzymes protéolytiques, encore désignées sous le nom de protéases, provoquent la dégradation des protéines en protéoses, peptones et acides aminés. Un certain nombre de ces enzymes sont connues et très uti- lisées dans l'inductrie. On peut indiquer comme exem- ples la trypsine, qui se trouve dans le suc pancréati- que, la pepsine qui se forme dans la muqueuse gastri- que, la rennine qui est sécrétée dans la caillette des jeunes veaux, et la papa!ne que l'on peut obtenir à partir de la sécrétion du papale exotique.
Les enzymes protéolytiques que l'on vient,de citer et.celles de nature et d'origine semblables pré- sentent différents inconvénients évidents. La trypsi- ne a une courte demi-cie (une demi heure), elle est instable, coûteuse à purifier, et exige un pH neutre ou légèrement alcalin pour montrer une activité protéo- lytique optima. La pepsine n'est active qu'à des pH très acides de 1,5 à 435. La rennine n'a que des ap- plications industrielles très limitées, n'offrant comme seul intérêt que de cailler rapidement le lait en trans formant la caséine en para-caséine. Le papale, dont on obtient la papaine à partir de son latex, est une plan- te des climats tropicaux.
On doit donc importer la papaïne brute de pays lointains comme Ceylan et l'Afri' que.' Bien qu'on puisse le cultiver dans certaines par- ties méridionales des Etats-Unis, les frais de main d'oeuvre pour l'extraction et le traitement du latex sont prohibitifs.
Un autre inconvénient important de la papaïne
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comme enzyme industrielle est son extrême sensibilité du point de vue chimique-. La molécule de papaïne ren- fermant un groupe sulfhydryle;, les oxydants agissent facilement sur cette enzume. Ainsi en exposant le la- tex à l'air, même pendant une courte durée, il se forme des groupes dithioniques qui diminuent l'activité du latex. L'addition dtun agent réducteur comme la cys- téine est donc nécessaire pour obtenir l'activité pro- téolytique maxima.
Les enzymes protéolytiques dont on dispose actuellement étant de structure chimique inconnue et ne pouvant donc être obtenues par synthèse, leurs sources principales sont des sources naturelles comme les esto- macs d'animaux, les glandes pancréatiques, et les sécré- tions des plantes.
Des efforts considérables ont été tentés ces dernières années du c8té d moisissures et mycètes comme source bon matché et d'accès aisé d'enzymes pro- téolytiques. Des recherches limitées ont été entrepri- ses sur des méthodes de fermentation, des formules de milieux, et sur les conditions appropriées à une produc tion et une obtention les meilleures d'enzymes protéo- lytiques. Ainsi Maxwell (Australian Journal Scientific Research, série B, 5, 42-55, 1952) a montré que lors- qu'on cultivait une moisissure d'Aspergillus or zae sur un milieu de Raulin modifié, il s'élaborait une enzyme protéolytique. On trouve dans la littérature d'autres publications détaillées d'essais effectués sur cette moisissure ainsi que sur d'autres.
La plupart des recherches antérieures sur la culture des mycètes dans des conditions convenant pour une production industrielle d'enzymes protéolytiques n'ont eu qu'un succès modéré. Les méthodes découvertes
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précédemment sont d'un intérêt très limité en raison du coût prohibitif des milieux prescrits pour la cultu- re, du temps prolongé nécessaire à la fermentation, ou de l'absence de méthodes convenables pour séparer et purifier l'enzyme. En outre, les enzymes qui se forment dans les conditions indiquées par ces chercheurs possè- dent une activité protéolytique très limitée, à la fois en ce qui concerne le champ de cette activité et son degré. D'autre part, l'intervalle de pH dans lequel elles sont stables est extrêmement étroit, comme pour la trypsine et pour la pepsine.
On obtient selon la présente invention une nouvelle enzyme protéolytique en faisant fermenter un ou plusieurs genres d'un champignon de l'ordre des Entomophthorales dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions aérobies.
Cette nouvelle enzyme protéolytique se prête à une grande variété d'applications. Dans l'industrie du cuir par exemple, pour préparer les cuirs à partir de peaux brutes, on doit enlever les tissus épidermi- ques et sous-cutanés par dépilage et chipage des peaux.
On peut réaliser cette opération de chipage en utili- sant l'enzyme protéolytique de cette invention en combi- naison avec un agent de déplainage comme le sulfate d'ammonium. On fait d'abord détremper les peaux dans de la chaux ou de la souae diluée, puis on les transfère dans la solution contenant l'enzyme et le sel d'ammo- nium. On effectue généralement cette opération à 25 C et à pH 7,5. On peut ainsi éliminer aisément le poil, l'élastine et la kératine, et les peaux sont préparées pour le tannage.
Un autre champ d'application intéressant ae cette enzyme est la protection de la bière contre le
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froid. On sait qu'il se forme un trouble dans la bière lorsqu'on la conserve à une température juste supérieure à sa congélation, après les opérations de maltage, et de brassage. Ce trouble est dû/à la précipitation d'une petite quantité restante des protéines du grain initial, dont la proportion s'élève à 0,35 % environ. L'addition d'une petite quantité de l'enzyme protéolytique empêche ce trouble en hydrolysant la protéine restante.
Une autre application intéressante de cette enzyme consiste à attendrir la viande en modifiant par- tiellement les.protéines. Une petite quantité d'enzy- me en poudre répandue sur la viande avant la cuisson donne une viande tendre et facile à digérer. L'enzyme de la présente invention peut encore être employé dans d'autres domaines, par exemple dans l'industrie du net- toyage à sec, en particulier pour enlever les taches de blanc d'oeuf, etc..., dans l'industrie textile pour le désapprêtage des tissus, dans l'industrie de la boulan- gerie pour obtenir un pain de meilleure texture, et dans l'industrie des matières alimentaires pour jeunes ,enfants en vue de faciliter la digestion des protéines.
Cette nouvelle enzyme est une substance pro- téinique de structure chimique inconnue. Un volume de 1 cc du mélange de fermentation brut offre une activi- té protéolytique non inférieure à 15. 000 unités Azocoll déterminée par la méthode de Bidwell et Oakley décrite plus loin. Un certain nombre d'échantillons de la substance solide amorphe, tels que ceux obtenus par les procédés détaillés plus loin et d'un titre moyen non inférieur à 1. 000 unités Azocoll par gamma d'azote, montrent une notable activité protéolytique vis-à-vis de la caséine dans un domaine dé pH compris entre 4,0 et 11,0 environ, le pH optimum étant de 9,0. L'enzyme
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a un point isoélectrique d'environ 10,2.
Une solution à 1% de la substance dans un tampon d'acétate à pH 6,3 extrapolée à la concentration zéro et corrigée à 20 C, dans l'eau, possède une constante de sédimentation éga- le à 2,5 x 10-13. Une solution à 0,4 % de l'enzyme cor. rigée à 20 @ dans l'eau possède une constante de diffu- sion de 8,2 x 10-7. Une solution aqueuse de degré io- nique 0,13 à pH 8,5 dans un tampon au véronal présente une mobilité électrophorétique de 0,43 x 10-5. Une so- lution de même degré ionique à pH 10,5 dans un tampon de glycine présente une mobilité électrophorétique de 0,08 x 10-5.
En supposant un volume spécifique partiel égal à 0,75, les constantes de sédimentation et de dif- fusion correspondent à un poids moléculaire d'environ 30.000. Des volumes de 5 cc d'une solution aqueuse de l'enzyme à.une concentration d'environ 0,5 %, injectés par voie intraveineuse à un lapin à des intervalles de 4 jours,.produisent après 4 ou 5 injections environ un antisérum d'une teneur satisfaisante en anticorps. , L'antisérum spécifique ainsi obtenu donne une réaction positive à la précipitine avec 1/20 cc d'une solution aqueuse à 0,5 % de l'enzyme, à une dilution non infé- rieure à 1 : 1000.L'enzyme est stable dans le domaine de pH compris entre 4,0 et 11,0 environ.
Les champignons phycomycètes de l'ordre des Entomophthorales utilisés dans le procédé de fermenta- tion de l'invention sont décrits par Bessy (Morphdogy and Taxonomy of' Fungi, pages 172-177, Blakiston Company, Philadelphie, 1950). L'ordre comprend une seule famil- le, la famille ces Entomophthoraceae qui comprend six genres : Entomophthora, Basidiobolus, Conidiobolus, Completoria, Massaspora, et Ancylistes.
Parmi les divers genres de cette famille, les
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genres Entomophthora, Basidiobolus, et Conidiobolus ont été reconnu les plus intéressants dans la méthode de la présente invention. Les espèces des genres se montrant actives dans cette méthode comprennent par exemple les espèces Entomophthora spiculata, coronata, sphaerosperma, et les espèces Basidiobolus ranarum et Conidiobolus brefeldianus.
Bien que les espèces de la famille des mycè- tes généralement désignée sous le nom d'Entomophthor&- ceae soient très actives dans'la méthode de l'invention comme productrices de l'enzyme protéolytique, on préfè- re pour des raisons de productivité les espèces des -,en- res Entomophthora et Conidiobolus.
Il est préférable pour la mise en oeuvre ou l'invention que le milieu nutritif contienne des sour- ces assimilables de carbone et d'azote, et des traces de sels inorganiques. On peut faire varier entre de larges limites les conditions de fermentation telles que le temps; la température et la concentration en ions hydrogène, tout en restant dans le domaine de l'invention. A la fin de la période de fermentation on peut récupérer l'enzyme du mélange de fermentation par aifférentes méthoaes, par exemple par adsoprtion sur aes terres d'infusoires, ou du silicate de magné- sium, puis élution par aes milieux aqueux à pH sensi- blement alcalin.
On peut employer une grande variété de sub- st@@ces comme sources de carbone du milieu nutritif.
Ces substances peuvent être solubles ou insolubles dans l'eau et il est seulement souhaitable que les com- posés utilisés soient aisément assimilables par le champignon. On peut citer comme exemples les pento@@@ comme l'arabinose, le ribose, et le xylose; les @@@-
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saccharides comme le mannose, le lévulose et le galac- tose ; les disaccharides comme le tréhalose, le maltose, le lactose, le cellobiose et le sucrose; les polysac- charides comme l'amidon; les alcools comme la glycéri- ne, la mannite, la sorbite et l'inosite; et des source; diverses comme l'alcool éthylique et le carbonate de calcium.
Le milieu préféré est un milieu contenan 5% en poids environ de source de carbone. On a trouvé que la présence de sucre était essentielle au dévelop- pement de la moisissure, si l'on désirait avoir une production élevée de mycélium. Bien qu'il soit possi- ble de cultiver le champignon avec succès dans un mi- lieu nutritif auquel on n'a pas ajouté d'hydrates de carbone, la production d'enzyme est fible dans ces conditions et de peu d'intérêt industriel..
L'azote assimilable peut être apporté par des protéines animales ou végétales, la farine de soja, la caséine, les peptones, polypeptides ou acides aminés. On peut indiquer comme exemples spéci- fiques la liqueur obtenue par cuisson à la vapeur sous pression de résidus de graisses et issues d'abat- toirs et deoucherie (ou liqueur animale de collage), le nitrate de sodium, l'asparagine, l'urée, l'histi- dine et la guanine. Une proportion de 1% d'hydroly- sat de caséine, seul ou avec un sucre comme le dextro- se, fournit des quantités appréciables d'enzyme. On peut si l'on veut ajouter différentes proportions de sels inorganiques, soit à une combinaison d'hydroly- sat de caésine et de sucre, soit au sucre seul.
On a constaté avec la liqueur animale de collage comme source d'azote, que l'on obtenait les meilleurs résul tats en présence également a'un sucre dans le milieu)
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bien que l'on ait également de bons rendements sans ajouter d'hydrates de carbone.
Les conditions de pH optima pour le dé- veloppement de l'enzyme protéolytique de l'invention peuvent être de pH 5,0 à 9,0 environ, mais on a trouvé que le domaine compris entre 6,0 et 8,0 environ donnait de meilleurs résultats. Au-dessus de cette limite l'enzyme est très active et elle se détruit elle-même, tandis qu'un pH inférieur à 6,0 n'est pas favorable au développement des micro-organismes. On peut ajuster le pH par toute base convenable comme la soude, un tampon au phosphate, le citrate de sodium, l'acétate de sodium, ou tout autre composé approprié portant le pH à la valeur désirée.
On peut maintenir la température du mi- lieu nutritif au cours de la fermentation du mycète entre 20 C et 30 C environ, les températures compri- ses entre 25 et 300 C environ étant préférables. En laissant la température s'élever au-dessus de 30 C il se forme peu ou pas d'enzyme et l'on obtient une croissance analogue à la levure. Si l'on abaisse la température sensiblement au-dessous de 25 C, le déve- loppement du champignon est trop lent.
On peut faire varier dans de larges li- mites le temps nécessaire à l'obtention d'une quantité maxima d'enzyme protéolytique, selon la nature des constituants particuliers du milieu nutritif. Toute- fois, une durée de 24 à 90 heures environ est généra- lement considérée comme bonne pour la production de quantités optima d'enzyme.
Dans le mode de réalisation préférentiel de la présente invention, on ajoute un germe de 24 heures du mycète à 50 cc de milieu en quantité suffi-
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sante pour avoir une concentration de 0,5 % à 1,0%, puis on place le flacon sur une machine à secousse et on fait incuber entre 26 C et 29 C pendant 48 à 96 heures environ. On fait passer de l'air stérilisé dans.
. le milieu pendant la fermentation, cet air servant en même temps de moyen d'agitation. On évalue alors le degré activité de l'enzyme protéolytique élaborée par un essai de titre Azacoll modifié, de la façon décrite en détails plus loin. On observe en général une pro- duction maxima en 48 à 72 heures.
On peut cultiver la moisissure utilisée comme germe sur un milieu convenable tel que l'agar- agar. Pour obtenir un germe de 24 heures en peut prendre une certaine quantité de mycélium végétatif à partir de l'agar-ag@r, le déposer dans 50 cc environ de milieu nutritif, puis faire incuber pendant 24 heu- res entre 20 C ete 30 C environ.
On peut ajouter aseptiquement des agents anti-mousse au milieu de fermentation. On a trouvé que 1% d'octadécanol dans de l'huile de saindoux était préférable dans ce but, bien que l'on puisse également employer une grande variété d'autres produits. On peut indiquer comme exemples de ces produits l'huile de soja, l'huile de ricin, l'oléine, les huiles sulfo- nées, l'huile de saindoux, l'huile de ricin bromée.
On peut en ajouter de 0,1 à 1%.
On obtient le meilleur résultat avec un milieu liquide contenant des sels inorganiques. On opère donc de préférence avec un milieu liquide ren- fermant des traces de constituants minéraux, ajoutés ou naturellement présents. On peut utiliser des ni- trates, phosphates, sulfates, chlorures de métaux lourds, de métaux alcalino-terreux ou de métaux alca-
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lins, par exemple de calcium, cobalt, sodium,' potas- sium, magnésium ou manganèse. On entend par traces des proportions variant entre 0,001 et 0,0001 %.
A la fin de l'opération de fermentation, et après avoir déterminé par le titre en unités Azocoll que l'on a obtenu le rendement maximum en protéase, on sépare et on purifie l'enzyme. Du fait de la nature instable de celle-ci, la méthode de purification uti- lisée doit être nécessairement sélective et assurer le minimum de destruction et la meilleure séparation du reste des constituants du bouillon de fermentationi
Bien que l'on puisse employer des métho- des variées pour séparer l'enzyme du bouillon de fer- mentation, on a trouvé un procédé particulièrement in- téressant qui doit être considéré comme faisant partie du domaine de la présente invention. Selon ce procé- dé, la substance active.est adsorbée sur une matière adsorbante appropriée à un pH de la bouillie compris entre 6,5 et 8,5 environ.
L'adsorption peut avoir lieu soit avant, soit après séparation des cellules de la bouillie. On sépare la matière adsorbante con- tenant l'enzyme du mélange de fermentation par tout moyen approprié, par exemple par filtration ou den- trifugation, et l'on écarte le filtrat ou le liquide surnageant. On récupère la substance active protéoly- tique en formant une bouillie avec l'adsorbant et un alcali en solution aqueuse comme l'ammoniaque, la sou- de ou la potasse à un pH compris entre 9,0 et 11,5 environ, et de préférence de 10,5 environ. On filtre ' la bouillie et on lave le gâteau avec l'alcali aqueux pour récupérer le maximum de substance. On réunit le liquide de lavage et l'éluat, et si on le désire on les soumet à d'autres séparations et purifications.
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Les matières adsorbantes pouvant être avantageusement utilisées dans cette invention et que l'on préfère employer appartiennent à la catégorie des terres d'infusoires purifiées. On peut se les procurer. sous différentes appellations commerciales comme l'Attasorb ou le Superfiltrol. On peut également se servir de silicate de magnésium, par exemple des pro- duits du commerce connus sous les désignations de "Magnésol" ou "Florisil".' D'autres adsorbants appro- priés sont la terre à foulon, le charbon actif, le noir de fumée; l'oxyde de titane, les catalyseurs de cracking synthétiques, et les composés de types ana- logues. On peut également employer avec un bon résul- tat Ses zéolites artificielles, par exemple le produit vendu dans le commerce sous le nom de "Permutite".
Avec un adsorbant du type silicate de magnésium on obtient les meilleurs résultats en lavant au préalable cet adsorbant avec une solution aqueuse diluée d'acide minéral comme l'acide chlorhydrique ou sulfurique, puis en éliminant l'acide par lavage à l'eau et en séchant avant emploi.
Pour obtenir la meilleure élution on met l'adsorbant en suspension dans l'eau, on ajuste à un pH élevé, on agite, puis on filtre ou/on centrifuge.
On élue généralement à pH 10,5 environ, mais ce pH peut varier de 9,0 à 11,5 environ. Dans le cas d'un adsorbant faible, comme par exemple un catalyseur de cracking synthétique, le pH d'élution peut descendre à la valeur 7,4.
La présence d'une petite quantité de chlorure de sodium est généralement considérée comme favorable à l'élution maxima,:, Ainsi, avec un éluat de pH 10,5 il est préférable d'avoir une concentra- tion d'environ 2 % en chlorure de sodium.
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Immédiatement après la filtration on abaisse le pH de l'éluat (renfermant l'enzyme protéolytique) entre 6,0 et S,0 environ, l'enzyme étant de plus stable à cette concentration en ions hydrogène. On peut coin- modément y parvenir en ajoutant de la neige caroonique ou en faisant passer du gaz carbonique dans la solution jusqu'à ce que l'on obtienne le pH désiré.
L'enzyme brute ootenue par cette méthode est à peu près exempte d'impuretés et peut être em- ployée telle quelle dans nombre d'opérations industriel' les comme le nettouage à sec, le chipage des peaux ou le désapprétage des tissus. Toutefois, dans d'autres domaines comme l'industrie pharmaceutique, la fabrica tion du pain ou des matières alimentaires pour bébés, il peut être souhaitable d'avoir un produit le plus pur possible. Une variante de la présente invention consiste donc à soumettre la substance protéolytique partiellement purifiée à un traitement de purification supplémentaire.
On précipite l'enzyme de sa solution aqueuse par addition d'un volume d'acétone, et cela constitue un trait caractéristique du procédé. bien que l'on considère comme suffisante 2 à 4 volumes d'acétone, il est préférable d'en ajouter 2,5 à 3 vo- lumes envmron. On rassemble le précipité obtenu par centrifugation, ou par filtration sur une matière fil- trante appropriée comme une terre d'infusoires. Il
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est nécessaire dans cette dernière méthcrde de séparer l'enzyme de la matière filtrante par lavage à l'aide d'un solvant aqueux convenable, par exemple d'une so- lution à 1% ae chlorure de sodium.
On peut aisément mettre sous une forme sta-
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ble cC:llmerci91e l'ensyme précipitée à i t4cctcn: par un certain, nombre de procédés simples, parmi lesquels
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sont la dissolution dans une solution aqueuse à 1% de chlorure de sodium suivie d'une stérilisation, la lyo philisation en un produit solide stable, ou le séchage par mise en suspension dans de l'acétone anhydre et filtration.
Il a été reconnu bon d'employer un agent pro- tecteur pour le séchage de la substance protéolytique active. Un tel produit auxiliaire est souhaitable si l'on opère par lyophilisation ou par séchage à l'aide d'un solvant comme l'acétone ou des solvants analogues. Des adjuvants protecteurs s'étant montrés satisfaisants sont la sorbite, le sirop de grain, le lactose, le dextrose, la gélatine et la gomme arabi- que, mais les spécialistes trouveront aisément d'autres composés de nature semblable. On peut convenablement ajouter le protecteur à la solution d'enzyme juste avant la lyophilisation ou le traitement à l'acétone.
Bien que l'on ne connaisse pas la nature exacte de l'action de l'auxiliaire prptecteur, il 'est possible qu'il agisse'comme humectant. Il peut se faire cependant qu'il forme simplement un revêtement autour des fines particules d'enzyme au cours de la dessiccation, et protège ainsi cette enzyme de l'at- mosphère.
Si l'on effectue le séchage à l'aide d'acé- tone, l'adjuvant seul tend à donner un précipité gommeux que l'on ne peut obtenir à l'état sec. Il est avantageux dans ces cas là d'employer avec l'adju- vant un agent de gonflement avant d'ajouter l'acétone, ce qui permet la formation d'un précipité solide faci- le à traiter, que l'on peut facilement sécher. Comme produits qui se sont montrés particulièrement satisfai- sants dans ce but, on peut citer l'amidon, la pulpe de
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bois, le silicate de magnésium, la terre d'infusoires, et les composés de semblable nature. On ajoute l'ad- juvant protecteur et les agents de gonflement à une solution aqueuse de l'enzyme protéolytique, puis on agite le mélange.
On additionne ensuite de 2 à 5 vo- lumes d'acétone,'puis on rassemble le précipité actif sur un filtre et on le lave à l'acétone froid. On met le précipité en suspension dans de l'acétone anhydre, on filtre, on sèche à l'air et on pulvérise. On peut employer le produit obtenu tel quel dans un domaine de pH étendu allant de 4,0 à 11,0 environ, le domaine optimum et préféré étant compris entre 8,0 et 9,0 en- viron.
On peut si on le désire sécher l'enzyme avec des solvants autres que l'acétone, miscibles à l'eau, et dans lesquels l'enzyme est insoluble. Des exemples de solvants sont le dioxane, et les alcools aliphati- ' ques inférieurs comme les alcools méthylique, éthyli- que, propylique, isopropylique, butylique et isobutuli- que.
Si l'enzyme protéolytique est destinée à un usage non médicinal, comme par'exemple le tannage , du cuir, il n'est pas nécessaire de soumettre le bouil- lon de fermentation à des séparations coûteuses et @ ennuyeuses. Ainsi une autre variante de l'invention consiste à précipiter la substance protéolytique acti- ve du bouillon par l'acide tannique ou d'autres compo- sés précipitant les protéines, comme l'acide phospho- tungstique, le chlorure de zinc, le chlorure ferrique, etc... Cette méthode permet la préparation très simple d'un produit utilisable à partir des mélanges de fer- mentation.
On ajoute simplement le composé précipi- tant la protéine directement au bouillon exempt de
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cellules, puis on sépare le précipité de la liqueur mère, on le mélange avec un agent de gonflement comme la sciure de bois et on le sèche. On peut opérer avec ou sans adjuvants protecteurs, tel que le sirop de grain, etc...
On voit aisément que l'on peut combiner de différentes façons les opérations que l'on vient d'in- diquer selon la pureté et l'état physique désirés pour le produit. On peut par exemple obtenir une poudre très pure, stable et sèche, par adsorption et élution, puis précipitation à l'acétone et redissolution dans une solution à 1% de sel, suivie à son tour de l'addi- tion d'un adjuvant, et lyophilisation. On peut d'au- tre part obtenir un produit brut simplement par adso@p- tion de la substance active sur un adsorbant comme le charbon actif, et utiliser le produit absorbé tel quel sur le support. Les spécialistes trouveront aisé. ment des variantes et permutations de ces diverses opérations.
Quand on effectue la purification par pré- cipitation par un acide, comme par exemple l'acide tannique, le complexe obtenu peut être utilisable tel quel, mais il peut être avantageux de séparer la nouvelle enzyme de l'acide tannique afin d'obtenir un produit plus pur. Il est donc préférable de former une bouillie avec une petite quantité d'eau et le pré- cipité obtenu par l'acide tannique, puis d'ajouter
2 volumes d'un solvant organique comme l'acétone ou un alcool, par exemple l'alcool méthylique, éthylique, propylique ou butylique. Le complexe d'acide tanni- que et de protéine se aécompose et l'acide tannique passe en solution dans le solvant, l'enzyme restant insoluble.
On peut aisément séparer les deux frac-
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tions par centrifugation ou par filtration, puis re- prendre par une solution saline la. substance active du produit solide.
Ainsi qu'il a été indiqué plus haut, on peut déterminer la présence et le degré d'activité protéo- lytique de l'enzyme par l'essai Azocoll, la méthode employée dans la présente invention étant une variante de celle décrite par Bidwell (Biochemical Journal, 46. pages 589-59 (1950), et par Oakley et ses colla- borateurs (Journal of Pathology and Bacteriology, 58, pages 229-235 (Avril 1946). Cet essai est basé sur -le pouvoir que présente l'enzyme protéolytique d'hy- drolyser de la poudre de peau teinte par un colorant azoïque.
Au contact de l'enzyme, la molécule de pro- téine est détruite et le colorant libéré passe dans le milieu liquide Plùs le pouvoir hydrolysant de l'en- zyme est élevé, plus grande est l'intensité de la teinte produite par la libération du colorant, que l'on compare avec celle donnée par un essai à blanc.
L'enzyme de la présente invention montre un titre ca- ractéristique d'au moins 15.000 unités Azocoll par cm3 de bouillon de fermentation. Dans des conditions convenables de durée, de température, de pH, d'aéra- tion, de sources d'azote et de carbone, on est arrivé jusqu'à 75.000 unités par cm3.
Pour effectuer l'essai Azocoll modifié se- lon la présente invention, on-prépare une poudre de peau teinte par un colorant azoique de la façon indi- quée par Oakley et collaborateurs (voir ci-dessus).
On prépare un tampon de pH 7,4 à 7,5 comprenant 85
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parties de N2XP y.12H20> 8 parties de KH2P04' et 40 parties de NaCl, complétées à 9000 parties avec de l'eau distillée. On porte à 37 C une pipette de
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10 cm3, la poudre Azocoll et le tampon, et on dilue l'échantillon d'enzyme à l'aide du tampon de façon qu'après digestion de l'Azocoll on fasse une lecture égale ou inférieure à 700 au photocolorimètre de Klett-
Summerson, en employant un filtre vert n 54. On place
0,1 cc d'échantillon d'enzyme dilué et 9,9 cc de tam- pon dans un flacon Azocoll contenant 50 mg de poudre Azocoll, puis on fait incuber pendant 15 minutes à 37 C sur une machine à secousse.
On filtre le mélan- ge et on effectue la lecture sur le filtrat, à l'appa- reil de Klett préalablement mis au zéro à l'aide du tampon. On effectue un essai à blanc de la même façon en employant 10 cc de tampon au lieu de 0,1 cc de solution diluée d'enzyme et 9,9 cc de tampon. On soustrait la lecture faite dans cet essai-témoin de celle correspondant à l'échantillon d'enzyme et on multiple la différence obtenue par 10 fois le facteur de dilution ; a ainsi une valeur donnant le nombre d'unités Azocoll.par cm3 d'échantillon primitif, On va supposer, à titre d'exemple, qu'avec un échantil- lon d'enzyme dilué de 1 à 8 on fasse une lecture de 500, et que la lecture soit 115 pour l'essai Azocoll à blanc. On multiplie la différence, soit 385, par 10 x 8, ce qui donne 30.800 unités Azocoll par cm3.
Les exemples suivants servent à illustrer le procédé de la présente invention, mais ne limitent pas le domaine de celle-ci; sauf spécification contrai- re, toutes les parties représentent des parties en poids.
EXEMPLE 1
On complète à 12 litres avec de l'eau ordi- naire un milieu comprenant 1% d'hydrolysat de caséine.
1% de glucose, 0,3% de NaNO, 0,1% de K2HPO4, 0,05% de
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KCl, 0,05% de MgSO4.7H2O et 0,001% de FeSO4.7H2O, puis on stérilise. On ajoute au bouillon de culture un germe d'Entomophthora. apiculata d'une culture en flacon de 30 heures, et on fait incuber à 27-28 C en agitant Au bout de 96 heures le bouillon titre 50.000 unités Azocoll d'activité protéolytique par cm3.
EXEMPLE 2
On complète le milieu de l'exemple 1 à 100 litres avec de l'eau ordiaaire et on stérilise pendant 30 minutes environ entre 115 et 1200 C. On ajoute au milieu stérilisé un germe a'une culture de 30 heures d'Entomophthora apiculata et on règle la température de fermentation entre 26 C et 28 C. On fait passer de l'air stérilisé dans le mélange.et on agite par un système mécanique. Au bout de 32 heures après l'en- semencement, le milieu de fermentation titre 21.500 unités Azocoll d'enzyme protéolytique par cm3.
EXEMPLE 3
On complète à 1 litre avec de l'eau ordinai re le milieu employé à l'exemple 1. On place des échantillons d'environ 50 cm3 dans des flacons de fer- mentation appropriés, puis on les stérilise pendant 30 minutes à 115-120 C. On ensemence chaque flacon par un volume de Conidiobolus brafeldianus d'une cul- ture de 48 heures. On fait incuber sur une machine à secousse alternative à 28 C. 24 heures après l'en- semencement, le milieu titre 49.200 unités Azocoll d'enzyme protéolytique par cm3.
EXEMPLE L
On complète à 12 litres le milieu de l'exem- ple 1, puis on stérilise pendant 30 à 40 minutes à 115-120 C, dans un récipient approprié. On ajoute un gemme de Conidiobolus brefeldianus au bouillon de
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culture, puis on fait incuber entre 27 et 28 C. On fait passer de l'air stérilisé dans le mélange de fer- mentation et on agite par un moyen mécanique 39 heures.
Après le début de l'incubation le milieu titre 57.000 unités Azocoll d'activité protéolytique par cm3.
EXEMPLE 5
On complète à 200 litres avec de l'eau ordi- naire le milieu employé à l'exemple 1, puis on stérili- se à 120 C environ pendant 30 à 40 minutes. On ajou- te au milieu stérile un germe d'une culture de 30 heu- res de Conidiobolus brefeldianus et on règle la tempé- rature entre 26 et 27 C. On fait passer de l'air stérilisé dans le mélange et on agite par un moyen mé- canique. 48 heures après le début de l'agitation, le milieu titre 43.500 unités Azocoll d'activité protéo- lytique par cm3.
EXEMPLE 6
On complète à 100 parties avec de l'eav or- dinaire un milieu comprenant 2 parties de liqueur ani- male de collage et 3 parties de glucose, puis on sté- rilise. On place dans des récipients convenables des lots de 50 parties de ce milieu et on les ensemence à l'aide d'une culture de 24 heures de Conidiobolus brefeldianus. On fait incuber à 28 C pendant 3 jours sur une machine à secousse. A la fin de cette période le milieu titre 78.000 unités Azocoll d'activité pro- téolytique par cm3.
EXEMPLE 7
On complète à 100 parties avec de l'eau or- dinaire le même milieu qu'à l'exemple 6, puis on sté- rilise. On place 400 parties en volume, dans un réci- pient approprié, et on ensemence avec une culture de 24 heures de Gonidiobolus brefelnianus. On fait passer
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de l'air stérilisé dans le mélange de fermentation et on agite par un moyen mécanique. 70 heures après l'en- @ semencement, le milieu titre 79.000 unités Azocoll d'activité protéolytique par cm3.
EXEMPLE 8
On peut ajouter un germe de Conidiobolus villosus au même milieu que celui de l'exemple 1, com- plété à 100% avec de l'eau ordinaire, puis faire incu- ber le mélange autre 26 et 28 C. On fait passer de l'air stérilisé et on agite par un moyen mécanique. On obtient au bout de trois jours environ de bons rende- ments en enzyme protéolytique.
EXEMPLE 9
On peut ajouter un germe de Basidiobolus ranarum au milieu de l'exemple 1, complété à 100% avec de l'eau ordinaire et faire incuber le mélange entre
26 et 28 C. On peut faire passer de l'air stérilisé dans le mélange et agiter par un moyen mécanique. On obtient au bout de 48 heures environ un bon rendement en enzyme protéolytique.
EXEMPLE 10
On peut ajouter un germe d'Entomophthora coronata au même milieu que celui employé à l'exemple 1 et complété à 100% avec de l'eau ordinaire, puis faire incuber le mélange entre 26 et 28 C. On fait passer de l'air stérilisé et on agite par un moyen mécanique. On obtient au bout de 36 heures environ un bon rendement en enzyme protéolytique.
EXEMPLE 11
Au milieu utilisé à l'exemple 6 et complété à 100 parties avec de l'eau ordinaire, on peut ajouter des germes de Conidiobolus villosus ou de Basidiobolus ranarym, ou d'Entomophthora sphaerosperma, ou d'Ento-
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mophthora coronata. On obtient de bons rendements en enzyme protéolytique après une incubation de 3 jours à 28 C sur une secoueuse mécanique.
EXEMPLE 12
On ajoute 15 parties en poids de silicate de magnésium lavé à l'acide sulfurique à 1000 parties en volume de bouillon exempt de cellules (préparé sélon la méthode de l'exemple 4), puis on agite le mélange.
On filtre la suspension et on lave le gâteau filtré avec 100 parties en volume d'eau distillée. On forme une bouillie avec le gâteau et une solution froide de 100 parties en volume d'ammoniaque aqueux concentré et 100 parties en volume d'eau, puis on filtre le mé- lange. On lave le gâteau avec une petite quantité de solution ammoniacale froide, puis on réunit le fil- trat et le liquide de lavage. Le bouillon exempt de cellules titre, avant adsorption et élution, environ 25 millions d'unités Azocoll d'activité protéolytique pour 1000 parties en.volume de liquide. Après adsorp- tion et élution l'éluat titre 18 millions d'unités Azocoll d'activité protéolytique par 1000 parties en volume de liquide.
EXEMPLE 13
On filtre sur 2000 parties en poids de terre d'infusoires un volume de bouillon fermenté obtenu se- lon le procédé de l'exemple 4, ce qui donne 140.000 parties en volume de bouillon exempt de cellules .
On ajoute à ce bouillon 1% de silicate de magnésium lavé à l'acide et on agite le mélange. Lorsque le solide s'est déposé, on siphone le liquide surnageant, puis on lave à l'eau le gâteau filtré. On forme une bouillie avec.ce gâteau et 5000 à 6000 parties en vo- lume d'eau froide, puis on ajoute une solution aqueuse
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de soude à la bouillie agitée jusqu'à ce que l'on at- teigne et maintienne un pH d'environ 10,5. On agite la bouillie alcaline, puis on filtre le mélange. On ajuste le pH de l'éluat à 8,0 environ à l'aide de gaz carbonique. 140.000 parties en volume de bouillon exempte de cellules titrent avant purification environ 1,9 milliard d'unités Azocoll d'activité protéolyti- que.
Les 6000 parties en volume d'éluat titrant 1,7 milliard d'unités Azocoll d'activité protéolytique.
EXEMPLE 14
On ajoute environ 18.000 parties en volume d'acétone froide à l'éluat de l'exemple précédent et on laisse reposer le mélange pendant plusieurs heures à 4 C environ. On rassemble le précipité par centri- fugation et on le dissout dans 2500 parties en volume environ de solution aqueuse à 1% de chlorure de so- dium. 6.000 parties en volume de léluat titrent 1,7 milliard d'unités Azocoll d'activité protéolytique et 2500 parties en volume de solution saline titrent au minimum 1,7 milliard d'unités d'activité protéolyti.: que.
EXEMPLE 15
On ajoute 3000 parties en poids de silicate de magnésium lavé à l'acide sulfurique à 200. 000 par- ties en volume de bouillon exempt de cellules (obtenu à partir du mélange fermenté de l'exemple 4). On agite le mélange, on filtre, puis on forme une bouil- lie avec le gâteau filtré' et 4500 parties en volume environ de solution aqueuse à 2% de chlorure de so- dium, et on ajoute une solution aqueuse de soude à la bouillie agitée pour porter le pH à 10,5. On agite' le mélange et on élue à nouveau deux fois le gâteau filtré par la même méthode.
On réunit les trois
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éluats, ce qui donne un total d'environ 14.000 parties en volume. 200. 000 parties en volume de bouillon exempt de cellules titrent 5,76 milliards d'unités Azocoll d'activité protéolytique avant purification.
L'éluat, 13.900 parties en volume, titre 4 milliards d'unités Azocoll d'activité protéolytique.
EXEMPLE 16
On ajoute environ 40. 000 parties en volume d'acétone froide aux 13.900 parties en volume de l'éluat de l'exemple précédent. On laisse reposer le mélange pendant plusieurs heures, puis on rassemble le précipité par centrifugation. On dissout ce précipité dans 1400 parties en volume de solution aqueuse froide à 1% de chlorure de sodium, puis on clarifie la solu- tion par de la terre d'infusoires. Les 1400 parties en voiume de solution titrent 3,75 milliards d'unités Azocoll d'activité protéolytique.
EXEMPLE 17
On dissout environ 70 parties en poids de sorbite cristalline sèche dans 1400 parties en volume de la solution saline de l'exemple précédent. On con- gèle des parties aliquotes et on les lyophilise. 1400 parties en volume de solution saline de sorbite titrent 3,73 milliards d'unités Azocoll d'activité protéolyti- que. Le lyophilat titre 3,94 milliards d'unités d'ac- tivité protéolytique.
EXEMPLE 18
On ajoute environ 2600 parties en poids de silicate de magnésium lavé à l'acide à 175.000 partie--
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on ajuste le pH à 10,5 avec de la soude. 175.000 par- ties en volume du bouillon exempt de cellules titrent 3,06 milliards d'unités Azocoll d'activité protéolyti- que. L'éluat, 10. 200 parties en volume, titre 2,09 milliards d'unités Azocoll d'activité protéolytique.
EXEMPLE 19
On ajoute environ 500 parties en volume de solution aqueuse à 10% de chlorure de calcium au fil- trat de pH 10 de l'exemple précédent, puis on filtre le mélange. On lave le gâteau à l'eau et on ajoute les eaux de lavage au filtrat. On ajuste l e pH du filtrat et des eaux de lavage combinés à 7 à l'aide de gaz carbonique puis on ajoute 29. 000 parties en vo- lume d'acétone froide. On rassemble le précipité formé par centrifugation et on le dissout dans une solution aqueuse froide à 1% de chlorure de sodium.
Il.750 parties en volume du filtrat de chlorure de . calcium titrent 2,23 milliards d'unités d'activité protéolytique. 1300 parties en volume de solution saline titrent 1,5 milliard d'unités Azocoll d'activé té protéolytique.
EXEMPLE 20
On ajoute environ 182 parties en volume de solution aqueuse à 70% de sorbite et 520 parties en poids d'amidon de pomme de terre à la solution saline de l'exemple précédent, puis on agite le mélange tout en ajoutant 7800 parties en volume d'acétone froide (à -30 C environ), et on poursuit l'agitation. On laisse déposer les solides et on décante le liquide surnageant. On filtre ls produits solides, on les sèche à l'acétone froide, puis avec de l'acétone à la température ordinaire et à l'air. Le produit sec ti- tre 1,3 milliard d'unités d'activité protéolytique.
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EXEMPLE 21
On ajoute environ 1000 parties en poids de silicate de magnésium humide lavé à l'acide à 180.000 parties en volume de bouillon exempt de cellules pré- paré par le procédé décrit à l'exemple 4, puis on agite le mélange. On ajoute encore 200 parties en poids de silicate de magnésium humide lavé à l'atide et on pour- suit l'agitation pendant encore 1 heure. On sépare les produits solides à l'aide d'une supercentrifugeuse, en les met en bouillie dans 2000 parties en volume d'eau distillée et on filtre. On forme une bouillie avec le gâteau filtré'lavé et 840 parties en volume de solution aqueuse à 70% de sorbite, puis on congèle la bouillie et on la lyophilise. On peut utiliser le produit sec sous cette forme et l'ajouter simplement au support.
On ne peut toutefois pas titrer ce pro- duits par l'essai Azocoll; on effectue le calcul par comparaison aved du caséinate de sodium. 10.000 par- ties en volume de bouillon exempt de cellules titrent 3,1 milliards d'unités d'activité protéolytique. Le produit sec titre 2,7 milliards d'unité d'activité protéolytique.
EXEMPLE 22
On ajoute 5.000 parties en volume d'une so- lution aqueuse à 10% d'acide tannique et à 5% de bisul- fite de sodium à 465.000 parties en volume environ de bouillon exempt de cellules obtenu par le procédé de l'exemple 4. On agite le mélange, puis on laisse dé- poser. On décante le liquide surnageant et on sépare les produits solides dans une supercentrifugeuse. On agite le gâteau avec 5000 parties en volume d'eau aux- quelles on a ajouté environ 1000 parties en poids de sirop de grain. On agite le mélange, on ajoute 6000
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parties en poids de sciure de bois, on brasse à fond et on sèche.
Le bouillon exempt de cellules (465.000 parties en volume) titre Il,4 milliards d'unités Azo- coll d'activité protéolytique, et le produit sec, 7200 'parties en poids de poudre moulue, titre 6,2 milliards d'unités Azocoll d'activité protéolytique.
EXEMPLE 23
On ajoute environ 10 parties en volume d'une solution aqueuse à 10% d'acide tannique et à 5% de bisulfite de sodium à 1000 parties en volume de bouil- lon exempt de cellules obtenu par le procédé de l'exem-' ple 4. On agite le mélange, puis on sépare la substan- ce solide par centrifugation. On agite ensuite cette substance avec 30 parties en volume d'eau distillée et on ajoute 6 parties en volume d'acétone froide. On agite la bouillie et on la centrifuge. On remet les produits solides en bouillie avec 30 parties en volume d'eau et 60 parties en volume d'acétone, puis on cen- trifuge à nouveau. On réunit les deux parties liqui- des, la solution obtenue donne une réaction importante au chlorure ferrique.
On brasse à fond le produit so- lide dans 100 parties en volume d'une solution aqueuse à 2% de chlorure de sodium et on centrifuge. Le bouil- lon exempt de cellules titre 18 millions d'unités Azo- coll d'activité protéolytique, et la solution aqueuse saline surnageante 15 millions d'unités d'activité protéolytique.
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